CN109536592A - 一种鉴定番茄灰叶斑抗性基因的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴定番茄灰叶斑抗性基因的方法，主要包括：基因组DNA提取、抗感品种的PCR片段克隆、抗性基因特异性引物的设计；HRM（高分辨率熔解曲线）反应体系等步骤。最后利用LightCycler®480的Gene Scanning 1.5 version软件进行高分辨率熔解曲线分析。通过该方法能科学高效准确地检测出番茄灰叶斑的抗性基因。
Description
技术领域
本发明提供一种快速、简捷、高效的番茄灰叶斑抗性基因的方法，属植物保护领域。
背景技术
近年来随着设施番茄栽培面积的不断扩大、频繁引进国外品种及主栽品种的更换，使得灰叶斑病在一些番茄种植基地流行为害逐年偏重。目前在生产上推广的抗番茄黄化曲叶病毒病的番茄品种很多都表现出对灰叶斑病的高度感病性，且感病后发病速度快，严重影响植物的光合作用并减少营养物质的合成，甚至造成全株死亡；又由于该病是新发展起来的病害，农户普遍缺乏防治经验，加之生产上缺乏有效的防控措施，时常发生误诊或防治不及时，导致番茄减产或绝收，给农户造成严重的经济损失。因此，积极开展灰叶斑病抗性鉴定工作和抗病育种研究工作，对减少该病害具有重要意义。
前人已经对灰叶斑的抗性遗传规律及分子标记进行了一些研究。2009 年Ji andScott 报道了一个能够检测Sm 基因的Caps 标记CT55，该标记是一个隐性标记，PCR 产物约为400bp，经DdeI 酶切后，感病材料和杂合材料产生330bp、200bp 和140bp左右的条带，而抗病材料中产生200bp 和140bp 的条带，该标记不能区分感病材料与杂合材料，且其尚未在番茄种质资源中验证应用。高建昌等人发明开发了一个与番茄抗灰叶斑病基因Sm 连锁的Indel 标记，利用PCR 技术对该标记位点进行扩增，通过电泳检测扩增产物的片段数量和大小，判断被检番茄样品是否为抗灰叶斑病材料。这种方法也有一些弊端，因抗病材料和感病材料只相差12个碱基，普通的凝胶电泳很难区分来，在实际应用中常出现误判的现象。
本研究就是在高建昌等人的标记基础上，利用HRM方法开发出一种操作简单易于区分的分子标记方法来检测番茄灰叶斑的抗性基因。该方法不需PCR、酶切和电泳，只需利用HRM曲线就可检测出番茄灰叶斑的抗性基因。本方法可加快抗病育种进程，对推进蔬菜产业可持续发展具有重要意义。
发明内容
目前番茄灰叶斑的抗性基因检测方法中需要进行PCR和限制性内切酶酶切等步骤。针对该方法检测时间太长且结果容易误判等问题，发明人进行了大量的研究工作，通过基因克隆和测序确定了抗感品种中的基因差异，利用HRM方法建立了番茄灰叶斑的抗性基因的检测体系。此方法无酶切、操作简单是一种简单方便的番茄灰叶斑的抗性基因检测的新方法。
本发明旨在提供一种简便的抗性基因检测方法，通过该方法能科学高效准确地检测出番茄灰叶斑的抗性基因。
为实现上述目的，本发明公开了的如下的技术内容：
一种鉴定番茄灰叶斑抗性基因的方法，其特征在于按如下的步骤进行
（1）基因组DNA提取：
（2）抗感品种的PCR片段克隆：
利用Sm-Indel-F /R引物，对抗病品种和感病品种进行PCR扩增，反应总体积为25μL，包括模板DNA 20-60 ng，Taq DNA聚合酶 0.5 U，dNTPs(each 10mmol/L) 0.5μL，10×PCR缓冲液2.5μL，5，端引物（10 µmol/L）2.5μL，3，端引物（10µmol/L ）2.5μL。PCR反应条件为： 95℃热启动之后，进行PCR扩增。循环条件为：95℃变性5 min，95℃ 30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环35次，72℃过度延伸10 min，将所有反应物混匀后，于PCR仪上扩增，PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，将其进行连接、转化后，挑取阳性克隆；所述的引物指的是：Sm-Indel-F:GATCTCATCCCGTTGTATATG ；
Sm-Indel-R:CACCCACAAACAAATCAAG。
（3）抗性基因特异性引物的设计
因为感病品种存在PCR产物大小不同，所以在抗感品种间一定存在一个或几个SNP（单核苷酸多态性），根据测序结果设计等位基因特异性的引物；
（4） HRM（高分辨率熔解曲线）反应体系
PCR 扩增和高分辨率熔解曲线分析在荧光定量PCR 仪上进行，反应总体积为20μL，包括模板DNA 20-60 ng，premix 10uL,20×Evagreen 1uL，5，端引物（10µmol/L）0.4μL，3，端引物（10µmol/L ）0.4μL，PCR 扩增程序：95 ℃预变性10 min，然后按95 ℃变性10 min，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s 进行45 个循环，扩增产物HRM 检测程序为：95 ℃ 1 min，40 ℃1 min，65 ℃ 1 s，在65 ℃升温至95 ℃的过程中，以25 次 ·-1 ℃的频率收集荧光信息，最后降温至40 ℃，利用LightCycler®480 的Gene Scanning 1.5 version 软件进行高分辨率熔解曲线分析；所述的引物指的是：
