CN109536505A - 鬼臼毒素的核酸适配体及其应用 - Google Patents

鬼臼毒素的核酸适配体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种核酸适配体，特别涉及能与鬼臼毒素特异性结合的核酸适配体以及利用该核酸适配体制作成的电化学生物传感器。本发明所述的鬼臼毒素的核酸适配体具有如SEQ ID NO.1所示的核酸序列。核酸序列的5’端具有巯基修饰基团。本发明所述的鬼臼毒素核酸适配体对底物鬼臼毒素具有特异性亲和力。本发明所述的核酸适配体组装在电极上，能够制成对鬼臼毒素响应灵敏的电化学生物传感器以及用于检测鬼臼毒素的试剂盒。本发明所述的核酸适配体具有分子量小、性质稳定、成本低廉、易于保存等优点，利用其制成的电化学生物传感器可用于定性定量检测鬼臼毒素，比传统检测方法更快速更灵敏更稳定，大大提高检测效率及成本。

Description

鬼臼毒素的核酸适配体及其应用
技术领域
本发明涉及一种核酸适配体，特别涉及能与鬼臼毒素特异性结合的核酸适配体以及利用该核酸适配体制作成的电化学生物传感器。
背景技术
鬼臼毒素(Podophyllotoxin,PPT)，化学名称为5R-5,8,8a,9-四氢-9-羟-5-(3,4,5-三甲氧苯基)呋喃(3',4':6,7)萘并-[2,3-d]-1,3-间二氧杂环烯-6(5aH)-酮，分子式是C22H22O8，分子量大小是414.41Da。其熔点在114～118℃(泡沸)之间，其水合物熔点是114～118℃。干燥后其熔点是183.3～184.0℃，旋光度是-132.7°(氯仿)。23℃水中溶解度为120 mg/L，溶于乙醇、氯仿、丙酮、冰醋酸，热溶于苯。
鬼臼毒素是从小蘖科鬼臼属植物——华鬼臼(又称鸡苔素)的根和茎中提取到的木脂类抗肿瘤成份。为白色结晶性粉末，无嗅，有吸湿性。从华鬼臼中提取到的鬼臼毒素可以制成膏剂和酊剂。鬼臼毒素能有效抑制疱疹病毒，抑制细胞中期的有丝分裂，用于毒性性病。
鬼臼毒素针对尖锐湿疣、多发性浅表性上皮瘤病(如多发性浅表性或浸润性基底细胞上皮瘤，鳞状细胞上皮瘤和基底鳞状细胞上皮瘤)，前上皮瘤性角化病，脂溢性角化、日光性角化和射线角化病，幼年喉头乳头瘤、疣(寻常疣、丝状疣)有一定疗效。
鬼臼毒素因其具有良好的药用价值，逐渐成为了研究的热点，以其为主要成分的药物也越来越多。目前检测鬼臼毒素的手段不多，主要有高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱法(LC)、反相高效液相色谱(reveresed-phase HPLC)、色谱联用技术LC/MS)、酶联免疫法(ELISA)等。这些方法检出限低、精密度高，但操作复杂、检测成本高且不够快速，故开发一种简便的、价格低廉的、快速的检测手段定性定量检测药物或其他物质中的鬼臼毒素成为了一种紧急的需求。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种鬼臼毒素的核酸适配体，该核酸适配体对底物鬼臼毒素具有特异性亲和力，经等温滴定微量热实验表明，该核酸适配体可与鬼臼毒素进行特异性的结合。。
本发明所述的鬼臼毒素的核酸适配体具有如SEQ ID NO.1所示的核酸序列。SEQID NO.1：
5’-GGTGGGCACGTGCCTTCCCCGCCGGTCTCGTGCCCTTCGCTAGG-3’。
根据本发明所述的鬼臼毒素的核酸适配体的进一步特征，所述核酸序列的5’端具有巯基修饰基团。
优选的序列为：
5’-SHGGTGGGCACGTGCCTTCCCCGCCGGTCTCGTGCCCTTCGCTAGG-3’。
本发明的第二个目的在于提供一种电化学生物传感器，它能实现对鬼臼毒素的高灵敏度、高选择性的快速检测。
本发明所述的电化学生物传感器包括根据本发明所述的鬼臼毒素适配体。
根据本发明所述的电化学生物传感器的进一步特征，所述鬼臼毒素的核酸适配体偶联于丝网印刷电极表面。
本发明的第三个目的在于提供一种用于检测鬼臼毒素的试剂盒。
本发明所述的用于检测鬼臼毒素的试剂盒包括如本发明所述的电化学生物传感器。
本发明的第四个目的在于提供一种鬼臼毒素核酸适配体电化学生物传感器的制备方法。
