BRPI0919268B1 - aptâmero que se liga ao ngf e medicamento - Google Patents

Abstract

APTÂMERO PARA NGF E USO DESTE. A presente invenção refere-se a um aptâmero tendo uma atividade inibitória contra NGF; um complexo contendo um aptâmero tendo uma atividade de ligação ou atividade inibitória contra NGF e uma substância funcional (por exemplo, substâncias de afinidade, substâncias de etiquetação, enzimas, veículos de distribuição de fármaco, fármacos e similares); um medicamento, um agente diagnóstico, um agente de etiquetação e similares contendo um aptâmero tendo uma atividade de ligação ou atividade inibitória contra NGF, ou um complexo contendo o aptâmero e a substância funcional; e similares.

Description

CAMPO TÉCNICO

[0001] A presente invenção refere-se a um aptâmero para NGF, um método de utilização do mesmo, e similares.

TÉCNICA ANTECEDENTE

[0002] Fator de crescimento de nervo (NGF) é a primeira neurotrofina identificada em 1951, e é uma proteína secretória importante envolvida no desenvolvimento e sobrevivência de neurônios periféricos e centrais. Ela consiste em 118 aminoácidos, tem um peso molecular de 13 kDa, e tem ligações S-S nas posições 3 em uma molécula. BDNF, NT-3 e NT-4/5 estão presentes na família de proteína, que são estruturalmente bem conservadas e formam um homodímero por uma ligação não-covalente. Ela tem uma estrutura de β folha que faceia 3 direções diferentes, e é considerada ser dimerizada nesta parte. Ela também tem quatro estruturas de circuito fechado com baixa homologia entre famílias, e estas partes são consideradas definirem especificidade a receptores.

[0003] Como Receptores de NGF, receptor tipo tirosina cinase TrkA com alta afinidade e p75 com baixa afinidade que pertence a uma superfamília de receptor de fator de necrose de tumor são conhecidos. Estes receptores agem como um homodímero ou heterodímero e são profundamente envolvidos no desenvolvimento e manutenção do sistema nervoso. TrkA é um receptor transmembrana de passagem simples e tem uma estrutura de tirosina cinase no domínio intracelular. Quando NGF é ligado, fosforilação de tirosina ocorre, o sinal é transmitido a jusante, e promoção de diferenciação e manutenção de sobrevivência da célula ocorre.

[0004] Como família de receptores de TrkA, TrkB e TrkC são conhecidos. TrkB é ligado a BDNF e NT-4/5, e TrkC é ligado a NT-3. p75 mostra baixa especificidade de ligante conforme comparada a TrkA e é também ligado a BDNF, NT-3 e NT-4/5 além de NGF. Enquanto p75 é um receptor transmembrana de passagem simples, ele não tem um domínio de tirosina cinase no lado citoplásmico. Similar a TrkA, ele é expresso não somente em células de nervo, mas também em células de não-nervo. Este receptor é conhecido para estar envolvido na promoção de diferenciação e manutenção de sobrevivência da célula, bem como relacionado à indução de apoptose e migração de célula. Os resultados de análise de estrutura de cristal têm sugerido que um homodímero de NGF se liga a TrkA a 2:2 e a p75 a 2:1. Um homodímero de NGF às vezes se liga a um heterodímero de TrkA e p75.

[0005] NGF é produzido por célula de Schwann, célula queratinizada, célula epitelial bronquial, fibroblasto, linfócito T, macrófago, célula-tronco, linfócito B, queratinócito, célula de músculo liso, célula glomerular renal, célula de músculo esqueletal e similares. Por outro lado, TrkA é conhecido por ser expresso em célula de nervo, bem como monócito, linfócito T, linfócito B e célula-tronco outras do que célula de nervo. Similarmente, p75 é expresso em célula de nervo, bem como em célula de não-nervo.

[0006] É bem-conhecido que NGF desempenha um papel-chave no sistema nervoso. Foi esclarecido que NGF tem uma ação para manter sobrevivência de neurônio colinérgico e é considerado estar relacionado em algum modo à doença de Alzheimer. Em adição, desde que administração intracerebral de NGF aperfeiçoa distúrbios de memória de ratos idosos, é também esperado como um fármaco terapêutico para demência senil.

