CN101573446A

CN101573446A - 针对中期因子的适体及其应用

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Publication number: CN101573446A
Application number: CNA2007800424280A
Authority: CN
Inventors: 宫川伸; 藤原将寿; 中村义一; 松井隆; 佐久间贞俊
Original assignee: Ribomic Inc
Current assignee: Ribomic Inc
Priority date: 2006-11-14
Filing date: 2007-11-14
Publication date: 2009-11-04
Anticipated expiration: 2027-11-14
Also published as: KR101516024B1; WO2008059877A1; RU2460794C2; CY1113679T1; PT2096167E; TW200831668A; CA2669523C; SI2096167T1; NO20092280L; HK1135729A1; CO6190535A2; IL198705A; IL198705A0; CA2669523A1; EP2096167A4; HRP20130012T1; EP2096167A1; JPWO2008059877A1; JP5190573B2; BRPI0718913A2

Abstract

本发明意欲提供针对中期因子的高质量适体。具有针对中期因子的抑制活性的适体；复合物，其包括具有针对中期因子的结合活性或抑制活性的适体和功能物质(诸如亲和性物质、标记物质、酶、药物递送介质或药物)；药物，细胞迁移抑制剂，诊断剂和标记试剂，其包括具有针对中期因子的结合活性或抑制活性的适体，或包含所述适体和官能物质的复合体；等等。

Description

针对中期因子的适体及其应用

[技术领域]

[0001]

本发明涉及一种针对中期因子的适体，使用其的方法等。

[发明背景]

[0002]

中期因子(以下在需要时简写为“MK”)是一种生长/分化因子，其最初发现为肺性肿瘤细胞(embyonic tumor cells，EC)在用视黄酸诱导的分化过程中瞬时表达的基因产物，所述基因产物是一种分子量为13kDa的多肽，富含碱性氨基酸和半胱氨酸(参见，例如，非专利文献1和非专利文献2)。

[0003]

已经通过NMR确定了MK的空间结构，并进行了报道(参见，例如，非专利文献3)。当进行结构表征时，MK主要构型为两个结构域。具体地，MK由下列各项组成：在N端一侧由氨基酸残基1-52组成的片段(以下称为“N端片段”)，在C端一侧由氨基酸残基62-121组成的片段(以下称为“C端片段”)，和连接所述片段的环区(氨基酸残基53-61)。与每个结构域的外侧结合的是富含碱性氨基酸的尾。在MK分子中，N端片段和C端片段每一个都具有主要由下列各项组成的空间结构：3个反向β折叠结构(以下称为“结构域”；在N端片段中由氨基酸残基15-52组成的结构域称为“N-结构域”，在C端片段中由氨基酸残基62-104组成的结构域称为“C-结构域”)，和没有采取特定结构的自由移动结构(以下称为“尾”；在N端片段中由氨基酸残基1-14组成的尾称为“N-尾”，和在C端片段中由氨基酸残基105-121组成的尾称为“C-尾”)。

[0004]

已知的MK受体包括受体型蛋白酪氨酸磷酸酶ζ(PTPζ)，LRP(低密度脂蛋白受体-相关蛋白)，ALK(退行发育白血病激酶)，整联蛋白和黏结蛋白聚糖等。MK是一种包含大量碱性氨基酸赖氨酸(K)和精氨酸(R)的高度带正电荷的蛋白。它在其C-结构域中具有肝素-结合位点，并且已知与带负电荷分子如肝素和硫酸软骨素E强结合。作为诱变分析和NMR分析的结果，认为由K79，R81，和K102构成的簇I和由K86，K87，和R89构成的簇II对于与肝素结合是重要的。同时，可获得仅簇I对于与硫酸软骨素E结合是重要的的报道。当簇I的R81用A替代时，针对肝素的结合活性下降。结果，针对PTPζ结合活性的减少以及MK-诱导的神经突延长和神经细胞运动受到抑制。

[0005]

一些生长因子，如成纤维细胞生长因子(bFGF)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)具有肝素-结合位点。认为这些生长因子与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖即一种细胞外基质结合，停留在适当的位置，并且在需要时释放。还已知这些生长因子结合在神经细胞和血管内皮细胞中表达的硫酸乙酰肝素，从而有助于神经突延长和纤维蛋白溶解活性提高。当将培养皿用MK包被，并且在其上接种小鼠胚胎神经细胞时，神经突延长。在这种情形中，用类肝素酶消化所述神经细胞抑制神经突延长。同时，当培养血管内皮细胞并且加入MK时，细胞的纤溶酶原激活物活性升高。在这种情形中，用类肝素酶消化所述细胞同样抑制纤溶酶原活性的升高。

[0006]

认为MK在两个位点与PTPζ结合。一个位点包括与硫酸软骨素的高亲和力结合(Kd＝0.58nM)。当用软骨素酶消化时该结合消失。另一个位点包括与蛋白的结合，是一种在用软骨素酶消化后保留的低亲和力结合(Kd＝3nM)。MK促进表达PTPζ的胎儿神经细胞的迁移；用软骨素酶ABC处理所述神经细胞抑制了这种迁移。成骨细胞样UMR106细胞表达PTPζ，并且已知为具有用软骨素酶ABC处理而被抑制的MK-依赖性迁移。用软骨素酶ABC、软骨素酶B或肝素酶处理还抑制巨噬细胞的MK-依赖性迁移。因为不认为巨噬细胞表达PTPζ，所以认为涉及另一种受体。

[0007]

带负电荷的任何物质均不与MK的肝素-结合位点结合。当MK通过氨基偶联被固定并且进行表面等离子体共振分析时，得到的结果表明，硫酸软骨素E和肝素与MK强结合，而硫酸软骨素A，B，C，和D不与MK结合。

[0008]

已知MK具有宽范围的生物活性。例如，已知在人癌症细胞中，MK表达增加。已经在宽泛种类的癌症中观察到这种增加的表达，包括食道癌、甲状腺癌、尿路膀胱癌、结肠直肠癌、胃癌、胰腺癌、胸部癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、成神经细胞瘤、成神经细胞瘤、成胶质细胞瘤、子宫癌、卵巢癌、和维尔姆斯瘤(参见，例如，专利文献1和非专利文献4)。还认为MK促进癌细胞的存活和运动，并且促进新血管形成，从而辅助癌症的发展。

[0009]

还已知MK是在炎症发展过程中起重要作用的分子之一。例如，已知在缺少MK基因的敲除小鼠中，在血管损伤后新生内膜的形成和局部缺血损伤中肾炎的发作被减轻。还已知在风湿病模型中，在MK敲除小鼠中手术后粘连也被极大减轻(参见，例如，专利文献2，专利文献3和专利文献4)。因此，已知MK参与炎性疾病如关节炎、自体免疫疾病、风湿性关节炎(类风湿性关节炎(RA)、骨关节炎(OA))、多发性硬化病、手术后粘连、炎性大肠炎、银屑病、狼疮、哮喘、和嗜中性粒细胞功能异常。此外，已知MK促进炎细胞如巨噬细胞和嗜中性粒细胞的运动(迁移)。因为这种运动是炎症发展所必需的，所以认为当缺乏中期因子时，不可能发生基于炎症的疾病(参见，例如，专利文献5)。

[0010]

由于在患有晚期子宫内膜异位的女性的腹膜液中MK水平升高，并且还由于MK刺激培养的子宫内膜间质细胞的增殖，所以已知MK参与子宫内膜异位的发作和发展(参见，例如，专利文献6)。

[0011]

此外，由于表现出血管内膜增厚作用，已知MK参与血管阻塞疾病，如在血管再建外科手术后的再狭窄、心脏冠状动脉血管阻塞病、脑血管阻塞病、肾血管阻塞病、外周血管阻塞病、动脉硬化、和脑梗死(参见，例如，专利文献2)。

[0012]

已知细胞迁移对于癌细胞浸润/转移、动脉硬化病灶的内膜增厚、新血管形成等的机制很重要。还已知炎性细胞迁移与心血管病如心绞痛、心肌梗死、脑梗死、脑出血和高血压紧密相关。

[0013]

多营养因子(PTN或HB-GAM)是唯一的MK家族蛋白，与MK约有50％的同源性。MK和PTN都是包含大量半胱氨酸和碱性残基的蛋白。在MK和PTN中，所有10个半胱氨酸残基都是保守的，并且在结构上，二者均可以分成N-结构域和C-结构域。作为NMR分析的结果，已知这两种分子具有非常相似的三维结构。每个结构域由通过柔性连接体区连接的3个β折叠组成。在这两种蛋白之间，K79，R81，和K102是保守的，认为所述K79，R81，和K102对于与硫酸软骨素和肝素的结合很重要。K79和R81存在于同一个β折叠上，而K102存在于另一个β折叠上。当MK和PTN形成空间结构时，这些碱性残基出现在蛋白表面附近。

[0014]

近年来，RNA适体对治疗药物、诊断试剂、和检测试剂的应用已经引起了注意；一些RNA适体已经进入临床阶段或实践阶段。在2004年12月，世界上首个RNA适体药物，Macugen，在美国被核准作为年龄相关的黄斑变性的治疗药物。RNA适体是指特异性与靶物质如蛋白结合的RNA，并且可以使用SELEX(通过指数富集的配体系统发展(SystematicEvolution of Ligands by Exponential Enrichment))方法(非专利文献5，6)制备。SELEX方法是这样的一种方法，即，通过该方法，从具有不同核苷酸序列的约10¹⁴RNA集合体中选择特异性结合靶物质的RNA。所用的RNA具有这样的结构，其中约40个残基的随机序列被夹在引物序列之间。允许所述RNA集合体与靶物质缔合，并且使用滤器等，仅回收已经与靶物质结合的RNA。回收的RNA通过RT-PCR扩增，并且这被用作下一轮的模板。通过重复该操作约10次，有时可以获得特异性结合靶物质的RNA适体。

[专利文献1]JP-A-6-172218

[专利文献2]WO2000/10608

[专利文献3]WO2004/078210

[专利文献4]WO2004/085642

[专利文献5]WO1999/03493

[专利文献6]WO2006/016571

[非专利文献1]Kadomatsu，K.等，生物化学和生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)，151：第1312-1318页

[非专利文献2]Tomokura，M.等，：生物化学杂志(J.Biol.Chem)，265：第10765-10770页

[非专利文献3]Iwasaki，W.等，(1997)胚胎学杂志(EMBO J.)16，第6936-6946页

[非专利文献4]Muramatsu，T.，(2002)生化杂志(J.Biochem.)132，第359-371页

[非专利文献5]Ellington等，(1990)自然(Nature)，346，818-822

[非专利文献6]Tuerk等，(1990)科学(Science)，249，505-510

[发明内容]

[发明解决的问题]

[0015]

本发明涉及提供针对中期因子的适体，和使用其的方法等。

[解决问题的方式]

[0016]

本发明人勤勉研究以解决上述问题，并且，结果，成功制备了良好质量的针对中期因子的适体，这导致了本发明的完成。

[0017]

因此，本发明提供下述：

[1]具有针对中期因子的抑制活性的适体，

[2][1]的适体，其中所述适体不具有针对多营养因子的抑制活性，

[3][1]的适体，其具有针对中期因子N端片段的结合活性，

[4][1]的适体，其具有针对中期因子C端片段的结合活性，

[5][2]的适体，其具有针对中期因子N端片段的结合活性，

[6][2]的适体，其具有针对中期因子C端片段的结合活性，

[7]通过抑制中期因子和PTPζ的结合而表现出针对中期因子的抑制活性的适体，

[8][1]的适体，其是下述(a)或(b)：

(a)包括选自SEQ ID NO：1-70的核苷酸序列(条件是尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)的适体，其中包含在所述适体中的核苷酸是这样的，以致

(i)嘧啶核苷酸的2’-位置，不管是相同的还是不同的，是氟原子或被选自由氢原子、羟基和甲氧基组成的组的原子或基团取代；和

(ii)嘌呤核苷酸的2’-位置，不管是相同的还是不同的，是羟基或被选自由氢原子、甲氧基和氟原子组成的组的原子或基团取代；

(b)包括选自SEQ ID NO：1-70的核苷酸序列(条件是尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)的适体，其中一个或数个核苷酸被取代、删除、插入或添加，其中包含在所述适体中的核苷酸是这样的，以致

(ii)嘌呤核苷酸的2’-位置，不管是相同的还是不同的，是羟基或被选自由氢原子、甲氧基和氟原子组成的组的原子或基团取代，

[9][1]-[8]中任一项的适体，其中包含在所述适体中的核苷酸被修饰，

[10]包括[1]-[9]中任一项的适体和功能物质的复合体，

[11][10]的复合体，其中所述功能物质是亲和性物质、用于标记的物质、酶、药物递送赋形剂或药物，

[12]药物，其包括[1]-[9]中任一项的适体或者[10]或[11]的复合体，

[13]细胞迁移抑制剂，其包括[1]-[9]中任一项的适体或者[10]或[11]的复合体，

[14]诊断试剂，其包括[1]-[9]中任一项的适体或者[10]或[11]的复合体，

[15]标记试剂，其包括[1]-[9]中任一项的适体或者[10]或[11]的复合体，和

[16]检测[1]-[9]中任一项的适体或者[10]或[11]的复合体的方法。

[发明效果]

[0018]

本发明的适体或复合体可以有效用作多种疾病的药物或试剂如诊断试剂，所述多种疾病如自体免疫疾病、癌症、手术后粘连、和子宫内膜异位。本发明的适体或复合体还可以有效用于纯化和浓缩MK，以及检测和定量MK。

[附图简述]

[0019]

图1A显示通过MFOLD程序预测的SEQ ID NO：1所示RNA的两种二级结构中的一种。

图1B显示通过MFOLD程序预测的SEQ ID NO：1所示RNA的另一种二级结构。

图2A显示通过MFOLD程序预测的SEQ ID NO：2所示RNA的两种二级结构中的一种，其中包在正方形中的部分表示共有区。

图2B显示通过MFOLD程序预测的SEQ ID NO：2所示RNA的另一种二级结构，其中包在正方形中的部分表示共有区。

图3A显示通过MFOLD程序预测的SEQ ID NO：3所示RNA的两种二级结构中的一种。

图3B显示通过MFOLD程序预测的SEQ ID NO：3所示RNA的另一种二级结构，其中包在正方形中的部分表示共有区。

图4显示通过MFOLD程序预测的SEQ ID NO：4所示RNA的二级结构，其中包在正方形中的部分表示共有区。

图5显示通过MFOLD程序预测的SEQ ID NO：5所示RNA的二级结构。

图6显示在SEQ ID NO：5所示RNA和中期因子之间、以及在所述RNA和人IgG1之间的相互作用(使用BIAcore 2000获得的传感图)。

图7显示在SEQ ID NO：4所示RNA和中期因子之间的相互作用(使用BIAcore 2000获得的传感图)。

图8显示通过MFOLD程序预测的SEQ ID NO：20所示RNA的二级结构。

图9显示通过MFOLD程序预测的SEQ ID NO：61所示RNA的二级结构。

[实施发明的最佳方式]

