CN102171339A - 针对ngf的适体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了具有针对NGF的抑制活性的适体；包含具有针对NGF的结合活性或抑制活性的适体和功能物质(例如，亲和物质、标记物质、酶、药物递送载体、药物等)的复合物；包含具有针对NGF的结合活性或抑制活性的适体，或含有所述适体和所述功能物质的复合物的药剂、诊断剂、标记试剂等。

Description

针对NGF的适体及其用途
技术领域
本发明涉及针对NGF的适体，利用其的方法等。
背景技术
神经生长因子(NGF)是于1951年鉴定的第一个神经营养蛋白，并且是参与外周和中枢神经元的发育和存活的重要的分泌性蛋白。其由118个氨基酸组成，分子量为13kDa，并且在分子中的3个位处具有S-S键。在该家族蛋白中有BDNF，NT-3和NT-4/5，它们在结构上是非常保守的，并且通过非共价键形成同型二聚体。其具有面向3个不同方向的β折叠结构，并且被认为在此部分中二聚化。其还具有4个环结构(loop structure)，它们在家族内的同源性很低，并且这些部分被认为决定对受体的特异性。
作为NGF受体，已知有具有高亲和性的酪氨酸激酶-型受体TrkA和具有低亲和性的p75，后者属于肿瘤坏死因子受体超家族。这些受体作为同型二聚体或异二聚体起作用，并且深入地参与至神经系统的发育和维持中。TrkA是单次(single-pass)跨膜受体并且在细胞内结构域中具有酪氨酸激酶结构。当结合NGF时，发生酪氨酸磷酸化，信号传递至下游，并促进细胞的分化和维持细胞的存活。
作为TrkA的家族受体，已知有TrkB和TrkC。TrkB与BDNF和NT-4/5结合，TrkC与NT-3结合。p75与TrkA相比显示较低的配体特异性，并且除了NGF以外也与BDNF，NT-3和NT-4/5结合。尽管p75是单次跨膜受体，但其在细胞质侧没有酪氨酸激酶结构域。类似于TrkA，其不仅在神经细胞中表达，而且在非神经细胞中也表达。此受体已知参与促进细胞的分化和维持细胞的存活，以及涉及诱导凋亡和细胞迁移。晶体结构分析的结果表明NGF同型二聚体以2∶2结合TrkA且以2∶1结合p75。NGF同型二聚体有时与TrkA和p75的异二聚体结合。
NGF由施旺细胞(Schwann cell)、角化细胞(keratinized cell)、支气管上皮细胞、成纤维细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞、肥大细胞、B淋巴细胞、角质形成细胞、平滑肌细胞、肾小球细胞、骨骼肌细胞等产生。另一方面，TrkA已知在神经细胞中，以及除神经细胞以外在单核细胞，T淋巴细胞，B淋巴细胞和肥大细胞中表达。同样，p75在神经细胞以及非神经细胞中表达。
众所周知，NGF在神经系统中具有关键性的作用。已经阐明NGF具有维持胆碱能神经元存活的作用并且被认为与阿尔兹海默病具有某种联系。另外，由于NGF的脑内给药改善老年大鼠的记忆障碍，因而其也预期作为老年性痴呆的治疗药物。
已经发现NGF也作用于神经系统以外的组织和细胞，并且参与机体的防御和组织修复过程。例如，已知将NGF施用于动物增加血管通透性，增强T细胞和B细胞的免疫应答，诱导淋巴细胞分化，诱导肥大细胞生长，诱导肥大细胞释放多种细胞因子等。
NGF与炎症有关，并且在患有炎性疾病的患者和炎性动物模型中已经观察到NGF的表达增加。其实例有系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus)、多发性硬化(multiple sclerosis)、银屑病(psoriasis)、关节炎(arthritis)、间质性膀胱炎(interstitial cystitis)、哮喘(asthma)等。已经报道类风湿性关节炎患者的滑液显示较高的NGF浓度。另外，已经报道类风湿关节炎模型大鼠中NGF表达增加，和在关节炎模型小鼠中肥大细胞增多和NGF表达增加。
NGF与疼痛密切相关。当NGF经皮下施用于人时，深部疼痛诸如肌肉疼痛持续数天，并且发生注射部位的痛觉过敏。NGF敲除小鼠和TrkA敲除小鼠缺少无髓鞘神经并且不会感觉到疼痛。当NGF经腹膜内以1mg/kg施用于成熟大鼠，发生针对有害热刺激和机械性刺激的痛觉过敏。NGF转基因小鼠显示不伴有炎性病症的痛觉过敏。另外，已知患有先天性无痛无汗症(congenital insensitivity to pain with anhidrosis)(CIPA)的患者的TrkA基因具有异常，并且当NGF基因异常时痛觉减退。
从上面来看，NGF抑制剂可以用作用于疼痛诸如伤害性疼痛(nociceptive pain)，炎性疼痛(inflammatory pain)，神经性疼痛(neuropathic pain)，癌性疼痛(carcinomatous pain)，纤维肌痛(fibromyalgia pain)等的治疗药物。已经报道了NGF抗体和NSAID的联合疗法(WO04/073653)，NGF抗体和阿片样物质止痛剂的联合疗法(WO04/096122)，使用NGF抗体治疗术后疼痛的方法(WO04/032870，WO05/000194)，使用NGF抗体治疗骨癌疼痛的方法(WO05/111077)，和使用NGF抗体治疗骨关节炎疼痛的方法(WO06/110883)。
Tanezumab(PF-4383119或RN624)是针对NGF的抗体，其显示在使用骨关节炎动物模型的疼痛模型试验中有效，并且目前处于临床试验阶段。尽管NGF和NGF受体是否存在抑制活性还未知，但有涉及结合NGF的天然RNA的报道(非专利文件1)。
近年来，RNA适体在药剂、诊断剂和检测药物方面的应用已经得到了关注；一些RNA适体已经处于临床研究阶段或实际应用中。在2004年12月，世界上第一个RNA适体药物，哌加他尼钠(Macugen)在美国被批准为用于老年性黄斑变性(age-related macular degeneration)的治疗药物。RNA适体是指与靶分子诸如蛋白特异性结合的RNA，并且其可以使用SELEX(指数富集的配体系统进化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment))方法(专利文献1-3)制备。在SELEX方法中，特异性结合靶分子的RNA选自具有约1014种不同的核苷酸序列的RNA集合体(pool)。使用的RNA结构具有约40个残基的随机序列，其侧翼是引物序列。此RNA集合体允许与靶物质装配，并且使用滤器等仅收集与靶物质结合的RNA。收集的RNA通过RT-PCR扩增，并且将其用作用于下一轮的模板。通过重复此操作约10次，可以获得与靶物质特异性结合的RNA适体。
适体药物，如同抗体药物，可以靶向细胞外因子。参考公共领域中的许多科学文章和其他参考材料，适体药物被认为在一些方面有可能超越抗体药物。例如，适体经常显示比抗体更高的结合力和更高的特异性。适体不可能经历免疫排除，并且使用适体不可能发生抗体的不良反应特性诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。从递送的角度看，由于适体的尺寸为抗体的约1/10，药物至目标部位的递送较为容易。由于适体通过化学合成制备，因此可以容易地作出各种改动，通过大规模制备降低成本成为可能。同时，适体的血液半衰期通常比抗体的血液半衰期短；然而，就毒性而言，此性质有时是有利的。这些事实得出结论，即使当靶向同一种分子，适体药物有可能优于抗体药物。
[文件列表]
[专利文件]
专利文件1：WO91/19813
专利文件2：WO94/08050
专利文件3：WO95/07364
[非专利文件]
非专利文件1：Binkley J等，(1995)Nucleic Acids Res(核酸研究)，23，3198-3205
发明内容
发明要解决的问题
本发明针对提供针对NGF的适体和利用其的方法，等。
解决问题的方式
本发明人进行了大量的研究以解决上述问题，并且成功地制备了良好质量的针对NGF的适体，从而完成了本发明。
因此，本发明提供了下述各项：
[1]一种适体，其结合NGF并抑制NGF和NGF受体的结合；
[2]一种适体，其结合NGF并抑制NGF的神经突伸长(outgrowth)活性；
[3]根据[2]所述的适体，其具有不大于100nM的50％抑制浓度(IC50)；
[4]根据[2]所述的适体，其具有不大于10nM的50％抑制浓度(IC50)；
[5]根据[1]-[4]中任一项所述的适体，其中至少一个核苷酸被修饰；
[6]根据[1]-[4]中任一项所述的适体，其包含由HGAANNNANCY(SEQ ID NO：106)所示的序列，其中N是任意核苷酸，H是除G以外的核苷酸，Y是嘧啶核苷酸，并且上述序列的至少一个核苷酸被修饰；
[7]根据[1]-[4]中任一项所述的适体，其包含由UGAAANNANCY(SEQ ID NO：107)，CGAANNAAACY(SEQ ID NO：108)或AGAANNAAACY(SEQ ID NO：109)所示的序列，其中N是任意核苷酸，Y是嘧啶核苷酸，并且上述序列的至少一个核苷酸被修饰；
[8]根据[1]-[4]中任一项所述的适体，其包含由UGAAAAAAACY(SEQ ID NO：110)，UGAAAGAAACY(SEQ ID NO：111)，CGAACAAAACY(SEQ ID NO：112)或CGAAAGAAACY(SEQ ID NO：113)所示的序列，其中Y是嘧啶核苷酸，并且上述序列的至少一个核苷酸被修饰；
[9]根据[5]-[8]中任一项所述的适体，其中各个嘧啶核苷酸的核糖的2’-位处的羟基是相同的或不同的，并且是未取代的或被选自由氢原子、氟原子和甲氧基组成的组的原子或基团取代；
[10]根据[5]-[8]中任一项所述的适体，其中各个嘌呤核苷酸的核糖的2’-位处的羟基是相同的或不同的，并且是未取代的或被选自由氢原子、氟原子和甲氧基组成的组的原子或基团取代；
[11]根据[1]所述的适体，其包含下面核苷酸序列(a)，(b)和(c)中的任一个；
(a)包含选自SEQ ID NOs：1-9，12，24-55和57-90(其中尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的核苷酸序列的适体；
(b)包含选自SEQ ID NOs：1-9，12，24-55和57-90(其中尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的核苷酸序列的适体，其中一个或多个核苷酸被取代、删除、插入或添加；和
(c)与选自SEQ ID NOs：1-9，12，24-55和57-90(其中尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的核苷酸序列具有70％以上的同一性的核苷酸序列；
[12]根据[11]所述的适体，其中至少一个核苷酸被修饰；
[13]根据[12]所述的适体，其中各个嘧啶核苷酸的2’-位处的羟基是相同的或不同的，并且是未取代的或被选自由氢原子、氟原子和甲氧基组成的组的原子或基团取代；
[14]根据[12]所述的适体，其中各个嘌呤核苷酸的2’-位处的羟基是相同的或不同的，并且是未取代的或被选自由氢原子、氟原子和甲氧基组成的组的原子或基团取代；
[15]一种复合物，其包含根据[1]-[14]中任一项所述的适体和功能物质；[16]根据[15]所述的复合物，其中所述功能物质是亲和物质，标记物质，酶，药物递送载体或药物；
[17]一种药剂，其包含根据[1]-[14]中任一项所述的适体或根据[15]或[16]所述的复合物；
[18]一种抗疼痛剂，其包含根据[1]-[14]中任一项所述的适体或根据[15]或[16]的复合物；
[19]一种抗炎剂，其包含根据[1]-[14]中任一项所述的适体或根据[15]或[16]所述的复合物；
[20]一种诊断剂，其包含根据[1]-[14]中任一项所述的适体或根据[15]或[16]所述的复合物；
[21]一种用于NGF检测的探针，其包含根据[1]-[14]中任一项所述的适体或根据[15]或[16]所述的复合物；
[22]一种用于NGF纯化的固相载体，其包含根据[1]-[14]中任一项所述的适体或根据[15]或[16]所述的复合物；
[23]一种检测NGF的方法，其包括使用根据[1]-[14]中任一项所述的适体或根据[15]或[16]所述的复合物；
[24]一种纯化NGF的方法，其包括使用根据[1]-[14]中任一项所述的适体或根据[15]或[16]所述的复合物；
[25]一种治疗或预防伴有疼痛或炎症的疾病的方法，其包括向需要所述方法的受试者施用[1]-[14]中任一项所述的适体或[15]或[16]所述的复合物；
[26][1]-[14]中任一项所述的适体或[15]或[16]所述的复合物在用于治疗或预防伴有疼痛或炎症的疾病的药剂中的用途；
[27][1]-[14]中任一项所述的适体或[15]或[16]所述的复合物用作用于治疗或预防伴有疼痛或炎症的疾病的药剂的用途；
[28][1]-[14]中任一项所述的适体或[15]或[16]所述的复合物用作用于治疗或预防伴有疼痛或炎症的疾病的药剂的用途；
[29][1]-[14]中任一项所述的适体或[15]或[16]所述的复合物在制备用于治疗或预防伴有疼痛或炎症的疾病的药剂中的用途。
本发明的效果
本发明的适体和复合物可以用作用于疾病诸如疼痛、炎性疾病等的药剂、诊断剂或试剂。本发明的适体和复合物也可以用于NGF的纯化和浓缩，以及NGF的检测和定量。
附图说明
图1显示通过MFOLD程序预测的由SEQ ID NO：1所示的适体的二级结构，其中包在黑色圆圈中的部分表示共有序列。
图2显示通过MFOLD程序预测的由SEQ ID NO：2所示的适体的二级结构。
图3显示通过MFOLD程序预测的由SEQ ID NO：3所示的适体的二级结构，其中包在黑色圆圈中的部分表示共有序列。
图4显示通过MFOLD程序预测的由SEQ ID NO：4所示的适体的二级结构，其中包在黑色圆圈中的部分表示共有序列。
图5显示通过MFOLD程序预测的由SEQ ID NO：5所示的适体的二级结构，其中包在黑色圆圈中的部分表示共有序列。
图6显示通过MFOLD程序预测的由SEQ ID NO：6所示的适体的二级结构，其中包在黑色圆圈中的部分表示共有序列。
图7显示通过MFOLD程序预测的由SEQ ID NO：7所示的适体的二级结构，其中包在黑色圆圈中的部分表示共有序列。
图8显示通过MFOLD程序预测的由SEQ ID NO：8所示的适体的二级结构。
图9显示通过MFOLD程序预测的由SEQ ID NO：9所示的适体的二级结构，其中包在黑色圆圈中的部分表示共有序列。
图10a显示通过MFOLD程序预测的由SEQ ID NO：12所示的适体的二级结构。
图10b显示通过MFOLD程序预测的由SEQ ID NO：12所示的适体的二级结构。
图11是显示由SEQ ID NO：6所示的适体(Apt)结合人NGF的传感图(sensorgram)，其中40N是含有具有40个核苷酸的随机序列的RNA。使用作为配体的Apt，或作为阴性对照的40N，和作为分析物的人NGF，通过由BIAcore制造的BIAcore2000进行测量。
图12是显示由SEQ ID NO：6所示的适体(Apt)抑制人NGF和人TrkA受体的结合的图，其中40N是含有具有40个核苷酸的随机序列的RNA。使用作为配体的TrkA，作为分析物的NGF和Apt的混合物，作为阴性对照的单独的NGF，以及NGF和40N的混合物，通过由BIAcore制造的BIAcore2000进行测量。