[0007] Verificou-se que NGF também age nos tecidos e células outras do que o sistema nervoso, e envolvido na defesa do corpo e processo de reparo de tecido. Por exemplo, é conhecido que administração de NGF a um animal aumenta a permeabilidade do vaso sanguíneo, intensifica respostas imunes de célula T e célula B, induz diferenciação de linfócitos, induz crescimento de células-tronco, induz liberação de várias citocinas de células-tronco e similares.

[0008] NGF está relacionado à inflamação, expressão aumentada de NGF foi observada em pacientes com doenças inflamatórias e modelos de animal inflamatórios. Lúpus eritematoso sistêmico, esclerose múltipla, psoríase, artrite, cistite intersticial, asma e similares são os exemplos destes. Foi reportado que o fluido sinovial de pacientes com artrite reumatoide mostra concentração mais alta de NGF. Em adição, expressão aumentada de NGF em ratos de modelo de artrite reumatoide, e aumento nas células-troncos e expressão aumentada de NGF em camundongo de modelo de artrite foram reportados.

[0009] NGF está profundamente envolvido na dor. Quando NGF é subcutaneamente administrado a ser humano, uma dor profunda, tal como dor muscular, continua por vários dias, e hiperalgesia do local de injeção ocorre. Camundongo de golpe de NGF e camundongo de golpe de TrkA carecem de nervo não-mielinizado e sem sentimento de dor. Quando NGF é intraperitonealmente administrado a 1 mg/kg a um rato maduro, hiperalgesia contra calor nocivo e estímulo mecânico ocorre. Camundongo transgênico de NGF mostra hiperalgesia desacompanhada por condições inflamatórias. Em adição, é conhecido que o gene de TrkA de pacientes com insensibilidade congenital a dor com anidrose (CIPA) tem anormalidade, e a sensação de dor diminui quando gene de NGF tem anormalidade.

[00010] A partir do acima, um inibidor de NGF pode ser usado como um fármaco terapêutico para dor tais como dor nociceptiva, dor inflamatória, dor neuropática, dor carcinomatosa, dor de fibromialgia e similares. Uma terapia de combinação de anticorpo de NGF e NSAID (WO04/073653), uma terapia de combinações de anticorpo de NGF e analségico opioide (WO04/096122), um método de tratamento de pós- cirúrgica usando um anticorpo de NGF (WO04/032870, WO05/000194), um método de tratamento de dor de câncer de osso usando um anticorpo de NGF (WO05/111077), e um método de tratamento de dor de osteoartrite usando um anticorpo de NGF (WO06/110883) foi reportado.

[00011] Tanezumab (PF-4383119 ou RN624) é um anticorpo contra NGF, mostra efeito no experimento de modelo de dor usando um modelo de animal de osteoartrite, e está atualmente sob ensaio clínico. Enquanto a presença ou ausência de atividade inibitória de NGF e Receptor de NGF é desconhecida, existe um relatório relacionado a RNA natural que se liga ao NGF (documento de não-patente 1).

[00012] Nos anos recentes, aplicações de aptâmeros de RNA a medicamentos, agentes diagnósticos, e fármacos de teste estão chamando atenção; alguns aptâmeros de RNA já estiveram em estágio de estudo clínico ou em uso prático. Em dezembro de 2004, o primeiro fármaco de aptâmeto de RNA mundial, Macugen, foi aprovado como um fármaco terapêutico para degeneração macular relacionada à idade nos Estados Unidos. Um aptâmero de RNA se refere a um RNA que se liga especificamente a uma molécula-alvo tal como uma proteína, e pode ser preparado usando o método SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) (Referências de Patente 1 - 3). No método SELEX, um RNA que se liga especificamente a uma molécula-alvo é selecionado de uma reunião de RNA com cerca de 1014 sequências de nucleotídeos diferentes. A estrutura de RNA usada tem uma sequência aleatória de cerca de 40 resíduos, que é flanqueada por sequências de iniciador. Esta reunião de RNA é permitida ser montada com uma substância- alvo, e somente o RNA que tem se ligado à substância-alvo é coletado usando um filtro e similares. O RNA coletado é amplificado por RT- PCR, e este é usado como um molde para a próxima etapa. Repetindo-se esta operação cerca de 10 vezes, um aptâmero de RNA que se liga especificamente à substância-alvo pode ser adquirido.

