CN109554429B - 诱导藻细胞高效合成虾青素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供诱导藻细胞高效合成虾青素的方法，属于虾青素合成技术领域，包括：a)沉降并浓缩处于对数生长期的高产虾青素藻液；b)在浓缩藻液中加入冻存液后除上清，预冷冻后迅速冷冻保藏；c)420～440nm的蓝光辐照下诱导培养藻液；d)在含有葡萄糖的无碳源组合培养基中加入发酵助剂进行振荡发酵培养。有益效果为：本方法有助于在藻液冻藏过程中降低藻细胞收到的损伤，首先在培养过程中以特定波长的蓝光辐照诱导细胞形态改变，促进虾青素的合成，然后再发酵过程中加入助剂以丙酮酸和乙酰CoA的通量，强化PP途径和TCA循环，提高对虾青素的代谢合成。

Description

诱导藻细胞高效合成虾青素的方法
技术领域
本发明属于虾青素合成技术领域，具体涉及诱导藻细胞高效合成虾青素的方法。
背景技术
虾青素(astaxanthin)，又名虾黄质、龙虾壳色素，是一种类胡萝卜素，也是类胡萝卜素合成的最高级别产物，是一种精细深紫褐色粉末，熔点216℃，沸点774℃，密度1.071g/cm3，不易溶于水，易溶于丙酮、乙醇、二氯甲烷、乙醚、正己烷等有机溶剂，其化学结构类似于β-胡萝卜素。化学名称：3,3′-二羟基-4，4′-二酮基β-胡萝卜素，色素Aj067-69，CAS No:472-61-7，分子式C40H52O4，分子量为596.86。虾青素分子是由4个异戊二烯双键首位连接而成，共有11个共轭双键，是典型的类胡萝卜素碳链结构，由于在虾青素分子中碳原子共轭双键链的两端有不饱和羰基和羟基构成α-羟基酮结构，而α-羟基酮结构具有非常活泼的电子效应，易于清楚自由基等氧化成分，所以天然虾青素应避免受到光热酸碱氧化剂的影响而被氧化成虾红素。
现代研究表明虾青素不仅可以作为色素添加剂，还具有抗衰老、抗氧化、预防心脑血管、抗肿瘤疾病等多种生物活性作用，因此在制药、食品和化妆品行业深受大家的青睐，具有广阔的应用前景。
由于两端的羟基(-OH)旋光性原因，虾青素具有3S-3'S、3R-3'S、3R-3'R(也称为左旋、内消旋、右旋)这3种异构型态，其中人工合成虾青素为3种结构虾青素的混合物(左旋占25％、右旋占25％，内消旋50％左右)，极少抗氧化活性，与鲑鱼等养殖生物体内的虾青素(以反式结构—3S-3S型为主)截然不同。酵母菌源的虾青素是100％右旋(3R-3'R)，有部分抗氧化活性；上述两种来源虾青素主要用在非食用动物和物资的着色上。虾青素中只有藻源的虾青素是100％左旋(3S-3'S)结构，具有最强的生物学活性。除人工化学合成方法之外，天然虾青素的生物来源一般有3种：水产品加工工业的废弃物、红发夫酵母(Phaffiarhodozyma)和微藻(雨生红球藻)。其中，废弃物中虾青素含量较低，且提取费用较高，不适于进行大规模生产。天然的红发夫酵母中虾青素平均含量也仅为0.40％。相比之下，雨生红球藻中虾青素含量却高达1.5～3.0％，因此被看作是天然虾青素的“浓缩品”。尽管雨生红球藻中的虾青素含量最高，但是占比依然较低，因此寻求诱导藻细胞合成更多虾青素的方法具有显著的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供诱导藻细胞高效合成虾青素的方法，本方法有助于在藻液冻藏过程中降低藻细胞收到的损伤，首先在培养过程中以特定波长的蓝光辐照诱导细胞形态改变，促进虾青素的合成，然后再发酵过程中加入助剂以丙酮酸和乙酰CoA的通量，强化PP途径和TCA循环，提高对虾青素的代谢合成。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