图13是显示由SEQ ID NO：6所示的适体(Apt)抑制人NGF和人P75受体的结合的图，其中40N是含有具有40个核苷酸的随机序列的RNA。使用作为配体的TrkA，作为分析物的NGF和Apt的混合物，作为阴性对照的单独的NGF，以及NGF和40N的混合物，通过由BIAcore制造的BIAcore2000进行测量。
图14显示通过MFOLD程序预测的由SEQ ID NO：31所示的适体的二级结构，其中包在黑色圆圈中的部分表示共有序列。
图15显示通过MFOLD程序预测的由SEQ ID NO：36所示的适体的二级结构，其中包在黑色圆圈中的部分表示共有序列。
具体实施方式
本发明提供了一种具有与NGF的结合活性的适体。本发明的适体结合NGF，并且可以通过抑制NGF和NGF受体的结合来抑制NGF的活性。
适体是指针对特定的靶分子具有结合亲和性的核酸分子。适体可以通过与特定的靶分子结合而抑制该特定靶分子的活性。本发明的适体可以是RNA，DNA，修饰的核酸或它们的混合物。本发明的适体还可以采取线性或环形的形式。
NGF是已知的神经营养蛋白(neurotrophin)，并且是参与外周和中枢神经元的发育和存活的一种重要的分泌性蛋白。NGF是神经生长因子(Nerve Growth Factor)的缩写。在本发明中，NGF特别地指β型NGF。人β-NGF的氨基酸序列是登记号NP002497，P01138，AAI26151，AAI26149和CAB75625所示的那些，它们也可以是带有突变的氨基酸序列，其结构域或肽。其不仅可以是单体，而且可以是二聚体或多聚体。
本发明的适体在生理缓冲液(例如，溶液A：参见实施例1)中结合NGF。本发明的适体以通过下列测试可检测到的强度结合NGF。
对于测量，使用由BIAcore制造的BIAcore2000。适体固定在传感器芯片(sensorchip)上。待固定的量设定为1000RU。含0.3M NaCl的生理缓冲液(溶液A：参见实施例1)用来制备NGF溶液(0.5μM)。注入此NGF溶液(20μL)并检测NGF与该适体的结合。使用含有由40个核苷酸组成的随机核苷酸序列的RNA作为阴性对照，当与对照RNA相比NGF显著地强力结合该适体时，该适体被评价为具有与NGF的结合性(bindability)。
本发明的适体通过结合NGF和抑制NGF与NGF受体的结合来抑制NGF的活性。在本说明书中，“针对NGF的抑制活性”是指对NGF具有的任何活性的抑制能力。例如，其是指抑制NGF与NGF受体结合的活性。
另外，其他“针对NGF的抑制活性”的实例包括抑制NGF受体下游中的信号转导(Ras-MAP激酶途径，PI3激酶途径)，抑制TRPV1，SP，BDNF等的增加的表达，从肥大细胞等释放的HA，BK，PG，NGF和其他细胞因子的表达的抑制活性，等等，它们由NGF与NGF受体的结合所导致。
此外，可以提及的有由NGF诱导的神经细胞的分化；存活、神经突伸长和血管通透性的增加；T细胞和B细胞的免疫应答的增强；淋巴细胞的分化；抑制多种细胞诸如肥大细胞、红白血病细胞、癌细胞等的生长等；减轻疼痛、痛觉过敏等。
本发明的适体所具有的优选“针对NGF的抑制活性”为抑制NGF与NGF受体结合的活性，和抑制由NGF诱导的神经突伸长活性的活性。
在本说明书中，“NGF受体”是指NGF所结合的细胞表面蛋白。作为NGF受体，已知有TrkA和p75。本发明中提到的NGF受体可以是含有天然氨基酸序列或其变体的蛋白。在此，“其变体”是指其中“NGF受体”的氨基酸序列的数个氨基酸已经被取代的蛋白或肽或其部分氨基酸序列，其具有与NGF的结合活性并且抑制NGF与NGF受体的结合。
本发明的适体结合NGF并抑制NGF与NGF受体的结合。可以通过下列测试来评价适体是否抑制NGF与NGF受体的结合。
对于测量，使用由BIAcore制造的BIAcore2000。在CM5传感器芯片上固定有NGF受体和Fc的融合蛋白(例如，Trk A-Fc(175-TK，R&Dsystems))或p75-Fc(R&D systems))。待固定的量为1100RU。NGF(0.1μM)和适体(0.33μM)混合在生理缓冲液(溶液A：参见实施例1)中，并且混合物制备30min。注入此混合物(20μL)，并且检测NGF与NGF受体的结合。当抑制活性(％)不小于60％，适体被评价为抑制NGF与NGF受体的结合。以不存在适体和NGF受体的NGF的结合量为0，且注入无NGF溶液的结合量为100来计算抑制活性(％)。在此，结合量是指在BIAcore的传感图的峰顶处的RU值(NGF注入结束后即刻的RU值)。
在一个实施方案中，本发明的适体可以抑制NGF和TrkA的结合，以及NGF和p75的结合两者。
本发明的适体可以显示针对来源于任何哺乳动物的NGF的抑制活性。这样的哺乳动物包括灵长类动物(例如，人、猴子)、啮齿类动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠)、以及伴侣动物(companion animals)、家畜和劳作动物(working animals)(例如，犬、猫、马、牛、山羊、绵羊、猪)。
本发明的适体没有特别的限制，只要其结合NGF的任何部分并且可以抑制NGF与NGF受体的结合。
在一个优选的实施方案中，本发明的适体包含由HGAANNNANCY(SEQ ID NO：106)所示的序列，其中N是任意核苷酸，H是除G以外的核苷酸，且Y是嘧啶核苷酸，所述适体结合NGF并且抑制NGF与NGF受体的结合。SEQ ID NO：106所示的核苷酸序列包含在结合NGF并且抑制NGF与NGF受体的结合的适体中，所述适体通过下面提及的SELEX法获得。上面提及的序列的至少一个核苷酸优选地被修饰。
在一个优选的实施方案中，本发明的适体包含由UGAAANNANCY(SEQ ID NO：107)，CGAANNAAACY(SEQ ID NO：108)或AGAANNAAACY(SEQ ID NO：109)所示的共有序列，其中N是任意核苷酸，Y是嘧啶核苷酸，所述适体结合NGF并且抑制NGF与NGF受体的结合。SEQ ID NO：107，SEQ ID NO：108和SEQ ID NO：109所示的核苷酸序列包含在结合NGF并且抑制NGF与NGF受体的结合的适体中，所述适体通过下面提及的SELEX法获得。这些序列的至少一个核苷酸优选地被修饰。
在一个优选的实施方案中，本发明的适体包含由UGAAAAAAACY(SEQ ID NO：110)，UGAAAGAAACY(SEQ ID NO：111)，CGAACAAAACY(SEQ ID NO：112)或CGAAAGAAACY(SEQ ID NO：113)所示的共有序列，其中Y是嘧啶核苷酸，所述适体结合NGF并且抑制NGF与NGF受体的结合。SEQ ID NO：110，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：112和SEQ ID NO：113所示的核苷酸序列包含在结合NGF并且抑制NGF与NGF受体的结合的适体中，所述适体通过下面提及的SELEX法获得。这些序列的至少一个核苷酸优选地被修饰。
另外，本发明的适体可以是结合NGF并抑制NGF的神经突伸长活性的适体。适体是否抑制NGF的神经突伸长活性可以通过实施例7或实施例8中所述的试验来评价。
另外，提供50％的神经突伸长活性的适体浓度(IC50)也可以通过使用不同的适体浓度进行实施例8中所述的试验来确定。本发明的适体的IC50优选不大于100nM，更优选不大于10nM。
本发明的适体的长度没有限制，并且通常可以是约10-约200个核苷酸，并且可以是，例如，不多于约100个核苷酸，优选不多于约60个核苷酸，更优选不多于约50个核苷酸，最优选不多于约45个核苷酸。当核苷酸总数较小时，化学合成和大量生产将更容易，并且在成本上存在显著优势。还认为较容易进行化学修饰，体内稳定性较高，并且毒性较低。
本发明的适体中包含的各个核苷酸是相同的或不同的，并且可以是在核糖(例如，嘧啶核苷酸的核糖，嘌呤核苷酸的核糖)的2’-位处包含羟基的核苷酸(即，未取代的核苷酸)或在核糖的2’-位处被任何原子或基团取代的核苷酸。作为任何这样的原子或基团的实例，可以提及用氢原子、氟原子或-O-烷基基团(例如，-O-Me基团)、-O-酰基基团(例如，-O-CHO基团)，或氨基基团(例如，-NH2基团)取代的核苷酸。
本发明的适体也可以是这样的核苷酸，其中至少一种类型的(例如，1，2，3或4种类型)核苷酸在核糖的2’位处包含羟基，或上述任意原子或基团的核苷酸，例如，选自由氢原子、氟原子、羟基和-O-Me基团组成的组的至少两种(例如2，3或4种)基团。
此外，在本发明的适体中，所有的嘧啶核苷酸是相同的或不同的，并且每种均可以是在核糖的2’处被氟原子取代的核苷酸，或在核糖的2’处被上面提及的任意原子或基团取代的核苷酸，优选所述原子或基团选自由氢原子、羟基和甲氧基组成的组。
此外，在本发明的适体中，所有的嘌呤核苷酸是相同的或不同的，并且每种均可以是在核糖的2’处被羟基取代的核苷酸，或被上面提及的任意原子或基团取代的核苷酸，优选所述原子或基团选自由氢原子、甲氧基和氟原子组成的组。
本发明的适体也可以是这样的一种适体，其中所有的核苷酸在核糖的2’位处包含羟基，或上面提及的任意原子或基团，例如，通过由氢原子、氟原子、羟基和-O-Me基团组成的组选择的相同基团。
在本说明书中，在描述如何修饰核苷酸中的糖基时，假设构成适体的核苷酸是RNAs(即，糖基假设是核糖)。然而，这不意味着DNA被排除在构成适体的核苷酸之外，并且RNA的修饰应该被理解为当适当时对DNA的修饰。例如，当构成适体的核苷酸是DNA时，在核糖的2’处羟基被X取代应该被理解为在脱氧核糖的2’处一个氢原子被X取代。
本发明的适体还可以是：
(a)包含选自SEQ ID NO：1-9，12，24-55和57-90(条件是尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的核苷酸序列的适体；
(b)包含选自SEQ ID NO：1-9，12，24-55和57-90(条件是尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的核苷酸序列的适体，其中一个或多个核苷酸被取代、删除、插入或添加；
(c)包含与选自SEQ ID NO：1-9，12，24-55和57-90(条件是尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的核苷酸序列具有70％以上(优选80％以上，更有选90％以上，最优选95％以上)的同一性的核苷酸序列的适体；或
(d)缀合物，其选自由多个上述适体(a)的缀合物、多个上述适体(b)的缀合物、多个上述适体(c)的缀合物，和多个上述适体(a)、(b)和(c)的缀合物组成的组。
上面提及的(b)-(d)的适体可以结合NGF和/或抑制NGF的活性(NGF受体结合活性等)。
另外，优选地，上面提及的(b)-(d)的适体结合NGF并抑制NGF与NGF受体的结合，和/或结合NGF，并抑制NGF的神经突伸长活性。
更优选，上面提及的(b)-(d)的适体显示不大于100nM，更优选不大于10nM的NGF神经突伸长抑制浓度。
在上述(b)中，被取代、删除、插入或添加的核苷酸数目没有特别限制，只要所述适体结合NGF，并且可以抑制NGF的活性(NGF受体结合活性等)。其可以是，例如，不多于约30个，优选不多于约20个，更优选不多于约10个，更优选不多于5个，最优选为4，3，2或1个。
关于上述(c)中，“同一性”是指在使用本技术领域中公知的数学算法(优选该算法考虑在一个或两个序列上引入空位以获得最佳比对)对两个核苷酸序列进行比对的最优比对中，相同核苷酸残基与所有重叠的核苷酸残基的比率(％)。
本发明说明书中的核苷酸序列同一性可以通过，例如，使用同源性计算算法NCBI BLAST-2(国立生物技术信息中心基础局部比对搜索工具中心(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool))在下列的条件下(空位开放(gap open)＝5个罚分；空位延伸(gap extension)＝2个罚分；x_dropoff＝50；预期值(expectation value)＝10；过滤(filtering)＝ON)比对两个核苷酸序列来计算。
在上述(d)中，缀合可以通过串联结合获得。在缀合过程中，可以使用接头。作为接头，可以提及核苷酸链(例如，1-约20个核苷酸)和非-核苷酸链(例如，-(CH2)n-接头，-(CH2CH2O)n-接头，六甘醇(hexaethylene glycol)接头，TEG接头，包含肽的接头，包含-S-S-键的接头，包含-CONH-键的接头，包含-OPO3-键的接头)。对在上述多个缀合物中提及的多个(plurality)没有特别限制，只要它是两个或多个，并且所述多个可以是，例如，2、3、或4个。在上述(a)-(d)中的每个核苷酸，不管是相同的还是不同的，可以是在核糖的2’位处包括羟基的核苷酸，或是在核糖(例如，嘧啶核苷酸的核糖)的2’位处用任意基团(例如，氢原子，氟原子或-O-Me基团)取代的核苷酸。
本发明的适体可以是其中每个核苷酸的糖残基(例如，核糖)已经被修饰以增加NGF结合活性，NGF-NGF受体结合抑制活性，NGF神经突伸长抑制活性，适体的稳定性，药物递送性等的适体。作为糖残基中的修饰作用的实例，可以提及糖残基的2’-位，3’-位和/或4’-位处的氧原子被另一个原子取代，等。作为修饰作用的种类，可以提及氟化作用、O-烷基化(例如，O-甲基化，O-乙基化)，O-芳基化，S-烷基化(例如，S-甲基化，S-乙基化)，S-芳基化，和胺化(例如，-NH2)。在糖残基中的这种改变可以通过本身已知的方法进行(参见，例如，Sproat等，(1991)Nucle.Acid.Res.(核酸研究)19，733-738；Cotton等，(1991)Nucle.Acid.Res.(核酸研究)19，2629-2635；Hobbs等，(1973)Biochemistry(生物化学)12，5138-5145)。
本发明的适体可以具有改变(例如，化学取代)的核酸碱基(例如，嘌呤或嘧啶)，以增加NGF结合活性，NGF-NGF受体结合抑制活性，NGF神经突伸长抑制活性等。作为这样的改变的实例，可以提及5-位处的嘧啶改变，6-和/或8-位处的嘌呤改变，用环外胺(extracyclic amine)改变、用4-硫尿苷取代、和用5-溴或5-碘-尿嘧啶取代。可以改变包含在本发明的适体中的磷酸基团，从而赋予针对核酸酶和水解的抗性。例如，P(O)O基团可以用P(O)S(硫代(thioate))，P(S)S(二硫代(dithioate))，P(O)NR2(酰胺化)，P(O)R，R(O)OR’，CO或CH2(formacetal)或3’-胺(-NH-CH2-CH2-)取代[其中R或R’的每个单元独立地是H，或是取代的或未取代的烷基(例如，甲基，乙基)]。
连接基团是，例如，-O-，-N-或-S-，并且核苷酸可以通过这些连接基团与相邻的核苷酸结合。
所述改变还可以包括如在3’和5’加帽的改变。
改变还可以通过在末端添加下列各项而进行：聚乙二醇、氨基酸、肽、倒置的(inverted)dT、核酸、核苷、肉豆蔻酰基、石胆酸(Lithocolic)-油基、二十二烷基、月桂酰、硬脂酰、棕榈酰、油酰、亚油酰(linoleoyl)、其它脂质、类固醇、胆固醇、咖啡因、维生素、色素、荧光性物质、抗癌药、毒素、酶、放射性物质、生物素等。对于这样的改变，参见，例如，美国专利5,660,985和5,756,703。