[0020]

本发明提供具有针对中期因子(MK)的结合活性的适体。本发明的适体能够抑制MK的活性。

[0021]

适体是指针对特定的靶分子具有结合亲和性的核酸分子。适体还可以通过与特定的靶分子结合而抑制特定靶分子的活性。本发明的适体可以是RNA，DNA，修饰的核酸或它们的混合物。本发明的适体还可以采取线性或环形的形式。

[0022]

针对MK的抑制活性意指对MK的任何生物活性的抑制。关于MK生物活性的实例，可以提及下列各项：细胞(例如，巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、血管平滑肌细胞、肿瘤细胞、成骨细胞、神经细胞以及它们的祖细胞)的迁移活性(Takada等，1997，生化杂志(J.Biochem.)122，453-458，Horiba等，2000，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)105，489-495，Maeda等，1999，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)274，12474-12479，Qi等，2001，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)276，15868-15875)，对细胞(例如，肿瘤细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、神经细胞、软骨细胞以及它们的祖细胞)的增殖和分化促进活性(Muramatsu和Muramatsu，1991，生物化学和生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun).177，652-658，Muramatsu等，1993，发育生物学(Dev.Biol.)159，392-402，Takei等，2001，癌症研究(Cancer Res.)61，8486-8491)，针对调节T细胞的增殖和功能的抑制活性，神经细胞神经突的延长促进活性，针对细胞(例如，肿瘤细胞、神经细胞)的程序性细胞死亡的抑制活性，针对细胞(例如，肿瘤细胞)的新生血管诱导活性，针对成肌细胞的突触形成诱导活性，针对血管内皮细胞的纤维蛋白溶解系统促进活性，针对血管平滑肌细胞的IL-8产生促进活性，等。因此，作为针对MK的抑制活性的实例，可以提及针对这些活性的抑制活性。

[0023]

本发明的适体可以具有针对来源于任何哺乳动物的MK的抑制活性。作为所述哺乳动物的实例，可以提及灵长类动物(例如，人、猴子)、啮齿类动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠)、以及伴侣动物、家畜和劳作动物(例如，狗、猫、马、牛、山羊、绵羊、猪)。

[0024]

本发明的适体没有特别的限制，只要它们能够与任意选择的MK部分结合，从而抑制其活性；例如，通过与MK的N端片段或C端片段结合，本发明的适体能够抑制MK的活性。人MK的氨基酸序列由GenBank登记号BC011704所示，该分泌蛋白由从赖氨酸23到天冬氨酸143的121个氨基酸残基构成(configured)。通常，赖氨酸残基23表示为在位置1的氨基酸残基。人MK由下列各项组成：由氨基酸残基1-52组成的N端片段，由氨基酸残基62-121组成的C端片段，和连接所述片段的环区，但是所述N端片段和所述C端片段的界限可以是MK的任何环部分(53-61)，并不能精确定义。

[0025]

对本发明适体的长度没有限制，并且通常可以是约15-约200个核苷酸，并且可以是，例如，不多于约100个核苷酸，优选不多于约80个核苷酸，更优选不多于约60个核苷酸，最优选不多于约45个核苷酸。例如，本发明适体的长度可以不少于约18，20或25个核苷酸。如果核苷酸总数较小，化学合成和大量生产将更容易，并且在成本上存在主要优点。还认为容易进行化学修饰，主体稳定性高，并且毒性低。

[0026]

包含在本发明的适体中的每一个核苷酸，不管是相同的还是不同的，可以是在核糖(例如，嘧啶核苷酸的核糖)的2’位置包括羟基的核苷酸(即，未取代的核苷酸)或是在核糖的2’位置羟基被任意选择的原子或基团取代的核苷酸。作为这样任意选择的原子或基团的实例，可以提及用氢原子、氟原子或-O-烷基基团(例如，-O-Me基团)、-O-酰基基团(例如，-O-CHO基团)，或氨基基团(例如，-NH₂基团)取代的核苷酸。本发明的适体也可以是这样一种，即，其中至少一种类型的(例如，1，2，3或4种类型)核苷酸在核糖的2’位置包括含有羟基或上述任意选择的原子或基团的核苷酸，例如，选自由氢原子、氟原子、羟基和-O-Me基团组成的组的至少两种(例如2，3或4种)基团。在本发明的适体中，所有的核苷酸均可以是这样的核苷酸，其在核糖的2’位置包含羟基、或上述任意选择的原子或基团，例如，选自由氢原子、氟原子、羟基和-O-Me基团组成的组的基团。

[0027]

本发明适体的一个实例可以具有包括选自由下列各项组成的组的一个或多个区域的潜在的二级结构：单链区(例如，gggagaggaac)，第一干区(例如，gacg及其互补链)，内环区(例如，aggagua和gg)，第二干区(例如，gcc及其互补链)，和内环区(例如，ggaaagaa)。本发明适体的另一个实例可以具有包括选自由下列各项组成的组的一个或多个区域的潜在的二级结构：单链区(例如，gggaaggaggaa)，第一干区(例如，gugcac及其互补链)，内环区(例如，ag和gg)，第二干区(例如，gg及其互补链)，和内环区(例如，guuggug)。

[0028]

当用于本文时，“潜在的二级结构”是指在生理条件下能够稳定存在的二级结构；例如，使用在实施例中描述的结构预测程序可以确定潜在的二级结构是否存在。干区是指其中在两个或多个连续核苷酸中通过碱基配对(例如，G-C，A-U，A-T)形成双链的部分。内环部分是指在两个不同的干区之间形成的非干区。发夹环区是指由一个干区形成的部分结构，是在与适体链5’末端和3’末端相对一侧上形成的环区。单链区是指多核苷酸链的末端部分，是与上述干区、内环区或发夹环区不相对应的区域。

[0029]

本发明的适体还可以具有结合MK的N端片段和/或C端片段的能力。SEQ ID NO：39所示的适体及其改变的形式，如肝素和硫酸软骨素E，表现出针对C端片段的高结合活性。认为肝素结合于簇I和簇II区的C端片段。认为硫酸软骨素E结合于簇I区的C端片段。已知MK与PTPζ相互作用，其包括硫酸软骨素作为其组成分子。PTPζ表达在胎儿神经细胞和成骨细胞样细胞中，并且在MK存在下，促进这些细胞的迁移。在本发明中，提供能够结合所述C端片段从而抑制细胞迁移的适体，和主要结合所述N端片段从而抑制细胞迁移的适体。

[0030]

本发明的适体还能够抑制MK的活性(例如，MK的细胞迁移活性)，并且可以具有不能抑制PTN活性的特征(例如，PTN的细胞迁移活性)。PTN是具有50％同源性的唯一的MK家族蛋白，它们具有非常相似的三维结构，并且对于与硫酸软骨素和肝素结合重要的氨基酸残基是保守的。

[0031]

本发明的适体还可以是下列各项：(a)包括选自SEQ ID NO：1-70中的一个的核苷酸序列(但是尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)的适体，(b)包括选自SEQ ID NO：1-70中的一个的核苷酸序列(但是尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)的适体，其中一个或多个核苷酸被取代、删除、插入或添加，或(c)缀合物，其选自由多个上述(a)单位的缀合物、多个上述(b)单位的缀合物、和多个上述(a)和(b)单位的缀合物组成的组。在上述(b)中，被取代、删除、插入或添加的核苷酸数目没有特别限制，只要是几个，并且核苷酸的数目可以是，例如，不多于约30个，优选不多于约20个，更优选不多于约10个，更优选不多于5个，最优选为4，3，2或1个即可。在上述(c)中，缀合物可以通过串联结合获得。在缀合过程中，可以使用连接体。关于连接体，可以提及核苷酸链(例如，1-约20个核苷酸)和非-核苷酸链(例如，-(CH₂)n-连接体，-(CH₂CH₂O)n-连接体，六甘醇连接体，TEG连接体，包含肽的连接体，包含-S-S-键的连接体，包含-CONH-键的连接体，包含-OPO₃-键的连接体)。对在上述多个缀合物中提及的多个没有特别限制，只要它是两个或多个，并且多个可以是，例如，2、3、或4个。在上述(a)-(c)中的每个核苷酸，不管是相同的还是不同的，可以是在核糖的2’位置包括羟基的核苷酸，或是在核糖(例如，嘧啶核苷酸的核糖)的2’位置用任意选择的基团(例如，氢原子，氟原子或-O-Me基团)取代的羟基的核苷酸。

[0032]

在一个特别的方面，本发明的适体根据它们的结构粗分成3种类型。第一种适体是由SEQ ID NO：61所示核苷酸序列或其突变体组成的适体。由SEQ ID NO：61所示核苷酸序列组成的适体，当通过MFOLD程序预测其二级结构时，具有图9所示的潜在的二级结构，其由单链区、第一干区、内环区、第二干区、和发夹环区构成。在这种适体中，在所述单链区、第一干区、内环区、第二干区、和发夹环区中，取代、删除、插入和/或添加几个核苷酸是可接受的。例如，在这种适体中，在单链区插入几个核苷酸，在第一干区插入几个核苷酸，和向3’末端单链区(例如，SEQ ID NO：5)添加几个核苷酸是可接受的。这样的适体结合MK的N端片段比结合C端片段更强。

[0033]

第二种适体是由SEQ ID NO：20所示核苷酸序列或其突变体组成的适体。由SEQ ID NO：20所示核苷酸序列组成的适体，当通过MFOLD程序预测其二级结构时，具有图8所示的潜在的二级结构，其由单链区、第一干区、内环区、第二干区、和发夹环区构成。在这种适体中，在所述单链区、第一干区、内环区、第二干区、和发夹环区中，取代、删除、插入和/或添加几个核苷酸是可接受的。例如，在这种适体中，在单链区、第一干区和/或3’末端(例如，SEQ ID NO：4)添加几个核苷酸是可接受的。这样的适体对于MK的N端片段几乎没有表现出亲和性，并且与C端片段强结合。

[0034]

第三种适体可以是由SEQ ID NO：1所示核苷酸序列或其突变体组成的适体。

[0035]

本发明的适体可以是这样一种适体，即，其中每个核苷酸的糖(例如，核糖)残基已被修饰，从而增加MK的结合活性、稳定性、药物递送能力等。作为在糖残基中被修饰的位点的实例，可以提及这样一种位点，即，在糖残基2’-位置，3’-位置和/或4’-位置的氧原子被另一种原子取代，等等。作为修饰的实例，可以提及氟化作用、O-烷基化(例如，O-甲基化，O-乙基化)，O-芳基化，S-烷基化(例如，S-甲基化，S-乙基化)，S-芳基化，和胺化(例如，-NH₂)。在糖残基中的这种改变可以通过本身已知的方法进行(参见，例如，Sproat等，(1991)核酸研究(Nucle.Acid.Res.)19，733-738；Cotton等，(1991)核酸研究(Nucle.Acid.Res.)19，2629-2635；Hobbs等，(1973)生物化学(Biochemistry)12，5138-5145)。

[0036]

本发明的适体还可以改变(例如，化学取代)核酸碱基(例如，嘌呤或嘧啶)以增加MK的结合活性等。作为所述改变的实例，可以提及5-位置嘧啶改变、6-和/或8-位置嘌呤改变、用环外胺改变、用4-硫代尿苷取代、和用5-溴或5-碘-尿嘧啶取代。可以改变包含在本发明的适体中的磷酸基团，从而赋予针对核酸酶和水解的抗性。例如，P(O)O基团可以用P(O)S(硫代(thioate))，P(S)S(二硫代(dithioate))，P(O)NR₂(酰胺化)，P(O)R，R(O)OR’，CO或CH₂(formacetal)或3’-胺(-NH-CH₂-CH₂-)取代[其中每个R或R’单位独立地是H，或是取代的或未取代的烷基(例如，甲基，乙基)]。

连接基团是，例如，-O-，-N-或-S-，并且核苷酸可以通过这些连接基团与相邻的核苷酸结合。

所述改变还可以包括如在3’和5’加帽的改变。

改变还可以通过在末端添加下列各项而进行：聚乙二醇、氨基酸、肽、倒位的(inverted)dT、核酸、核苷、肉豆蔻酰基、Lithocolic-油基、二十二烷基、月桂酰、硬脂酰、棕榈酰、油酰、亚油酰(linoleoyl)、其它脂质、类固醇、胆固醇、咖啡因、维生素、色素、荧光性物质、抗癌药、毒素、酶、放射性物质、生物素等。对于这样的改变，参见，例如，美国专利5,660,985和5,756,703。

[0037]

可以通过本文公开的内容和本领域本身已知的方法化学合成本发明的适体。适体以宽泛种类的结合方式与靶物质结合，诸如基于磷酸基团负电荷的离子键、基于核糖的疏水键和氢键、基于核酸碱基的氢键和堆积键(stacking bond)。特别地，基于磷酸基团负电荷的离子键较强，并且与在蛋白正电荷表面上存在的赖氨酸和精氨酸结合，所述磷酸基团以与组成核苷酸的数目相同的数目存在。由于这种原因，不参与与靶物质直接结合的核酸碱基可以被取代。特别地，因为干结构区已经形成碱基对，并且朝向双螺旋结构的内侧，所以核酸碱基不可能直接与靶物质结合。因此，甚至当用另一种碱基对取代碱基对时，适体的活性通常不降低。在其中不形成碱基对的结构中，诸如环结构中，假如所述核酸碱基不参与与靶分子直接结合，则碱基取代是可能的。关于核糖2’-位置的修饰，在核糖2’-位置的官能团很少与靶分子直接相互作用，但是在许多情形中，它是不相关的，并且可以被另一种修饰的分子取代。因此，除非参与与靶分子直接结合的官能团被取代或删除，适体通常保留其活性。整体空间结构没有相当大的改变也是重要的。

[0038]

适体可以利用SELEX方法或其改进形式(例如，Ellington等，(1990)自然(Nature)，346，818-822；Tuerk等，(1990)科学(Science)，249，505-510)制备。在SELEX方法中，通过增加轮数或使用竞争物质，浓缩并且选择表现出针对靶物质更强的结合力的适体。因此，通过调整SELEX的轮数，和/或改变竞争性条件，在一些情形中可以获得具有不同结合力的适体、具有不同结合模式的适体、和具有相同结合力和结合模式但具有不同碱基序列的适体。SELEX方法包括通过PCR扩增的过程；通过在该过程中使用锰离子等引入突变，以更高多样性进行SELEX是可能的。

[0039]

通过SELEX获得的适体是表现出针对靶物质的高亲和性的核酸，并且这并不意味着其与所述靶物质活性位点的结合。因此，通过SELEX获得的适体不是总是在靶物质的功能上起作用。MK在其每个N末端和C末端的尾区具有富含赖氨酸的区域，认为核酸非特异性地与该区结合。认为该尾部分在肝素或硫酸软骨素的结合中是不重要的。在这样的环境中制备有效抑制MK活性的适体并不容易。事实上，在本发明中，检验了23种适体的细胞迁移抑制活性，并且仅有4种适体保留不小于50％的活性。