马来酸二钠盐作为发酵助剂在诱导藻细胞高效合成虾青素中的应用，其特征在于包括：在培养基中加入发酵助剂对藻细胞进行发酵培养。
为应用上述应用，本发明还提供一种诱导藻细胞高效合成虾青素的方法，包括：
a)沉降并浓缩处于对数生长期的高产虾青素雨生红球藻藻液；
b)在浓缩藻液中加入冻存液后除上清，预冷冻后冷冻保藏；
c)420～440nm的蓝光辐照下诱导培养藻液；
d)在含有葡萄糖的无碳源组合培养基中加入发酵助剂进行振荡发酵培养。
本发明方法通过以冻存液冷冻保藏高产虾青素的雨生红球藻藻液，可降低冰晶的成长速度，削弱冷冻过冲中冰晶的延伸对藻细胞的伤害，从而保持藻细胞的活性，藻细胞培养过程中进行特定波长的蓝光辐照，有助于降低胞内蛋白质的含量，大大提高碳水化合物的含量，诱导雨生红球藻对虾青素的合成；在发酵阶段添加发酵助剂能大幅度提高雨生红球藻细胞内丙酮酸和乙酰CoA的通量，强化PP途径和TCA循环，加快了虾青素的合成，合成需要消耗更多的葡萄糖，进而降低体系的pH值，而低pH值有助于降低生物量的合成，使葡萄糖的消耗主要用于虾青素的合成，强化雨生红球藻对虾青素的高效合成。
所述诱导藻细胞高效合成虾青素的方法，具体包括下列步骤：
浓缩藻液：取处于对数生长期的高产虾青素雨生红球藻藻液收集并进行静止沉降，去除上清培养液，沉降、去除杂至得到细胞密度不低于25g/L的浓缩藻液；选取处于对数生长期的高产虾青素雨生红球藻进行筛选浓缩有利于获取优质高效的藻液，实现最高效地诱导合成虾青素；
冷冻保藏：1～2℃温度下，按照重量比1～8:1的比例将冻存液加入到浓缩藻液中，搅拌离心去除上清液，得到藻泥，在-5～-10℃预冷冻后迅速转入-25～-55℃冷冻保藏；冻存液中的有效成分在冷冻保藏期间可以起到延缓冰晶围绕冰核生成的作用，从而降低了冰晶的成长速度，削弱了冷冻过冲中冰晶的延伸对藻细胞的伤害，从而保持藻细胞的活性；
诱导培养：将冷冻保藏的藻液活化后进行诱导培养，分别以20～25g/L葡萄糖和0.18～0.22g/L硝酸钾作为碳源与氮源，控制pH至6.8～7.5，pH缓冲体系是2-苯基苯并咪唑-5-磺酸，在16～24℃温度下培养10～18d，培养期间持续以420～440nm的蓝光辐照；藻细胞培养过程中，持续以420～440nm的蓝光辐照能够促使雨生红球藻由鞭毛状态细胞转变为孢子态细胞，并降低胞内蛋白质的含量，大大提高碳水化合物的含量，蓝光辐照的光合固碳和碳水化合物的前体性物质均可为虾青素的合成提供充足的碳骨架，诱导雨生红球藻对虾青素的合成，因此特定频率的蓝光辐照可大大诱导雨生红球藻高效合成虾青素；
发酵：以无碳源组合培养基，加入30～45g/L葡萄糖作为碳源，并加入0.22～0.28g/L马来酸二钠盐作为发酵助剂，在23～25℃、100～140r/min条件下振荡发酵培养80～100h即完成诱导；马来酸二钠盐还能大幅度提高雨生红球藻细胞内丙酮酸和乙酰CoA的通量，强化PP途径和TCA循环，加快了虾青素的合成，从而消耗更多的葡萄糖，为藻细胞的生长繁殖以及对虾青素的积累提供能量源，消耗葡萄糖的过程有助于降低体系的pH值，而低pH值有助于降低生物量的合成，使葡萄糖的消耗主要用于虾青素的合成，强化雨生红球藻对虾青素的高效合成，提高代谢产物中虾青素的含量。
本发明方法通过以冻存液冷冻保藏高产虾青素的雨生红球藻藻液，可降低冰晶的成长速度，削弱冷冻过冲中冰晶的延伸对藻细胞的伤害，从而保持藻细胞的活性，藻细胞培养过程中进行特定波长的蓝光辐照，有助于降低胞内蛋白质的含量，大大提高碳水化合物的含量，诱导雨生红球藻对虾青素的合成；在发酵阶段添加发酵助剂能大幅度提高雨生红球藻细胞内丙酮酸和乙酰CoA的通量，强化PP途径和TCA循环，加快了虾青素的合成，合成需要消耗更多的葡萄糖，进而降低体系的pH值，而低pH值有助于降低生物量的合成，使葡萄糖的消耗主要用于虾青素的合成，强化雨生红球藻对虾青素的高效合成。