可以通过本文公开和本领域本身已知的方法化学合成本发明的适体。适体以宽泛种类的结合方式与靶分子结合，诸如基于磷酸基团负电荷的离子键、基于核糖的疏水键和氢键、基于核酸碱基的氢键和堆积相互作用(stacking interaction)。特别地，基于磷酸基团负电荷的离子键很强，并且与在蛋白正电荷表面上存在的赖氨酸和精氨酸结合，所述磷酸基团以与组成核苷酸的数目相同的数目存在。由于这种原因，不参与与靶分子直接结合的核酸碱基可以被取代。特别地，因为干(stem)结构区已经形成碱基对，并且朝向双螺旋结构的内侧，所以核酸碱基不可能直接与靶分子结合。因此，即使当用另一碱基对取代碱基对时，适体的活性通常不降低。在其中不形成碱基对的结构中，诸如环结构中，假如所述核酸碱基不参与与靶分子直接结合，则碱基取代是可能的。关于核糖2’-位置的修饰，在核糖2’-位置的官能团很少与靶分子直接相互作用，但是在许多情形中，它是不相关的，并且可以被另一种修饰的分子取代。因此，除非参与与靶分子直接结合的官能团被取代或删除，适体通常保留其活性。整体三维结构基本上没有改变也是重要的。
适体可以利用SELEX方法或其改进形式(例如，Ellington等，(1990)Nature(自然)，346，818-822；Tuerk等，(1990)Science(科学)，249，505-510)制备。在SELEX方法中，通过增加轮数或使用竞争物质，浓缩并且选择表现出针对靶分子更强的结合潜力的适体。因此，通过调整SELEX的轮数，和/或改变竞争性条件，在一些情形中可以获得具有不同结合力的适体、具有不同结合模式的适体、和具有相同结合力或结合模式但具有不同碱基序列的适体。SELEX方法包括通过PCR扩增的过程；通过在该过程中使用锰离子等引起突变，以更高多样性进行SELEX是可能的。
通过SELEX获得的适体是表现出针对靶物质的高亲和性的核酸，但这并不意味着与所述靶物质的活性位点的结合。因此，通过SELEX获得的适体不一定对靶物质的功能起作用。NGF是碱性蛋白，并且被认为可能允许核酸与其非特异性地结合。不结合活性位点的适体不会影响靶物质的活性。事实上，用于控制的RNA不抑制NGF和NGF受体的结合。
基于由此选择的有活性的适体，SELEX可以通过进一步改变引物来进行从而获得具有较高活性的适体。具体地，在制备其中具有确定的序列的适体被部分随机化的模板或掺杂约10-30％随机序列的模板后，再次进行SELEX。
通过SELEX获得的适体具有约80个核苷酸的长度，并且这难以将其原样作为药物制备。因此，重复尝试-和-差错性尝试(try-and-error efforts)以将适体缩短为长度约为50个核苷酸或更少从而能够使化学合成变容易，是必要的。取决于针对通过SELEX获得的适体的引物设计，随后的最小限度操作容易性改变。除非成功设计引物，否则随后的发展将是不可能的，即使是通过SELEX选择了具有活性的适体。在本发明中，获得了甚至具有38个核苷酸的保留了活性的适体。
适体容易被修饰，原因在于它们允许化学合成。对于适体，通过使用MFOLD程序预测二级结构，或通过X-射线分析或NMR分析预测空间结构，可能在某种程度上预测哪种核苷酸可以被取代或删除，和在何处插入新的核苷酸。预测的具有新序列的适体可以容易地进行化学合成，并且使用现有的测定系统可以确定所述适体是否保留活性。
如果通过上述重复的尝试-和-差错性尝试鉴定了对所获得的适体与靶分子结合很重要的区域，则在许多情形中，甚至在向所述序列的两端添加新序列时，活性将保持不变。对新序列的长度没有特别限制。特别地，由HGAANNNANCY(SEQ ID NO：106)，UGAAANNANCY(SEQ ID NO：107)，CGAANNAAACY(SEQ ID NO：108)，AGAANNAAACY(SEQ ID NO：109)，UGAAAAAAACY(SEQ ID NO：110)，UGAAAGAAACY(SEQ ID NO：111)，CGAACAAAAC(SEQ ID NO：112)和CGAAAGAAAC(SEQ ID NO：113)所示的上述序列是对于本发明的适体结合NGF和抑制NGF与NGF受体的结合重要的部分。即使当将新序列添加至这些序列的两端，在许多情况下活性仍然不会改变。
修饰，如同序列，提供宽范围的设计或变化。
如上文阐述，适体允许修饰作用的宽范围的设计或变化。本发明还提供适体的制备方法，其能够进行包括指定序列(例如，与选自干区、内环区、发夹环区和单链区的部分相对应的序列；以下，在需要时简称为固定序列)的适体的宽范围的设计或变化。
例如，所述适体的制备方法包括通过使用单种类型的核酸分子或多种类型的核酸分子(例如，具有不同数目的a、b等的核酸分子文库)和分别对应于引物序列(i)和(ii)的引物对产生包括固定序列的适体，所述核酸分子由下式所示的核苷酸序列组成：
Figure BPA00001332082900171
-(N)a-固定序列-(N)b-
Figure BPA00001332082900172
[其中(N)a表示由“a”个N单元组成的核苷酸链；(N)b表示由“b”个N单元组成的核苷酸链；每个N单元，不管是相同的还是不同的，是选自由A，G，C，U和T(优选地，A，G，C和U)组成的组的核苷酸。“a”和“b”的每个，不管是相同的还是不同的，可以是任意的数目，并且可以是，例如，1-约100，优选为1-约50，更优选为1-约30，还更优选为1-约20或1-约10]。
本发明还提供包括本发明的适体和与其结合的功能物质的复合体。本发明的复合体中适体和功能物质之间的键可以是共价键或非共价键。本发明的复合体可以是这样一种复合物，即，其中本发明的适体和一种或多种(例如，2或3个)相同类型或不同类型的功能物质结合在一起。对所述功能物质没有特别限制，只要它新赋予本发明的适体某种功能，或能够改变(例如，提高)本发明的适体可以具有的某种特征。作为功能物质的实例，可以提及蛋白、肽、氨基酸、脂质、糖、单糖、多核苷酸和核苷酸。作为功能物质的实例，可以提及下列各项：亲和物质(例如，生物素，链霉抗生物素，具有针对靶互补序列的亲和性的多核苷酸，抗体，谷胱甘肽琼脂糖，组氨酸)，标记物质(例如，荧光物质，发光物质，放射性同位素)，酶(例如，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶)，药物递送载体(例如，脂质体，微球体，肽，聚乙二醇)，药物(例如，在定向破坏(missile)治疗中使用的那些，如刺孢霉素(calicheamycin)和多卡米星(duocarmycin)；氮芥类似物如环磷酰胺(cyclophosphamide)，美法仑(melphalan)，异环磷酰胺(ifosfamide)或曲磷胺(trofosfamide)；氮丙啶(ethylenimines)如塞替派(thiotepa)；亚硝基脲(nitrosoureas)如卡莫司汀(carmustine)；烷化剂如替莫唑胺(temozolomide)或达卡巴嗪(dacarbazine)；叶酸样代谢拮抗剂如甲氨蝶呤(methotrexate)或雷替曲塞(raltitrexed)；嘌呤类似物如硫鸟嘌呤(thioguanine)，克拉屈滨(cladribine)或氟达拉滨(fludarabine)；嘧啶类似物如氟尿嘧啶(fluorouracil)，替加氟(tegafur)或吉西他滨(gemcitabine)；长春花生物碱(vinca alkaloids)如长春碱(vinblastine)，长春新碱(vincristine)或长春瑞滨(vinorelbine)以及它们的类似物；鬼臼毒素(podophyllotoxin)衍生物如依托泊苷(etoposide)，紫衫烷(taxans)，多西他赛(docetaxel)或紫杉醇(paclitaxel)；蒽环霉素(anthracyclines)如多柔比星(doxorubicin)，表柔比星(epirubicin)，伊达比星(idarubicin)和米托蒽醌(mitoxantrone)以及它们的类似物；其它细胞毒性抗生素如博来霉素(bleomycin)和丝裂霉素(mitomycin)；铂化合物如顺铂(cisplatin)，卡铂(carboplatin)和奥沙利铂(oxaliplatin)；喷司他丁(pentostatin)，米替福新(miltefosine)，雌莫司汀(estramustine)，托泊替康(topotecan)，伊立替康(irinotecan)和比卡鲁胺(bicalutamide))，和毒素(例如，蓖麻毒素(ricin toxin)，liatoxin和Vero毒素(Vero toxin))。在一些情形中，最终去除这些功能分子。此外，所述分子可以是能够被酶识别和裂解的肽，所述酶如凝血酶、基质金属蛋白酶(MMP)，和因子X识别和裂解的肽，并且可以是可被核酸酶或限制性核酸内切酶裂解的多核苷酸。
本发明的适体或复合体可以用作，例如，药剂或诊断剂、检测药物、试剂、用于饮用水和食物的添加剂、增强剂和缓和剂。
本发明的适体和复合物可以通过结合NGF和抑制NGF与NGF受体的结合而具有抑制NGF的功能的活性。如上所述，NGF深入地参与到疼痛和炎症中。因此，本发明的适体和复合物能够用作用于治疗和预防伴有疼痛或炎症的疾病的药剂(抗疼痛剂，抗炎剂等)。
在此，疼痛的实例包括伤害性疼痛(nociceptive pain)(肌痛(muscular pain)，背痛(back pain)，上肢痛(upper limb pain)，鞭伤(whiplash injury)，关节痛(arthralgia)，骨关节炎(osteoarthritis)，痛风(gout)，慢性类风湿性关节炎(chronic rheumatoid arthritis)，头痛(headache)，偏头痛(migraine headache)，紧张性头痛(catatonic headache)，丛集性头痛(cluster headache)，继发性头痛(secondary headache)，口面疼痛(orofacial pain)，牙痛(toothache)，拔牙后灼性神经痛(causalgia after tooth extraction)，幻觉牙痛(phantom tooth pain)，内脏痛(visceral pain)，心脏疼痛(cardiac pain)，腹痛(abdominal pain)，经间痛(mittelschmerz)，痛经(dysmenorrhea)，产痛(labor pain)，肾痛(nephralgia)，输尿管痛(ureteralgia)，骨痛(ostalgia)等)，炎性痛(inflammatory pain)，神经性疼痛(neuropathic pain)(糖尿病神经病变(diabetic neuropathy)，中毒性神经病(toxic neuropathy)，术后疼痛(pain after operation)，幻肢痛(phantom limb pain)，断片部痛(fragment pain)，反射性交感神经营养障碍(reflex sympathetic dystrophy)，灼性神经痛(causalgia)，疱疹后疼痛(postherpetic pain)，三叉神经痛(trigeminal neuralgia)，中枢性疼痛(central pain))，癌性疼痛(由于癌症浸润进入内脏器官导致的疼痛，由于癌组织浸润血管导致的血管阻塞引起的疼痛，骨转移的疼痛，与脑内转移相关的疼痛，由癌组织浸润外周神经导致的疼痛)，纤维肌痛(fibromyalgia pain)等。
尽管在此与炎症相关的疾病不特别限制，但可以提及系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus)，多发性硬化(multiple sclerosis)，银屑病(psoriasis)，骨关节炎(osteoarthritis)，慢性类风湿性关节炎(chronic rheumatoid arthritis)，间质性膀胱炎(interstitial cystitis)，哮喘(asthma)等。
尽管上面提及的癌症不特别地限制，但可以提及食道癌(esophagus cancer)，甲状腺癌(thyroid cancer)，膀胱癌(urinary bladder cancer)，结肠直肠癌(colorectal cancer)，胃癌(gastric cancer)，胰腺癌(pancreatic cancer)，胸部癌症(thoracic cancer)，肝癌(liver cancer)，肺癌(lung cancer)，非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer)，乳癌(breast cancer)，成神经细胞瘤(neuroblastoma)，成神经细胞瘤(neuroblastoma)，成胶质细胞瘤(glioblastoma)，子宫癌(uterine cancer)，宫颈癌(cervical cancer)，卵巢癌(ovarian cancer)，肾母细胞瘤(Wilms’tumor)，前列腺癌(prostate cancer)等。
当NGF结合其受体TrkA时，其激活TrkA的酪氨酸磷酸化和TrkA下游处的Ras-MAPK，PLC-γ，PI3K等，并且显示生理学作用诸如神经细胞的存活和分化。另一方面，其经p75受体诱导信号途径中的细胞死亡。因此，本发明的适体和复合物可以用作用于涉及这些信号转导途径的激活的疾病的药剂，诊断剂，检测药物，或试剂。涉及这些信号转导途径的激活的疾病的实例包括上面提及的疼痛和癌症。
当本发明的适体和复合物用作药剂，诊断剂，检测药物，试剂等时，施用所述适体的受试者不特别限制，并且，例如，可以提及灵长类动物(例如，人、猴子)、啮齿类动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠)、以及伴侣动物、家畜和劳作动物(例如，犬、猫、马、牛、山羊、绵羊、猪)。
本发明的适体和复合物能够特异性地结合NGF。因此，本发明的适体和复合物有效用作用于NGF检测的探针。所述探针有效用于NGF的体内成像，血液浓度的测量，组织染色，ELISA等。所述探针也有效用作用于由NGF参与的疾病(伴有疼痛或炎症的疾病等)的诊断剂，检测药物，试剂等。
基于它们与NGF的特异性结合，本发明的适体和复合物可以用作用于纯化NGF的配体。
另外，本发明的适体和复合物可以用作用于检验幻想癖(romance)等的精神状况的检测药物，或用于控制所述精神状况的药剂、调节剂、增强剂或缓和剂。
本发明的适体和复合物可以用作药物递送载体。
本发明的药物可以是与药用载体配制在一起的药物。作为药用载体的实例，可以提及下列各项：赋形剂如蔗糖，淀粉，甘露醇(mannit)，山梨醇，乳糖，葡萄糖，纤维素，滑石，磷酸钙，和碳酸钙；粘合剂如纤维素，甲基纤维素，羟丙基纤维素，聚丙基吡咯烷酮，明胶，阿拉伯树胶，聚乙二醇，蔗糖，和淀粉；崩解剂如淀粉，羧甲基纤维素，羟基丙基淀粉，乙二醇钠-淀粉(sodium-glycol-starch)，碳酸氢钠，磷酸钙，和柠檬酸钙；润滑剂如硬脂酸镁，二氧化硅气凝胶(Aerosil)，滑石，和十二烷基硫酸钠；调味剂如柠檬酸，薄荷醇，甘草皂苷-铵盐，甘氨酸，和橙味粉剂；防腐剂如苯甲酸钠，亚硫酸氢钠，对羟基苯甲酸甲酯，和对羟基苯甲酸丙酯；稳定剂如柠檬酸，柠檬酸钠，和乙酸；悬浮剂如甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，和硬脂酸铝；分散剂如表面活性剂；稀释剂如水，生理盐水，和橙汁；基质蜡(base waxs)诸如可可脂，聚乙二醇，和煤油；等等，但是这些不是限制性的。
适合口服施用的制剂是通过将有效量的配体溶解在稀释剂如水、生理盐水、或橙汁中而制备的溶液；包括采用固体或颗粒形式的有效量的配体的胶囊、囊剂或片剂；通过将有效量的活性成分悬浮在适当的分散剂中而制备的混悬液；通过在适当的分散剂中分散并且乳化有效量活性成分的溶液而制备的乳状液，等等。
