CN112725502A - 一种鉴定番茄颈腐基腐病抗性基因Frl检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴定番茄颈腐基腐病抗性基因Frl检测的方法。它是采用一组特异性引物对番茄颈腐基腐病抗性基因进行鉴定。该方法利用HRM开发出一种操作简单的分子标记方法来检测番茄颈腐根腐病的抗性基因。该方法不需酶切和电泳，只需利用HRM曲线就可区分出番茄颈腐根腐病抗感性。本方法可加快抗病育种进程，对推进蔬菜产业可持续发展具有重要意义。
Description
技术领域
本发明提供一种快速、简捷、高效的番茄颈腐基腐病抗性基因的方法，属植物保护领域。
背景技术
近年来随着设施番茄栽培面积的不断扩大、频繁引进国外品种及主栽品种的更换，使得番茄颈腐基腐病在一些番茄种植基地流行为害逐年偏重。目前在生产上推广的很多番茄品种都表现出对番茄颈腐基腐病（Fusarium crown and root rot，FCRR）的高度感病性，且感病后发病速度快，死苗率非常高，给农户造成严重的经济损失。因此，积极开展番茄颈腐基腐病抗性鉴定工作和抗病育种研究工作，对减少该病害具有重要意义。
番茄颈腐基腐病是一种极具为害的土传病害，由尖孢镰刀菌FORL（Fusarium oxysporum f. sp. Radicis-lycopersici）引起。番茄颈腐基腐病抗源来自于野生番茄Solanum peruvianum(PI126944、PI128650、PI126926)，现已将抗病基因转入栽培番茄中。有研究表明，番茄颈腐基腐病抗性遗传受显性单基因Frl控制，且该基因位于9号染色体的长臂上。
前人已经对番茄颈腐基腐病的抗性遗传规律及分子标记进行了一些研究。Fazio等（1999)利用RAPD技术开发了一个抗番茄颈腐根腐病的标记UBC 194。然而，Tanyolac(2010)的研究结果则表明UBC 194不能准确地标记Frl基因的存在，并且表明RAPD技术区分不出杂合型和纯合型，该技术在育种中的应用存在局限性。
Staniaszek（2014）等人以保守序列位点C2-At2的8025为基础开发了一个CAPS标记，该标记与Frl紧密连锁，同时研究表明该序列位于番茄9号染色体45cM的位置上。目前番茄的抗颈腐基腐病的育种中大多应用的是该CAPS标记。但在操作的过程中，CAPS标记需要先进行PCR扩增及电泳再进行酶切。该方法成本高，过程繁琐，难以实现高通量检测。
本研究就是在Staniaszek等人的CAPS标记基础上，利用HRM方法开发出一种操作简单的分子标记方法来检测番茄颈腐基腐病的抗性基因（Frl）。该方法不需要电泳和酶切，只需利用HRM曲线就可检测出番茄中是否存在Frl基因。本方法可加快抗病育种进程，对推进蔬菜产业可持续发展具有重要意义。
发明内容
目前在番茄颈腐根腐病的抗性基因（Frl）检测方法中，需要进行电泳和限制性内切酶酶切等步骤。针对该方法检测时间太长且过程繁琐，难以实现高通量检测等问题，发明人进行了大量的研究工作，通过基因克隆和测序确定了抗感品种中的基因差异，利用HRM方法建立了番茄颈腐基腐病的抗性基因的检测体系。此方法无电泳和酶切，操作简单是一种简单方便的番茄颈腐基腐病的抗性基因（Frl）检测的新方法。
本发明旨在提供一种简便的抗性基因检测方法，通过该方法能科学高效准确地检测出番茄颈腐基腐病的抗性基因，为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：
一种鉴定番茄颈腐基腐病抗性基因的特异性引物，特异性引物如下：
HRMC2F4: GGTACAGTATCAGTATGTCATCC
HRMC2R4：CACAAATCCTTATCTCTCTC。
本发明进一步公开了采用特异性引物进行番茄颈腐基腐病抗性基因（Frl）鉴定的方法，其特征在于按如下步骤进行：
（1）材料：待检测的番茄种子
（2）方法
1）育苗将番茄种子播于育苗盘中每穴2粒，常规管理，待到2片真叶时进行检测；
2）DNA提取：采用CTAB法进行DNA提取；
3）HRM扩增
HRM分析的引物对：
HRMC2F4:GGTACAGTATCAGTATGTCATCC SEQ ID NO:7
HRMC2R4：CACAAATCCTTATCTCTCTC SEQ ID NO:8
PCR 扩增和高分辨率熔解曲线分析在Quantstudio 3荧光定量PCR 仪上进行，反应总体积为20μL，包括模板DNA 20-60 ng，premix 10uL，20×Evagreen 1uL, 5，端引物（10µmol/L）0.4μL，3，端引物（10µmol/L ）0.4μL；
PCR 扩增程序：95℃预变性10 min，然后按95℃变性10 min，55℃退火15 s，72℃延伸10 s 进行45 个循环；