在本发明的实施例中，冻存液加入到浓缩藻液中时的重量比存在于1:1，或2:1，或3:1，或4:1，或5:1，或6:1，或7:1，或8:1的范围内。
在本发明的实施例中，蓝光辐照时蓝光的波长存在于420，或421，或422，或423，或424，或425，或426，或427，或428，或429，或430，或431，或432，或434，或435，或436，或437，或438，或439，或440纳米的范围内。
进一步地，在本发明较优的实施例中，所述冻存液含有0.1～1.2wt％的1-丁醇和0.05～0.06wt‰的L-阿糖醇，其余为蒸馏水；冷冻保藏过程中，以晶核-藻细胞为中心，围绕晶核中心的水分子生长出子晶，子晶构成外延结晶的晶核，依靠子晶表面的分子力“抓住”合适取向的水分子进而使冰冻迅速延伸构成浸提，冻存液中特殊配比的1-丁醇和L-阿糖醇具有协同作用，该作用可使改变水分子的取向，降低适合成长为晶体的水分子的取向，从而降低晶核到子晶、子晶到晶体的成长速度，弱化冷冻对藻细胞的损伤，从而保持藻细胞的活性。
在本发明的实施例中，冻存液中1-丁醇的含量存在于0.1，或0.2，或0.3，或0.4，或0.5，或0.6，或0.7，或0.8，或0.9，或1.0，或1.1，或1.2重量百分比的范围内。
在本发明的实施例中，冻存液中L-阿糖醇的含量存在于0.05，或0.051，或0.052，或0.053，或0.054，或0.055，或0.056，或0.057，或0.058，或0.059，或0.60重量千分比的范围内。
进一步地，在本发明较优的实施例中，所述蓝光的辐射照度是1500～6000μW/cm2；藻细胞培养过程中，持续以420～440nm的蓝光辐照能够促使雨生红球藻由鞭毛状态细胞转变为孢子态细胞，并降低胞内蛋白质的含量，大大提高碳水化合物的含量，蓝光辐照的光合固碳和碳水化合物的前体性物质均可为虾青素的合成提供充足的碳骨架，因此特定频率的蓝光辐照可大大诱导雨生红球藻高效合成虾青素。
在本发明的实施例中，蓝光的辐射照度存在于1500，或2000，或2500，或3000，或3500，或4000，或4500，或5000，或5500，或6000μW/cm2的范围内。
本发明的有益效果为：
1)以冻存液冷冻保藏高产虾青素的雨生红球藻藻液，可降低冰晶的成长速度，削弱冷冻过冲中冰晶的延伸对藻细胞的伤害，从而保持藻细胞的活性；
2)藻细胞培养过程中进行特定波长的蓝光辐照，有助于降低胞内蛋白质的含量，大大提高碳水化合物的含量，诱导雨生红球藻对虾青素的合成；
3)在发酵阶段添加发酵助剂能大幅度提高雨生红球藻细胞内丙酮酸和乙酰CoA的通量，强化PP途径和TCA循环，加快了虾青素的合成；
4)虾青素的高效合成需要消耗更多的葡萄糖，进而降低体系的pH值，而低pH值有助于降低生物量的合成，使葡萄糖的消耗主要用于虾青素的合成，强化雨生红球藻对虾青素的高效合成。
本发明采用了上述技术方案提供诱导藻细胞高效合成虾青素的方法，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。
具体实施方式
在本发明及实施例中，除非另有所指且特别说明外，“份”指重量份，“％”指重量百分比，“wt％”指重量百分比，“‰”指重量千分比，“wt‰”指重量千分比，“倍”指重量倍。
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：
实施例1：
诱导藻细胞高效合成虾青素的方法，具体包括下列步骤：