[00013] Fármacos de aptâmero, similares a fármacos de anticorpo, podem ter como alvo fatores extracelulares. Com referência a muitos artigos científicos e outros materiais de referência no domínio público, fármacos de aptâmero são julgados superar potencialmente fármacos de anticorpo em alguns aspectos. Por exemplo, aptâmeros frequentemente mostram força de ligação mais alta e especificidade mais alta do que anticorpos. Aptâmeros são, de modo diferente, para suportarem eliminação imune, e características de reação adversas de anticorpos, tais como citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) e citotoxicidade dependente de complemento (CDC), são, de modo diferente, para ocorrerem com o uso de aptâmeros. A partir do aspecto de distribuição, desde que aptâmeros são cerca de 1/10 de anticorpo em tamanho, a distribuição de um fármaco do local objeto é mais fácil. Desde que aptâmeros são produzidos por síntese química, várias modificações podem ser feitas facilmente, redução de custo por produção de grande escala é possível. Por enquanto, as meias-vidas do sangue de aptâmeros são geralmente mais curtas do que aquelas de anticorpos; contudo, esta propriedade é, às vezes, vantajosa em vista de toxicidade. Estes fatos conduzem à conclusão que mesmo quando a mesma molécula é alvo, fármacos de aptâmero superam potencialmente fármacos de anticorpo. Lista de Documento documentos de patente documento de patente 1: WO91/19813 documento de patente 2: WO94/08050 documento de patente 3: WO95/07364 documento de não-patente documento de não-patente 1: Binkley J et al., (1995) Nucleic Acids Res, 23, 3198-3205

Sumário da Invenção Problemas a serem Resolvidos pela Invenção

[00014] A presente invenção é direcionada à provisão de um aptâmero para NGF e um método de utilização do mesmo, e similares.

Meios de Solucionar os Problemas

[00015] Os presentes inventores investigaram diligentemente para solucionar o problema descrito acima e foram bem-sucedidos na preparação de um aptâmero de boa qualidade para NGF, que resultou no término da presente invenção.