[0040]

通过进行最优化的SELEX，可以使得这样选择的具有活性的适体具有甚至更高的性能。最优化的SELEX是指这样的方法，即，在所述方法中，在制备部分改变具有特定固定序列的适体以包括随机序列的模板或掺杂约10-30％随机序列的模板后，再次进行SELEX。

[0041]

通过SELEX获得的适体具有约80个核苷酸的长度，并且这难以将其原样作为药物制备。因此，重复尝试-和-差错性尝试(try-and-error efforts)以将适体缩短为长度约为50个核苷酸或更少从而能够使化学合成变容易，是必要的。

取决于针对通过SELEX获得的适体的引物设计，随后的最小限度操作容易性改变。除非成功设计引物，否则随后的发展将是不可能的，即使是通过SELEX选择了具有活性的适体。

[0042]

适体可容易改变，原因在于它们允许化学合成。对于适体，通过使用MFOLD程序预测二级结构，或通过X-射线分析或NMR分析预测空间结构，可以在某种程度上预测哪种核苷酸可以被取代或删除，并且在何处插入新的核苷酸。具有预测的新序列的适体可以容易地进行化学合成，并且使用现有的测定系统可以确定所述适体是否保留活性。

[0043]

如果通过上述重复的尝试-和-差错性尝试鉴定了对所获得的适体与靶物质结合是重要的区域，则在许多情形中，甚至在向所述序列的两端添加新序列时，活性将保持不变。对新序列的长度没有特别限制。

[0044]

修饰，如序列，提供宽范围的设计或变化。

[0045]

如上文阐述，适体允许宽范围的设计或变化。本发明还提供适体的产生方法，其能够进行包括指定序列(例如，与选自干区、内环区、发夹环区和单链区的部分相对应的序列；以下，在需要时简称为固定序列)的适体的宽范围的设计或变化。

[0046]

例如，所述适体的产生方法包括通过使用单种类型的核酸分子或多种类型的核酸分子(例如，具有不同数目的“a”或“b”的核酸分子文库)产生包括固定序列的适体，所述核酸分子由下式所示的核苷酸序列组成：

[0047]

[0048]

[其中(N)a表示由“a”个N单位组成的核苷酸链；(N)b表示由“b”个N单位组成的核苷酸链；每个N单位，不管是相同的还是不同的，是选自由A，G，C，U和T(优选地，A，G，C和U)组成的组的核苷酸。“a”和“b”的每个，不管是相同的还是不同的，可以是任意选择的数目，并且可以是，例如，1-约100，优选为1-约50，更优选为1-约30，更优选为1-约20或1-约10]，并且引物对分别对应于引物序列(i)和(ii)。

[0049]

本发明还提供包括本发明的适体和与其结合的功能物质的复合体。在本发明的复合体中，在所述适体和所述功能物质之间的键可以是共价键或非共价键。本发明的复合体可以是这样一种，即，其中本发明的适体和一种或多种(例如，2或3个)相同类型或不同类型的功能物质结合在一起。对所述功能物质没有特别限制，只要它新赋予本发明的适体某种功能，或能够改变(例如，提高)本发明的适体可以具有的某种特征。作为功能物质的实例，可以提及蛋白、肽、氨基酸、脂质、糖、单糖、多核苷酸和核苷酸。作为功能物质的实例，可以提及下列各项：亲和性物质(例如，生物素，链霉抗生物素，具有针对靶互补序列的亲和性的多核苷酸，抗体，谷胱甘肽琼脂糖，组氨酸)，标记物质(例如，荧光物质，发光物质，放射性同位素)，酶(例如，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶)，药物递送赋形剂(例如，脂质体，微球体，肽，聚乙二醇)，药物(例如，在弹道导弹(missile)治疗中使用的那些，如刺孢霉素(calicheamycin)和duocarmycin；氮芥类似物如环磷酰胺，美法仑，异环磷酰胺或曲磷胺；氮丙啶如塞替派；亚硝基脲如卡莫司汀；reast剂如替莫唑胺或达卡巴嗪；叶酸样代谢拮抗剂如甲氨蝶呤或雷替曲塞；嘌呤类似物如硫鸟嘌呤，克拉屈滨或氟达拉滨；嘧啶类似物如氟尿嘧啶，替加氟或吉西他滨；长春花生物碱如长春碱，长春新碱或长春瑞滨以及它们的类似物；鬼臼毒素衍生物如依托泊苷，紫衫烷，多西他赛或紫杉醇；蒽环霉素如多柔比星，表柔比星，伊达比星和米托蒽醌以及它们的类似物；其它细胞毒性抗生素如博来霉素和丝裂霉素；铂化合物如顺铂，卡铂和奥沙利铂；喷司他丁，米替福新，雌莫司汀，托泊替康，伊立替康和比卡鲁胺)，和毒素(例如，蓖麻毒毒素，liatoxin和细菌外毒素(Verotoxin))。在一些情形中，最终去除这些功能分子。此外，所述分子可以是能够被酶识别和裂解的肽，所述酶如凝血酶、基质金属蛋白酶(MMP)，和因子X，可以被核酸酶或限制性核酸内切酶裂解的多核苷酸。

[0050]

本发明的适体或复合体可以用作，例如，药物或试剂(例如，诊断试剂，检测试剂(包括实验试剂))。例如，本发明的适体或复合体可以用作细胞迁移的抑制剂，调节T细胞增殖的促进剂，调节T细胞抑制功能的促进剂，程序性细胞死亡抑制性抑制剂，细胞增殖抑制剂，细胞分化抑制剂，药物递送剂，用于体内成像的探针，测量MK的血液浓度的探针，用于组织染色的探针，用于ELISA的探针，和用于MK分离和纯化的配体。

[0051]

本发明的适体或复合体还可以用于预防或治疗多种疾病，如自体免疫疾病(例如，多发性硬化病，系统性红斑狼疮(SLE)，斯耶格伦病，多肌炎(PM)，皮肌炎(DM)，风湿性关节炎(类风湿性关节炎(RA)，骨关节炎(OA))，炎性肠炎(局限性回肠炎等)，进行性系统性硬化病(PSS)，结节性动脉外膜炎(PN)，甲状腺病(巴塞多病等)，急性热病性多神经炎，原发性胆汁性肝硬变(PBC)，先天性血小板减少性紫癜，自体免疫性溶血性贫血症，重症肌无力(MG)，肌萎缩性侧索硬化病(ALS)，I型糖尿病，银屑病，哮喘，嗜中性粒细胞功能异常)，癌症(例如，食道癌，甲状腺癌，尿路膀胱癌，结肠直肠癌，胃癌，胰腺癌，胸部癌，肝癌，肺癌，乳腺癌，成神经细胞瘤，neuroglastoma，成胶质细胞瘤，子宫癌，卵巢癌，维尔姆斯瘤，前列腺癌(prostatic cancer))，手术后粘连，子宫内膜异位，移植中的排斥，过敏症，血管重建外科手术后的再狭窄，心脏冠状动脉血管阻塞病，脑血管阻塞病，肾血管阻塞病，外周血管阻塞病，动脉硬化，和脑梗死。特别地，本发明的适体抑制MK的细胞迁移活性，并且因此有效用于预防或治疗多发性硬化病、手术后粘连、子宫内膜异位、类风湿性关节炎和血管狭窄。

[0052]

本发明的药物可以是与药用载体配制在一起的药物。作为药用载体的实例，可以提及下列各项：赋形剂如蔗糖，淀粉，甘露糖醇，山梨醇，乳糖，葡萄糖，纤维素，滑石，磷酸钙，和碳酸钙；粘合剂如纤维素，甲基纤维素，羟丙基纤维素，聚丙基吡咯烷酮，明胶，阿拉伯树胶，聚乙二醇，蔗糖，和淀粉；崩解剂如淀粉，羧甲基纤维素，羟基丙基淀粉，乙二醇钠-淀粉(sodium-glycol-starch)，碳酸氢钠，磷酸钙，和柠檬酸钙；润滑剂如硬脂酸镁，二氧化硅气凝胶，滑石，和十二烷基硫酸钠；调味剂如柠檬酸，薄荷醇，甘草甜素-铵盐，甘氨酸，和橙味粉剂；防腐剂如苯甲酸钠，亚硫酸氢钠，对羟基苯甲酸甲酯，和对羟基苯甲酸丙酯；稳定剂如柠檬酸，柠檬酸钠，和乙酸；混悬剂如甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，和硬脂酸铝；分散剂如表面活性剂；稀释剂如水，生理盐水，和橙汁；基底蜡如可可脂，聚乙二醇，和煤油；等等，但是这些不是限制性的。

[0053]

适合口服施用的制剂是通过将有效量的配体溶解在稀释剂如水、生理盐水、或橙汁中而制备的液体制剂；包括采用固体或颗粒形式的有效量的配体的胶囊、囊剂或片剂；通过将有效量的活性成分混悬在适当的分散剂中而制备的混悬液；通过在适当的分散剂中分散并且乳化有效量活性成分的溶液而制备的乳状液，等等。

[0054]

当需要时，出于掩饰味道、肠溶解、缓释等目的，本发明的药物可以通过本身已知的方法进行包被。作为用于包被的包衣剂的实例，可以使用下列各项：羟丙基甲基纤维素，乙基纤维素，羟甲基纤维素，羟丙基纤维素，聚氧乙烯二醇，吐温80，Pluronic F68，醋酸邻苯二甲酸纤维素，羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯，羟甲基纤维素乙酸琥珀酸酯，Eudragit(由Rohm，德国供应，甲基丙烯酸/丙烯酸共聚物)，色素(例如，红色氧化铁，二氧化钛等)等。所述药物可以是快速释放的制剂或缓释的制剂。作为缓释的基质物质的实例，可以提及脂质体、atherocollagen、明胶、羟磷灰石、PLGA等。

[0055]

作为适于肠胃外施用(例如，静脉内施用、皮下施用、肌内施用、局部施用、腹膜内施用、鼻内施用、肺部施用等)的制剂，可用水性和非水性等渗无菌注射液，其可以包括抗氧化剂、缓冲液、细菌抑制剂、等渗剂等。也可以提及水性和非水性无菌混悬液，其可以包括混悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、防腐剂等。制剂可以以单位剂量体积或以数个分开的剂量包含在容器中，如安瓿或小瓶中。活性成分和药用载体也可以是冻干的，并且以这样的状态保存，即，在使用前，其立即可以溶解或混悬在适当的无菌赋形剂中。此外，除了注射液之外，吸入剂和油膏也是可以的。在吸入剂的情形中，将处于冻干状态的活性成分微粉化，并且使用适当的吸入装置通过吸入而施用。当需要时，吸入剂可以适当地用常规所用的表面活性剂、油、调料、环糊精或它们的衍生物等配制。

此处，作为表面活性剂的实例，可以提及下列各项：油酸，磷脂酰胆碱，二甘醇二油酸酯，油酸四氢糠酯(tetrahydrofiufuryl oleate)，油酸乙酯，肉豆蔻酸异丙酯，三油酸甘油酯，单月桂酸甘油酯，甘油单油酸酯，甘油单硬脂酸酯，甘油基monolysinoate，鲸蜡醇，硬脂醇，聚乙二醇400，氯化十六烷基吡啶，失水山梨糖醇三油酸酯(商标名司盘85)，失水山梨糖醇单油酸酯(商标名司盘80)，失水山梨糖醇单月桂酸酯(商标名司盘20)，聚氧乙烯硬化蓖麻油(商标名HCO-60)，聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单月桂酸酯(商标名吐温20)，聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单油酸酯(商标名吐温80)，天然来源的磷脂酰胆碱(商标名EPICLON)，油基聚氧乙烯(2)醚(商标名Brij 92)，硬脂酰聚氧乙烯(2)醚(商标名Brij 72)，十二烷基聚氧乙烯(4)醚(商标名Brij 30)，油基聚氧乙烯(2)醚(商标名Genapol 0-020)，氧乙烯和氧丙烯嵌段共聚物(商标名Synperonic)等等。作为油的实例，可以提及玉米油、橄榄油、棉籽油、葵花子油等。在油膏的情形中，将适当的药用基质(黄色矿脂，白色矿脂，石蜡，液体石腊和聚乙烯的复合软膏基质(plastibase)，硅氧烷，白色油膏，蜂蜡，猪油，植物油，亲水性油膏，亲水性矿脂，纯化的羊毛脂，水解羊毛脂，吸水性油膏，亲水性液体石腊和聚乙烯的复合软膏基质，聚二乙醇油膏等)与活性成分掺合，并且用作制剂。

[0056]

吸入剂可以按照常规方法生产。具体地，吸入剂可以这样生产：通过将上述本发明的适体或复合体粉末化或液化，将其掺加到吸入推进剂和/或载体中，并且将其填充在适当的吸入容器中。当上述本发明适体或复合体是粉末时，可以使用普通的机械粉末吸入器；在液体的情形中，可以使用诸如喷雾器的吸入器。此处，作为推进剂，可以广泛使用常规已知的一种推进剂；可以提及下列各项：含氯氟烃-系列化合物，如含氯氟烃-11，含氯氟烃-12，含氯氟烃-21，含氯氟烃-22，含氯氟烃-113，含氯氟烃-114，含氯氟烃-123，含氯氟烃-142c，含氯氟烃-134a，含氯氟烃-227，含氯氟烃-C318，和1，1，1，2-四氟乙烷，烃类如丙烷，异丁烷，和正丁烷，醚如二乙醚，压缩气体如气态氮和气态二氧化碳，等。

[0057]

本发明药物的剂量取决于活性成分的类型和活性、疾病的严重性、作为施用受试者的动物物种、施用的受试者对药物耐受性、体重、年龄等而变化，并且，基于每天用于成年人的活性成分量，通常的剂量可以是约0.0001-约100mg/kg，例如，约0.0001-约10mg/kg，优选约0.005-约1mg/kg。

[0058]

本发明还提供将本发明适体和/或复合体固定在其中的固相载体。作为所述固相载体的实例，可以提及基底、树脂、平板(例如，多孔平板)、滤器、药筒、柱、和多孔材料。所述基底可以是用在DNA芯片、蛋白质芯片等中的基底；例如，镍-PTFE(聚四氟乙烯)基底，玻璃基底，磷灰石基底，硅基底，氧化铝基底等，并且可以提及通过用聚合物等包被这些基底而制备的基底。作为树脂的实例，可以提及下列各项：琼脂糖颗粒，二氧化硅颗粒，丙烯酰胺和N，N’-亚甲基二丙烯酰胺的共聚物，聚苯乙烯-交联的二乙烯基苯颗粒，与表氯醇交联的葡聚糖颗粒，纤维素纤维，芳基葡聚糖和N，N’-亚甲基二丙烯酰胺的交联聚合物，单分散性合成聚合物，单分散性亲水性聚合物，琼脂糖，Toyopearl等，并且还包括通过将各种官能团结合在这些树脂上而制备的树脂。本发明的固相载体可以有效用于，例如，纯化、检测和定量MK。