浓缩藻液：取处于对数生长期的高产虾青素雨生红球藻藻液收集并进行静止沉降，去除上清培养液，沉降、去除杂至得到细胞密度为25g/L的浓缩藻液；选取处于对数生长期的高产虾青素雨生红球藻进行筛选浓缩有利于获取优质高效的藻液，实现最高效地诱导合成虾青素；
冷冻保藏：配备冻存液：含有0.1wt％的1-丁醇和0.05wt‰的L-阿糖醇，其余为蒸馏水；1℃温度下，按照重量比1:1的比例将冻存液加入到浓缩藻液中，搅拌离心去除上清液，得到藻泥，在-5℃预冷冻后迅速转入-25℃冷冻保藏；冷冻保藏过程中，以晶核-藻细胞为中心，围绕晶核中心的水分子生长出子晶，子晶构成外延结晶的晶核，依靠子晶表面的分子力“抓住”合适取向的水分子进而使冰冻迅速延伸构成浸提，冻存液中特殊配比的1-丁醇和L-阿糖醇具有协同作用，该作用可使改变水分子的取向，降低适合成长为晶体的水分子的取向，从而降低晶核到子晶、子晶到晶体的成长速度，弱化冷冻对藻细胞的损伤，从而保持藻细胞的活性；
诱导培养：将冷冻保藏的藻液活化后进行诱导培养，分别以20g/L葡萄糖和0.18g/L硝酸钾作为碳源与氮源，控制pH至6.8，pH缓冲体系是2-苯基苯并咪唑-5-磺酸，在16℃温度下培养10d，培养期间持续以420nm的蓝光辐照，蓝光的辐射照度是1500μW/cm2；藻细胞培养过程中，持续以420nm的蓝光辐照能够促使雨生红球藻由鞭毛状态细胞转变为孢子态细胞，并降低胞内蛋白质的含量，大大提高碳水化合物的含量，蓝光辐照的光合固碳和碳水化合物的前体性物质均可为虾青素的合成提供充足的碳骨架，诱导雨生红球藻对虾青素的合成，因此特定频率的蓝光辐照可大大诱导雨生红球藻高效合成虾青素；
发酵：以无碳源组合培养基，加入30g/L葡萄糖作为碳源，并加入0.22g/L马来酸二钠盐作为发酵助剂，在23℃、100r/min条件下振荡发酵培养80h即完成诱导；马来酸二钠盐还能大幅度提高雨生红球藻细胞内丙酮酸和乙酰CoA的通量，强化PP途径和TCA循环，加快了虾青素的合成，从而消耗更多的葡萄糖，为藻细胞的生长繁殖以及对虾青素的积累提供能量源，消耗葡萄糖的过程有助于降低体系的pH值，而低pH值有助于降低生物量的合成，使葡萄糖的消耗主要用于虾青素的合成，强化雨生红球藻对虾青素的高效合成，提高代谢产物中虾青素的含量。
本发明方法通过以冻存液冷冻保藏高产虾青素的雨生红球藻藻液，可降低冰晶的成长速度，削弱冷冻过冲中冰晶的延伸对藻细胞的伤害，从而保持藻细胞的活性，藻细胞培养过程中进行特定波长的蓝光辐照，有助于降低胞内蛋白质的含量，大大提高碳水化合物的含量，诱导雨生红球藻对虾青素的合成；在发酵阶段添加发酵助剂能大幅度提高雨生红球藻细胞内丙酮酸和乙酰CoA的通量，强化PP途径和TCA循环，加快了虾青素的合成，合成需要消耗更多的葡萄糖，进而降低体系的pH值，而低pH值有助于降低生物量的合成，使葡萄糖的消耗主要用于虾青素的合成，强化雨生红球藻对虾青素的高效合成。
对比例1：
对比例1与实施例1基本相同，不同之处在于冷冻保藏步骤中未加入冻存液。
实施例2：
一种诱导藻细胞高效合成虾青素的方法，包括：
a)沉降并浓缩处于对数生长期的高产虾青素雨生红球藻藻液；
b)在浓缩藻液中加入冻存液后除上清，预冷冻后冷冻保藏；
c)440nm的蓝光辐照下诱导培养藻液；
d)在含有葡萄糖的无碳源组合培养基中加入发酵助剂进行振荡发酵培养。
本发明方法通过以冻存液冷冻保藏高产虾青素的雨生红球藻藻液，可降低冰晶的成长速度，削弱冷冻过冲中冰晶的延伸对藻细胞的伤害，从而保持藻细胞的活性，藻细胞培养过程中进行特定波长的蓝光辐照，有助于降低胞内蛋白质的含量，大大提高碳水化合物的含量，诱导雨生红球藻对虾青素的合成；在发酵阶段添加发酵助剂能大幅度提高雨生红球藻细胞内丙酮酸和乙酰CoA的通量，强化PP途径和TCA循环，加快了虾青素的合成，合成需要消耗更多的葡萄糖，进而降低体系的pH值，而低pH值有助于降低生物量的合成，使葡萄糖的消耗主要用于虾青素的合成，强化雨生红球藻对虾青素的高效合成。