出于掩饰味道、肠内溶解、持续释放等目的，本发明的药物可以通过本身已知的方法进行包被。作为用于包被的包衣剂的实例，使用下列各项：羟丙基甲基纤维素，乙基纤维素，羟甲基纤维素，羟丙基纤维素，聚氧乙烯二醇，吐温80，Pluronic F68，醋酸邻苯二甲酸纤维素，羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯，羟甲基纤维素乙酸琥珀酸酯，Eudragit(由Rohm，德国制造，甲基丙烯酸/丙烯酸共聚物)，色素(例如，红色氧化铁，二氧化钛等)等。所述药物可以是快速释放的制剂或持续释放的制剂。持续释放的基质的实例包括脂质体、atelocollagen、明胶、羟磷灰石、PLGA等。
作为适于肠胃外施用(例如，静脉内施用、皮下施用、肌内施用、局部施用、腹膜内施用、鼻内施用、肺部施用等)的制剂，可用水性和非水性等渗无菌注射液，其可以包括抗氧化剂、缓冲溶液、制菌剂、等渗剂等。也可以提及水性和非水性无菌混悬液，其可以包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、防腐剂等。制剂可以以单位剂量体积或以数个分开的剂量包含在容器中，如安瓿或小瓶中。活性成分和药用载体也可以是冻干的，并且以这样的状态保存，即，其可以在即将使用前，溶解或悬浮在适当的无菌载体中。持续释放制剂也是合适的制剂。持续释放制剂包括从埋植在体内的载体或容器持续释放，所述载体或容器诸如人工骨，可生物降解的或不可降解的海绵，袋子，药泵，渗透压泵等。用于从体外持续地或间歇地，全身地或局部地递送的装置也包括在持续释放制剂的范围内。可生物降解的基质包括脂质体，阳离子脂质体，聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物(PLGA)，atherocollagen，明胶，羟磷灰石，多糖西佐喃(polysaccharide sizofiran)。除了注射液和持续释放制剂之外，吸入剂和油膏也是可以接受的。在吸入剂的情形中，将处于冻干状态的活性成分微粉化，并且使用适当的吸入装置通过吸入而施用。当需要时，吸入剂可以适当地用常规使用的表面活性剂、油、调料、环糊精或其衍生物等配制。
在此，作为表面活性剂的实例，可以提及下列各项：油酸，磷脂酰胆碱，二甘醇二油酸酯，油酸四氢糠酯(tetrahydroflufuryl oleate)，油酸乙酯，肉豆蔻酸异丙酯，三油酸甘油酯，单月桂酸甘油酯，甘油单油酸酯，甘油单硬脂酸酯，甘油基monolysinoate，鲸蜡醇，硬脂醇，聚乙二醇400，氯化十六烷基吡啶，失水山梨糖醇三油酸酯(商标名，司盘85)，失水山梨糖醇单油酸酯(商标名，司盘80)，失水山梨糖醇单月桂酸酯(商标名，司盘20)，聚氧乙烯硬化蓖麻油(商标名，HCO-60)，聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单月桂酸酯(商标名，吐温20)，聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单油酸酯(商标名，吐温80)，天然来源的磷脂酰胆碱(商标名，EPICLON)，油烯基聚氧乙烯(2)醚(oleylpolyoxyethylene(2)ether)(商标名，Brij 92)，硬脂酰聚氧乙烯(2)醚(商标名，Brij 72)，十二烷基聚氧乙烯(4)醚(商标名，Brij 30)，油烯基聚氧乙烯(2)醚(商标名，Genapol 0-020)，氧乙烯和氧丙烯嵌段共聚物(商标名，Synperonic)等等。作为油的实例，可以提及玉米油、橄榄油、棉籽油、葵花油等。在油膏的情形中，将适当的药用基质(黄色矿脂，白色矿脂，石蜡，液体石腊和聚乙烯的复合软膏基质(plastibase)，硅氧烷，白色油膏，蜂蜡，猪油，植物油，亲水性油膏，亲水性矿脂，纯化的羊毛脂，水解羊毛脂，吸水性油膏，亲水性液体石腊和聚乙烯的复合软膏基质，聚二乙醇油膏等)与活性成分掺合，并且用作制剂。
吸入剂可以按照常规方法生产。具体地，吸入剂可以这样生产：通过将上述本发明的适体和复合体粉末化或液化，将其掺加到吸入推进剂和/或载体中，并且将其填充在适当的吸入容器中。当上述本发明适体和复合体是粉末时，可以使用普通的机械粉末吸入器；在液体的情形中，可以使用诸如喷雾器的吸入器。此处，作为推进剂，可以广泛使用常规已知的一种推进剂；可以提及下列各项：含氯氟烃-系列化合物，如含氯氟烃-11，含氯氟烃-12，含氯氟烃-21，含氯氟烃-22，含氯氟烃-113，含氯氟烃-114，含氯氟烃-123，含氯氟烃-142c，含氯氟烃-134a，含氯氟烃-227，含氯氟烃-C318，和1，1，1，2-四氟乙烷，烃类如丙烷，异丁烷，和正丁烷，醚如二乙醚，压缩气体如氮气和二氧化碳气体，等。
本发明药物的剂量取决于活性成分的类型和活性、疾病的严重性、作为施用受试者的动物物种、施用的受试者对药物耐受性、体重、年龄等而变化，并且，基于每天用于成年人的活性成分量，通常的剂量可以是约0.0001-约100mg/kg，例如，约0.0001-约10mg/kg，优选约0.005-约1mg/kg。
本发明还提供将本发明适体和复合体固定在其上的固相载体。作为所述固相载体的实例，可以提及基底、树脂、平板(例如，多孔平板)、滤器、药筒、柱、和多孔材料。所述基底可以是用在DNA芯片、蛋白质芯片等中的基底；例如，可以提及镍-PTFE(聚四氟乙烯)基底，玻璃基底，磷灰石基底，硅基底，氧化铝基底等，和通过用聚合物等包被这些基底而制备的基底。作为树脂的实例，可以提及下列各项：琼脂糖颗粒，二氧化硅颗粒，丙烯酰胺和N，N’-亚甲基二丙烯酰胺的共聚物，聚苯乙烯-交联的二乙烯基苯颗粒，与表氯醇交联的葡聚糖颗粒，纤维素纤维，芳基葡聚糖和N，N’-亚甲基二丙烯酰胺的交联聚合物，单分散性合成聚合物，单分散性亲水性聚合物，琼脂糖，Toyopearl等，并且还包括通过将各种官能团结合在这些树脂上而制备的树脂。本发明的固相载体可以有效用于，例如，纯化、检测和定量NGF。
本发明的适体和复合体可以通过本身已知的方法固定在固相载体上。例如，可以提及这样的方法，即，所述方法向本发明的适体或复合体中引入亲和物质(例如，上述那些)或预先确定的官能团，并且然后将所述适体和复合体通过所述亲和物质或预先确定的官能团固定在固相载体上。本发明也提供这样的方法。所述预先确定的官能团可以是可以进行偶联反应的官能团；例如，可以提及氨基基团、硫醇基团、羟基基团、和羧基基团。本发明还提供在其中引入这样的官能团的适体。
本发明还提供了纯化和浓缩NGF的方法。特别地，本发明使将NGF从其他家族蛋白的蛋白中分离成为可能。本发明的纯化和浓缩方法可以包括将NGF吸附到本发明的固相载体上，并且用洗脱剂洗脱所吸附的NGF。将NGF吸附到本发明的固相载体上可以通过本身已知的方法实现。例如，将含有NGF的样品(例如，细菌或细胞培养物或培养物上清，血液)引入到本发明的固相载体中或引入到包含本发明的固相载体的组合物中。NGF可以使用诸如中性溶液的洗脱剂来洗脱。对所述中性洗脱剂没有限制，其可以具有例如约6-约9、优选约6.5-约8.5、且更优选约7-约8的pH。所述中性溶液还可以包括，例如，尿素、螯合剂(例如，EDTA)、钾盐(例如，KCl)、镁盐(例如，MgCl2)、表面活性剂(例如，吐温20，Triton，NP40)、和或甘油。本发明的纯化和浓缩方法还可以包括在NGF吸附后用洗涤溶液洗涤所述固相载体。洗涤溶液的实例，包括含有尿素，螯合剂(例如，EDTA)，Tris，酸，碱，转移RNA，DNA，表面活性剂诸如吐温20，盐诸如NaCl等的那些。本发明的纯化和浓缩方法还可以包括加热所述固相载体。该步骤能使所述固相载体再生和灭菌。
本发明还提供检测和定量NGF的方法。特别地，本发明使与其他家族蛋白的蛋白分开地检测和定量NGF成为可能。本发明的检测和定量方法可以包括通过使用本发明的适体(例如，使用本发明的复合体和固相载体)测量NGF。检测和定量NGF的方法可以以与免疫学方法相同的方式进行，不同的是用本发明的适体替代抗体。因此，检测和定量可以通过使用本发明的适体替代抗体作为探针，以与诸如下列各项的那些方法相同的方式进行：酶免疫测定(EIA)(例如，直接竞争性ELISA，间接竞争性ELISA，夹心ELISA)，放射性免疫测定(RIA)，荧光免疫测定(FIA)，蛋白质印迹技术，免疫组织化学染色方法，和细胞分选方法。本发明的适体还可以用作PET等的分子探针。这些方法可以有效用于，例如，测量在活生物体或生物样品中的NGF含量，并且诊断与NGF相关的疾病。
在本文中提及的所有出版物的公开内容，包括专利和专利申请说明书，以所有这些出版物被明确地给出的程度通过引用结合在本发明中。
以下，通过下述实施例更详细地描述本发明，然而，所述实施例并不限制本发明的范围。
实施例1：制备特异性结合NGF1的RNA适体
使用SELEX方法制备特异性结合NGF的RNA适体。参考Ellington等(Ellington和Szostak，Nature(自然)346，818-822，1990)的方法和Tuerk等(Tuerk和Gold，Science(科学)249，505-510，1990)的方法进行SELEX。人NGF(由R&D Systems制造)用作靶物质。
通过使用DuraScribeTM T7转录试剂盒(由Epicentre制造)转录化学合成的DNA而获得第一轮所用的RNA(40N-RNA)。通过该方法获得的RNA在嘧啶核苷酸的核糖2’-位处被氟-取代。下文所示的长度为79个核苷酸的DNA，被用作DNA模板，其在40个核苷酸的随机序列的每一端具有引物序列。所述DNA模板和引物通过化学合成制备。
DNA模板：5’-ccagttgttggtgacaatgc-40N-gcagctccacaggcttccc-3’(SEQ ID NO：114)
正向引物：5’-taatacgactcactatagggaagcctgtggagctgc-3’(SEQ ID NO：115)
反向引物：5’-ccagttgttggtgacaatgc-3’(SEQ ID NO：116)
N代表A，G，C和T中的任一个。正向引物包括T7 RNA聚合酶的启动子序列。第一轮中使用的RNA集合体的变化理论上为1014。
在进行10轮SELEX后，对序列进行测序；观察到序列趋同性(convergence)。在48个克隆中，存在6个由SEQ ID NO：1显示的序列，和5个由SEQ ID NO：2显示的序列。存在3个由SEQ ID NOs：3-5显示的序列，和2个由SEQ ID NOs：6-8显示的序列。仅一个序列由SEQ ID NOs：9-23显示。许多序列包含共有序列UGAAAAAAACC(SEQ ID NO：91)。使用MFOLD程序(M.Zuker，Nucleic Acids Res.(核酸研究)31(13)，3406-3415，2003)预测这些序列的二级结构并且预测具有类似的共有序列部分的突起结构(bulge structure)。SEQ ID NOs：1-9和12显示的序列的适体的推定二级结构在图1-10中给出，其中共有序列包在圆圈中。
实际获得的核苷酸序列显示在下面，它们对应于各个SEQ ID NO。各个核苷酸中的括号显示在2’-位处的修饰，且F是氟原子(后面相同)。
SEQ ID NO：1：
gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaaaac(F)aaagac(F)aau(F)gau(F)u(F)gagu(F)agc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg
SEQ ID NO：2：
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SEQ ID NO：3：
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SEQ ID NO：4：
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SEQ ID NO：5：
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SEQ ID NO：6：
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SEQ ID NO：7：
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SEQ ID NO：8：
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SEQ ID NO：9：
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SEQ ID NO：10：
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SEQ ID NO：11：
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SEQ ID NO：12：
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SEQ ID NO：13：
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SEQ ID NO：14：
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SEQ ID NO：15：
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SEQ ID NO：16：
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SEQ ID NO：17：
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SEQ ID NO：18：
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SEQ ID NO：19：
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SEQ ID NO：20：
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SEQ ID NO：21：
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SEQ ID NO：22：
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SEQ ID NO：23：
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通过表面等离振子共振方法评价SEQ ID NO：1-9和12所示的核酸对NGF的结合活性。使用BIAcore 2000(由BIAcore制造)进行测量。SA芯片用作传感器芯片，在其上固定链霉抗生物素。与其结合的是约1500RU的16个核苷酸的聚dT，在其5’末端结合生物素。配体核酸具有添加在其3’末端的16个核苷酸的聚腺苷酸，并且通过T和A之间的键固定在SA芯片上。固定的量为约1000RU。对分析物注射20μL NGF，其以0.5μM制备，加入终浓度为0.3M的NaCl以减少非特异性吸附。溶液A用作运行缓冲液。在此，溶液A是145mM氯化钠，5.4mM氯化钾，1.8mM氯化钙，0.8mM氯化镁，20mM Tris(pH 7.6)，和0.05％吐温20的混合溶液。作为测量的结果，发现SEQ ID NO：1-9和12所示的所有核酸均比对照40N显著更多地结合NGF。在此，40N是指用于第一轮的核酸集合体，包含40个核苷酸随机序列。作为实例，显示由SEQ ID NO：6所示的适体和NGF的结合状态的传感图显示在图11中。从上面，显示这些核酸是结合NGF的适体。