[0059]

本发明的适体和/或复合体可以通过本身已知的方法固定在固相载体上。例如，可以提及这样的方法，即，所述方法向本发明的适体和/或复合体中引入亲和性物质(例如，上述那些)或预先确定的官能团，并且然后将所述适体或复合体通过所述亲和性物质或预先确定的官能团固定在固相载体上。本发明还提供这样的方法。所述预先确定的官能团可以是可以进行偶联反应的官能团；例如，可以提及氨基基团、硫醇基团、羟基、和羧基基团。本发明还提供在其中引入这样的官能团的适体。

[0060]

本发明还提供纯化和浓缩MK的方法。本发明的纯化和浓缩方法可以包括将MK吸附到本发明的固相载体上，并且用洗脱剂洗脱所吸附的MK。将MK吸附到本发明的固相载体上可以通过本身已知的方法实现。例如，将含有MK的样品(例如，细菌或细胞培养物或培养物上清，血液)引入到本发明的固相载体中或引入到包含本发明的固相载体的组合物中。MK洗脱可以使用诸如中性溶液的洗脱剂实现。对所述中性洗脱剂没有特别限制，并且可以具有例如约6-约9、优选约6.5-约8.5、且更优选约7-约8的pH。所述中性溶液还可以是这样一种溶液，例如，其包括钾盐(例如，NaCl，KCl)、镁盐(例如，MgCl₂)、表面活性剂(例如，吐温20，Triton，NP40)、或甘油。本发明的纯化和浓缩方法还可以包括在MK吸附后用洗涤溶液洗涤所述固相载体。作为洗涤溶液的实例，可以提及包含尿素、螯合剂(例如，EDTA)、Tris、酸、或碱等的那些。本发明的纯化和浓缩方法还可以包括加热所述固相载体。该步骤能使所述固相载体再生和灭菌。

[0061]

本发明还提供检测和定量MK的方法。本发明的检测和定量方法可以包括通过使用本发明的适体(例如，使用本发明的复合体和固相载体)测量MK。检测和定量MK的方法可以以与免疫学方法相同的方式进行，不同的是用本发明的适体替代抗体。因此，通过使用本发明的适体替代抗体，可以以与诸如下列各项的那些方法相同的方式进行检测和定量：酶免疫测定(EIA)(例如，直接竞争性ELISA，间接竞争性ELISA，夹心ELISA)，放射性免疫测定(RIA)，荧光免疫测定(FIA)，蛋白质印迹技术(例如，在蛋白质印迹技术中用作二抗的替代物)，免疫组织化学染色方法，和细胞分类方法。这些方法可以有效用于，例如，测量在活生物体或生物样品中的MK含量，并且诊断MK--相关的疾病。

[0062]

在本文引用的所有出版物的内容包括专利和专利申请说明书，通过参考以特意提供所有这些出版物的程度结合在本发明中。

[0063]

以下，通过下述实施例的方式更详细地描述本发明，然而，所述实施例并不限制本发明的范围。

[实施例1]

[0064]

制备特异性结合中期因子1的核酸

使用SELEX方法制备特异性结合中期因子的核酸。用对Ellington等(Ellington和Szostak，自然(Nature)346，818-822，1990)的方法和Tuerk等(Tuerk和Gold，科学(Science)249，505-510，1990)的方法的改进进行SELEX。参考Murasugi等(Murasugi和Tohma-Aiba，蛋白质表达和纯化(Protein Expression and Purification)27，244-252，2003)的方法，使用酵母制备作为靶物质的人中期因子。以下，除非另外指明，中期因子意指人中期因子。将中期因子通过氨基偶联固定在琼脂糖树脂(NHS-活化的琼脂糖，由安玛西亚生物科学(Amersham Bioscience)供应)上。所述氨基偶联按照在安玛西亚生物科学(Amersham Bioscience)说明书的指导进行。通过恰好在固定前检验所述中期因子溶液和在固定后通过SDS-PAGE立即检查上清，而验证固定的量。作为SDS-PAGE的结果，在上清中没有检测到中期因子的任何条带，这证实几乎所用的全部中期因子已被偶联。这意味着约175μg的中期因子被固定在约70μL树脂上。

通过使用DuraScribe^TM T7转录试剂盒(由Epicentre供应)转录化学合成的DNA而获得第一轮所用的RNA(40N-RNA)。通过该方法获得的RNA在嘧啶核苷酸的核糖2’-位置被氟-取代。下文所示的长度为94个核苷酸的DNA，被用作DNA模板，其在40个核苷酸的随机序列的每一端具有引物序列。所述DNA模板和引物通过化学合成制备(由Operon制备)。

[0065]

DNA模板：5’-tcctcattcctgtcctcta-40N-ttcctcttctcctctccc-3’(SEQ ID NO：71)

引物Fwd：5’-taatacgactcactatagggagaggagaagaggaa-3’(SEQ ID NO：72)

引物Rev：5’-tcctcattcctgtcctcta-3’(SEQ ID NO：73)

N表示A，G，C和T中的任一个。引物Fwd包括T7RNA聚合酶启动子序列。用在第一轮中的RNA集合体的变化理论上为10¹⁴。

[0066]

将所述RNA集合体添加到固定中期因子的树脂上，并且允许在室温下静置30分钟。30分钟后，为了去除未与中期因子结合的RNA，用溶液A洗涤树脂。此处，所述溶液A是145mM氯化钠，5.4mM氯化钾，1.8mM氯化钙，0.8mM氯化镁，和20mM Tris(pH7.6)的混合溶液。通过在95℃加热10分钟，添加洗脱剂而回收与中期因子结合的RNA。使用调整到pH6.6的7M尿素，3mM EDTA，和100mM TRIS的混合溶液作为洗脱液。通过RT-PCR扩增所回收的RNA，并且使用DuraScribe^TM T7转录试剂盒进行转录，并且将这用作下一轮的集合体。使用如第1轮采用的这种方法，进行7轮相同操作。在SELEX结束后，将PCR产物克隆到pGEM-T Easy载体(由普洛麦格(Promega)供应)中，并且用其转化大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株DH5α(由Toyobo供应)。在从单个菌落提取质粒后，使用DNA测序仪(ABI PRISM 3100，由ABI供应)确定48个克隆的碱基序列。

在进行SELEX 7轮后，检验序列；序列表现出趋同性。存在20个拷贝的SEQ ID NO：1所示的序列，并且存在1个拷贝的2-碱基取代形式。存在2个拷贝的SEQ ID NO：2所示的序列。存在1个拷贝的SEQ ID NO：3-5所示的每一种序列。使用MFOLD程序(M.Zuker，核酸研究(Nucleic AcidsRes.)31(13)，3406-3415，2003)，估测SEQ ID NO：1-5所示的RNAs的二级结构。结果，观察到与SEQ ID NO：2，3，和4所示的RNAs形态相似的内环-干-发夹环结构(图1-5)。所有发夹环都由8个核苷酸形成，与SEQID NO：4比较，2和3是1-碱基取代的形式。关于干，SEQ ID NO：2由两个碱基对构成，并且SEQ ID NO：3和4由3个碱基对构成。

[0067]

下文显示每种核苷酸序列。在每种核苷酸中的括号表示在2’-位置的修饰，并且F是氟原子(以下相同)。

SEQ ID NO：1：

gggagaggagaagaggaaau(F)agu(F)u(F)aagggu(F)gaau(F)u(F)u(F)gc(F)gaaagc(F)u(F)au(F)u(F)u(F)u(F)agu(F)c(F)gc(F)agu(F)agaggac(F)aggaau(F)gagga

SEQ ID NO：2：

gggagaggagaagaggaaggac(F)u(F)aagu(F)aagagaac(F)ac(F)c(F)ggaau(F)gaagggac(F)u(F)u(F)ac(F)gu(F)gu(F)agaggac(F)aggaau(F)gagga

SEQ ID NO：3：

gggagaggagaagaggaaagc(F)c(F)u(F)u(F)c(F)u(F)ac(F)c(F)gaaagu(F)gggaaagc(F)ac(F)ac(F)au(F)aaau(F)c(F)u(F)ggu(F)agaggac(F)aggaau(F)gaga

SEQ ID NO：4：

gggagaggagaagaggaac(F)gu(F)gc(F)u(F)c(F)u(F)gu(F)ac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggu(F)gu(F)gu(F)agaggac(F)aggaau(F)gaga

SEQ ID NO：5：

gggagaggagaagaggaagu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F)agu(F)au(F)aagau(F)agaggac(F)aggaau(F)gaga

[0068]

发夹环序列

SEQ ID NO：2-ggaaugaa-

SEQ ID NO：3-ggaaagca-

SEQ ID NO：4-ggaaagaa-

[实施例2]

[0069]

制备特异性结合中期因子2的核酸

为了制备与中期因子结合但不与多营养因子即一种中期因子家族蛋白结合的适体，进行SELEX，其包括使用多营养因子预扣除(pre-subtraction)。首先，如关于中期因子，将多营养因子通过氨基偶联固定在琼脂糖树脂上。接着，将RNA集合体添加到结合多营养因子的树脂中，并且允许在室温下静置30分钟。此后，仅回收上清。理论上，该上清不应该包含与多营养因子结合的RNA。将该上清添加到结合中期因子的树脂中，以与实施例1相同的方式进行SELEX。所用的多营养因子已经通过Murasugi等(Murasugi，Kido，Kumai，和Asami，生物科学、生物技术和生物化学(Biosci.Biotech.Biochem.)67(10)，2288-2290，2003)的方法表达在酵母中。所用的DNA模板和引物与实施例1中所用的那些相同。

在完成7轮之后，检验48个克隆的序列；在这些序列中观察到趋同性。在它们中，存在10个拷贝的与在实施例1中获得的SEQ ID NO：3相同的序列，并且存在1个拷贝的1-碱基取代形式。存在6个拷贝的与SEQID NO：2相同的序列，并且存在2个拷贝的1-碱基取代形式。此外，存在1个拷贝的与SEQ ID NO：5相同的序列。

[实施例3]

[0070]

制备特异性结合中期因子3的核酸

当通过氨基偶联固定中期因子时，取决于氨基偶联位点，可以分解重要部分。因此，使用硝基纤维素膜进行过滤结合的SELEX，其不包括与载体的固定。这意欲分离与靶蛋白结合的核酸和没有结合靶蛋白的核酸，这是基于这样的事实，即，蛋白可能与硝基纤维素膜结合，而核酸不可能结合。混合RNA集合体和中期因子，允许在室温下静置30分钟，并且然后使用硝基纤维素膜过滤该混合物。在用溶液A彻底洗涤硝基纤维素膜后，将所述硝基纤维素膜浸没在洗脱剂B中，并且在90℃加热5分钟。随后，以与实施例1相同的方式，通过乙醇沉淀回收RNA，通过RT-PCR扩增，并且转录成用于下一轮的RNA集合体。所用的DNA模板和引物与实施例1中所用的那些是相同的。洗脱剂B是50％苯酚和6M尿素的混合液体。

在完成6轮之后，检验48个克隆的序列；没有获得充分的趋同性。因此，在进行3轮以上SELEX；在完成9轮之后，检验48个克隆的序列；观察到充分的趋同性。在所述序列中，存在21个拷贝的与SEQ ID NO：2相同的序列，并且存在4个拷贝的1-碱基取代形式。存在10个拷贝的与SEQ ID NO：4相同的序列。观察到3种新序列，它们中没有一种表现出趋同性。

[实施例4]

[0071]

通过表面等离子体共振方法评估结合活性

通过表面等离子体共振方法检验SEQ ID NO：1-5所示的RNAs对中期因子的结合活性。测量使用BIAcore提供的BIAcore2000进行。所用的传感器芯片是SA芯片，在其上固定链霉抗生物素蛋白。其上结合的是约1000RU的16个核苷酸的聚dT，在其5’末端结合生物素。作为配体的RNA在其3’末端添加16个核苷酸的聚腺苷酸，并且通过dT和A之间的键合固定在SA芯片上。固定的量为约1000RU。注射70μL用作分析物的中期因子，其以0.5μM制备。用于BIAcore的运行缓冲液是溶液A。作为测量的结果，发现SEQ ID NO：1-5所示的所有RNAs都与中期因子结合(图6)。作为阴性对照，使用固定的40N-RNA进行相似测量，所述40N-RNA包括40个核苷酸的随机序列。结果，发现所述40N-RNA也具有针对中期因子的亲和性。在与由SEQ ID NO：1-5所示的RNAs的亲和性相似的水平，程度较高。因为中期因子包含大量碱性氨基酸，如赖氨酸，所以预测其与带负电荷的核酸非特异性结合。

因此，进行测量，其使用具有高盐浓度的缓冲液(溶液B)作为BIAcore的运行缓冲液，其通过将溶液A的氯化钠浓度改变为500mM制备而成。预测通过使用高盐浓度的缓冲液，可以减小离子键合的非特异性吸附。作为测量的结果，发现所述40N-RNA几乎不结合中期因子。同时，SEQ IDNO：2-5所示的RNAs以比所述40N-RNA高的程度结合中期因子(图7)。在高盐浓度结合的事实意味着所述键合可能是疏水性键合。这表明，这些RNAs可能不与赖氨酸部分非特异性结合，但是特异性识别中期因子。

接着，进行这样的实验，其中通过氨基偶联将中期因子固定在CM4传感器芯片上，并且注射作为分析物的SEQ ID NO：4或5所示RNA，由此检验RNA和中期因子的亲和性。使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，11mg/L)和N-乙基N′-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC，75mg/L)按照BIAcore说明书实现中期因子固定。中期因子用HBS-EP缓冲液(由BIAcore供应)稀释并以20μg/mL的浓度使用。为了封闭，使用1M盐酸乙醇胺(pH8.5)。将MK(1？59，MK？N，由肽研究所公司(Peptide Institute，Inc.)提供)固定在一个传感器芯片的流动单元2(flow cell)上，将MK(60？121，MK？C，由肽研究所公司(Peptide Institute，Inc.)提供)固定在流动单元3上，并且将全长中期因子(MK？NC)固定在流动单元4上。流动单元1用作对照单元。通过按照上述向一个传感器芯片上固定3种中期因子和中期因子片段，一次可以测量3种配体的亲和性。作为测量的结果，发现SEQ ID NO：4所示的RNA与全长中期因子(以下，写作MK-NC)和中期因子的C结构域(以下，写作MK-C)结合，但是不与中期因子的N结构域(以下，写作MK-N)结合(表1)。同时，SEQ ID NO：5所示的RNA与全部MK-NC，MK-N，和MK-C结合，但是对MK-N的亲和性高于对于MK-C的亲和性。

[0072]

[表1]

中期因子和各种分析物的亲和性

通过表面等离子体共振方法测量。将中期因子固定在CM4传感器芯片上，并且注射不同的分析物。亲和性高低顺序为+++，++，+和-。

[0073]