所述步骤a)中，高产虾青素雨生红球藻藻液浓缩至细胞密度为30g/L的浓缩藻液；选取处于对数生长期的高产虾青素雨生红球藻进行筛选浓缩有利于获取优质高效的藻液，实现最高效地诱导合成虾青素。
所述步骤b)中，在2℃温度下，按照重量比8:1的比例将冻存液加入到浓缩藻液中，搅拌离心去除上清液，得到藻泥。
所述步骤b)中，所述冻存液中含有1.2wt％的1-丁醇和0.06wt‰的L-阿糖醇，其余为蒸馏水；冷冻保藏过程中，以晶核-藻细胞为中心，围绕晶核中心的水分子生长出子晶，子晶构成外延结晶的晶核，依靠子晶表面的分子力“抓住”合适取向的水分子进而使冰冻迅速延伸构成浸提，冻存液中特殊配比的1-丁醇和L-阿糖醇具有协同作用，该作用可使改变水分子的取向，降低适合成长为晶体的水分子的取向，从而降低晶核到子晶、子晶到晶体的成长速度，弱化冷冻对藻细胞的损伤，从而保持藻细胞的活性。
所述步骤b)中，预冷冻的温度是-10℃，然后迅速转入-55℃冷冻保藏；冻存液中的有效成分在冷冻保藏期间可以起到延缓冰晶围绕冰核生成的作用，从而降低了冰晶的成长速度，削弱了冷冻过冲中冰晶的延伸对藻细胞的伤害，从而保持藻细胞的活性。
所述步骤c)中，诱导培养时，分别以25g/L葡萄糖和0.22g/L硝酸钾作为碳源与氮源。
所述步骤c)中，诱导培养时，以2-苯基苯并咪唑-5-磺酸作为缓冲体系控制pH为7.5；诱导培养温度是24℃，诱导培养时间是18d。
所述步骤c)中，诱导培养期间持续以440nm的蓝光辐照，蓝光的辐射照度是6000μW/cm2；藻细胞培养过程中，持续以420～440nm的蓝光辐照能够促使雨生红球藻由鞭毛状态细胞转变为孢子态细胞，并降低胞内蛋白质的含量，大大提高碳水化合物的含量，蓝光辐照的光合固碳和碳水化合物的前体性物质均可为虾青素的合成提供充足的碳骨架，诱导雨生红球藻对虾青素的合成，因此特定频率的蓝光辐照可大大诱导雨生红球藻高效合成虾青素。
所述步骤d)中，发酵时在无碳源组合培养基中加入的葡萄糖的量是45g/L，振荡发酵培养调节是25℃、140r/min，发酵100h即完成诱导。
所述步骤d)中，发酵时加入的发酵助剂是0.28g/L的马来酸二钠盐；马来酸二钠盐还能大幅度提高雨生红球藻细胞内丙酮酸和乙酰CoA的通量，强化PP途径和TCA循环，加快了虾青素的合成，从而消耗更多的葡萄糖，为藻细胞的生长繁殖以及对虾青素的积累提供能量源，消耗葡萄糖的过程有助于降低体系的pH值，而低pH值有助于降低生物量的合成，使葡萄糖的消耗主要用于虾青素的合成，强化雨生红球藻对虾青素的高效合成，提高代谢产物中虾青素的含量。
本发明方法通过以冻存液冷冻保藏高产虾青素的雨生红球藻藻液，可降低冰晶的成长速度，削弱冷冻过冲中冰晶的延伸对藻细胞的伤害，从而保持藻细胞的活性，藻细胞培养过程中进行特定波长的蓝光辐照，有助于降低胞内蛋白质的含量，大大提高碳水化合物的含量，诱导雨生红球藻对虾青素的合成；在发酵阶段添加发酵助剂能大幅度提高雨生红球藻细胞内丙酮酸和乙酰CoA的通量，强化PP途径和TCA循环，加快了虾青素的合成，合成需要消耗更多的葡萄糖，进而降低体系的pH值，而低pH值有助于降低生物量的合成，使葡萄糖的消耗主要用于虾青素的合成，强化雨生红球藻对虾青素的高效合成。
对比例2：
对比例2与实施例2基本相同，不同之处在于步骤c)中诱导培养藻液时使用白光，辐射照度是6000μW/cm2。
实施例3：
一种诱导藻细胞高效合成虾青素的方法，包括：