Smhrm2F： GATCTCATCCCGTTGTATATGC
Smhrm2R GCAAAGACAT GACTAAACTCT。
本发明进一步公开了所述的鉴定番茄灰叶斑抗性基因方法在加快抗病材料和品种选育速度方面的应用。实验结果证明：本发明的方法能有效区分出番茄对灰叶斑的抗感性，可用于抗灰叶斑的分子标记育种，加快抗病材料和品种选育速度。本发明主要解决了现有番茄灰叶斑抗性基因检测方法不易判断的问题，重点考察了抗病品种和感病品种的基因序列特征，主要的难点在于针对基因序列特片设计出能够区分抗感品种的HRM引物及相应的反应体系，使番茄灰叶斑的抗性基因和感病基因得以明显的判断。
本发明更加详细的描述如下
主要步骤：
1.1材料
抗病纯合：欧旺（天津朝研种苗科技有限公司）的高代自交系J-6，由天津市农业生物技术研究中心保存。
感病纯合：Moneymaker, 由天津市农业生物技术研究中心保存。
杂合型：3110（ J-6× Moneymaker获得的F1代）。
市售商品种：市售商品种：1（圣迪）、2（欧旺）、340（秋盛）、罗拉（341）、213（津杂213）。
1.2方法
1.2.1基因组DNA提取
参考毛国杰等(2001)的方法。
1．2．2 Indel和的验证
根据高等人设计的1对引物，用于标记基因片段的扩增（抗病型为158bp;感病型为170bp）。引物序列分别为：
Sm-Indel-F:GATCTCATCCCGTTGTATATG ；
Sm-Indel-R:CACCCACAAACAAATCAAG。
1.2.3 抗感品种的PCR片段克隆
利用Sm-Indel-F /R引物，对抗病品种和感病品种进行PCR扩增，反应总体积为25μL，包括模板DNA 20-60 ng，Taq DNA聚合酶 0.5 U，dNTPs(each 10mmol/L) 0.5μL，10×PCR缓冲液2.5μL，5，端引物（10 µmol/L）2.5μL，3，端引物（10µmol/L ）2.5μL。PCR反应条件为： 95℃热启动之后，进行PCR扩增。循环条件为：95℃变性5 min，95℃ 30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环35次，72℃过度延伸10 min。将所有反应物混匀后，于PCR仪上扩增（MJ PTC-200）。PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。采用奥莱博有限公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物，将其进行连接、转化后，挑取阳性克隆。在Takara公司进行测序。
1.2.4抗性基因特异性引物的设计
因为感病品种存在PCR产物大小不同，所以在抗感品种间一定存在一个或几个SNP（单核苷酸多态性），根据测序结果设计等位基因特异性的引物。为了在不同材料中检测目标SNP，采用HRM方法（高分辨率熔解曲线）进行研究。
1.2.5 HRM反应体系
PCR 扩增和高分辨率熔解曲线分析在LightCycler®480Ⅱ荧光定量PCR 仪（Roche）上进行。反应总体积为20μL，包括模板DNA 20-60 ng，premix 10uL,20×Evagreen 1uL, 5，端引物（10µmol/L）0.4μL，3，端引物（10µmol/L ）0.4μL。PCR 扩增程序：95 ℃预变性10 min，然后按95 ℃变性10 min，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s 进行45 个循环。扩增产物HRM检测程序为：95 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min，65 ℃ 1 s，在65 ℃升温至95 ℃的过程中，以25次 · ℃-1的频率收集荧光信息，最后降温至40 ℃。利用LightCycler®480 的GeneScanning 软件（1.5 version）进行高分辨率熔解曲线分析。
2结果和分析
2.1材料的测序验证及引物设计
将含有抗病基因的品种J-6和含有感病基因的品种Moneymaker进行克隆，经PCR检测为阳性的克隆送到上海生工公司测序。测序结果发现抗病品种存在12个碱基的缺失，抗病基因型为158bp，感病基因型为170bp（如图1），通过美国国家生物信息中心NCBI的GeneBank对比，结果表明克隆获得的片段为番茄第9条染色体的一段序列（GenBank: EU139075.1）。