使用下列各项替代RNA作为分析物进行相似的实验：肝素(肝素，钠盐，猪肠黏膜，低分子量，Mw：5000，由Calbiochem供应)，硫酸软骨素E(来自乌贼(Squid)软骨，由Seikagaku公司供应)，硫酸软骨素C(来自鲨鱼软骨，Mw：40,000-80,000，由Seikagaku公司供应)，或tRNA(由西格玛(Sigma)供应)。结果，发现所有这些分析物对MK-N具有低亲和性，并且主要与MK-C结合(表1)。

从上述发现，SEQ ID NO：4所示的RNA，如肝素等，与中期因子的C结构域结合。同时，发现SEQ ID NO：5所示的RNA对C结构域具有低亲和性，并且与N结构域更强结合。这表明SEQ ID NO：4和5所显示的RNAs结合中期因子的不同位点。已知中期因子在其C结构域具有作为肝素-结合位点的活性位点(Muramatsu H等，生物化学和生物物理学研究通讯(Biochem Biophys Res Commun.)1994年9月15日；203(2)：1131-9.，106.；Iwasaki W等，胚胎学杂志(EMBO J.)1997年12月1日；16(23)：6936-46.)。

[0074]

如上述，通过表面等离子体共振方法确定SEQ ID NO：5所示的RNA是否具有针对中期因子家族蛋白多营养因子的结合活性。将所述RNA固定在SA传感器芯片上，并且注射0.5μM多营养因子。为了减少非特异性吸附，向所述多营养因子溶液中加入0.4mg/mL tRNA。作为测量的结果，发现SEQ ID NO：5所显示的RNA具有针对多营养因子的结合活性，但是程度低于针对中期因子的结合活性。使用40N-RNA作为配体，进行相似的测量。中期因子和多营养因子均与40N-RNA结合，但是程度低于与由SEQ ID NO：5所示的RNA结合的程度。所述40N-RNA针对中期因子表现出比针对多营养因子更高的亲和性。从上述发现，多营养因子，如同中期因子，具有结合核酸的倾向性。还发现由SEQ ID NO：5所示的RNA针对中期因子具有比针对多营养因子更高的亲和性。

[0075]

其次，确定SEQ ID NO：4和5所示的RNAs是否具有针对其它蛋白质的亲和性。使用人IgG1(由Calbiochem供应)和人白蛋白(由西格玛(Sigma)供应)作为所述蛋白质。如上述，使用SA传感器芯片固定每种RNA，并且注射作为分析物的每种蛋白质。结果，人IgG1和人白蛋白完全不与SEQ ID NO：4和5所示的任何RNA结合。从上述发现，SEQ ID NO：4和5所示的RNAs不与人白蛋白和人IgG结合，所述人白蛋白和人IgG大量存在于血液中。

[0076]

测量了SEQ ID NO：2-7，31，32，36，40，40-1和40-2所示的RNAs与MK的结合活性。如上文所述，将MK固定在CM4传感器芯片上，而进行所述测量。结果，发现所有这些RNAs具有针对MK的亲和性。

[实施例5]

[0077]

通过细胞迁移抑制实验评估RNA适体

已知中期因子具有成骨细胞祖细胞浸润作用(Qi等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)276(19)，15868-15875，2001)。因此，使用大鼠成骨细胞祖细胞细胞系(ATCC No.CRL1661)的UMR106细胞，检验所制备的RNA适体是否抑制中期因子的细胞迁移活性。将30μL的1.5μM中期因子应用到Chemotaxicell膜(膜孔直径8μm，由Kurabo供应)的外表面，从而将中期因子固定在膜的外表面。将固定中期因子的Chemotaxicell置于24-孔培养平板中，其包含500μL培养基(补充了0.3％牛血清白蛋白，Dulbecco改良的Eagle培养基)，向其中以100nM补充加入每种RNA适体。将200μLUMR106细胞以1×10⁶个细胞/mL的密度置于Chemotaxicell室的内层，并且在37℃培养4小时。去除保留在Chemotaxicell室内层的细胞，并且用甲醇固定已经浸润并且黏附到应用中期因子的表面上的细胞。将所述Chemotaxicell室浸没在1％结晶紫水溶液中达30分钟以染色细胞。在用蒸馏水洗涤所述Chemotaxicell室并且干燥后，用200μL 1％SDS和1％tritonX100的混合溶液提取色素。将150μL提取物转移到96-孔微量培养板上，并且在590nm处确定其吸光度。

作为测量的结果，发现SEQ ID NO：1，2，4，和5所示的RNAs具有显著的细胞迁移抑制活性。结果显示在表2中。SEQ ID NO：5所示的适体表现出最高的抑制活性，对于14次测量的平均值是76％。用作阴性对照的40N-RNA几乎不表现出抑制活性。

[0078]

[表2]

制备的适体针对中期因子和多营养因子的细胞迁移抑制活性

RNA浓度：100nM

此处，抑制活性％是通过从被视为100的不加入所述适体运动的细胞数目(染色的细胞提取物的吸光度)减去加入所述适体运动的细胞数目而获得的值。在该表中，每个％值是所示测量次数的平均值。

[0079]

接着，测量SEQ ID NO：4和5所示的适体是否具有针对多营养因子的细胞迁移抑制活性。按上述进行实验，不同的是使用多营养因子替代中期因子。作为该实验的结果，发现这些适体不表现出针对多营养因子的显著抑制活性(表2)。

[0080]

其次，测量肝素，硫酸软骨素E，硫酸软骨素C是否抑制中期因子和多营养因子的细胞迁移活性。按上述进行实验，不同的是用肝素、硫酸软骨素E或硫酸软骨素C替代所述适体。所用的肝素供应是由NacalaiTesque制备的产品。所用的硫酸软骨素E和C的供应与在实施例4中所用的那些相同。肝素和硫酸软骨素E的浓度是0.1，1，10，和100μg/mL。作为该实验的结果，0.1μg/mL的肝素抑制中期因子和多营养因子的细胞迁移活性。1μg/mL浓度的肝素抑制中期因子和多营养因子的不小于80％的细胞迁移活性。同时，硫酸软骨素E在10μg/mL的浓度抑制中期因子达49％，和抑制多营养因子达69％。假设硫酸软骨素C的分子量是40,000，实验以500nM(20μg/mL)进行。结果，当将SEQ ID NO：4所示的适体(500nM)的抑制活性视为100时，硫酸软骨素C的抑制活性是44。

[0081]

从上述发现，SEQ ID NO：1，2，4，和5所示的适体特异性结合中期因子，从而抑制其细胞迁移活性。40N-RNA以静电作用非特异性吸附中期因子，但是不抑制细胞迁移活性。这表明通过SELEX获得的RNAs不有助于非特异性吸附，而是与和细胞迁移活性相关的重要位点结合。肝素和硫酸软骨素E在中期因子和多营养因子之间无区分性地同等抑制细胞迁移活性。同时，SEQ ID NO：4和5所示的适体仅抑制中期因子活性。由于中期因子和多营养因子具有50％的同源性，并且还由于肝素-结合位点高度保守，所以所述适体的高特异性是可以理解的。

[实施例6]

[0082]

SEQ ID NO：4所示的适体的小型化和稳定化

SEQ ID NO：4所示的适体是77个核苷酸长，在其嘧啶核苷酸的核糖2’位置被氟-取代。为了能够进行化学合成，为了减少毒性，并且为了提高在血液中的稳定性，进行该适体的小型化和稳定化。基于通过MFOLD程序估测的二级结构进行小型化和稳定化的操作，并且通过细胞迁移抑制实验评估活性。在细胞迁移抑制实验中，RNA浓度为100nM或500nM。由于取决于细胞状况在实验结果中存在一些误差，所以在每次测量中包括先前测定的样品作为阳性对照。当RNA浓度为500nM时获得的抑制活性显示在表3中(表3-1和3-2)。所述抑制活性表示为相对值，其将SEQ IDNO：4所示的适体的活性视为100，以便阐释清楚改变形式之间的活性差异。当RNA浓度为500nM时，SEQ ID NO：4所示的适体的抑制活性％(通过从100减去在加入适体条件下运动的细胞数目而获得的数值，100是在不加入适体条件下运动的细胞数目)是73％。这是4次测量的平均值。当RNA浓度是100nM时，6次测量的抑制活性％的平均值是63％。

[0083]

[表3-1]

SEQ ID NO：4所示的RNA的改变形式针对中期因子的细胞迁移抑制活性

SEQ ID NO	活性	测量次数	长度(nt)
SEQ ID NO	活性	测量次数	长度(nt)	4	100	2	77
	57(小鼠)	2		4	100	2	77
	57(小鼠)	2		6	110	2	67
7	91	2	64	6	110	2	67
7	91	2	64	8	100	2	69
9	57	2	66	8	100	2	69
9	57	2	66	10	81	2	73

11	100	2	77
11	100	2	77	12	100	2	58
13	100	2	50	12	100	2	58
13	100	2	50	14	100	2	54
15	75	2	56	14	100	2	54
15	75	2	56	16	61	2	57
17	68	2	46	16	61	2	57
17	68	2	46	18	88	2	37
19	94	2	44	18	88	2	37
19	94	2	44	20	97	2	42
20-1	109	2	42	20	97	2	42
20-1	109	2	42	20-2	84	2	42
20-3	60	2	42	20-2	84	2	42
20-3	60	2	42	20-4	60	2	42
20-5	88	2	42	20-4	60	2	42
20-5	88	2	42	20-6	69	2	42
20-7	88	2	42	20-6	69	2	42
20-7	88	2	42	20-8	99	2	42
20-9	130	2	42	20-8	99	2	42
20-9	130	2	42	20-10	86	2	42
20-11	76	2	42	20-10	86	2	42
20-11	76	2	42	20-12	53	2	42
20-13	89	2	42	20-12	53	2	42

[0084]

[表3-2]

SEQ ID NO	活性	测量次数	长度(nt)
SEQ ID NO	活性	测量次数	长度(nt)	21	0	2	44
22	70	6	33	21	0	2	44
22	70	6	33	23	66	2	38

24	65	2	38
24	65	2	38	25	81	2	41
26	18	2	41	25	81	2	41
26	18	2	41	27	78	2	41
28	71	2	31	27	78	2	41
28	71	2	31	29	74	2	31
Cond-C	44	2		29	74	2	31

RNA浓度为500nM。活性表示为相对值，其中将SEQ ID NO：4所示的RNA的活性视为100。SEQ ID NO：4所示的RNA的抑制活性％是73％。该值是4次测量的平均值。(小鼠)表示相对于小鼠中期因子的数值。Cond-C表示硫酸软骨素C。

[0085]

所述改变形式(SEQ ID NOs：6-29)中的改变的部分说明如下。SEQ ID NO：6：从在SEQ ID NO：4所示的RNA的3’末端侧的单链部分删除10个核苷酸。

gggagaggagaagaggaac(F)gu(F)gc(F)u(F)c(F)u(F)gu(F)ac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggu(F)gu(F)gu(F)agaggac(F)a

SEQ ID NO：7：从在SEQ ID NO：4所示的RNA的5’末端侧的单链部分删除14个核苷酸，并且添加一个G用于转录。

gggaac(F)gu(F)gc(F)u(F)c(F)u(F)gu(F)ac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggu(F)gu(F)gu(F)agaggac(F)aggaau(F)gagga

SEQ ID NO：8：从在SEQ ID NO：4所示的RNA末端侧的干删除4个碱基对。

gggagaggagaagaggaac(F)gc(F)u(F)gu(F)ac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggu(F)gu(F)gu(F)agc(F)aggaau(F)gagga

SEQ ID NO：9：从SEQ ID NO：4所示的RNA删除内环的8个核苷酸和在其相对一侧的CGG。

gggagaggagaagaggaac(F)gu(F)gc(F)u(F)c(F)u(F)gu(F)ac(F)gc(F)c(F)ggaaagaaggu(F)gu(F)gu(F)agaggac(F)aggaau(F)gagga

SEQ ID NO：10：在SEQ ID NO：4所示的RNA中，环部分被GAAA四核苷酸环替代。

gggagaggagaagaggaac(F)gu(F)gc(F)u(F)c(F)u(F)gu(F)ac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)gaaaggc(F)ggu(F)gu(F)gu(F)agaggac(F)aggaau(F)gagga

[0086]

SEQ ID NO：11：在SEQ ID NO：4所示的RNA的末端侧的干中，3个G-U碱基对被G-C碱基对替代。

gggagaggagaagaggaac(F)gu(F)gc(F)u(F)c(F)u(F)gc(F)ac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)gc(F)agaggac(F)aggaau(F)gagga

SEQ ID NO：12：在SEQ ID NO：8所示的RNA的末端侧的干中，3个G-U碱基对被G-C碱基对替换，并且从其3’末端侧的单链部分删除11个核苷酸。

gggagaggagaagaggaac(F)gc(F)u(F)gc(F)ac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)gc(F)agc(F)

SEQ ID NO：13：从SEQ ID NO：12所示的RNA的5’末端侧的单链部分删除11个核苷酸，并且在其中添加GGG用于转录。

gggagaggaac(F)gc(F)u(F)gc(F)ac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)gc(F)agc(F)

SEQ ID NO：14：从SEQ ID NO：12所示的RNA的末端侧的干删除1个G-C碱基对和1个C-G碱基对。

gggagaggagaagaggaac(F)gc(F)u(F)ac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)agc(F)

SEQ ID NO：15：从SEQ ID NO：12所示的RNA的环部分删除A36和A37。

gggagaggagaagaggaac(F)gc(F)u(F)gc(F)ac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagggc(F)ggc(F)gu(F)gc(F)agc(F)

[0087]

SEQ ID NO：16：从SEQ ID NO：12所示的RNA的内环部分删除A23。

gggagaggagaagaggaac(F)gc(F)u(F)gc(F)ac(F)gagggu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)gc(F)agc(F)

SEQ ID NO：17：从SEQ ID NO：13所示的RNA的末端侧的干删除1个G-C碱基对和1个C-G碱基对。

gggagaggaac(F)gc(F)u(F)ac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)agc(F)

SEQ ID NO：18：从SEQ ID NO：17所示的RNA的5’末端侧的单链部分删除11个核苷酸，并且在其中加入GG用于转录。

gggc(F)u(F)ac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)agc(F)

SEQ ID NO：19：从SEQ ID NO：17所示的RNA末端侧的干部分删除1个C-G碱基对。

gggagaggaac(F)gu(F)ac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)ac(F)

[0088]

SEQ ID NO：20：从SEQ ID NO：17所示的RNA末端侧的干部分删除1个C-G碱基对和1个U-A碱基对。

gggagaggaac(F)gac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)c(F)SEQ ID NO：20-1：SEQ ID NO：20所示的RNA的单链部分完全用OMe修饰。

g(M)g(M)g(M)a(M)g(M)a(M)g(M)g(M)a(M)a(M)c(F)gac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)c(F)

SEQ ID NO：20-2：在SEQ ID NO：20所示的RNA中的第一个干用OMe修饰。

gggagaggaac(F)g(M)a(M)c(F)g(M)aggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)g(M)u(F)c(F)