本发明所述的鬼臼毒素核酸适配体电化学生物传感器的制备方法包括以下步骤：将本发明所述的核酸适配体上修饰巯基基团以共价键偶联固定在丝网印刷金电极表面构建成鬼臼毒素核酸适配体电化学生物传感器。
根据本发明所述的制备方法的进一步特征，所述核酸适配体在进行偶联前，将装有适配体的离心管，加入保存液，充分震荡后在冰箱中保存备用；使用前加入组装液稀释成所需要的浓度，然后在电磁炉上加热，再退火；和/或所有丝网印刷电极在偶联前，用超纯水冲洗干净，晾干后浸入浓硫酸中，用CV对电极表面进行扫描，清洗和活化电极表面；再把清洗好的丝网印刷电极置于电解液中进行CV和DPV扫描分析；扫描后的电极用超纯水冲洗干净备用。
根据本发明所述的制备方法的进一步特征，所述偶联具体为：晾干后在丝网印刷金电极表面滴加适配体溶液，放置密闭的容器中组装，得到鬼臼毒素核酸适配体电化学生物传感器。
本发明是利用计算机模拟手段预测并结合等温滴定微量热的检测，筛选出与鬼臼毒素具有亲和力的核酸适配体。
本发明优选的等温滴定体系(缓冲液浓度及DMSO用量)与pH选择为：选择0.1mol/L的磷酸氢二钠-柠檬酸(Na2HPO4—C6H8O7)为缓冲液，并在缓冲液系统加入1％的DMSO帮助鬼臼毒素溶解；为了保持核酸的负电性，因此选择pH 5.5作为ITC滴定的pH值。
本发明优选的等温滴定的主要参数选择：滴定针数选定为20针，第一针为0.4μl，释放时间为0.8s，这一针的积分不计入总的曲线拟合中。每一针的间隔时间设定为120s，同时RPM转速选择为700。
本发明所述的电化学生物传感器可用于检测药品、食品及其原料中的鬼臼毒素的含量。
本发明所述的适配体电化学生物传感器是以本发明所述的适配体为分子识别元件来检测鬼臼毒素的，其原理是：在鬼臼毒素存在的情况下，本发明所述的适配体与鬼臼毒素特异性结合，引起所述适配体空间构象发生变化，进一步影响电解液中铁氰化钾与电极界面的电子转移速率，即阻抗发生变化。通过建立鬼臼毒素浓度的对数与△Ip之间的线性关系，就可以达到检测鬼臼毒素的作用。
本发明的有益效果是：本发明基于适配体与鬼臼毒素的特异性识别作用，采用DPV为电化学检测技术，建立了一种电化学适配体电化学生物传感器检测鬼臼毒素的方法，为鬼臼毒素的检测提供了一种新的方法和途径。
与目前的鬼臼毒素检测方法相比较，本发明具有如下优点：
(1)该传感器的制备是基于适配体与鬼臼毒素的特异性识别作用所构建的，相比蛋白质而言，适配体具有亲和力高，特异性强，稳定性好，易于修饰，生产成本低，靶分子范围广，长时间暴露不易变性，对周围环境要求不高等特点。
(2)采用金电极为工作电极，利用Au-N键的作用实现了对适配体的一步修饰，大大简化了适配体的修饰过程。
(3)适配体电化学传生物感器制备过程试剂用量极少，检测仪器为电化学工作站，与传统的检测手段相比，该方法具有特异性强，简便灵活，分析速度快，检测成本低廉等优点。
附图说明
图1为滴定液200μmol/L的ssDNA滴定被滴定液10μmol/L的PPT的程序。
图2为不同浓度梯度的PPT溶液滴加到组装好的丝网印刷电极进行DPV扫描的结果。
图3为不同毒素标准液低价到组装好的丝网印刷电极后的峰电流变化条状分析图。图中，AFB1为黄曲霉毒素B1，ZEN为玉米赤霉烯酮，DON为呕吐毒素，VerA为杂色曲霉素A，PPT为鬼臼毒素，分别制成1ng/ml标准溶液，滴加到组装后的适配体传感器在电解液(5.0mmol/l K3[Fe(CN)6],5.0mmol/l K4[Fe(CN)6],进行CV检测。记录不同毒素标准液所对应的峰电流值(Ip)，以0.1ng/ml浓度的毒素名称为横坐标，不同毒素对应的峰电流变化值(△Ip，即Ipo代表适配体与各种毒素作用前的峰电流值Ip,Ipi代表第i个毒素与适配体作用后的峰电流值(Ip)，△Ip＝Ipo-Ipi)作为纵坐标，建立条状分析图。
具体实施方式
本文中所采用的术语，除非另有说明，均为本领域技术人员所通常理解的含义。以下提供在本发明中使用的一些特殊术语的定义。
“ssDNA”表示单链核酸链的缩写，此处特质鬼臼毒素单链核酸适配体。
“PPT”表示鬼臼毒素的缩写。
实施例一：鬼臼毒素核酸适配体的制备