[00016] Consequentemente, a presente invenção proporciona o seguinte: [1] um aptâmero que se liga ao NGF e inibe ligação de NGF e um receptor de NGF; [2] um aptâmero que se liga ao NGF e inibe a atividade de crescimento de neurite de NGF; [3] o aptâmero de acordo com [2], tendo uma concentração inibitória (IC50) 50% de não mais do que 100 nM; [4] o aptâmero de acordo com [2], tendo uma concentração inibitória (IC50) 50% de não mais do que 10 nM; [5] o aptâmero de acordo com qualquer um de [1] a [4], no qual pelo menos um nucleotídeo é modificado; [6] o aptâmero de acordo com qualquer um de [1] ao [4], compreendendo uma sequência mostrada por HGAANNNANCY (SEQ ID NO: 106), no qual N é qualquer nucleotídeo, H é um nucleotídeo excluindo G, Y é um nucleotídeo de pirimidina, e pelo menos um nucleotídeo da sequência antes mencionado é modificado; [7] o aptâmero de acordo com qualquer um de [1] a [4], compreendendo uma sequência mostrada por UGAAANNANCY (SEQ ID NO: 107), CGAANNAAACY (SEQ ID NO: 108) ou AGAANNAAACY (SEQ ID NO: 109), no qual N é qualquer nucleotídeo, Y é um nucleotídeo de pirimidina e pelo menos um nucleotídeo da sequência antes mencionado é modificado; [8] o aptâmero de acordo com qualquer um de [1] a [4], compreendendo uma sequência mostrada por UGAAAAAAACY (SEQ ID NO: 110), UGAAAGAAACY (SEQ ID NO: 111), CGAACAAAACY (SEQ ID NO: 112) ou CGAAAGAAACY (SEQ ID NO: 113), no qual Y é um nucleotídeo de pirimidina e pelo menos um nucleotídeo da sequência antes mencionado é modificado; [9] o aptâmero de acordo com qualquer um de [5] a [8], no qual os grupos hidroxila na posição 2' de uma ribose de respectivos nucleotídeos de pirimidina são os mesmos ou diferentes e não- substituídos ou substituídos por um átomo ou grupo selecionado a partir do grupo consistindo em um átomo de hidrogênio, um átomo de flúor e um grupo metóxi; [10] o aptâmero de acordo com qualquer um de [5] a [8], no qual os grupos hidroxila na posição 2' de uma ribose de respectivos nucleotídeos de purina são os mesmos ou diferentes e não- substituídos ou substituídos por um átomo ou grupo selecionado a partir do grupo consistindo em um átomo de hidrogênio, um átomo de flúor e um grupo metóxi; [11] o aptâmero de acordo com [1], compreendendo qualquer uma das sequências de nucleotídeo (a), (b) e (c) abaixo: (a) um aptâmero compreendendo uma sequência de nucleotídeo selecionada de entre SEQ ID NOs: 1-9, 12, 24-55 e 57-90 (no qual uracila pode ser timina); (b) um aptâmero compreendendo uma sequência de nucleotídeo selecionada de entre SEQ ID NOs: 1-9, 12, 24-55 e 57-90 (no qual uracila pode ser timina), no qual 1 ou vários nucleotídeos são substituídos, anulados, inseridos ou adicionados; e (c) uma sequência de nucleotídeo tendo uma identidade de 70% ou mais uma sequência de nucleotídeo selecionada de entre SEQ ID NOs: 1-9, 12, 24-55 e 57-90 (no qual uracila pode ser timina); [12] o aptâmero de acordo com [11], no qual pelo menos um dos nucleotídeos foi modificado; [13] o aptâmero de acordo com [12], no qual os grupos hidróxi na posição 2' de respectivos nucleotídeos de pirimidina são os mesmos ou diferentes e não-substituídos ou substituídos por um átomo ou um grupo selecionado a partir do grupo consistindo em um átomo de hidrogênio, um átomo de flúor e um grupo metóxi; [14] o aptâmero de acordo com [12], no qual os grupos hidróxi na posição 2' de respectivos nucleotídeos de purina são os mesmos ou diferentes e não-substituídos ou substituídos por um átomo ou um grupo selecionado a partir do grupo consistindo em um átomo de hidrogênio, um átomo de flúor e um grupo metóxi; [15] um complexo compreendendo o aptâmero de qualquer um de [1] a [14] e uma substância funcional; [16] o complexo de acordo com [15], no qual a substância funcional é uma substância de afinidade, uma substância de etiquetação, uma enzima, um veículo de distribuição de fármaco ou um fármaco; [17] um medicamento compreendendo o aptâmero de qualquer um de [1] a [14] ou o complexo de [15] ou [16]; [18] um agente antidor compreendendo o aptâmero de qualquer um de [1] a [14] ou o complexo de [15] ou [16]; [19] um agente anti-inflamatório compreendendo o aptâmero de qualquer um de [1] a [14] ou o complexo de [15] ou [16]; [20] um agente diagnóstico compreendendo o aptâmero de qualquer um de [1] a [14] ou o complexo de [15] ou [16]; [21] uma sonda para detecção de NGF, compreendendo o aptâmero de qualquer um de [1] a [14] ou o complexo de [15] ou [16]; [22] um veículo de fase sólida para purificação de NGF, compreendendo o aptâmero de qualquer um de [1] a [14] ou o complexo de [15] ou [16]; [23] um método de detecção de NGF, compreendendo uso do aptâmero de qualquer um de [1] a [14] ou o complexo de [15] ou [16]; [24] um método de purificação de NGF, compreendendo uso do aptâmero de qualquer um de [1] a [14] ou o complexo de [15] ou [16]; [25] um método de tratamento ou prevenção de uma doença que acompanha uma dor ou inflamação, compreendendo administrar o aptâmero de qualquer um de [1] a [14] ou o complexo de [15] ou [16] a um indivíduo em necessidade deste; [26] uso do aptâmero de qualquer um de [1] a [14] ou o complexo de [15] ou [16] para um medicamento para o tratamento ou profilaxia de uma doença que acompanha uma dor ou inflamação; [27] uso do aptâmero de qualquer um de [1] a [14] ou o complexo de [15] ou [16] para uso como um medicamento para o tratamento ou profilaxia de uma doença que acompanha uma dor ou inflamação; [28] uso do aptâmero de qualquer um de [1] a [14] ou o complexo de [15] ou [16] para uso como um medicamento para o tratamento ou profilaxia de uma doença que acompanha uma dor ou inflamação; [29] uso do aptâmero de qualquer um de [1] a [14] ou o complexo de [15] ou [16] para a produção de um medicamento para o tratamento ou profilaxia de uma doença que acompanha uma dor ou inflamação.

Efeito da Invenção

[00017] O aptâmero e o complexo da presente invenção podem ser úteis como medicamentos, agentes diagnósticos ou reagentes para doenças tais como dor, doença inflamatória, e similares. O aptâmero e o complexo da presente invenção podem também ser úteis para a purificação e concentração de NGF, bem como detecção e quantificação de NGF.