扩增产物HRM 检测程序为：95℃ 1 min，40℃ 1 min，65℃ 1 s，在65 ℃升温至95℃的过程中，以25 次·℃-1 的频率收集荧光信息，最后降温至40℃，利用HRM软件（Version3.1）进行高分辨率熔解曲线分析。
本发明更进一步公开了番茄颈腐基腐病抗性基因（Frl）鉴定方法在准确分出番茄颈腐基腐病抗感性方面的应用。实验结果显示：本发明的方法能有效检测出番茄中是否含有番茄颈腐基腐病的抗性基因（Frl），可用于番茄抗颈腐基腐病的分子标记育种，加快抗病材料和品种选育速度。
本发明主要解决了现有番茄颈腐基腐病的抗性基因（Frl）检测方法检测时间太长且过程繁琐的问题，重点考察了抗病品种和感病品种的基因序列特征，主要的难点在于针对基因序列特片设计出能够区分抗感品种的HRM引物及相应的反应体系，使番茄颈腐基腐病的抗性基因和感病基因得以明显的判断。
附图说明
图1为利用引物HRMC2F4/R4 进行HRM分析结果； 注：上面的曲线为抗病基因型2f；下面的曲线为感病基因型J601；中间的曲线为杂合基因型 328；
图2为引物C2-25F/R扩增结果；M．2000DL；1．圣迪； 2. 意佰芬3.津杂213；4.傲美；5.P-5；
图3为利用引物HRMC2F4/R4对不同品种HRM分析结果；
图4为普罗旺斯F2代与津杂213、意佰芬、2f HRM分型结果；注：上面的曲线为F2-1、F2-3和2f；下面的曲线为F2-2与津杂213；中间的曲线为 F2-4与意佰芬。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。
实施例1
主要步骤：
1.1材料
抗病纯合： 欧旺（天津朝研种苗科技有限公司）的高代自交系2f，由天津市农业生物技术研究中心保存。
感病纯合：粉宴1号（纽内姆(北京)种子有限公司）的高代自交系J601, 由天津市农业生物技术研究中心保存。
杂合型：328（ 2f×J601获得的F1代）。
市售商品种：圣迪（天津朝研种苗科技有限公司）、意佰芬（北京中研益农种苗科技有限公司）和自育品种津杂213、傲美、普罗旺斯（德澳特种业有限公司）
1.2方法
1.2.1基因组DNA提取： 参考毛国杰等(2001)的方法。
1．2．2 CAPS标记的验证：根据Staniaszek等人建立的CAPS标记对感病材料和抗病材料进行扩增。引物序列分别为：
C2-25F：ATG GGC GCT GCA TGT TTC GTG
C2-25R：ACA CCT TTG TTG AAA GCC ATC CC
1.2.3 抗感品种的PCR片段克隆
利用C2-25F/R引物，对抗病品种和感病品种进行PCR扩增，反应总体积为25μL，包括模板DNA 20-60 ng，Taq DNA聚合酶 0.5 U，dNTPs(each 10mmol/L) 0.5μL，10×PCR缓冲液2.5μL，5，端引物（10 µmol/L）2.5μL，3，端引物（10µmol/L ）2.5μL。PCR反应条件为： 95℃热启动之后，进行PCR扩增。循环条件为：95℃变性5 min，95℃ 30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环35次，72℃过度延伸10 min。将所有反应物混匀后，于PCR仪上扩增（MJ PTC-200）。PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。采用奥莱博有限公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物，将其进行连接、转化后，挑取阳性克隆。在Takara公司进行测序。
1.2.4抗性基因特异性引物的设计
因为感病品种存在酶切位点，所以在抗感品种间一定存在一个或几个SNP（单核苷酸多态性），根据测序结果设计等位基因特异性的引物。为了在不同材料中检测目标SNP，采用HRM方法（高分辨率熔解曲线）进行研究。
1.2.5 HRM反应体系
PCR 扩增和高分辨率熔解曲线分析在Quantstudio 3荧光定量PCR 仪（AppliedBiosystems）上进行。反应总体积为20μL，包括模板DNA 20-60 ng，premix 10uL，20×Evagreen 1uL, 5，端引物（10µmol/L）0.4μL，3，端引物（10µmol/L ）0.4μL。PCR 扩增程序：95℃预变性10 min，然后按95℃变性10 min，55℃退火15 s，72℃延伸10 s 进行45 个循环。扩增产物HRM 检测程序为：95℃ 1 min，40℃ 1 min，65℃ 1 s，在65℃升温至95℃的过程中，以25 次·℃-1 的频率收集荧光信息，最后降温至40℃。利用HRM软件（Version3.1）进行高分辨率熔解曲线分析。
2结果和分析
2.1材料的测序验证及引物设计