化学合成如下所示的核酸适配体，该核酸适配体具有如SEQ ID NO.1所示的核酸序列。
SEQ ID NO.1：
5’-GGTGGGCACGTGCCTTCCCCGCCGGTCTCGTGCCCTTCGCTAGG-3’。
在该核酸适配体的核酸序列的5’端加上巯基修饰基团。序列为：
5’-SHGGTGGGCACGTGCCTTCCCCGCCGGTCTCGTGCCCTTCGCTAGG-3’。
由此得到本发明所述的鬼臼毒素核酸适配体，用于以下的实施例。
实施例二：鬼臼毒素与核酸适配体的滴定
200μmol/L鬼臼毒素核酸适配体为滴定液滴定被滴定液10μmol/L的PPT。具体操作程序如图1所示：
(1)使用300μl的超纯水清洗参比池与样品池8次，之后连接syringe并插入样品池中，开启清洗程序。
(2)将导管与syringe连接后，使用执行清洗与干燥程序。
(3)使用超纯水清洗干燥后的syringe，避免里面还有残留的甲醇干扰。
(4)在样品cell与syringe中分别吸入300μl超纯水与60μl超纯水，执行water-water实验即水滴水实验确定仪器情况。
(5)设定样品cell浓度与syringe浓度执行滴定液100μmol/L的ssDNA滴定空白缓冲液100mmol/L NaH2PO4—C6H8O7，1％DMSO的程序。
(6)设定样品cell浓度与syringe浓度后执行滴定液200μmol/L的ssDNA滴定被滴定液10μmol/L的PPT的程序。
(7)利用配套的基于Origin 7.0的MicroCal Analysis Launcher软件导出与分析数据。
实施例三：鬼臼毒素核酸适配体电化学传感器的构建
首先，制作鬼臼毒素核酸适配体丝网印刷电极。
(1)适配体预处理：将装有适配体的离心管离心一分钟，然后再轻轻打开管盖，加入保存液，充分震荡5-10分钟，在-20℃冰箱中保存备用。使用前加入组装液稀释成所需要的浓度，然后在电磁炉上加热至95℃左右，保持5分钟，再于室温下缓慢退火，退火后适配体生成发夹结构。
所采用的保存液为0.3％硝酸溶液；所采用的组装液为1mol/L NaCl。
(2)丝网印刷电极预处理：丝网印刷电极在偶联前，用超纯水冲洗干净，晾干后浸入0.5M浓硫酸中，用CV(-0.3-1.3V,0.1V/s)对电极表面进行扫描15圈，清洗和活化电极表面。再把清洗好的丝网印刷电极置于在5mmol/l K3[Fe(CN)6]，含100mmol/L KCl的电解液中进行CV和DPV扫描分析。
(3)电极修饰：扫描后的电极用超纯水冲洗干净，晾干后在丝网印刷金电极表面滴加7μL，5μM适配体溶液，放置密闭的容器中于4℃下组装20小时，得到鬼臼毒素核酸适配体传感器。组装完成后用超纯水冲洗干净，并滴加7μL超纯水在丝网印刷金电极表面浸泡以除去未结合但吸附在金电极表面的适配体，然后在上述电解液中进行CV和DPV扫描。
所采用的电解液B为5.0mmol/l K3[Fe(CN)6],含100mmol/l KCl。
实施例四：丝网印刷传感器检测鬼臼毒素的可行性分析
检测丝网印刷电极对缓冲液和鬼臼毒素的吸附作用
(1)将1ng/ml PPT溶液(含1％DMSO)滴加到未修饰的丝网印刷金电极中，室温孵育35min，在0.3％硝酸电解液中进行CV和DPV扫描，分析孵化前后峰值电流的变化，考察裸金对鬼臼毒素是否存在吸附作用。
(2)将1％DMSO水溶液和1ng/ml PPT溶液(含1％DMSO)分别滴加在构建好的传感器上，室温孵育35min，在电解液中进行CV和DPV扫描，分析孵育前后峰值电流的变化。以确定1％DMSO水溶液和1ng/ml PPT溶液(含1％DMSO)溶液分别对适配体传感器信号的影响，考察鬼臼毒素适配体传感器检测鬼臼毒素的可行性。
实施例五：适配体传感器对PPT标准品的检测及其标准曲线的绘制
(1)把丝网印刷电极用超纯水冲洗干净后晾干，在0.5mol/L的硫酸溶液进行CV扫描(设置参数：-0.3-1.3V，0.1V/s)15圈清洗活化金表面，用超纯水冲洗干净后在电解液A中进行CV、DPV扫描。