Breve Descrição dos Desenhos

[00018] A figura 1 mostra a estrutura secundária de aptâmero mostrada por SEQ ID NO: 1 prognosticada pelo programa MFOLD, no qual a parte encerrada em um círculo negro mostra uma Sequência consenso.

[00019] A figura 2 mostra a estrutura secundária de aptâmero mostrada por SEQ ID NO: 2 prognosticada pelo programa MFOLD.

[00020] A figura 3 mostra a estrutura secundária de aptâmero mostrada por SEQ ID NO: 3 prognosticada pelo programa MFOLD, no qual a parte encerrada em um círculo negro mostra uma Sequência consenso.

[00021] A figura 4 mostra a estrutura secundária de aptâmero mostrada por SEQ ID NO: 4 prognosticada pelo programa MFOLD, no qual a parte encerrada em um círculo negro mostra uma Sequência consenso.

[00022] A figura 5 mostra a estrutura secundária de aptâmero mostrada por SEQ ID NO: 5 prognosticada pelo programa MFOLD, no qual a parte encerrada em um círculo negro mostra uma Sequência consenso.

[00023] A figura 6 mostra a estrutura secundária de aptâmero mostrada por SEQ ID NO: 6 prognosticada pelo programa MFOLD, no qual a parte encerrada em um círculo negro mostra uma Sequência consenso.

[00024] A figura 7 mostra a estrutura secundária de aptâmero mostrada por SEQ ID NO: 7 prognosticada pelo programa MFOLD, no qual a parte encerrada em um círculo negro mostra uma Sequência consenso.

[00025] A figura 8 mostra a estrutura secundária de aptâmero mostrada por SEQ ID NO: 8 prognosticada pelo programa MFOLD.

[00026] A figura 9 mostra a estrutura secundária de aptâmero mostrada por SEQ ID NO: 9 prognosticada pelo programa MFOLD, no qual a parte encerrada em um círculo negro mostra uma Sequência consenso.

[00027] A figura 10a mostra a estrutura secundária de aptâmero mostrada por SEQ ID NO: 12 prognosticada pelo programa MFOLD.

[00028] A figura 10b mostra a estrutura secundária de aptâmero mostrada por SEQ ID NO: 12 prognosticada pelo programa MFOLD.

[00029] A figura 11 é um sensorgrama mostrando que o aptâmero (Apt) mostrado por SEQ ID NO: 6 se liga ao NGF humano, no qual 40N é um RNA contendo uma sequência aleatória com 40 nucleotídeos. Usando-se, como um ligante, Apt ou 40N como um controle negativo, e NGF humano como um analito, a medição foi realizada por BIAcore2000 manufaturado por BIAcore.

[00030] A figura 12 é um desenho mostrando que o aptâmero (Apt) mostrado por SEQ ID NO: 6 inibe a ligação de NGF humano e receptor de TrkA humano, no qual 40N é um RNA contendo uma sequência aleatória com 40 nucleotídeos. Usando-se TrkA como um ligante, uma mistura de NGF e Apt como um analito, NGF sozinho como um controle negativo, e uma mistura de NGF e 40N, a medição foi realizada por BIAcore2000 manufaturado por BIAcore.

[00031] A figura 13 é um desenho mostrando que o aptâmero (Apt) mostrado por SEQ ID NO: 6 inibe a ligação de NGF humano e receptor P75 humano, no qual 40N é um RNA contendo uma sequência aleatória com 40 nucleotídeos. Usando TrkA como um ligante, uma mistura de NGF e Apt como um analito, NGF sozinho como um controle negativo, e uma mistura de NGF e 40N, medição foi realizada por BIAcore2000 manufaturado por BIAcore.

[00032] A figura 14 mostra a estrutura secundária de aptâmero mostrada por SEQ ID NO: 31 prognosticada pelo programa MFOLD, no qual a parte encerrada em um círculo negro mostra uma Sequência consenso.

[00033] A figura 15 mostra a estrutura secundária de aptâmero mostrada por SEQ ID NO: 36 prognosticada pelo programa MFOLD, no qual a parte encerrada em um círculo negro mostra uma Sequência consenso.

Descrição das Modalidades

[00034] A presente invenção proporciona um aptâmero tendo uma atividade de ligação para NGF. O aptâmero da presente invenção se liga ao NGF, e pode inibir a atividade de NGF por inibição da ligação de NGF e receptor de NGF.