实施例2：制备特异性结合NGF2的RNA适体
以与实施例1中相同的方式进行SELEX，不同之处在于使用具有30个核苷酸随机序列的模板和与实施例1中使用的那些不同的引物序列。使用的模板和引物序列显示在下面。作为模板，使用30个核苷酸的随机序列。DNA模板和引物通过化学合成制备。
DNA模板：5’-tgaggatccatgtatgcgcacata-30N-cttctggtcgaagttctccc-3’(SEQ ID NO：117)
正向引物：5’-cggaattctaatacgactcactatagggagaacttcgaccagaag-3’(SEQ ID NO：118)
反向引物：5’-tgaggatccatgtatgcgcacata-3’(SEQ ID NO：119)
13轮SELEX后，对序列进行测序。尽管还没有观察到序列趋同性，但许多序列含有共有序列UGAAAAAAACC(SEQ ID NO：91)。另外，一些序列在共有序列UGAAAAAAACC(SEQ ID NO：91)中含有突变，诸如UGAAAGAAACC(SEQ ID NO：92)，UGAAAAGAACC(SEQ ID NO：95)，UGAAAGGAACC(SEQ ID NO：105)等。
尽管一级序列(primary sequence)有点不同，但AGAAUGAAACU(SEQ ID NO：102)作为由MFOLD程序预期具有类似的突起结构的序列存在。
这些序列的亚组由SEQ ID NOs：37-42显示。
16轮SELEX后，对序列进行再次测序。没有观察到其他序列的趋同性，但存在两个由SEQ ID NOs：43和51显示的序列。类似于13轮后的序列，这些序列中的许多包含共有序列UGAAAAAAACC(SEQ ID NO：91)。另外，一些序列在共有序列UGAAAAAAACC(SEQ ID NO：91)中含有突变，诸如UGAAAGAAACC(SEQ ID NO：92)，UGAAACAAACC(SEQ ID NO：94)，UGAAAAGAACC(SEQ ID NO：95)，UGAAAGGAACC(SEQ ID NO：105)，UGAAAAAACCU(SEQ ID NO：97)等。
这些序列的亚组由SEQ ID NOs：43-53显示。
19轮SELEX后，对序列再次进行测序。尽管存在3个由SEQ ID NO：56显示的序列和2个由SEQ ID NOs：54，57和67中的每一个显示的序列，但仍未观察到其他序列的趋同性。这些序列中的许多包含共有序列诸如UGAAAAAAACC(SEQ ID NO：91)，UGAAAGAAACC(SEQ ID NO：92)和UGAAAAGAACC(SEQ ID NO：95)。
这些序列的亚组由SEQ ID NOs：54-59显示。
22轮SELEX后，对序列进行再次测序。存在6个由SEQ ID NO：67显示的序列和3个由SEQ ID NO：68显示的序列。这些序列含有类似于SEQ ID NO：91所示的共有序列的序列CGAACAAAACU(SEQ ID NO：103)和CGAAAGAAACU(SEQ ID NO：104)。没有观察到其他序列的趋同性，但许多序列包含共有序列UGAAAAAAACC(SEQ ID NO：91)和UGAAAGAAACC(SEQ ID NO：92)。
这些序列的亚组由SEQ ID NOs：60-68显示。
实际获得的核苷酸序列显示在下面，它们对应于以上提及的SEQ ID NO。核苷酸中的括号显示在2’-位处的修饰，且F是氟原子。
SEQ ID NO：37：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaagaaac(F)c(F)c(F)aaaggu(F)gaaac(F)aac(F)aau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
SEQ ID NO：38：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagagaau(F)gaaac(F)u(F)c(F)c(F)ac(F)aaagu(F)ac(F)au(F)aaaac(F)au(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
SEQ ID NO：39：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)gu(F)gaaaagaac(F)c(F)c(F)aaau(F)aaaac(F)aac(F)aau(F)gu(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
SEQ ID NO：40：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aggaaaau(F)ggaagac(F)gu(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
SEQ ID NO：41：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaaggaac(F)c(F)c(F)aaagc(F)gaaac(F)aaaac(F)gu(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
SEQ ID NO：42：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaaagagc(F)agc(F)agagau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
SEQ ID NO：43：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagc(F)u(F)u(F)gaaaaaac(F)c(F)c(F)c(F)aau(F)au(F)gagaau(F)c(F)au(F)au(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
SEQ ID NO：44：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaagaaac(F)c(F)c(F)aaaau(F)u(F)agc(F)ac(F)c(F)au(F)aau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
SEQ ID NO：45：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagagaau(F)gaaac(F)u(F)c(F)c(F)c(F)aaau(F)c(F)aaggac(F)aau(F)gau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
SEQ ID NO：46：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaac(F)aaac(F)c(F)c(F)aaagu(F)u(F)ac(F)gc(F)ac(F)aaaau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
SEQ ID NO：47：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagaagu(F)u(F)u(F)gaaaagaac(F)c(F)c(F)aaaau(F)gagc(F)aaaau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
SEQ ID NO：48：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaaagaac(F)c(F)c(F)gaaaaac(F)gc(F)au(F)aau(F)aau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
SEQ ID NO：49：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)gaaagaaac(F)u(F)c(F)c(F)c(F)aagac(F)ggu(F)aac(F)gaaagu(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
SEQ ID NO：50：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)gaaaaaac(F)c(F)u(F)c(F)c(F)c(F)aau(F)ac(F)aaac(F)ac(F)aaaaau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
SEQ ID NO：51：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaagaaac(F)c(F)c(F)aaaaaaac(F)aac(F)au(F)au(F)gaac(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
SEQ ID NO：52：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaagaaac(F)c(F)c(F)aaau(F)au(F)ac(F)aaaac(F)ac(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
SEQ ID NO：53：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaaggaac(F)c(F)c(F)aaaaac(F)ac(F)aaaau(F)gu(F)c(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
SEQ ID NO：54：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)c(F)gaaagu(F)gaaagaaac(F)u(F)c(F)c(F)aac(F)gaaagc(F)au(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
SEQ ID NO：55：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaagaaac(F)c(F)c(F)aaaaau(F)gaau(F)gc(F)aac(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggac(F)c(F)u(F)c(F)a
SEQ ID NO：56：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)gaaagaaac(F)u(F)c(F)c(F)c(F)aac(F)ac(F)aaau(F)gc(F)ac(F)aac(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
SEQ ID NO：57：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaac(F)ac(F)c(F)gaagc(F)ac(F)aaau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
SEQ ID NO：58：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaaagaac(F)c(F)c(F)aaau(F)ac(F)agaau(F)aaau(F)gu(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
SEQ ID NO：59：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)c(F)gaaac(F)gu(F)u(F)u(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaggaggau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
SEQ ID NO：60：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagau(F)u(F)u(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)gaau(F)aaagau(F)aac(F)agu(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
SEQ ID NO：61：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaaggu(F)c(F)gu(F)aac(F)gaau(F)aaaac(F)u(F)c(F)c(F)u(F)gc(F)ac(F)aaaaau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
SEQ ID NO：62：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaagaaac(F)c(F)c(F)aaau(F)u(F)aaagu(F)gaac(F)agu(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
SEQ ID NO：63：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagau(F)u(F)u(F)gaaagaaac(F)c(F)c(F)aaac(F)u(F)aagc(F)ac(F)aaaau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
SEQ ID NO：64：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaagaaac(F)c(F)c(F)aaaac(F)au(F)u(F)agc(F)ac(F)ac(F)au(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
SEQ ID NO：65：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)gu(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaau(F)c(F)gagc(F)ac(F)aaaau(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