(2)然后滴加7μL，5μmol/L适配体在丝网印刷金电极表面，放置4℃的冰箱中组装20小时。组装后的适配体传感器在电解液(5.0mmol/l K3[Fe(CN)6],5.0mmol/l K4[Fe(CN)6],含100mmol/l KCl)中进行CV、DPV扫描。
(3)冲洗干净晾干后依次滴加0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL PPT标准溶液在室温中孵育35min，然后滴加超纯水浸泡5min除去静电吸附的离子。在上述电解液中进行CV、DPV扫描，如图2所示。
(4)记录不同浓度PPT标准液所对应的峰电流值(Ip)，以PPT浓度的对数为横坐标，不同浓度PPT对应的峰电流变化值(△Ip,即Ipo代表适配体与PPT作用前的峰电流值Ip,Ipi代表第i个浓度的PPT与适配体作用后的峰电流值(Ip)，△Ip＝Ipo-Ipi)作为纵坐标，建立标准曲线。
实施例六：抗干扰实验
为进一步评价基于核酸适配体的电化学传感器在各种干扰物存在下是否对PPT具有较好的选择性，以及考察同时存在多种不同干扰物的条件下，信号间是否存在叠加效应。
(1)选取鬼臼毒素(PPT)、黄曲霉毒素B1(AFB1)、杂色曲霉素A(VA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)以及呕吐毒素(DON)，分别制成1ng/ml标准溶液，滴加到组装后的适配体传感器在电解液(5.0mmol/l K3[Fe(CN)6],5.0mmol/lK4[Fe(CN)6],进行CV检测。
(2)记录不同毒素标准液所对应的峰电流值(Ip)，以0.1ng/ml浓度的毒素名称为横坐标，不同毒素对应的峰电流变化值(△Ip,即Ipo代表适配体与各种毒素作用前的峰电流值Ip,Ipi代表第i个毒素与适配体作用后的峰电流值(Ip)，△Ip＝Ipo-Ipi)作为纵坐标，建立条状分析图，如图3所示。
从图3结果表明，该传感器具有良好的抗干扰效果。
SEQUENCE LISTING
<110> 暨南大学
<120> 鬼臼毒素的核酸适配体及其应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ggtgggcacg tgccttcccc gccggtctcg tgcccttcgc tagg 44

Claims (8)

1.一种鬼臼毒素的核酸适配体，其特征在于：具有如SEQ ID NO.1所示的核酸序列。
2.根据权利要求1所述的鬼臼毒素的核酸适配体，其特征在于：所述核酸序列的5’端具有巯基修饰基团。
3.一种电化学生物传感器，其特征在于：所述电化学生物传感器包括如权利要求1至2之一所述的鬼臼毒素的核酸适配体。
4.根据权利要求3所述的电化学生物传感器，其特征在于：所述鬼臼毒素的核酸适配体偶联于丝网印刷电极表面。
5.一种用于检测鬼臼毒素的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括如权利要求3或4所述的电化学生物传感器。
6.一种鬼臼毒素核酸适配体电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1所述的核酸适配体上修饰巯基基团以共价键偶联固定在丝网印刷金电极表面构建成鬼臼毒素核酸适配体电化学生物传感器。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述核酸适配体在进行偶联前，将装有适配体的离心管，加入保存液，充分震荡后在冰箱中保存备用；使用前加入组装液稀释成所需要的浓度，然后在电磁炉上加热，再退火；和/或
所有丝网印刷电极在偶联前，用超纯水冲洗干净，晾干后浸入浓硫酸中，用CV对电极表面进行扫描，清洗和活化电极表面；再把清洗好的丝网印刷电极置于电解液中进行CV和DPV扫描分析；扫描后的电极用超纯水冲洗干净备用。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述偶联具体为：晾干后在丝网印刷金电极表面滴加适配体溶液，放置密闭的容器中组装，得到鬼臼毒素核酸适配体电化学生物传感器。
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