[00035] Um aptâmero se refere a uma molécula de ácido nucleico tendo uma afinidade de ligação a uma molécula-alvo particular. O aptâmero pode inibir a atividade de uma molécula-alvo particular por ligação à molécula-alvo particular. O aptâmero da presente invenção pode ser um RNA, um DNA, um ácido nucleico modificado ou uma mistura destes. O aptâmero da presente invenção pode também estar em uma forma linear ou circular.

[00036] NGF é uma neurotrofina conhecida, e é uma proteína secretória importante envolvida no desenvolvimento e sobrevivência de neurônios periféricos e centrais. NGF é uma abreviação de Fator de crescimento de nervo. Na presente invenção, NGF particularmente significa um NGF tipo β. As sequências de aminoácido de β-NGF humano são aquelas mostradas pelos Números de Acesso NP002497, P01138, AAI26151, AAI26149 e CAB75625, que podem também ser um com mutação, seu domínio ou peptídeo. Ele pode ser não somente um monômero, mas também um dímero ou multímero.

[00037] O aptâmero da presente invenção se liga ao NGF em um tampão fisiológico (por exemplo, solução A: ver Exemplo 1). O aptâmero da presente invenção se liga ao NGF a uma intensidade detectável pelo seguinte teste.

[00038] Para a medição, BIAcore2000 manufaturado por BIAcore é usado. Um aptâmero é imobilizado em um chip sensor. A quantidade a ser imobilizada é ajustada para 1000RU. Um tampão fisiológico contendo 0,3M de NaCl (solução A: ver Exemplo 1) é usado para preparar solução de NGF (0,5 μM). Esta solução de NGF (20 μL) é injetada e a ligação de NGF ao aptâmero é detectada. Usando-se RNA contendo uma sequência de nucleotídeo aleatória consistindo em 40 nucleotídeos como um controle negativo, quando NGF se liga significantemente fortemente ao aptâmero conforme comparado ao RNA de controle, o aptâmero é avaliado para ter ligabilidade ao NGF.

[00039] O aptâmero da presente invenção inibe a atividade de NGF por ligação ao NGF e inibição da ligação de NGF e receptor de NGF. No presente relatório, a "atividade inibitória contra NGF" significa uma capacidade inibitória em qualquer atividade de NGF. Por exemplo, isto significa uma atividade para inibir NGF de ligação a receptor de NGF.

[00040] Em adição, exemplos de outra "atividade inibitória contra NGF" inclui inibição de transdução de sinal a jusante do receptor de NGF (trajetória de Ras-MAP cinase, trajetória de PI3 cinase), inibição de expressão aumentada de TRPV1, SP, BDNF e similares, atividade inibitória de expressão de HA, BK, PG, NGF e outra citocina liberada de células-tronco, etc., e similares, que resultam da ligação de NGF a receptor de NGF.

[00041] Além disso, diferenciação de célula de nervo induzida por NGF, aumento de sobrevivência, crescimento de neurite e permeabilidade de vaso sanguíneo, intensificação de resposta imune de células T e células B, diferenciação de linfócitos, inibição de crescimento e similares de várias células tais como células-tronco, células eritroleucêmicas, células de câncer e similares, alívio de dor, hiperalgesia e similares, podem ser mencionados.

[00042] A "atividade inibitória contra NGF" preferível que o aptâmero da presente invenção tem é uma atividade para inibir a ligação de NGF a receptor de NGF, e uma atividade para inibir atividade de crescimento de neurite induzida por NGF.

[00043] No presente relatório, o "receptor de NGF" significa uma proteína de superfície de célula a qual NGF se liga. Como o receptor de NGF, TrkA e p75 são conhecidos. O receptor de NGF referido na presente invenção pode ser uma proteína contendo uma sequência de aminoácido natural ou uma variante desta. Aqui, a "variante desta" significa uma proteína ou peptídeo no qual vários aminoácidos de uma sequência de aminoácido de "receptor de NGF" foram substituídos ou uma sequência de aminoácido parcial desta, que tem uma atividade de ligação ao NGF e inibe a ligação de NGF e receptor de NGF.

[00044] O aptâmero da presente invenção se liga ao NGF e inibe a ligação de NGF e receptor de NGF. Se ou não o aptâmero inibe a ligação de NGF a receptor de NGF pode ser avaliado pelo seguinte teste.