SEQ ID NO：66：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaagc(F)aagc(F)ac(F)aac(F)au(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
SEQ ID NO：67：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)c(F)gau(F)aac(F)gaac(F)aaaac(F)u(F)c(F)c(F)c(F)aaaggaau(F)au(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
SEQ ID NO：68：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)c(F)gagagc(F)gaaagaaac(F)u(F)c(F)c(F)c(F)aaaac(F)ac(F)agu(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
通过表面等离振子共振方法来评价SEQ ID NOs：37-68所示的核酸对NGF的结合活性。对所述试验使用类似于实施例1中所示的方法。结果，发现与30N的对照相比，所有序列均更显著地结合NGF。
实施例3：制备特异性结合NGF的RNA-DNA嵌合适体
根据SELEX法制备这样的嵌合适体，其中RNA是嘌呤核苷酸，且DNA是嘧啶核苷酸。使用的模板包含40个核苷酸的随机序列，且使用的引物不同于实施例1和2中使用的那些。通过转录作为模板的化学合成的DNA，和作为底物的rATP，rGTP，dCTP和dTTP获得第一轮中使用的RNA-DNA嵌合核酸的集合体。此处，rNTP是核糖核苷酸，且dNTP是脱氧核糖核苷酸。其他试验方法几乎与实施例1中显示的那些相同。使用的模板和引物序列显示在下面。
DNA-RNA模板：5’-tcctaatgtctcttctcttcac-40N-gccctattcttgcctctccc-3’(SEQ ID NO：120)
正向引物：5’-taatacgactcactatagggagaggcaagaatagggc-3’(SEQ ID NO：121)
反向引物：5’-tcctaatgtctcttctcttcac-3’(SEQ ID NO：122)
7轮SELEX后，对序列进行测序。没有观察到序列趋同性，但许多序列包含共有序列TGAAAAAAACC(SEQ ID NO：91)。10轮SELEX后，对序列再次进行测序。存在6个由SEQ ID NO：72显示的序列，5个由SEQ ID NOs：70和71中的每一种显示的序列，和2个由SEQ ID NOs：69和73显示的序列。另外，22个序列仅发现1次(包括由SEQ ID NO：74显示的序列)，它们中的许多包含共有序列TGAAAAAAACC(SEQ ID NO：91)。
实际获得的核苷酸序列显示在下面，它们对应于SEQ ID NOs：69-74。大写字母的T和C显示脱氧核糖核苷酸，且小写字母的a和g显示核糖核苷酸。
SEQ ID NO：69：
gggagaggCaagaaTagggCCCagCTgaaaaaaaCCTggaCgTaCaCCgTTCgCCgagCgggTgaagagaagagaCaTTagga
SEQ ID NO：70：
gggagaggCaagaaTagggCTggaaaTagaaCCgCgCTgTCTTCaTTaagCCgCCCaaCggTgaagagaagagaCaTTagga
SEQ ID NO：71：
gggagaggCaagaaTagggCaCTTgaaaaaaaCCCaaaTTTaCCgTCTTCagCgTCgggTgTgaagagaagagaCaTTagga
SEQ ID NO：72：
gggagaggCaagaaTagggCTggaTgggCagTaaCCTgaaaaaaaCCaCCCaCCTCTaCCgTgaagagaagagaCaTTagga
SEQ ID NO：73：
gggagaggCaagaaTagggCaCTTgaaaaaaaCCCaaagaaagaaTaCTTaCCCggCgCgTgaagagaagagaCaTTagga
SEQ ID NO：74：
gggagaggCaagaaTagggCaTagTgTagaCCCCTCTCaagaTaCCCCaTgaaTTgCCCCgTgaagagaagagaCaTTagga
通过表面等离振子共振方法来评价SEQ ID NOs：69-74所示的核酸对NGF的结合活性。对所述试验使用类似于实施例1中所示的方法。结果，发现与4N的对照相比，所有序列均更显著地结合NGF。
实施例4：制备具有较高活性的NGF适体
使用包含掺杂有30％随机序列和在其两端添加新的引物序列的由SEQ ID NO：36显示的序列的RNA集合体进行SELEX。以与实施例1中几乎相同的方式进行SELEX。模板和引物的序列显示在下面。
模板：
5’-GAGGATCCATGTATGCGCACATAgggtttttttcatcctgcagctccacaggcttcccCTTCTGGTCGAAGTTCT-3’
a:a(70％)，g(10％)，c(10％)，t(10％)
g:g(70％)，a(10％)，c(10％)，t(10％)
c:c(70％)，a(10％)，g(10％)，t(10％)
t:t(70％)，a(10％)，c(10％)，g(10％)
(SEQ ID NO：123)
正向引物：
5’-CGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAACTTCGACCAGAAG-3’(SEQ ID NO：124)
反向引物：5’-GAGGATCCATGTATGCGCACATA-3’(SEQ ID NO：125)
10轮后，对48个克隆的序列进行测序。没有观察到序列趋同性，但许多序列包含共有序列UGAAAAAAACC(SEQ ID NO：91)。
另外，也存在UGAAAGAAACC(SEQ ID NO：92)，UGAAAGAAACU(SEQ ID NO：93)，UGAAAACAACC(SEQ ID NO：98)，UGAAAUAAACC(SEQ ID NO：99)，UGAAAUAAACU(SEQ ID NO：100)，UGAAAAAAUCU(SEQ ID NO：101)等，它们在共有序列UGAAAAAAACC(SEQ ID NO：91)中包含突变。
从中随机选择12个序列，并且通过表面等离振子共振方法来测量对NGF的结合活性。测量方法如实施例1中所示。测量的结果是，发现所有这些12个序列与掺杂有30％随机序列的第一模板相比，更显著地结合NGF。实际获得的核苷酸序列显示在下面，其对应用各个SEQ ID NO。
SEQ ID NO：75：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)gaaagaau(F)c(F)u(F)c(F)c(F)aaagac(F)aagau(F)aaaaac(F)aac(F)c(F)gu(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)
SEQ ID NO：76：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaaggau(F)aaac(F)gc(F)au(F)gu(F)au(F)u(F)u(F)gc(F)agu(F)au(F)u(F)aaaaau(F)gc(F)c(F)u(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)
SEQ ID NO：77：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)gaaaaaau(F)c(F)u(F)c(F)c(F)agu(F)u(F)gc(F)aagac(F)gaaac(F)aaac(F)c(F)u(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)
SEQ ID NO：78：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)gu(F)gu(F)au(F)u(F)gu(F)u(F)c(F)agggu(F)gu(F)gc(F)c(F)c(F)agc(F)c(F)u(F)au(F)aac(F)c(F)au(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)
SEQ ID NO：79：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaaggau(F)agc(F)c(F)au(F)gu(F)ggaggu(F)gaagac(F)u(F)gaaau(F)aaac(F)c(F)au(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)
SEQ ID NO：80：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)gaaaac(F)aac(F)c(F)u(F)c(F)c(F)c(F)aau(F)aau(F)gau(F)c(F)ac(F)agaaau(F)c(F)c(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)
SEQ ID NO：81：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaaggagau(F)gac(F)u(F)gu(F)gu(F)aac(F)c(F)ac(F)agu(F)au(F)gaaau(F)aaac(F)u(F)c(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)
SEQ ID NO：82：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagaggau(F)gc(F)u(F)u(F)gu(F)u(F)u(F)ggu(F)u(F)ac(F)aagc(F)u(F)gaaagaaac(F)c(F)u(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)
SEQ ID NO：83：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)gaagc(F)u(F)u(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aggau(F)u(F)aaac(F)agac(F)agu(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)
SEQ ID NO：84：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)gaaagaaac(F)u(F)c(F)c(F)c(F)gau(F)gaaagau(F)gu(F)aac(F)aaac(F)c(F)au(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)
SEQ ID NO：85：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagc(F)ggaagc(F)c(F)u(F)gc(F)gu(F)aac(F)c(F)gc(F)aggau(F)gaaaac(F)aac(F)c(F)gu(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)
SEQ ID NO：86：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaaggagu(F)agc(F)c(F)agu(F)gaac(F)c(F)u(F)ggaau(F)au(F)gaaaaaaac(F)c(F)u(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)
实施例5：制备特异性结合NGF的DNA适体
使用SELEX法制备特异性结合NGF的DNA适体。使用的SELEX法是Fitzwater，Polisky等(Fitzwater和Polisky，Methods Enzymol.(酶学方法)267，275-301，1996)的方法的改良方法。作为靶物质，使用实施例1中使用的人NGF。用于第一轮的集合体是通过将引物序列添加至40个核苷酸随机序列的两端获得的长度为71的DNA(40N-DNA)。为了获得单链DNA，生物素(bio)添加至反向引物的5’端。
模板：5’-GGGATCGACAGGGCT-40N-CCGAGTCGTGCCATCT-3’(SEQ ID NO：126)
正向引物：5’-GGGATCGACAGGGCT-3’(SEQ ID NO：127)
反向引物：bio-AGATGGCACGACTCGG-3’(SEQ ID NO：128)
7轮结束后，以与实施例1中相同的方式对46个克隆的序列进行测序。结果，存在20个由SEQ ID NO：87显示的序列。其序列显示在下面。SEQ ID NO：87：
GGGATCGACAGGGCTGCAGCACTGGCGTAGGTTGGAATATGGGTATTTTTGTGGTCCGAGTCGTGCCATCT
实施例6：抑制NGF与NGF受体结合的适体
使用表面等离振子共振方法确定由SEQ ID NOs：1-9，12，37-55和57-87所示的适体是否抑制NGF与NGF受体(TrkA和P75)的结合。如BIAcore公司的试验方案所指导，蛋白A(21181，PIERCE)固定在CM5传感器芯片上。其上固定有约1100RU的与IgG的Fc部分融合的人Trk A-Fc(175-TK，R&D systems)。作为分析物，将NGF(0.1μM)和各种适体(0.33μM)的混合物在静置30分钟后进行注射。如果该适体抑制NGF和TrkA的结合，则预期传感图上不出现信号；如果该适体不抑制结合，则将形成三重复合物，并且预期出现信号。当NGF与受体的结合比与适体的结合更强时，可以去除该适体并且NGF可以结合该受体。在开始抑制试验前，确认TrkA和NGF的结合。使用不存在适体时NGF和NGF受体的结合量为100，将添加适体时NGF和NGF受体的结合量确定为校正值。此处，结合量是BIAcore的传感图的峰顶处的RU值(NGF注射结束后即刻的RU值)。100减去校正值得到抑制活性％，在不小于60％时显示存在抑制活性。试验结果为，发现SEQ ID NOs：1-9，12，37-55，57-87所示的所有适体均抑制NGF和TrkA的结合(表1)。作为一个实例，由SEQ IDNO：6所示的适体对NGF和TrkA的结合的抑制显示在图12中。对另一受体P75(p75-Fc；R&D systems)进行类似试验。结果，发现由SEQ ID NOs：1-9，12，37-55，57-87所示的所有适体均抑制NGF和P75的结合不小于60％(表1)。作为一个实例，由SEQ ID NO：6所示的适体对NGF和P75的结合的抑制显示在图13中。
表1
Figure BPA00001332082900421
Figure BPA00001332082900431
Figure BPA00001332082900441
表1显示抑制TrkA或p75和NGF的结合的适体。“+”表示不小于60％的抑制活性(％)，“-”显示小于60％的抑制活性。