SEQ ID NO：20-3：在SEQ ID NO：20所示的RNA中的第二个干用OMe修饰。

gggagaggaac(F)gac(F)gaggagu(F)ag(M)c(F)c(F)ggaaagaag(M)g(M)c(F)ggc(F)gu(F)c(F)

SEQ ID NO：20-4：在SEQ ID NO：20所述的RNA的环部分中的G用OMe替代。

gggagaggaac(F)gac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)g(M)g(M)aaag(M)aaggc(F)ggc(F)gu(F)c(F)

[0089]

SEQ ID NO：20-5：在SEQ ID NO：20-1所示的RNA的凸起部分中的A用OMe替代。

g(M)g(M)g(M)a(M)g(M)a(M)g(M)g(M)a(M)a(M)c(F)gac(F)ga(M)gga(M)gu(F)a(M)gc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)c(F)

SEQ ID NO：20-6：在SEQ ID NO：20-1所示的RNA的凸起部分中的G用OMe替代。

g(M)g(M)g(M)a(M)g(M)a(M)g(M)g(M)a(M)a(M)c(F)gac(F)gag(M)g(M)ag(M)u(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)c(F)

SEQ ID NO：20-7：在SEQ ID NO：20-1所示的RNA的环部分中的A用OMe修饰。

g(M)g(M)g(M)a(M)g(M)a(M)g(M)g(M)a(M)a(M)c(F)gac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)gga(M)aa(M)gaaggc(F)ggc(F)gu(F)c(F)

[0090]

SEQ ID NO：20-8：在SEQ ID NO：20-5所示的RNA的环部分中的A用OMe修饰。

g(M)g(M)g(M)a(M)g(M)a(M)g(M)g(M)a(M)a(M)c(F)gac(F)ga(M)gga(M)gu(F)a(M)gc(F)c(F)gga(M)aa(M)gaaggc(F)ggc(F)gu(F)c(F)

SEQ ID NO：20-9：在SEQ ID NO：20-5所示的RNA中的第一个干用OMe修饰。

g(M)g(M)g(M)a(M)g(M)a(M)g(M)g(M)a(M)a(M)c(F)g(M)a(M)c(F)ga(M)gga(M)gu(F)a(M)gc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)g(M)u(F)c(F)

SEQ ID NO：20-10：SEQ ID NO：20-5所示的RNA的一些部分用OMe修饰。

g(M)g(M)g(M)a(M)g(M)a(M)g(M)g(M)a(M)a(M)c(F)gac(F)ga(M)gga(M)gu(F)a(M)gc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)g(M)g(M)c(F)gu(F)c(F)

SEQ ID NO：20-11：SEQ ID NO：20-5所示的RNA的一些部分用OMe修饰。

g(M)g(M)g(M)a(M)g(M)a(M)g(M)g(M)a(M)a(M)c(F)g(M)a(M)c(F)ga(M)gga(M)gu(F)a(M)gc(F)c(F)gga(M)aa(M)gaaggc(F)g(M)g(M)c(F)g(M)u(F)c(F)

SEQ ID NO：20-12：SEQ ID NO：20-5所示的RNA的一些部分用OMe修饰。

g(M)g(M)g(M)a(M)g(M)a(M)g(M)g(M)a(M)a(M)c(F)g(M)a(M)c(F)ga(M)gga(M)gu(F)a(M)gc(F)c(F)gga(M)aa(M)g(M)aaggc(F)ggc(F)g(M)u(F)c(F)

SEQ ID NO：20-13：SEQ ID NO：20-5所示的RNA的一些部分用OMe修饰

g(M)g(M)g(M)a(M)g(M)a(M)g(M)g(M)a(M)a(M)c(F)g(M)a(M)c(F)ga(M)gga(M)gu(F)a(M)gc(F)c(F)gga(M)aa(M)gaag(M)gc(F)ggc(F)g(M)u(F)c(F)

[0091]

SEQ ID NO：21：从SEQ ID NO：17所示的RNA的环侧的干部分删除1个G-C碱基对。

gggagaggaac(F)gc(F)u(F)ac(F)gaggagu(F)agc(F)ggaaagaagc(F)ggc(F)gu(F)agc(F)

SEQ ID NO：22：从在SEQ ID NO：20所示的RNA的5’末端侧的单链部分删除11个核苷酸，并且添加2个Gs用于转录。

gggac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)c(F)

[0092]

SEQ ID NO：23：在SEQ ID NO：20所示的RNA中，环部分用GAAA四核苷酸环替代。

gggagaggaac(F)gac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)gaaaggc(F)ggc(F)gu(F)c(F)SEQ ID NO：24：在SEQ ID NO：20所示的RNA中，环部分用UUCG四核苷酸环替代。

gggagaggaac(F)gac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)u(F)u(F)c(F)gggc(F)ggc(F)gu(F)c(F)

SEQ ID NO：25：在SEQ ID NO：20所示的RNA中的内环部分用SEQ IDNO：2所示的适体的内环替代。

gggagaggaac(F)gac(F)gagaac(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)c(F)

SEQ ID NO：26：删除在SEQ ID NO：20所示的RNA中的内环的G18。

gggagaggaac(F)gac(F)gagagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)c(F)SEQ ID NO：27：删除在SEQ ID NO：20所示的RNA中的内环的A19。

gggagaggaac(F)gac(F)gagggu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)c(F)SEQ ID NO：28：在SEQ ID NO：22所示的RNA中，从5’末端去除2个G，并且将第二个碱基对A-U改变成G-C。

ggc(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gc(F)c(F)

SEQ ID NO：29：从SEQ ID NO：22所示的RNA的5’末端去除2个G。

gac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)c(F)

[0093]

检验了SEQ ID NO：4所示的适体针对小鼠中期因子的细胞迁移抑制活性。实验方法与上述关于人中期因子的实验方法相同。作为实验的结果，该适体的抑制活性％为50％。相对于被视为100的该适体针对人中期因子的抑制活性，这等价于约57；与针对人中期因子的抑制活性相比较，活性明显减小。因此，发现该适体是表现出更高的针对人中期因子的抑制活性的适体。

[0094]

如在表3中所示，SEQ ID NO：4所示的适体，其初始长度为77个核苷酸，在没有极大减小所述活性的条件下，可以使其小型化至31个核苷酸(SEQ ID NO：28，29)。获得的该适体的发夹环部分不必总是GGAAAGAA；甚至在所述发夹环部分是GAAA或UUCG四核苷酸环时(SEQ ID NO：23，24)，所述适体保持活性。甚至在所述内环部分被SEQ IDNO：2所示适体的内环部分替代时，仍然保持活性(SEQ ID NO：25)。甚至在删除A19时，仍然保持活性，但是当删除G18时，活性极大减小(SEQ IDNO：26，27)。同时，发现当删除在环侧上的干的C-G碱基对时，二级结构极大改变，并且失去抑制活性(SEQ ID NO：21)。从上述发现，甚至在一些核苷酸被其它氨基酸替代或被删除之后，如果其基本结构没有大的改变，则SEQ ID NO：20所示的42个核苷酸的适体(图8)保持活性。

[实施例7]

[0095]

SEQ ID NO：5所示的适体的小型化和稳定化

SEQ ID NO：5所示的适体是77个核苷酸长，在其嘧啶核苷酸的核糖2’位置被氟-取代。为了能够进行化学合成，为了减少毒性，并且为了提高在血液中的稳定性，进行该适体的小型化和稳定化。基于通过MFOLD程序估测的二级结构进行小型化和稳定化的操作，并且通过细胞迁移抑制实验评估活性。在细胞迁移抑制实验中，RNA浓度为100nM或500nM。由于取决于细胞状况在实验结果中存在一些误差，所以在每次测量中包括先前测定的样品作为阳性对照。当RNA浓度为100nM时获得的抑制活性显示在表4-1中。所述抑制活性表示为相对值，其中将SEQ ID NO：5所示的适体的活性视为100，以便阐释清楚改变的形式之间的活性差异。当RNA浓度为100nM时，SEQ ID NO：5所示的适体的抑制活性％(通过从100减去在加入适体条件下运动的细胞数目而获得的数值，100是在不加入适体条件下运动的细胞的数目)是76％。这是14次测量的平均值。将RNA浓度变为500nM，进行相似的实验。结果显示在表4-2中(表4-2-1，表4-2-2)。活性表示为相对值，其中将SEQ ID NO：40所示的适体的活性视为100。SEQ ID NO：40所示的适体的抑制活性％是82％。这是4次测量的平均值。

[0096]

[表4-1]

RNA浓度为100nM。活性表示为相对值，其中将SEQ ID NO：5所示的RNA针对中期因子的抑制活性视为100。SEQ ID NO：5所示的RNA针对中期因子的抑制活性％是76％。该值是14次测量的平均值。

[0097]

[表4-2-1]

SEQ ID NO	活性	测量次数	长度(nt)
SEQ ID NO	活性	测量次数	长度(nt)	40	100	2	49
40-1	99	2	49	40	100	2	49
40-1	99	2	49	40-2	88	2	49
40-3	100	2	49	40-2	88	2	49
40-3	100	2	49	44	100	2	47
45	100	2	45	44	100	2	47
45	100	2	45	45-1	100	2	45
45-2	100	2	45	45-1	100	2	45
45-2	100	2	45	45-3	56	2	45
45-4	100	2	45	45-3	56	2	45
45-4	100	2	45	45-4-1	98*	2	45
45-4-1-1	85*	2	45	45-4-1	98*	2	45
45-4-1-1	85*	2	45	46	92	2	49
47	84	2	48	46	92	2	49
47	84	2	48	48	60	2	48
49	69	2	48	48	60	2	48
49	69	2	48	50	91	2	43
51	100	2	51	50	91	2	43
51	100	2	51	52	100	2	51
53	100	2	51	52	100	2	51
53	100	2	51	54	100	2	45

55	100	2	43
55	100	2	43	56	100	2	43
57	100	2	43	56	100	2	43
57	100	2	43	58	100	2	43
59	53	2	29	58	100	2	43
59	53	2	29	60	70	2	35

[0098]

[表4-2-2]

SEQ ID NO	活性	测量次数	长度(nt)
SEQ ID NO	活性	测量次数	长度(nt)	61	100	2	39
61-1	45*	2	39	61	100	2	39
61-1	45*	2	39	61-2	55*	2	39
61-3	80	2	39	61-2	55*	2	39
61-3	80	2	39	61-4	86	4	39
61-5	40	4	39	61-4	86	4	39
61-5	40	4	39	61-6	57	2	39
61-7	46	2	39	61-6	57	2	39
61-7	46	2	39	61-8	54	4	39
61-9	39	2	39	61-8	54	4	39
61-9	39	2	39	62	44	2	39
63	97	2	45	62	44	2	39
63	97	2	45	64	55*	2	37
65	0	2	39	64	55*	2	37
65	0	2	39	66	51	2	38
67	110	2	38	66	51	2	38
67	110	2	38	68	72	2	39
69	60	2	39	68	72	2	39
69	60	2	39	70	110	2	39
tRNA	28	2		70	110	2	39

凝血酶-S	0	2
凝血酶-S	0	2		HIV-S	48	2

RNA浓度为500nM。活性表示为相对值，其中将SEQ ID NO：40所示的RNA针对中期因子的抑制活性视为100。SEQ ID NO：40所示的RNA针对中期因子的抑制活性％是82％。这些值是4次测量的平均值。*：试验性鉴定的数值

[0099]

所述改变的形式(SEQ ID NOs：30-70)中的改变的部分说明如下。SEQ ID NO：30：从在SEQ ID NO：5所示RNA的5’末端侧的单链部分删除6个核苷酸，并且添加1个G用于转录。

ggagaagaggaagu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F)agu(F)au(F)aagau(F)agaggac(F)aggaau(F)gagga

SEQ ID NO：31：从在SEQ ID NO：5所示RNA的3’末端侧的单链部分删除10个核苷酸。

gggagaggagaagaggaagu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F)agu(F)au(F)aagau(F)agaggac(F)a

SEQ ID NO：32：从在SEQ ID NO：5所示RNA的3’末端侧的单链部分删除20个核苷酸。

gggagaggagaagaggaagu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F)agu(F)au(F)aag

SEQ ID NO：33：从在SEQ ID NO：5所示RNA的5’末端侧的单链部分删除6个核苷酸，并且从在其3’末端侧的单链部分删除10个核苷酸。

ggagaagaggaagu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F)agu(F)au(F)aagau(F)agaggac(F)a

[0100]

SEQ ID NO：34：从在SEQ ID NO：5所示RNA的5’末端侧的单链部分删除12个核苷酸，并且从在其3’末端侧的单链部分删除20个核苷酸。

ggaggaagu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F)agu(F)au(F)aag

SEQ ID NO：35：从在SEQ ID NO：32所示的RNA的3’末端侧的单链部分删除6个核苷酸。

gggagaggagaagaggaagu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F)ag

SEQ ID NO：36：从在SEQ ID NO：32所示的RNA的末端侧的干删除2个碱基对。

gggagaggagaagaggaagu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)agu(F)au(F)aag

SEQ ID NO：36-1：在SEQ ID NO：36所示的RNA的5’末端侧的单链部分完全用OMe修饰。

g(M)g(M)g(M)a(M)g(M)a(M)g(M)g(M)a(M)g(M)a(M)a(M)g(M)a(M)g(M)g(M)a(M)a(M)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)agu(F)au(F)aag

SEQ ID NO：37：从在SEQ ID NO：32所示的RNA的末端侧的干删除4个碱基对。

gggagaggagaagaggaagc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)agu(F)au(F)aag

SEQ ID NO：38：将在SEQ ID NO：32所示的RNA的5’末端侧的单链部分改变为聚U，其中U显示处在2’-位置氟化的核糖。

gggu(F)u(F)u(F)u(F)u(F)u(F)u(F)u(F)u(F)u(F)u(F)u(F)u(F)u(F)u(F)gu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F)agu(F)au(F)aag

[0101]

SEQ ID NO：39：从在SEQ ID NO：36所示RNA的3’末端侧的单链部分删除6个核苷酸，并且从在其末端侧的干删除1个碱基对。

gggagaggagaagaggaaggc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)c(F)ag

SEQ ID NO：40：从在SEQ ID NO：36所示RNA的3’末端侧的单链部分删除8个核苷酸。

gggagaggagaagaggaagu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F)

SEQ ID NO：40-1：将分子量为2000的聚乙二醇通过C12连接体添加到

SEQ ID NO：40所示RNA的5’末端，并且将idT添加到3’末端。

PEG2000-C 12-gggagaggagaagaggaagu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F)-idT

SEQ ID NO：40-2：将在SEQ ID NO：40所示RNA的5’末端侧的单链部分中的所有G用OMe修饰。

g(M)g(M)g(M)ag(M)ag(M)g(M)ag(M)aag(M)ag(M)g(M)aagu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F)