将含有抗病基因的材料2f和含有感病基因的材料J601进行克隆，经PCR检测为阳性的克隆送到公司测序。测序结果发现抗病品种存在多个SNP（序列如下），通过美国国家生物信息中心NCBI的GeneBank对比，结果表明克隆获得的片段为番茄第9条染色体的一段序列（GenBank:HG975448.1）
注：小写斜体加下划线为SNP；上面为津杂J601，下面为2f
根据引物的设计原则设计引物。引物1和2以及引物3和4是以抗病序列的814位点的SNP（T/C）和823位点的SNP（G/C）为基础而设计的HRM引物，引物1和2的大小为98bp，引物3和4的大小为172bp；引物5和6是以抗病序列的942位点的SNP（A/C）为基础设计，大小为102bp；引物7和8是以抗病序列的669位点的SNP（T/A）为基础设计，大小为111bp（表1，SEQID NO:1-8）。
表1 本研究中用到的PCR引物
2.2 HRM分型结果
利用设计的跨不同区域和位点的引物进行HRM分析。结果表明，引物1和2有扩增曲线但不能分辨抗感性。引物3和4，上机扩增后没有出现扩增子。引物7和8即HRMC2F4/R4的扩增子熔解曲线在亲本和F1中的形状明显不同。因此可利用该引物区分抗病型、感病型和杂合型（图1）。
2.3特异性引物有效性的验证
利用筛选出来的特异性PCR引物对市场上购买的品种圣迪、意佰芬和自育品种津杂213、傲美以及普罗旺斯的自交5代分离物P-5（编号分别为1、2、3、4、5）进行检测。用引物C2-25F/R扩增出预期的目的条带（图2），将该PCR产物进行测序，结果表明1和2为杂合型， 3和4为感病型，5为抗病型，序列如下：
注：津杂213和傲美为t; 圣迪和意佰芬为t/a; P-5为a；
将这5个样品的基因组DNA分别用HRMC2F4/R4引物进行扩增，结果抗病型、感病型和杂合型均分别出现不同的熔解曲线（如图3），与测序区分抗感性的结果一致。
本发明利用HRM方法建立的抗番茄颈腐基腐病基因检测方法所具有的积极效果在于：
本发明公开的检测方法与其它的抗番茄颈腐基腐病基因分子标记检测方法不同，该方法只需要一次HRM分析就能区分出番茄对颈腐基腐病的抗感性，不需要测序或其它仪器，具有简单快捷的特点。
实施例2
实际应用
1.材料：2020年春普罗旺斯的F2代植株共4株，以津杂213、意佰芬、2f为对照。
2.方法
2.1育苗
将番茄种子播于育苗盘中每穴2粒，常规管理，待到5片叶时进行检测。
2.2 DNA提取：采用CTAB法进行DNA提取。
2.3HRM扩增
HRM分析的引物对：
HRMC2F4:GGTACAGTATCAGTATGTCATCC
HRMC2R4：CACAAATCCTTATCTCTCTC
PCR 扩增和高分辨率熔解曲线分析在Quantstudio 3荧光定量PCR 仪（AppliedBiosystems）上进行。反应总体积为20μL，包括模板DNA 20-60 ng，premix 10uL，20×Evagreen 1uL, 5，端引物（10µmol/L）0.4μL，3，端引物（10µmol/L ）0.4μL。PCR 扩增程序：95℃预变性10 min，然后按95℃变性10 min，55 ℃退火15 s，72℃延伸10 s 进行45 个循环。扩增产物HRM 检测程序为：95℃ 1 min，40 ℃ 1 min，65℃ 1 s，在65 ℃升温至95℃的过程中，以25 次·℃-1 的频率收集荧光信息，最后降温至40℃。利用HRM软件（Version3.1）进行高分辨率熔解曲线分析。
2.4 结果
用HRMC2F4/R4引物对普罗旺斯的F2代进行HRM分析，结果显示F2-1、F2-3与2f分为一组为抗病型； F2-2与津杂213分为一组为感病型； F2-4与意佰芬分为一组为杂合型（如图4）。证明该方法能有效区分出番茄对颈腐基腐病的抗感性，可用于抗颈腐基腐病的分子标记育种，加快抗病材料和品种选育速度。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津市农业科学院
<120> 一种鉴定番茄颈腐基腐病抗性基因Frl检测的方法
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
taactcataa ca 12
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cttaccatat gtgaagag 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctcttcacat atggtaag 18
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggtacaaata gcatgaagta c 21
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ggtacagtat cagtatgtca tcc 23