a)沉降并浓缩处于对数生长期的高产虾青素雨生红球藻藻液；
b)在浓缩藻液中加入冻存液后除上清，预冷冻后冷冻保藏；
c)420～440nm的蓝光辐照下诱导培养藻液；
d)在含有葡萄糖的无碳源组合培养基中加入发酵助剂进行振荡发酵培养。
所述诱导藻细胞高效合成虾青素的方法，具体包括下列步骤：
浓缩藻液：取处于对数生长期的高产虾青素雨生红球藻藻液收集并进行静止沉降，去除上清培养液，沉降、去除杂至得到细胞密度为28g/L的浓缩藻液；选取处于对数生长期的高产虾青素雨生红球藻进行筛选浓缩有利于获取优质高效的藻液，实现最高效地诱导合成虾青素；
冷冻保藏：1℃温度下，按照重量比5:1的比例将冻存液加入到浓缩藻液中，搅拌离心去除上清液，得到藻泥，在-8℃预冷冻后迅速转入-45℃冷冻保藏；冻存液中的有效成分在冷冻保藏期间可以起到延缓冰晶围绕冰核生成的作用，从而降低了冰晶的成长速度，削弱了冷冻过冲中冰晶的延伸对藻细胞的伤害，从而保持藻细胞的活性；
诱导培养：将冷冻保藏的藻液活化后进行诱导培养，分别以24g/L葡萄糖和0.2g/L硝酸钾作为碳源与氮源，控制pH至7，pH缓冲体系是2-苯基苯并咪唑-5-磺酸，在22℃温度下培养15d，培养期间持续以430nm的蓝光辐照；藻细胞培养过程中，持续以430nm的蓝光辐照能够促使雨生红球藻由鞭毛状态细胞转变为孢子态细胞，并降低胞内蛋白质的含量，大大提高碳水化合物的含量，蓝光辐照的光合固碳和碳水化合物的前体性物质均可为虾青素的合成提供充足的碳骨架，诱导雨生红球藻对虾青素的合成，因此特定频率的蓝光辐照可大大诱导雨生红球藻高效合成虾青素；
发酵：以无碳源组合培养基，加入38g/L葡萄糖作为碳源，并加入0.25g/L马来酸二钠盐作为发酵助剂，在24℃、120r/min条件下振荡发酵培养96h即完成诱导；马来酸二钠盐还能大幅度提高雨生红球藻细胞内丙酮酸和乙酰CoA的通量，强化PP途径和TCA循环，加快了虾青素的合成，从而消耗更多的葡萄糖，为藻细胞的生长繁殖以及对虾青素的积累提供能量源，消耗葡萄糖的过程有助于降低体系的pH值，而低pH值有助于降低生物量的合成，使葡萄糖的消耗主要用于虾青素的合成，强化雨生红球藻对虾青素的高效合成，提高代谢产物中虾青素的含量。
本发明方法通过以冻存液冷冻保藏高产虾青素的雨生红球藻藻液，可降低冰晶的成长速度，削弱冷冻过冲中冰晶的延伸对藻细胞的伤害，从而保持藻细胞的活性，藻细胞培养过程中进行特定波长的蓝光辐照，有助于降低胞内蛋白质的含量，大大提高碳水化合物的含量，诱导雨生红球藻对虾青素的合成；在发酵阶段添加发酵助剂能大幅度提高雨生红球藻细胞内丙酮酸和乙酰CoA的通量，强化PP途径和TCA循环，加快了虾青素的合成，合成需要消耗更多的葡萄糖，进而降低体系的pH值，而低pH值有助于降低生物量的合成，使葡萄糖的消耗主要用于虾青素的合成，强化雨生红球藻对虾青素的高效合成。
所述冻存液含有1.1wt％的1-丁醇和0.055wt‰的L-阿糖醇，其余为蒸馏水；冷冻保藏过程中，以晶核-藻细胞为中心，围绕晶核中心的水分子生长出子晶，子晶构成外延结晶的晶核，依靠子晶表面的分子力“抓住”合适取向的水分子进而使冰冻迅速延伸构成浸提，冻存液中特殊配比的1-丁醇和L-阿糖醇具有协同作用，该作用可使改变水分子的取向，降低适合成长为晶体的水分子的取向，从而降低晶核到子晶、子晶到晶体的成长速度，弱化冷冻对藻细胞的损伤，从而保持藻细胞的活性。
所述蓝光的辐射照度是4500μW/cm2；藻细胞培养过程中，持续以430nm的蓝光辐照能够促使雨生红球藻由鞭毛状态细胞转变为孢子态细胞，并降低胞内蛋白质的含量，大大提高碳水化合物的含量，蓝光辐照的光合固碳和碳水化合物的前体性物质均可为虾青素的合成提供充足的碳骨架，因此特定频率的蓝光辐照可大大诱导雨生红球藻高效合成虾青素。