SEQ ID NO：40-3：将在SEQ ID NO：40所示RNA的5’末端侧的单链部分中的所有A完全用OMe修饰。

ggga(M)ga(M)gga(M)ga(M)a(M)ga(M)gga(M)a(M)gu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F)

SEQ ID NO：41：从在SEQ ID NO：36所示RNA的5’末端侧的单链部分删除G5。

gggaaggagaagaggaagu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)agu(F)au(F)aag

SEQ ID NO：42：从在SEQ ID NO：36所示RNA的5’末端侧的单链部分删除A11。

gggagaggagagaggaagu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)agu(F)au(F)aag

[0102]

SEQ ID NO：43：从在SEQ ID NO：36所示RNA的5’末端侧的单链部分删除A17。

gggagaggagaagaggagu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)agu(F)au(F)aag

SEQ ID NO：44：从在SEQ ID NO：40所示的RNA的末端侧的干删除1个碱基对。

gggagaggagaagaggaagu(F)u(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)aac(F)

SEQ ID NO：45：从在SEQ ID NO：40所示RNA的末端侧的干删除2个碱基对。

gggagaggagaagaggaagu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)

SEQ ID NO：45-1：将分子量为2000的聚乙二醇通过C12连接体添加到

SEQ ID NO：45所示RNA的5’末端，并且将idT添加到其3’末端。

PEG2000-C12-ggga(M)ga(M)gga(M)ga(M)a(M)ga(M)gga(M)a(M)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)-idT

SEQ ID NO：45-2：在SEQ ID NO：45所示RNA的5’末端侧的单链部分中的所有A和在环部分中的所有G完全用OMe修饰。

ggga(M)ga(M)gga(M)ga(M)a(M)ga(M)gga(M)a(M)gu(F)gc(F)ac(F)agggg(M)u(F)u(F)g(M)g(M)u(F)g(M)u(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)

SEQ ID NO：45-3：将在SEQ ID NO：45所示RNA的5’末端侧的单链部分中的所有A和在内环部分中的所有A和G完全用OMe修饰。

ggga(M)ga(M)gga(M)ga(M)a(M)ga(M)gga(M)a(M)gu(F)gc(F)ac(F)a(M)g(M)gggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)g(M)g(M)gu(F)gc(F)ac(F)

SEQ ID NO：45-4：将在SEQ ID NO：45所示RNA的5’末端侧的单链部分中的所有A和在其末端侧的干部分中的所有A和G完全用OMe修饰。

ggga(M)ga(M)gga(M)ga(M)a(M)ga(M)gga(M)a(M)gu(F)g(M)c(F)a(M)c(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)g(M)c(F)a(M)c(F)

SEQ ID NO：45-4-1：将在SEQ ID NO：45-4所示RNA的环部分中的所有G完全用OMe修饰。

ggga(M)ga(M)gga(M)ga(M)a(M)ga(M)gga(M)a(M)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)aggg(M)g(M)u(F)u(F)g(M)g(M)u(F)g(M)u(F)c(F)gggu(F)g(M)c(F)a(M)c(F)

SEQ ID NO：45-4-1-1：将SEQ ID NO：45-4-1所示RNA的C24改变成RNA核苷酸。

ggga(M)ga(M)gga(M)ga(M)a(M)ga(M)gga(M)a(M)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)caggg(M)g(M)u(F)u(F)g(M)g(M)u(F)g(M)u(F)c(F)gggu(F)g(M)c(F)a(M)c(F)

[0103]

SEQ ID NO：46：在SEQ ID NO：40所示RNA末端侧的干中，A-U碱基对被G-C碱基对替代。

gggagaggagaagaggaagu(F)gc(F)gc(F)gc(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggc(F)gc(F)gu(F)ac(F)

SEQ ID NO：47：从SEQ ID NO：40所示RNA的环删除U32。

gggagaggagaagaggaagu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F)

SEQ ID NO：48：从SEQ ID NO：40所示RNA的环删除G34。

gggagaggagaagaggaagu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)gu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F)

SEQ ID NO：49：从SEQ ID NO：40所示RNA的环删除U36。

gggagaggagaagaggaagu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)gggu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F)

SEQ ID NO：50：从在SEQ ID NO：45所示RNA的5’末端侧的单链部分删除G4和G10。

gggaaggaaagaggaagu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)

[0104]

SEQ ID NO：51：从在SEQ ID NO：36所示RNA的5’末端侧的单链部分删除G5和A11。

gggaaggagagaggaagu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)agu(F)au(F)aag

SEQ ID NO：52：从在SEQ ID NO：36所示RNA的5’末端侧的单链部分删除G1和G5。

ggaaggagaagaggaagu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)agu(F)au(F)aag

SEQ ID NO：53：从在SEQ ID NO：36所示RNA的5’末端侧的单链部分删除G5和G10。

gggaaggaaagaggaagu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)agu(F)au(F)aag

SEQ ID NO：54：将在SEQ ID NO：45所示RNA的5’末端侧的单链部分中的所有G用F修饰，并且所有A用OMe修饰。

g(F)g(F)g(F)a(M)g(F)a(M)g(F)g(F)a(M)g(F)a(M)a(M)g(F)a(M)g(F)g(F)a(M)a(M)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)

SEQ ID NO：55：从在SEQ ID NO：45所示RNA的5’末端侧的单链部分删除A11和A12。

gggagaggaggaggaagu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)

[0105]

SEQ ID NO：56：从在SEQ ID NO：45所示RNA的5’末端侧的单链部分删除G13和A14。

gggagaggagaaggaagu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)

SEQ ID NO：57：从在SEQ ID NO：45所示RNA的5’末端侧的单链部分删除G15和G16。

gggagaggagaagaaagu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)

SEQ ID NO：58：从在SEQ ID NO：45所示RNA的5’末端侧的单链部分删除A17和A18。

gggagaggagaagagggu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)

SEQ ID NO：59：从在SEQ ID NO：45所示RNA的5’末端侧的单链部分删除18个核苷酸，并且添加2个Gs用于转录。

gggu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)

SEQ ID NO：60：将在SEQ ID NO：45所示RNA的5’末端侧的单链部分改变为GGGAAGGA。

gggaaggagu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)

[0106]

SEQ ID NO：61：从在SEQ ID NO：45所示RNA的5’末端侧的单链部分删除G5，G10，A11，A12，G13和A14。

gggaaggaggaagu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)

SEQ ID NO：61-1：在SEQ ID NO：61所示RNA的5’末端侧，将在单链部分中的G用DNA核苷酸修饰，且A用OMe修饰，并且将在环部分的G用OMe修饰。

g(H)g(H)g(H)a(M)a(M)g(H)g(H)a(M)g(H)g(H)a(M)a(M)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)

SEQ ID NO：61-2：在SEQ ID NO：61所示RNA的5’末端侧，在单链部分中的G和A和在环部分中的G用OMe修饰。

g(M)g(M)g(M)a(M)a(M)g(M)g(M)a(M)g(M)g(M)a(M)a(M)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)

SEQ ID NO：61-3：将由SEQ ID NO：61所示RNA的一些部分用F和OMe修饰。

g(F)g(F)g(F)a(M)a(M)g(F)g(F)a(M)g(F)g(F)a(M)a(M)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)a(M)g(F)g(M)g(M)g(M)u(F)u(F)g(M)g(M)u(F)g(M)u(F)c(F)g(F)g(F)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)

SEQ ID NO：61-4：将由SEQ ID NO：61所示RNA的一些部分用OMe修饰。ggga(M)a(M)gga(M)gga(M)a(M)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)aggg(M)g(M)u(F)u(F)g(M)g(M)u(F)g(M)u(F)c(F)gggu(F)g(M)c(F)a(M)c(F)

[0107]

SEQ ID NO：61-5：将支化40kDa的聚乙二醇链添加到SEQ ID NO：61-5所示RNA的5’末端，并且将idT添加到其3’末端。

PEG40k-ggga(M)a(M)gga(M)gga(M)a(M)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)aggg(M)g(M)u(F)u(F)g(M)g(M)u(F)g(M)u(F)c(F)gggu(F)g(M)c(F)a(M)c(F)-idT

SEQ ID NO：61-6：将30kDa的聚乙二醇链添加到SEQ ID NO：61-5所示RNA的两个末端。

PEG30k-ggga(M)a(M)gga(M)gga(M)a(M)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)aggg(M)g(M)u(F)u(F)g(M)g(M)u(F)g(M)u(F)c(F)gggu(F)g(M)c(F)a(M)c(F)-PEG30k

SEQ ID NO：61-7：将SEQ ID NO：61所示的RNA的一些部分用OMe修饰。

ggga(M)a(M)gga(M)gga(M)a(M)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)aggg(M)g(M)u(F)u(F)g(M)g(M)u(F)g(M)u(F)c(F)g(M)g(M)gu(F)g(M)c(F)a(M)c(F)

SEQ ID NO：61-8：将SEQ ID NO：61所示RNA的一些部分用OMe修饰。

ggga(M)a(M)gga(M)gga(M)a(M)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)a(M)g(M)gg(M)g(M)u(F)u(F)g(M)g(M)u(F)g(M)u(F)c(F)gggu(F)g(M)c(F)a(M)c(F)

SEQ ID NO：61-9：将SEQ ID NO：61所示RNA的一些部分用OMe修饰，并且在5’末端添加2kDa聚乙二醇。

PEG2000-ggga(M)a(M)gga(M)gga(M)a(M)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)a(M)gg(M)g(M)g(M)u(F)u(F)g(M)g(M)u(F)g(M)u(F)c(F)ggg(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)

[0108]

SEQ ID NO：62：从在SEQ ID NO：45所示RNA的5’末端侧的单链部分删除G13，A14，G15，G16，A17和A18。

gggagaggagaagu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)

SEQ ID NO：63：将在SEQ ID NO：45所示RNA中的A25和G26改变为C，从而使内环变为干。

gggagaggagaagaggaagu(F)gc(F)ac(F)c(F)c(F)gggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)

SEQ ID NO：64：从在SEQ ID NO：61所示RNA的5’末端侧的干删除U-A。

gggaaggaggaaggc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)c(F)SEQ ID NO：65：将在SEQ ID NO：61所示RNA的内环中的A19和G20用C替代。

gggaaggaggaagu(F)gc(F)ac(F)c(F)c(F)gggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)

[0109]

SEQ ID NO：66：将SEQ ID NO：61所示RNA的一些部分用OMe修饰，并且G用F修饰。

g(F)g(F)a(M)a(M)g(F)g(F)a(M)g(F)g(F)a(M)a(M)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)a(M)gg(M)g(M)g(M)u(F)u(F)g(M)g(M)u(F)g(M)u(F)c(F)g(F)g(F)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)

SEQ ID NO：67：改变SEQ ID NO：66所示RNA的修饰。

gga(M)a(M)gga(M)gga(M)a(M)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)aggg(M)g(M)u(F)u(F)g(M)g(M)u(F)g(M)u(F)c(F)gggu(F)g(M)c(F)a(M)c(F)

SEQ ID NO：68：SEQ ID NO：61所示RNA的一些部分用OMe修饰，且U28用A(M)替代。

ggga(M)a(M)gga(M)gga(M)a(M)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)aggg(M)g(M)u(F)u(F)g(M)g(M)a(M)g(M)u(F)c(F)gggu(F)g(M)c(F)a(M)c(F)

SEQ ID NO：69：将SEQ ID NO：61所示RNA的一些部分用OMe修饰，且U25用A(M)替代。

ggga(M)a(M)gga(M)gga(M)a(M)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)aggg(M)g(M)u(F)a(M)g(M)g(M)u(F)g(M)u(F)c(F)gggu(F)g(M)c(F)a(M)c(F)

SEQ ID NO：70：将SEQ ID NO：61所示RNA的一些部分用OMe修饰，且U24用A(M)替代。

ggga(M)a(M)gga(M)gga(M)a(M)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)aggg(M)g(M)a(M)u(F)g(M)g(M)u(F)g(M)u(F)c(F)gggu(F)g(M)c(F)a(M)c(F)

[0110]

此处，n(M)表示在2′-位置用OMe修饰的核糖，n(F)表示在2’-位置用F修饰的核糖，n(H)表示脱氧核糖，PEG2000表示2000-Da的聚乙二醇，PEG40k表示支化的40kDa聚乙二醇，PEG30k表示30kDa的聚乙二醇，C12表示C12连接体，并且idT表示倒位的dT。

[0111]

进行了关于SEQ ID NO：5所示适体及其改变形式针对多营养因子的细胞迁移抑制作用的实验。实验方法如上述，不同的是使用多营养因子替代中期因子。适体浓度为100nM，并且将SEQ ID NO：5所示适体针对中期因子的抑制活性视为100。作为实验的结果，针对多营养因子的抑制活性为13(表4-1)。这是6次测量的平均值。在所述改变形式中，没有观察到针对多营养因子的显著抑制活性。

[0112]

检验了SEQ ID NO：35所示适体针对小鼠中期因子的细胞迁移抑制活性。实验与上述使用人中期因子的实验方法相同。作为该实验的结果，该适体的抑制活性％是84％。因此，发现该适体具有与针对人中期因子的抑制活性等价的针对小鼠中期因子的活性。

[0113]

使用不可能特异性结合中期因子的tRNA(由西格玛(Sigma)供应)、凝血酶-S、和HIV-S取代适体，按上述进行针对人中期因子的细胞迁移抑制实验。此处，凝血酶-S是t′ggttggtgtggttgg′taaaaaaaaaaaaaaaa(SEQ IDNO：74)的DNA适体，且HIV-S是g′tggtgggtgggtggg′t(SEQ ID NO：75)的DNA适体。每“′”个表示硫代磷酸酯键。添加该硫代磷酸酯键是为了增加核酸酶抗性。以500nM使用这些RNAs。当将SEQ ID NO：45所示适体针对人中期因子的抑制活性视为100时，确定tRNA的活性为28，凝血酶-S为0，并且HIV-S为48。此处，表明在本研究中制备的适体可能与和中期因子细胞迁移活性相关的重要位点特异性结合。

[0114]

SEQ ID NO：5所示的适体，其长度为77个核苷酸，在不大量减小活性的条件下，可以小型化为39个核苷酸(SEQ ID NO：61)。在5′末端的单链部分不能完全删除；推定该单链部分参与该适体的空间结构的形成。尽管该单链部分的G可以是F-修饰的核苷酸，但是在OMe-修饰的核苷酸(SEQ ID NO：40-2，54，61-2)的情形中，发现活性减小。同时，甚至当A是OMe-修饰的核苷酸时，活性保持不变(SEQ ID NO：40-3)。甚至当在5’末端侧的干中的一些A-U碱基对被G-C碱基对替代时，活性没有受到太大影响(SEQ ID NO：46)。甚至在该干部分的A和G被OMe-修饰的核苷酸替代时，仍保持活性(SEQ ID NO：45-4)。甚至在内环部分通过核苷酸取代被G-C干结构替代时，活性没有变化(SEQ ID NO：63)；然而，当缩短单链部分时，活性减小(SEQ ID NO：59)。当内环的G和A被OMe-修饰的核苷酸替代时，活性减小(SEQ ID NO：45-3)。当环部分去除1个核苷酸时，活性减小(SEQ ID NO：47-49)。甚至当环部分的G用OMe-修饰的核苷酸替代时，活性保持(SEQ ID NO：45-2)。