根据引物的设计原则设计引物。引物1和2为测序引物用于扩增含有INDEL的基因片段，以验证HRM方法的可靠性； 引物3至引物8设计为跨INDEL区两侧的不同引物（表1）。
表1 本研究中用到的PCR引物
2.2 HRM分型结果
利用设计的跨不同区域和位点的引物进行HRM分析。结果表明，引物3和4有扩增曲线但不能分辨抗感性。引物7和8，上机扩增后没有出现扩增子。引物3和4即Smhrm2F /R的扩增子熔解曲线在亲本和F1中的形状明显不同。因此可利用该引物区分抗病型、感病型植株和杂合基因型（图2）。
2.3特异性引物有效性的验证
利用筛选出来的特异性PCR引物对地方品种编号为1、2、340、341、213的品种进行检测。用引物1和2扩增出预期的目的条带（图3），将该PCR产物进行测序，结果表明340和341为杂合型， 213为感病型，1和2为抗病型。
将这5个样品的基因组DNA分别用Smhrm2F/2R引物进行扩增，结果抗病型、感病型和杂合型均分别出现不同的熔解曲线（如图4）。与测序区分抗感性的结果一致。
本发明利用HRM方法建立的Sm基因检测方法所具有的积极效果在于：
本发明公开的检测方法与其它的Sm分子标记检测方法不同，该方法只需要一次HRM分析就能区分出番茄对灰叶斑的抗感性，不需要测序或其它仪器，具有简单快捷的特点。
附图说明
图1 包含Indel的基因序列；注：斜体加下划线为Indel位置；下划线为保护引物；上面为Moneymaker，下面为J-6；
图2 利用引物Smhrm2F /R 进行HRM分析结果； 注：紫色为抗病基因型J-6；红色为感病基因型 Moneymaker；蓝色为杂合基因型 3110；
图3引物1和2扩增结果;M．2000DL；1．1号 ； 2. 2 号3.340 号；4.341号 ；5.213号；
图4利用引物Smhrm2F /R对地方品种HRM分析结果；注：红色为340、341； 蓝色为1和2；绿色为213；
图5罗拉F2代与moneymaker1、J-6和3110HRM分型结果；注：红色为2和moneymaker；蓝色为1和J-6；绿色为3、4和3110。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。
实施例1
一种鉴定番茄灰叶斑抗性基因的方法，其特征在于按如下的步骤进行
（1）基因组DNA提取：
（2）抗感品种的PCR片段克隆：
利用Sm-Indel-F /R引物，对抗病品种和感病品种进行PCR扩增，反应总体积为25μL，包括模板DNA 20-60 ng，Taq DNA聚合酶 0.5 U，dNTPs(each 10mmol/L) 0.5μL，10×PCR缓冲液2.5μL，5，端引物（10 µmol/L）2.5μL，3，端引物（10µmol/L ）2.5μL。PCR反应条件为： 95℃热启动之后，进行PCR扩增。循环条件为：95℃变性5 min，95℃ 30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环35次，72℃过度延伸10 min，将所有反应物混匀后，于PCR仪上扩增，PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，将其进行连接、转化后，挑取阳性克隆；所述的引物指的是：
Sm-Indel-F:GATCTCATCCCGTTGTATATG ；
Sm-Indel-R:CACCCACAAACAAATCAAG。
（3）抗性基因特异性引物的设计
因为感病品种存在PCR产物大小不同，所以在抗感品种间一定存在一个或几个SNP（单核苷酸多态性），根据测序结果设计等位基因特异性的引物；
（4） HRM反应体系
PCR 扩增和高分辨率熔解曲线分析在荧光定量PCR 仪上进行，反应总体积为20μL，包括模板DNA 20-60 ng，premix 10uL,20×Evagreen 1uL，5，端引物（10µmol/L）0.4μL，3，端引物（10µmol/L ）0.4μL，PCR 扩增程序：95 ℃预变性10 min，然后按95 ℃变性10 min，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s 进行45 个循环，扩增产物HRM 检测程序为：95 ℃ 1 min，40 ℃1 min，65 ℃ 1 s，在65 ℃升温至95 ℃的过程中，以25 次 ·-1 ℃的频率收集荧光信息，最后降温至40 ℃，利用LightCycler®480 的Gene Scanning 1.5 version 软件进行高分辨率熔解曲线分析；所述的引物指的是
Smhrm2F： GATCTCATCCCGTTGTATATGC
Smhrm2R：GCAAAGACAT GACTAAACTC T。
实施例2实际应用
1.材料：
2018年春罗拉的F2代植株共4株，以J-6、Moneymaker、3110为对照。
2.方法
2.1育苗
将番茄种子播于育苗盘中每穴2粒，常规管理，待到5片叶时进行检测。