对比例3：
对比例3与实施例3基本相同，不同之处在于发酵过程中未添加任何发酵助剂。
试验例：
A、细胞干重测定：取5mL发酵液于3500r/min离心10min后，用蒸馏水洗涤离心2次，于105℃烘干至恒重称重；
B、总蛋白质含量测定：采用凯氏定氮法测定雨生红球藻细胞中的总蛋白质含量；
C、碳水化合物含量测定：采用丙酮-硫酸法测定雨生红球藻细胞中的碳水化合物的含量；
D、虾青素含量测定：采用二甲亚砜(DMSO)法：取5mL发酵液，离心后用去离子水洗涤离心2次，加2mL75℃的DMSO破壁，最后用乙醇提取并定容，在474nm下测其OD值，用2mLDMSO和8mL乙醇混匀调零；以Sigma公司的虾青素标准品作标准曲线，回归得到线性标准曲线方程。
分别测定实施例1～3以及对比例1～3中发酵液中藻细胞的细胞干重、总蛋白质含量、碳水化合物含量以及虾青素含量，统计入表1。
表1藻细胞中细胞干重、总蛋白、碳水化合物以及虾青素的均值含量统计
Figure BDA0001924008690000111
由表1可以看出，在本发明的优选实施例1～3中，细胞干重显著提高，而随着总蛋白质含量的大幅度降低，细胞内碳水化合物含量显著得到提高，经过诱导培养、发酵之后藻细胞对虾青素的合成也得到了显著的增强，相对于初始藻液的虾青素含量，经过诱导培养、发酵之后，虾青素增量均超过了3倍，可见本发明方法对藻细胞合成虾青素具有较大程度的提升作用。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims (4)

1.马来酸二钠盐作为发酵助剂在诱导藻细胞高效合成虾青素中的应用，其特征在于包括：
取细胞密度不低于25g/L的浓缩雨生红球藻(Haematococcus Pluvialis)藻液，1～2℃温度下，按照重量比1～8:1的比例将冻存液加入到浓缩藻液中，搅拌离心去除上清液，得到藻泥，在-5～-10℃预冷冻后迅速转入-25～-55℃冷冻保藏；在持续的420～440nm波长、1500～6000μW/cm2辐射强度的蓝光辐照条件下对藻液诱导培养，然后以葡萄糖作为碳源，加入0.22～0.28g/L发酵助剂马来酸二钠盐对雨生红球藻进行振荡发酵完成诱导；
所述冻存液含有0.1～1.2wt％1-丁醇和0.05～0.06wt‰L-阿糖醇的水溶液。
2.诱导藻细胞高效合成虾青素的方法，其特征在于包括：
a)沉降并浓缩处于对数生长期的雨生红球藻(Haematococcus Pluvialis)藻液，得到细胞密度不低于25g/L的浓缩藻液；
b)1～2℃温度下，按照重量比1～8:1的比例将冻存液加入到浓缩藻液中，搅拌离心去除上清液，得到藻泥，在-5～-10℃预冷冻后迅速转入-25～-55℃冷冻保藏；
c)420～440nm波长、1500～6000μW/cm2辐射强度的的蓝光辐照下诱导培养藻液；
d)在含有葡萄糖的无碳源组合培养基中加入0.22～0.28g/L发酵助剂马来酸二钠盐对雨生红球藻进行振荡发酵完成诱导；
所述冻存液含有0.1～1.2wt％1-丁醇和0.05～0.06wt‰L-阿糖醇的水溶液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述诱导培养时，pH是6.8～7.5，培养温度是16～24℃，培养时间是10～18d。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述控制pH时的缓冲体系是2-苯基苯并咪唑-5-磺酸。
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