从上述发现，所获得的该适体的活性甚至没有受到取代一些碱基或改变修饰的影响。还发现该适体特异性结合中期因子，从而抑制细胞迁移活性。同时，发现该适体还结合家族蛋白多营养因子，但是不具有显著的细胞迁移抑制活性。

[实施例8]

[0115]

使用小鼠手术后粘连形成模型，适体对器官粘连的抑制作用

打开正常小鼠的腹部，并且用手术刀等切开腹膜，然后干燥内部器官，并且然后缝合剖腹的部分，在此后5天内，观察到器官粘连(Am J ObstetGynecol 179，438-443，1998)。据报道，当使用引起手术后器官粘连的该方法处理中期因子敲除小鼠时，不发生手术后器官粘连(生物化学和生物物理学研究通讯(Biochemical and Biophysical Research Communication)，317，108-113，2004)。因此，使用小鼠手术后粘连形成模型，研究SEQ ID NO：76所示适体的预防手术后器官粘连作用。在麻醉下，将8周龄的C57BL/6小鼠(雌性)剖开腹部，之后用脱脂棉擦拭腹膜。然后，用剪刀在腹膜的5个位置剪出约2cm的缝。在用脱脂棉止血10分钟后，用缝针和线缝合伤口。在恢复之后，以1mg/25mL/kg剂量腹膜内施用SEQ ID NO：76所示的适体。对于对照组，以相同方式以25mL/kg剂量腹膜内施用含有1mM MgCl₂的盐水。在手术后第0天、第1天和第2天，每天施用一次，总共3次，然后，在第3天，在麻醉下将动物腹部剖开，并且使用下述标准评估器官与伤口粘连的程度。

0：无粘连

1：有粘连，轻度粘连(轻度)

2：有粘连，中度粘连(中度)

3：由粘连，严重粘连，甚至通过牵拉在粘连部分的器官也不能分开所述粘连(重度)

结果表示为每组9-10只动物的粘连程度评分的平均值和标准误差(表5)。结果，在接受生理盐水组中所有动物的得分是3，而接受SEQ ID NO：76所示适体的组的平均得分是2.4。在接受SEQ ID NO：76所示适体的组中，与接受生理盐水的组相比较，观察到统计学显著差异(p＜5％)。对于统计学处理，使用Mann-Whitney U检验。从上述结果，表明SEQ ID NO：76所示适体具有预防手术后器官粘连的活性。

SEQ ID NO：76所示的适体如下：

SEQ ID NO：76：SEQ ID NO：40所示的RNA，其中5′末端单链部分的所有“A”用OMe修饰，其中将胆固醇(Chol)通过具有12个碳原子的饱和烃链(C12)连接体添加到5′末端，并且向3′末端添加倒位的dT(idT)。

Chol-C12-ggga(M)ga(M)gga(M)ga(M)a(M)ga(M)gga(M)a(M)gu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F)-idT

[0116]

[表5]

使用小鼠模型的器官粘连抑制实验的结果

施用	得分
施用	得分	生理盐水	3.0+/-0.0
SEQ ID NO：40-4-1	2.4+/-0.3*	生理盐水	3.0+/-0.0

*；p＜0.05Mann-Whitney U检验

[0117]

本申请基于在日本提交的专利申请号2006-308482(提交日期：2006年11月14日)，其内容通过该引用完全结合在本文中。

序列表

<110>力博美科股份有限公司.

<120>针对中期因子的适体及其应用

<130>091160

<150>JP 2006-308482

<151>2006-11-14

<160>76

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>77

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>1

gggagaggag aagaggaaau aguuaagggu gaauuugcga aagcuauuuu agucgcagua 60

gaggacagga augagga 77

<210>2

<211>77

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>2

gggagaggag aagaggaagg acuaaguaag agaacaccgg aaugaaggga cuuacgugua 60

gaggacagga augagga 77

<210>3

<211>75

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>3

gggagaggag aagaggaaag ccuucuaccg aaagugggaa agcacacaua aaucugguag 60

aggacaggaa ugaga 75

<210>4

<211>76

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>4

gggagaggag aagaggaacg ugcucuguac gaggaguagc cggaaagaag gcggugugua 60

gaggacagga augaga 76

<210>5

<211>76

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>5

gggagaggag aagaggaagu gugcacaggg guuggugucg ggugcauaca guauaagaua 60

gaggacagga augaga 76

<210>6

<211>67

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>6

gggagaggag aagaggaacg ugcucuguac gaggaguagc cggaaagaag gcggugugua 60

gaggaca 67

<210>7

<211>64

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>7

gggaacgugc ucuguacgag gaguagccgg aaagaaggcg guguguagag gacaggaaug 60

agga 64

<210>8

<211>69

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>8

gggagaggag aagaggaacg cuguacgagg aguagccgga aagaaggcgg uguguagcag 60

gaau gagga 69

<210>9

<211>66

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>9

gggagaggag aagaggaacg ugcucuguac gccggaaaga agguguguag aggacaggaa 60

ugagga 66

<210>10

<211>73

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>10

gggagaggag aagaggaacg ugcucuguac gaggaguagc cgaaaggcgg uguguagagg 60

acaggaauga gga 73

<210>11

<211>77

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>11

gggagaggag aagaggaacg ugcucugcac gaggaguagc cggaaagaag gcggcgugca 60

gaggacagga augagga 77

<210>12

<211>58

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>12

gggagaggag aagaggaacg cugcacgagg aguagccgga aagaaggcgg cgugcagc 58

<210>13

<211>50

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>13

gggagaggaa cgcugcacga ggaguagccg gaaagaaggc ggcgugcagc 50

<210>14

<211>54

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>14

gggagaggag aagaggaacg cuacgaggag uagccggaaa gaaggcggcg uagc 54

<210>15

<211>56

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>15

gggagaggag aagaggaacg cugcacgagg aguagccgga aagggcggcg ugcagc 56

<210>16

<211>57

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>16

gggagaggag aagaggaacg cugcacgagg guagccggaa agaaggcggc gugcagc 57

<210>17

<211>46

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>17

gggagaggaa cgcuacgagg aguagccgga aagaaggcgg cguagc 46

<210>18

<211>37

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>18

gggcuacgag gaguagccgg aaagaaggcg gcguagc 37

<210>19

<211>44

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>19

gggagaggaa cguacgagga guagccggaa agaaggcggc guac 44

<210>20

<211>42

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>20

gggagaggaa cgacgaggag uagccggaaa gaaggcggcg uc 42

<210>21

<211>44

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>21

gggagaggaa cgcuacgagg aguagcggaa agaagcggcg uagc 44

<210>22

<211>33

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>22

gggacgagga guagccggaa agaaggcggc guc 33

<210>23

<211>38

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>23

gggagaggaa cgacgaggag uagccgaaag gcggcguc 38

<210>24

<211>38

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>24

gggagaggaa cgacgaggag uagccuucgg gcggcguc 38

<210>25

<211>41

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>25

gggagaggaa cgacgagaac agccggaaag aaggcggcgu c 41

<210>26

<211>41

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>26

gggagaggaa cgacgagagu agccggaaag aaggcggcgu c 41

<210>27

<211>41

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>27

gggagaggaa cgacgagggu agccggaaag aaggcggcgu c 41

<210>28

<211>31

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>28

ggcgaggagu agccggaaag aaggcggcgc c 31

<210>29

<211>31

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>29

gacgaggagu agccggaaag aaggcggcgu c 31

<210>30

<211>71

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>30

ggagaagagg aagugugcac agggguuggu gucgggugca uacaguauaa gauagaggac 60

aggaaugagg a 71

<210>31

<211>67

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>31

gggagaggag aagaggaagu gugcacaggg guuggugucg ggugcauaca guauaagaua 60

gaggaca 67

<210>32

<211>57

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>32

gggagaggag aagaggaagu gugcacaggg guuggugucg ggugcauaca guauaag 57

<210>33

<211>61

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>33

ggagaagagg aagugugcac agggguuggu gucgggugca uacaguauaa gauagaggac 60

a 61

<210>34

<211>46

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>34

ggaggaagug ugcacagggg uuggugucgg gugcauacag uauaag 46

<210>35

<211>51

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>35

gggagaggag aagaggaagu gugcacaggg guuggugucg ggugcauaca g 51

<210>36

<211>53

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>36

gggagaggag aagaggaagu gcacaggggu uggugucggg ugcacaguau aag 53

<210>37

<211>49

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>37

gggagaggag aagaggaagc acagggguug gugucgggug caguauaag 49

<210>38

<211>57

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>38

ggguuuuuuu uuuuuuuugu gugcacaggg guuggugucg ggugcauaca guauaag 57

<210>39

<211>45

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>39

gggagaggag aagaggaagg cacagggguu ggugucgggu gccag 45

<210>40

<211>49

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>40

gggagaggag aagaggaagu gugcacaggg guuggugucg ggugcauac 49

<210>41

<211>52

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>41

gggaaggaga agaggaagug cacagggguu ggugucgggu gcacaguaua ag 52

<210>42

<211>52

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>42

gggagaggag agaggaagug cacagggguu ggugucgggu gcacaguaua ag 52

<210>43

<211>52

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>43

gggagaggag aagaggagug cacagggguu ggugucgggu gcacaguaua ag 52

<210>44

<211>47

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>44

gggagaggag aagaggaagu ugcacagggg uuggugucgg gugcaac 47

<210>45

<211>45

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>45

gggagaggag aagaggaagu gcacaggggu uggugucggg ugcac 45

<210>46

<211>49

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>46

gggagaggag aagaggaagu gcgcgcaggg guuggugucg ggcgcguac 49

<210>47

<211>48

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>47

gggagaggag aagaggaagu gugcacaggg guggugucgg gugcauac 48

<210>48

<211>48

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>48

gggagaggag aagaggaagu gugcacaggg guugugucgg gugcauac 48

<210>49

<211>48

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>49

gggagaggag aagaggaagu gugcacaggg guugggucgg gugcauac 48

<210>50

<211>43

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>50

gggaaggaaa gaggaagugc acagggguug gugucgggug cac 43

<210>51

<211>51

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>51

gggaaggaga gaggaagugc acagggguug gugucgggug cacaguauaa g 51

<210>52

<211>51

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>52

ggaaggagaa gaggaagugc acagggguug gugucgggug cacaguauaa g 51

<210>53

<211>51

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>53

gggaaggaaa gaggaagugc acagggguug gugucgggug cacaguauaa g 51

<210>54

<211>45

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>54

gggagaggag aagaggaagu gcacaggggu uggugucggg ugcac 45

<210>55

<211>43

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>55

gggagaggag gaggaagugc acagggguug gugucgggug cac 43

<210>56

<211>43

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>56

gggagaggag aaggaagugc acagggguug gugucgggug cac 43

<210>57

<211>43

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>57

gggagaggag aagaaagugc acagggguug gugucgggug cac 43

<210>58

<211>43

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>58

gggagaggag aagagggugc acagggguug gugucgggug cac 43

<210>59

<211>29

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>59

gggugcacag ggguuggugu cgggugcac 29

<210>60

<211>35

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>60

gggaaggagu gcacaggggu uggugucggg ugcac 35

<210>61

<211>39

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>61

gggaaggagg aagugcacag ggguuggugu cgggugcac 39

<210>62

<211>39

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>62

gggagaggag aagugcacag ggguuggugu cgggugcac 39

<210>63

<211>45

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>63

gggagaggag aagaggaagu gcacccgggu uggugucggg ugcac 45

<210>64

<211>37

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>64

gggaaggagg aaggcacagg gguugguguc gggugcc 37

<210>65

<211>39

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>65

gggaaggagg aagugcaccc ggguuggugu cgggugcac 39

<210>66

<211>38

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>66

ggaaggagga agugcacagg gguugguguc gggugcac 38

<210>67

<211>38

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>67

ggaaggagga agugcacagg gguugguguc gggugcac 38

<210>68

<211>39

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>68

gggaaggagg aagugcacag ggguuggagu cgggugcac 39

<210>69

<211>39

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>69

gggaaggagg aagugcacag ggguaggugu cgggugcac 39

<210>70

<211>39

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>70

gggaaggagg aagugcacag gggauggugu cgggugcac 39

<210>71

<211>77

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于产生针对中期因子的适体的DNA模板

<220>

<221>misc_feature

<223>n是a，c，g或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(59)

<223>n是a，c，g，或t

<400>71

tcctcattcc tgtcctctan nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnt 60

tcctcttctc ctctccc 77

<210>72

<211>35

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于产生针对中期因子的适体的引物

<400>72

taatacgact cactataggg agaggagaag aggaa 35

<210>73

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于产生针对中期因子的适体的反向引物

<400>73

tcctcattcc tgtcctcta 19

<210>74

<211>33

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>针对凝血酶(凝血酶-S)的DNA适体

<400>74

tggttggtgt ggttggtaaa aaaaaaaaaa aaa 33

<210>75

<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>针对HIV(HIV-S)的DNA适体

<400>75

gtggtgggtg ggtgggt 17

<210>76

<211>49

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对中期因子的适体

<400>76

gggagaggag aagaggaagu gugcacaggg guuggugucg ggugcauac 49

Claims

1.一种适体，其具有针对中期因子的抑制活性。

2.权利要求1的适体，其中所述适体不具有针对多营养因子的抑制活性。

3.权利要求1的适体，其具有针对中期因子N端片段的结合活性。

4.权利要求1的适体，其具有针对中期因子C端片段的结合活性。

5.权利要求2的适体，其具有针对中期因子N端片段的结合活性。

6.权利要求2的适体，其具有针对中期因子C端片段的结合活性。

7.一种适体，其通过抑制中期因子和PTPζ的结合而表现出针对中期因子的抑制活性。

8.权利要求1的适体，其是下述(a)或(b)：

(ii)嘌呤核苷酸的2’-位置，不管是相同的还是不同的，是羟基或被选自由氢原子、甲氧基和氟原子组成的组的原子或基团取代。

9.权利要求1-8中任一项的适体，其中包含在所述适体中的核苷酸被修饰。

10.一种复合体，其包含权利要求1-9中任一项的适体和功能物质。

11.权利要求10的复合体，其中所述功能物质是亲和性物质、用于标记的物质、酶、药物递送赋形剂或药物。

12.一种药物，其包括权利要求1-9中任一项的适体或者权利要求10或11的复合体。

13.一种细胞迁移抑制剂，其包括权利要求1-9中任一项的适体或者权利要求10或11的复合体。

14.一种诊断试剂，其包括权利要求1-9中任一项的适体或者权利要求10或11的复合体。

15.一种标记试剂，其包括权利要求1-9中任一项的适体或者权利要求10或11的复合体。

16.一种检测权利要求1-9中任一项的适体或者权利要求10或11的复合体的方法。