2.2 DNA提取：采用CTAB法进行DNA提取。
2.3HRM扩增
HRM分析的引物对：
Smhrm2F:GATCTCATCCCGTTGTATATGC
Smhrm2R: GCAAAGACATGACTAAACTCT。
PCR 扩增和高分辨率熔解曲线分析在LightCycler®480Ⅱ荧光定量PCR 仪（Roche）上进行。反应总体积为20μL，包括模板DNA 20-60 ng，premix 10uL,20×Evagreen1uL, 5，端引物（10µmol/L）0.4μL，3，端引物（10µmol/L ）0.4μL。PCR 扩增程序：95 ℃预变性10 min，然后按95 ℃变性10 min，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s ，进行45 个循环。扩增产物HRM 检测程序为：95 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min，65 ℃ 1 s，在65 ℃升温至95 ℃的过程中，以25 次 · ℃-1的频率收集荧光信息，最后降温至40 ℃。利用LightCycler®480 的Gene Scanning 软件（1.5 version）进行高分辨率熔解曲线分析。
2.4 结果
用Smhrm2F/R引物对罗拉的后代进行HRM分析，结果显示F2-1与J-6分为一组为抗病型；F2-2与moneymaker分为一组为感病型； F2-3和F2-4与3110分为一组为杂合型。证明该方法能有效区分出番茄对灰叶斑的抗感性，可用于抗灰叶斑的分子标记育种，加快抗病材料和品种选育速度。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津市农业生物技术研究中心
<120> 一种鉴定番茄灰叶斑抗性基因的方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gatctcatcc cgttgtatat gc 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcaaagacat gactaaactc t 21
Claims (2)
1.一种鉴定番茄灰叶斑抗性基因的方法，其特征在于按如下的步骤进行:
（1）基因组DNA提取；
（2）抗感品种的PCR片段克隆：
利用Sm-Indel-F /R引物，对抗病品种和感病品种进行PCR扩增，反应总体积为25μL，包括模板DNA 20-60 ng，Taq DNA聚合酶 0.5 U，dNTPs(each 10mmol/L) 0.5μL，10×PCR缓冲液2.5μL，5，端引物（10 µmol/L）2.5μL，3，端引物（10µmol/L ）2.5μL；
PCR反应条件为： 95℃热启动之后，进行PCR扩增；
循环条件为：95℃变性5 min，95℃ 30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环35次，72℃过度延伸10 min，将所有反应物混匀后，于PCR仪上扩增，PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，将其进行连接、转化后，挑取阳性克隆；所述的引物指的是：
Sm-Indel-F:GATCTCATCCCGTTGTATATG ；
Sm-Indel-R:CACCCACAAACAAATCAAG；
（3）抗性基因特异性引物的设计
因为感病品种存在PCR产物大小不同，所以在抗感品种间一定存在一个或几个SNP（单核苷酸多态性），根据测序结果设计HRM特异性的引物；
（4） HRM反应体系
PCR 扩增和高分辨率熔解曲线分析在荧光定量PCR 仪上进行，反应总体积为20μL，包括模板DNA 20-60 ng，premix 10uL,20×Evagreen 1uL，5，端引物（10µmol/L）0.4μL，3，端引物（10µmol/L ）0.4μL，PCR 扩增程序：95 ℃预变性10 min，然后按95 ℃变性10 min，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s 进行45 个循环，扩增产物HRM 检测程序为：95 ℃ 1 min，40 ℃1 min，65 ℃ 1 s，在65 ℃升温至95 ℃的过程中，以25 次 ·-1 ℃的频率收集荧光信息，最后降温至40 ℃，利用LightCycler®480 的Gene Scanning 1.5 version 软件进行高分辨率熔解曲线分析；所述的引物指的是：
Smhrm2F：GATCTCATCCCGTTGTATATGC
Smhrm2R GCAAAGACAT GACTAAACTCT。
2.权利要求1所述的鉴定番茄灰叶斑抗性基因方法在加快抗病材料和品种选育速度方面的应用。
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