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cacaaatcct tatctctctc 20
Claims (3)
1. 一种鉴定番茄颈腐基腐病抗性基因的特异性引物：
HRMC2F4: GGTACAGTATCAGTATGTCATCC
HRMC2R4：CACAAATCCTTATCTCTCTC。
2.采用权利要求1所述的特异性引物进行番茄颈腐基腐病抗性基因Frl检测的方法，其特征在于按如下步骤进行
（1）材料：待检测的番茄
（2）方法
1）育苗将番茄种子播于育苗盘中每穴2粒，常规管理，待到2片真叶时进行检测；
2）DNA提取：采用CTAB法进行DNA提取；
3）HRM扩增
HRM分析的引物对：
HRMC2F4:GGTACAGTATCAGTATGTCATCC
HRMC2R4：CACAAATCCTTATCTCTCTC
PCR 扩增和高分辨率熔解曲线分析在Quantstudio 3荧光定量PCR 仪上进行，反应总体积为20μL，包括模板DNA 20-60 ng，premix 10uL，20×Evagreen 1uL, 5，端引物（10µmol/L）0.4μL，3，端引物（10µmol/L ）0.4μL；
PCR 扩增程序：95 ℃预变性10 min，然后按95 ℃变性10 min，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s 进行45 个循环；
扩增产物HRM 检测程序为：95 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min，65 ℃ 1 s，在65 ℃升温至95℃的过程中，以25 次·℃-1 的频率收集荧光信息，最后降温至40 ℃，利用HRM软件（Version3.1）进行高分辨率熔解曲线分析。
3.权利要求2所述番茄颈腐基腐病抗性基因Frl检测方法在准确区分出番茄颈腐基腐病抗感性方面的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110100363.2A CN112725502A (zh) | 2021-03-09 | 2021-03-09 | 一种鉴定番茄颈腐基腐病抗性基因Frl检测的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110100363.2A CN112725502A (zh) | 2021-03-09 | 2021-03-09 | 一种鉴定番茄颈腐基腐病抗性基因Frl检测的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112725502A true CN112725502A (zh) | 2021-04-30 |
Family
ID=75593982
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| CN202110100363.2A Pending CN112725502A (zh) | 2021-03-09 | 2021-03-09 | 一种鉴定番茄颈腐基腐病抗性基因Frl检测的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112725502A (zh) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109536592A (zh) * | 2019-01-03 | 2019-03-29 | 天津市农业生物技术研究中心 | 一种鉴定番茄灰叶斑抗性基因的方法 |
-
2021
- 2021-03-09 CN CN202110100363.2A patent/CN112725502A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109536592A (zh) * | 2019-01-03 | 2019-03-29 | 天津市农业生物技术研究中心 | 一种鉴定番茄灰叶斑抗性基因的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| MIROSLAWA STANIASZEK ET,AL,: "Identification of a New Molecular Marker C2-25 Linked to the Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici Resistance Frl Gene in Tomato", 《CZECH JOURNAL OF GENETICS AND PLANT BREEDING》 * |
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