关于SEQ ID NO：87所示的适体，在NGF-适体摩尔比为1∶1(0.1μM)的条件下进行类似于上述的抑制试验。制备的相同的NGF和适体的混合溶液用于TrkA和P75的试验，并且在对样品制备的变化没有影响的条件下进行试验。结果，由SEQ ID NO：87所示的适体通过93％抑制NGF和TrkA的结合，但仅通过29％抑制NGF和p75的结合。
实施例7：使用PC-12细胞评价适体的生理活性
使用PC-12细胞通过神经突伸长抑制试验评价适体的生理活性。PC-12细胞，即一种来源于大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤的细胞系，是神经系统的模型细胞，通过NGF刺激使神经突伸长，并且象神经细胞一样分化。评价适体是否抑制神经突伸长。PC-12细胞接种在包被有胶原的96孔平底板上，并且NGF的混合溶液(终浓度为25ng/mL或1.9nM)在37℃下预反应1h，并加入适体(终浓度为500nM)以开始细胞培养。此后，每24hr加入等量的适体两次，并且在第3天时用显微镜观察神经突伸长的水平并进行评价。对于评价，使用0-3分，其中0分是没有神经突伸长，1分是稍有神经突伸长，2分是神经突伸长至附近细胞，3分是明显网状的神经突伸长。其中在仅加入NGF的条件下培养PC-12细胞3天的系统作为阴性对照，其中在不加入NGF的条件下培养细胞3天的系统作为阳性对照。为了确认NGF抑制剂对神经突伸长的遏制，作为对照NGF抑制剂的133nM抗NGF抗体(MAB2561，R&D Systems)与NGF一起添加，细胞培养3天并且验证对神经突伸长的遏制。将阴性对照的评分设定为抑制活性0％，并将阳性对照的评分设定为抑制活性100％，计算适体的抑制活性(％)。结果显示在表2中。不小于50％的抑制活性显示为+，小于50％的显示为-。显然由SEQ ID NOs：1，3-9和12所示的适体显著抑制神经突伸长(表2)。由SEQ ID NO：2所示的不含共有序列的适体不显示抑制活性。另一方面，SEQ ID NOs：5，6等所示的含有共有序列的适体显示抑制活性。SEQ ID NO：8所示的适体显示抑制活性，尽管其不含有共有序列。上面结果显示SEQ ID NOs：1，3-9和12所示的适体可以是NGF抑制剂。
表2
Figure BPA00001332082900461
Figure BPA00001332082900471
表2显示能够抑制PC12细胞的神经突伸长的适体。不小于50％的抑制活性为“+”，小于50％的抑制活性为“-”。
实施例8：使用Neuroscreen-1细胞评价适体的生理活性
使用Neuroscreen-1细胞评价适体的神经突伸长抑制活性，Neuroscreen-1细胞是PC-12细胞的亚克隆。2500细胞/孔在包被有IV型胶原的96孔平底板中，在含有2.5％马血清和1.25％胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养1天。加入在无血清RPMI-1640中室温下或37℃下预反应30min-1h的NGF(终浓度为15ng/mL或1.1nM)和适体(终浓度为500-3nM)的混合溶液。两天或三天后，使用Cellomics神经突伸长试剂盒(由Thermo Scientific制造)染色细胞质和核，并且通过Cellomics ArrayScan VTI(由Thermo Scientific制造)测量每个细胞的神经突长度。在将仅添加NGF培养细胞2天获得的每个细胞的神经突长度作为抑制活性0％，将通过无NGF培养获得的细胞的每个细胞的神经突长度作为抑制活性100％的条件下，从通过添加NGF和适体的混合物培养获得的每个细胞的神经突长度计算适体的抑制活性。当适体浓度为100nM和10nM时的抑制活性，以及50％抑制浓度(IC50)显示在表3中。当抑制活性为0％以下时，表示为‘0％’。当其不小于100％时，表示为‘100％’。从将50％抑制活性夹在中间的上下两点时的浓度确定50％抑制浓度。表示为＜的IC50值是指甚至在最低测量浓度下不小于50％的抑制活性，且指示的数显示最低测量浓度。试验的结果是，确认存在有IC50为10nm以下的具有高活性的适体。
这样的适体包含共有序列UGAAAAAAACC(SEQ ID NO：91)，UGAAAGAAACC(SEQ ID NO：92)，UGAAAGAAACU(SEQ ID NO：93)，UGAAAAGAACC(SEQ ID NO：95)，UGAAAAAACCC(SEQ ID NO：96)，UGAAAGGAACC(SEQ ID NO：105)，CGAACAAAACU(SEQ ID NO：103)，CGAAAGAAACU(SEQ ID NO：104)和AGAAUGAAACU(SEQ IDNO：102)。6种和5种适体分别包含UGAAAAAAACC(SEQ ID NO：91)和UGAAAGAAACC(SEQ ID NO：92)。
表3
Figure BPA00001332082900481
Figure BPA00001332082900491
(表中的N.D.是指未测量。)
表3显示当抑制Neuroscreen-1细胞的神经突伸长的适体浓度为100nM和10nM时的抑制活性(％)，和50％抑制浓度(IC50)。
实施例9：适体的链缩短
进行SEQ ID NOs：2，5，6，8所示的适体的链缩短。SEQ ID NOs：5，6所示的适体包含共有序列UGAAAAAAACC(SEQ ID NO：91)。SEQ ID NOs：2和8所示的适体不包含所述共有序列。变体的序列如下所述。
SEQ ID NO：24：69个核苷酸适体，其是SEQ ID NO：2所示的适体的变体gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)c(F)u(F)ac(F)ac(F)u(F)u(F)u(F)agu(F)au(F)gac(F)aaac(F)c(F)u(F)agagu(F)gu(F)aaau(F)gc(F)u(F)u(F)c(F)gc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)
SEQ ID NO：25：47个核苷酸适体，其是SEQ ID NO：2所示的适体的变体ggagc(F)u(F)gc(F)c(F)u(F)ac(F)ac(F)u(F)u(F)u(F)agu(F)au(F)gac(F)aaac(F)c(F)u(F)agagu(F)gu(F)aaau(F)gc(F)u(F)u(F)c(F)
SEQ ID NO：26：46个核苷酸适体，其是SEQ ID NO：5所示的适体的变体gggc(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)u(F)u(F)aaac(F)aagc(F)aagu(F)gaaaaaaac(F)c(F)ac(F)agc(F)c(F)c(F)
SEQ ID NO：27：45个核苷酸适体，其是SEQ ID NO：6所示的适体的变体gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaaau(F)u(F)aaau(F)
SEQ ID NO：28：40个核苷酸适体，其是SEQ ID NO：6所示的适体的变体gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaaau(F)
SEQ ID NO：29：61个核苷酸适体，其是SEQ ID NO：8所示的适体的变体ggu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)ggau(F)aaaaau(F)agagu(F)u(F)u(F)gau(F)aaac(F)ac(F)c(F)u(F)gu(F)au(F)u(F)aaaac(F)c(F)gc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)
SEQ ID NO：30：41个核苷酸适体，其是SEQ ID NO：8所示的适体的变体gggau(F)aaaaau(F)agagu(F)u(F)u(F)gau(F)aaac(F)ac(F)c(F)u(F)gu(F)au(F)u(F)aaaac(F)c(F)c(F)
SEQ ID NO：31：34个核苷酸适体，其是SEQ ID NO：26所示的适体的变体
gggagc(F)u(F)gc(F)u(F)u(F)aaac(F)aagc(F)aagu(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)SEQ ID NO：32：38个核苷酸适体，其是SEQ ID NO：26所示的适体的变体
u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)u(F)u(F)aaac(F)aagc(F)aagu(F)gaaaaaaac(F)c(F)ac(F)a
SEQ ID NO：33：36个核苷酸适体，其是SEQ ID NO：26所示的适体的变体
u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)u(F)aaac(F)agc(F)aagu(F)gaaaaaaac(F)c(F)ac(F)a
SEQ ID NO：34：34个核苷酸适体，其是SEQ ID NO：26所示的适体的变体
gu(F)ggagc(F)u(F)gu(F)u(F)aaac(F)aac(F)aagu(F)gaaaaaaac(F)c(F)ac(F)SEQ ID NO：35：38个核苷酸适体，其是SEQ ID NO：28所示的适体的变体
gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaa
SEQ ID NO：36：35个核苷酸适体，其是SEQ ID NO：28所示的适体的变体
gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)SEQ ID NO：88：33个核苷酸适体，其是SEQ ID NO：36所示的适体的变体
gggaagc(F)c(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)ggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)SEQ ID NO：89：34个核苷酸适体，其是SEQ ID NO：36所示的适体的变体
gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)aaac(F)agc(F)aggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)SEQ ID NO：90：32个核苷酸适体，其是SEQ ID NO：36所示的适体的变体
gggagc(F)c(F)u(F)gu(F)aaac(F)agc(F)aggu(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)
SEQ ID NOs：31和36所示的适体的推定二级结构显示在图14和图15中。共有序列用黑色圆圈显示。
通过转录制备长度为40个核苷酸或更长的适体，并且通过化学合成制备长度比所述适体短的适体。以与实施例6中相同的方式通过表面等离振子共振方法检查这些核酸是否抑制NGF与NGF受体的结合。结果，发现所有这些核酸均具有抑制活性(表1)。
另外，以与实施例7中相同的方式检查针对PC12细胞的神经突伸长抑制活性。结果，发现在SEQ ID NOs：28-30，32，35中有强抑制活性(表2)。
SEQ ID NO：32所示的适体已经缩短为38个核苷酸，其保留了SEQ ID NO：5所示的适体的共有序列。另外，SEQ ID NO：35所示的适体已经缩短为38个核苷酸，其保留了SEQ ID NO：6所示的适体的共有序列。从上面，显示所述共有序列至少对于SEQ ID NO：5和6是重要的。
另一方面，SEQ ID NO：30所示的适体是不含所述共有序列的SEQ ID NO：8所示的适体的链缩短序列，并且以41个核苷酸的长度确认活性。这些适体显示可用作NGF抑制剂。
实施例10：链缩短的适体的修饰
为了增加SEQ ID Nos：30，32，35所示的适体在血液中的稳定性，制备其中核糖的2’-位处的羟基已经被o-甲基取代的变体。以与实施例7中相同的方式，通过PC12细胞检查神经突伸长抑制。结果，所有这些适体显示强抑制活性。
修饰形式的序列显示在下面。核苷酸中的括号显示2’-位修饰作用，F为氟原子，M为o-甲基，且idT是倒置的dT。
SEQ ID NO：30(1)：
idT-gggau(F)aaaaau(F)a(M)g(M)a(M)g(M)u(F)u(F)u(F)g(M)a(M)u(F)a(M)a(M)a(M)c(F)a(M)c(F)c(F)u(F)gu(F)au(F)u(F)aaaac(F)c(F)c(F)-idT
SEQ ID NO：30(2)：
gggau(F)aaaa(M)a(M)u(F)agagu(F)u(F)u(F)gau(F)aaac(F)ac(F)c(F)u(F)gu(F)au(F)u(F)aaaac(F)c(F)c(F)
SEQ ID NO：30(3)：
gggau(F)aaaaau(F)agagu(F)u(F)u(F)gau(F)aaac(F)ac(F)c(F)u(F)gu(F)au(F)u(F)a(M)a(M)aac(F)c(F)c(F)
SEQ ID NO：30(4)：
idT-gggau(F)aaaa(M)a(M)u(F)a(M)g(M)a(M)g(M)u(F)u(F)u(F)g(M)a(M)u(F)a(M)a(M)a(M)c(F)a(M)c(F)c(F)u(F)gu(F)au(F)u(F)a(M)a(M)aac(F)c(F)c(F)-idT
SEQ ID NO：30(5)：
idT-gggau(F)aaaa(M)a(M)u(F)a(M)g(M)a(M)g(M)u(F)u(F)u(F)g(M)a(M)u(F)a(M)a(M)a(M)c(F)a(M)c(F)c(F)u(F)gu(F)a(F)u(F)u(F)a(M)a(M)a(F)a(F)c(F)c(F)c(F)-idT
SEQ ID NO：30(6)：
idT-g(M)g(M)g(M)au(F)a(M)aa(M)a(M)a(M)u(F)a(M)g(M)a(M)g(M)u(F)u(F)u(F)g(M)a(M)u(F)a(M)a(M)a(M)c(F)a(M)c(F)c(F)u(F)gu(F)a(M)u(F)u(F)a(M)a(M)a(F)a(F)c(F)c(F)c(F)-idT
SEQ ID NO：32(1)：
idT-u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)g(M)c(F)u(F)u(F)a(M)a(M)a(M)c(F)a(M)a(M)g(M)c(F)a(M)a(M)g(M)u(F)gaaaaaaac(F)c(F)ac(F)a-idT
SEQ ID NO：32(2)：
u(F)g(M)u(F)ggagc(F)u(F)gc(F)u(F)u(F)aaac(F)aagc(F)aagu(F)gaaaaaaac(F)c(F)ac(F)a(M)
SEQ ID NO：32(3)：
u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)u(F)u(F)aaac(F)aagc(F)aagu(F)gaaaa(M)a(M)aac(F)c(F)ac(F)a
SEQ ID NO：32(4)：
u(F)gu(F)gga(M)gc(F)u(F)gc(F)u(F)u(F)aaac(F)aagc(F)aagu(F)gaaaaaaac(F)c(F)ac(F)a
SEQ ID NO：32(5)：
idT-u(F)g(M)u(F)gga(M)gc(F)u(F)g(M)c(F)u(F)u(F)a(M)a(M)a(M)c(F)a(M)a(M)g(M)c(F)aagu(F)gaaaa(M)a(M)a(M)a(M)c(F)c(F)ac(F)a-idT
SEQ ID NO：32(6)：
idT-u(F)g(M)u(F)g(M)ga(M)gc(F)u(F)g(M)c(F)u(F)u(F)a(M)a(M)a(M)c(F)a(M)a(M)g(M)c(F)a(M)a(M)g(M)u(F)gaaaa(M)a(M)a(M)a(M)c(F)c(F)ac(F)a-idT
SEQ ID NO：35(1)：
idT-ggga(M)a(M)g(M)c(F)c(F)u(F)g(M)u(F)g(M)g(M)a(M)g(M)c(F)u(F)g(M)c(F)a(M)g(M)g(M)au(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaa-idT
SEQ ID NO：35(2)：
idT-ggga(M)a(M)g(M)c(F)c(F)u(F)g(M)u(F)ggagc(F)u(F)g(M)c(F)a(M)g(M)g(M)au(F)gaaaa(M)a(M)a(M)a(M)c(F)c(F)c(F)aaa-idT
SEQ ID NO：35(3)：
gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)a(M)a(M)a(M)
SEQ ID NO：35(4)：
idT-ggga(M)a(M)g(M)c(F)c(F)u(F)g(M)u(F)g(M)g(M)a(M)g(M)c(F)u(F)g(M)c(F)a(M)g(M)g(M)au(F)gaaaa(M)a(M)a(M)a(M)c(F)c(F)c(F)a(M)a(M)a(M)-idT
SEQ ID NO：35(5)：
idT-g(M)g(M)ga(M)a(M)g(M)c(F)c(F)u(F)g(M)u(F)g(M)g(M)a(M)g(M)c(F)u(F)g(M)c(F)a(M)g(M)g(M)au(F)gaaaa(M)a(M)a(M)a(M)c(F)c(F)c(F)a(M)a(M)a(M)-idT
SEQ ID NO：35(6)：
idT-g(M)g(M)ga(M)a(M)g(M)c(F)c(F)u(F)g(M)u(F)g(M)g(M)a(M)g(M)c(F)u(F)g(M)c(F)a(M)g(M)g(M)a(F)u(F)gaaaa(M)a(M)a(M)a(M)c(F)c(F)c(F)a(M)a(M)a(M)-idT
实施例11：通过足迹法(footprint method)鉴定适体的NGF结合位点
为了确认共有序列是NGF结合位点，在缺少NGF和存在NGF的条件下进行酶消化试验。当所述共有序列是NGF结合位点时，结果应该是在缺少NGF的条件下发生酶消化；在NGF的存在下核酸酶不能结合共有序列并且不发生酶消化。使用其中荧光物质(FAM6)与SEQ ID NO：62所示的适体的5’端或3’端缀合的适体，进行试验。SEQ ID NO：62所示的适体包含共有序列UGAAAGAAACC(SEQ ID NO：92)。作为核酸酶，使用3种选择性裂解单链的S1核酸酶(由TAKARA BIO制造)，选择性裂解双链的V1核酸酶(由Ambion制造)，和选择性裂解单链的G的T1核酸酶(由Ambion制造)。参照附带的说明书文件在表4的条件下进行各酶反应。向S1核酸酶的反应溶液中加入0.833mM ZnCl2。
[表4]
Figure BPA00001332082900551
在添加NGF的试验中，适体和NGF的摩尔比设定为1∶2，并且它们溶解在溶液B(一种结合缓冲液)中。此处，溶液B是145mM氯化钠，5.4mM氯化钾，1.8mM氯化钙，0.8mM氯化镁，和20mM Tris(pH 7.6)的混合溶液。
酶反应后，通过苯酚-氯仿处理终止反应，并且回收水溶性级分并浓缩。然后，通过碱性磷酸酶(由TAKARA BIO制造)去除末端磷酸。使用碱性磷酸酶的酶处理参照附带的说明书文件，在37℃下进行1.5hr。这些样品通过20％变性聚丙烯酰胺电泳分析。对于荧光检测，使用Storm850(由GE Healthcare制造)。试验结果是，在不存在NGF的条件下UGAAAGAAACC(SEQ ID NO：92)的GAAAGA被S1和T1核酸酶裂解。另一方面，在存在NGF的条件下裂解被显著遏制。此处，嘧啶核苷酸是氟-修饰形式。上面结果表明所述共有序列部分是NGF结合位点。
实施例12：通过向共有序列部分引入突变改变活性
向共有序列部分引入突变，并且使用Neuroscreen-1细胞以与实施例8相同的方式评价活性变化。作为含有共有序列UGAAAAAAACC(SEQ ID NO：91)的适体，使用SEQ ID NO：35所示的长度为38个核苷酸的序列。其结果显示在表5中。
当加入300nM的未引入突变的适体时，观察到以92％抑制神经突伸长。另一方面，引入一个核苷酸的突变导致活性完全消失。当UGAAAAAAACC(SEQ ID NO：91)的第3个至第5个的A被DNA型取代时，活性完全消失。从上面，显示所述共有序列对于NGF活性的抑制是重要的。
[表5]
  共有序列   300nM(％抑制)
  UGAAAAAAACC   92
  UCAAAAAAACC   0
  UgAAAAAAACC   0
  UGGAAAAAACC   0
  UGaAAAAAACC   0
  UGAaAAAAACC   0
  UGAAaAAAACC   0
表5显示使用Neuroscreen-1细胞的神经突伸长抑制试验的结果。SEQ ID NO：35显示的适体及其变体以300nM添加。嘧啶核苷酸是氟-修饰形式，嘌呤核苷酸的大写字母显示RNA型，小写字母显示DNA型。突变引入至下划线部分。
实施例13：关于共有序列的考虑
在此试验中，共有序列以高频率出现在不同条件下诸如不同集合体、引物序列等的SELEX中(实施例1-4)。在通过SELEX获得的74个序列中，59个序列含有具有共有序列UGAAANNANCY(SEQ ID NO：107)的适体，其中N是A，G，C和U中的任何核苷酸，并且U可以是T。Y是嘧啶核苷酸。在这些序列中，29个序列含有UGAAAAAAACY(SEQ ID NO：110)，13个序列含有UGAAAGAAACY(SEQ ID NO：111)。
另一方面，式CGAANNAAACY(SEQ ID NO：108)和AGAANNAAACY(SEQ ID NO：109)所示的共有序列分别在3个序列和2个序列中发现。在这些序列中，一个序列含有CGAACAAAACY(SEQ ID NO：112)，且一个序列含有CGAAAGAAACY(SEQ ID NO：113)。它们可以由式HGAANNNANCY(SEQ ID NO：106)显示。
由于这些共有序列是38个核苷酸的链缩短形式所必不可少的(实施例9)，通过添加NGF而在酶消化试验中得到保护(实施例11)，并且通过引入突变显著降低生理活性(实施例12)，所以很显然它们对于抑制NGF功能是重要的。
实施例14：向链缩短的适体中引入突变
确认在向链缩短的适体中引入突变后是否可以保持活性。SEQ ID NO：30(6)的适体的长度为41个核苷酸，并且不含有共有序列。倒置的dT添加至5’和3’端。以与实施例8中相同的方式使用Neuroscreen-1细胞评价活性。结果显示在表6中。
当由MFOLD程序预测的干(stem)部分中的G1:C41，A10:U33，A12:U31碱基对被C1:G41，U10:A33，U12:A31替代时，活性不显著地下降。当环部分中的G20和G23被A20和A23替代时，活性也不显著下降。从上面，显示SEQ ID NO：30(6)所示的适体的活性即使在引入几个突变后仍然得到保持。
[表6]
(％抑制)
  300nM   100nM   30nM
  G1:C41→C:G   98.1   92.0   19.5
  A10:U33→U:A   98.3   80.8   12.1
  A12:U31→U:A   96.0   93.1   35.8
  G20→A   98.1   96.1   47.7
  G23→A   98.0   91.2   31.0
  SEQ ID NO：30   98.6   92.7   28.4
实施例15：与现有技术参考文献中记载的NGF适体的比较
比较由SEQ ID NOs：30，32，35所示的适体和现有技术参考文献中记载的NGF适体(Binkley J等，(1995)Nucleic Acids Res.(核酸研究)23，3198)的NGF结合活性，NGF-NGF受体结合抑制活性和神经突伸长抑制活性。
现有技术参考文献中记载的适体均是未修饰的RNAs，并且其序列与本说明书中记载的序列不匹配。作为现有技术参考文献中记载的适体，选择显示高结合活性的H1，L2和L6，并用T7聚合酶转录。通过类似于实施例1中的方法评价结合活性，通过类似于实施例6中的方法评价NGF-NGF受体结合抑制活性，和通过类似于实施例8中的方法评价神经突伸长抑制活性。
结果，发现H1，L2和L6结合NGF，但活性低于由SEQ ID NOs：30，32，35所示的适体(表7)。此外，H1，L2和L6不抑制NGF与NGF受体的结合，并且在神经突伸长抑制试验中即使当以500nM添加时也不显示抑制活性(表7)。从上面，显示本说明书中记载的适体与现有技术参考文献中记载的适体相比具有更高的活性。
[表7]
Figure BPA00001332082900591
表7显示了SEQ ID NOs：30，32，35所示的适体和非专利文件1中记载的适体H1，L2，L6的NGF结合活性，NGF-NGF受体结合抑制，和NGF神经突伸长抑制活性。
基于通过NGF与SEQ ID NO：35结合获得的最大RU值作为100％来评价NGF结合活性。当其不小于80％时，表示为“++”，当其不小于50％时，表示为“+”，并且当其为50％以下时，表示为“-”。关于NGF-NGF受体结合抑制，“+”是指不小于60％的抑制活性(％)，“-”是指小于60％的抑制活性(％)。
NGF神经突伸长抑制活性是当适体的终浓度为500nM或250nM时的抑制活性(％)。
工业适用性
本发明的适体和复合物可以有效作为用于诸如疼痛、炎性疾病等的疾病的药剂，诊断剂或试剂。本发明的适体和复合物也可以有效用于纯化和浓缩NGF，以及检测和定量NGF。
本申请基于在日本申请的专利申请号2008-244982(申请日：2008年9月24日)，其全部内容结合入本文中。
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Claims (24)

1.一种适体，其结合NGF并抑制NGF和NGF受体的结合。
2.一种适体，其结合NGF并抑制NGF的神经突伸长活性。
3.根据权利要求2所述的适体，其具有不大于100nM的50％抑制浓度(IC50)。
4.根据权利要求2所述的适体，其具有不大于10nM的50％抑制浓度(IC50)。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的适体，其中至少一个核苷酸被修饰。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的适体，其包含由HGAANNNANCY(SEQ ID NO：106)所示的序列，其中N是任意核苷酸，H是除G以外的核苷酸，Y是嘧啶核苷酸，并且上述序列的至少一个核苷酸被修饰。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的适体，其包含由UGAAANNANCY(SEQ ID NO：107)，CGAANNAAACY(SEQ ID NO：108)或AGAANNAAACY(SEQ ID NO：109)所示的序列，其中N是任意核苷酸，Y是嘧啶核苷酸，并且上述序列的至少一个核苷酸被修饰。
8.根据权利要求1-4中任一项所述的适体，其包含由UGAAAAAAACY(SEQ ID NO：110)，UGAAAGAAACY(SEQ ID NO：111)，CGAACAAAACY(SEQ ID NO：112)或CGAAAGAAACY(SEQ ID NO：113)所示的序列，其中Y是嘧啶核苷酸，并且上述序列的至少一个核苷酸被修饰。
9.根据权利要求5-8中任一项所述的适体，其中各个嘧啶核苷酸的核糖的2’-位处的羟基是相同的或不同的，并且是未取代的或被选自由氢原子、氟原子和甲氧基组成的组的原子或基团取代。
10.根据权利要求5-8中任一项所述的适体，其中各个嘌呤核苷酸的核糖的2’-位处的羟基是相同的或不同的，并且是未取代的或被选自由氢原子、氟原子和甲氧基组成的组的原子或基团取代。
11.根据权利要求1所述的适体，其包含下面核苷酸序列(a)，(b)和(c)中的任一种：
(a)包含选自SEQ ID NOs：1-9，12，24-55和57-90(其中尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的核苷酸序列的适体；
(b)包含选自SEQ ID NOs：1-9，12，24-55和57-90(其中尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的核苷酸序列的适体，其中一个或多个核苷酸被取代、删除、插入或添加；和
(c)与选自SEQ ID NOs：1-9，12，24-55和57-90(其中尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的核苷酸序列具有70％以上的同一性的核苷酸序列。
12.根据权利要求11所述的适体，其中至少一个核苷酸被修饰。
13.根据权利要求12所述的适体，其中各个嘧啶核苷酸的2’-位处的羟基是相同的或不同的，并且是未取代的或被选自由氢原子、氟原子和甲氧基组成的组的原子或基团取代。
14.根据权利要求12所述的适体，其中各个嘌呤核苷酸的2’-位处的羟基是相同的或不同的，并且是未取代的或被选自由氢原子、氟原子和甲氧基组成的组的原子或基团取代。
15.一种复合物，其包含根据权利要求1-14中任一项所述的适体和功能物质。
16.根据权利要求15所述的复合物，其中所述功能物质是亲和物质、标记物质、酶、药物递送载体或药物。
17.一种药剂，其包含根据权利要求1-14中任一项所述的适体或根据权利要求15或16所述的复合物。
18.一种抗疼痛剂，其包含根据权利要求1-14中任一项所述的适体或根据权利要求15或16所述的复合物。
19.一种抗炎剂，其包含根据权利要求1-14中任一项所述的适体或根据权利要求15或16所述的复合物。
20.一种诊断剂，其包含根据权利要求1-14中任一项所述的适体或根据权利要求15或16所述的复合物。
21.一种用于NGF检测的探针，其包含根据权利要求1-14中任一项所述的适体或根据权利要求15或16所述的复合物。
22.一种用于NGF纯化的固相载体，其包含根据权利要求1-14中任一项所述的适体或根据权利要求15或16所述的复合物。
23.一种检测NGF的方法，其包括使用根据权利要求1-14中任一项所述的适体或根据权利要求15或16所述的复合物。
24.一种纯化NGF的方法，其包括使用根据权利要求1-14中任一项所述的适体或根据权利要求15或16所述的复合物。
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