[00045] Para a medição, BIAcore2000 manufaturado por BIAcore é usado. Em um chip de sensor CM5 é imobilizada uma proteína de fusão de receptor de NGF e Fc (por exemplo, Trk A-Fc (sistemas 175- TK, R&D)) ou p75-Fc (sistemas R&D)). A quantidade a ser imobilizada é 1100RU. NGF (0,1 μM) e um aptâmero (0,33 μM) são misturados em um tampão fisiológico (solução A: ver Exemplo 1), e a mistura é preparada por 30 minutos. Esta mistura (20 μL) é injetada, e a ligação de NGF a receptor de NGF é detectada. Quando a atividade inibitória (%) não é menor do que 60%, o aptâmero é avaliado para inibir a ligação de NGF a receptor de NGF. A atividade inibitória (%) é calculada com a quantidade de ligação de NGF livre de um aptâmero e receptor de NGF como 0, e uma quantidade de ligação por injeção de uma solução livre de NGF como 100. Aqui, a quantidade de ligação significa valor de RU em um topo de pico do sensorgrama de BIAcore (valor RU imediatamente após o término de injeção de NGF).

[00046] Em uma modalidade, o aptâmero da presente invenção pode inibir ambas a ligação de NGF e TrkA, e aquela de NGF e p75.

[00047] O aptâmero da presente invenção pode exibir atividade inibitória contra NGF derivada de quaisquer mamíferos. Tais mamíferos incluem primatas (por exemplo, ser humano, macaco), roedores (por exemplo, camundongo, rato e porquinho-da-índia), e animais de companhia, animais domésticos e animais de trabalho (por exemplo, cão, gato, cavalo, bovino, cabra, ovelha, suíno).

[00048] O aptâmero da presente invenção não é particularmente limitado considerando-se que ele se liga a qualquer porção de NGF e pode inibir a ligação de NGF e receptor de NGF.

[00049] Em uma modalidade preferível, o aptâmero da presente invenção contém uma sequência mostrada por HGAANNNANCY (SEQ ID NO: 106) no qual N é qualquer nucleotídeo, H é um nucleotídeo excluindo G, e Y é um nucleotídeo de pirimidina, se liga ao NGF, e inibe a ligação de NGF e receptor de NGF. A sequência de nucleotídeo mostrada por SEQ ID NO: 106 é incluída no aptâmero que se liga ao NGF e inibe a ligação de NGF e receptor de NGF, que é obtida pelo método SELEX abaixo mencionado. Pelo menos um nucleotídeo da sequência antes mencionada é preferivelmente modificado.

[00050] Em uma modalidade preferível, o aptâmero da presente invenção contém uma Sequência consenso mostrada por UGAAANNANCY (SEQ ID NO: 107), CGAANNAAACY (SEQ ID NO: 108) ou AGAANNAAACY (SEQ ID NO: 109) no qual N é qualquer nucleotídeo, e Y é um nucleotídeo de pirimidina, se liga ao NGF, e inibe a ligação de NGF e receptor de NGF. As sequências de nucleotídeo mostradas por SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108 e SEQ ID NO: 109 são incluídas no aptâmero que se liga ao NGF e inibe a ligação de NGF e receptor de NGF, que é obtida pelo método SELEX abaixo mencionado. Pelo menos um nucleotídeo destas sequências é preferivelmente modificado.

[00051] Em uma modalidade preferível, o aptâmero da presente invenção contém uma Sequência consenso mostrada por UGAAAAAAACY (SEQ ID NO: 110), UGAAAGAAACY (SEQ ID NO: 111), CGAACAAAACY (SEQ ID NO: 112) ou CGAAAGAAACY (SEQ ID NO: 113) no qual Y é um nucleotídeo de pirimidina, se liga ao NGF, e inibe a ligação de NGF e receptor de NGF. As sequências de nucleotídeos mostradas por SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112 e SEQ ID NO: 113 são incluídas no aptâmero que se liga ao NGF e inibe a ligação de NGF e receptor de NGF, que é obtida pelo método SELEX abaixo mencionado. Pelo menos um nucleotídeo destas sequências é preferivelmente modificado.

[00052] Em adição, o aptâmero da presente invenção pode ser um aptâmero que se liga ao NGF e inibe a atividade de crescimento de neurite de NGF. Se ou não o aptâmero inibe a atividade de crescimento de neurite de NGF pode ser avaliado pelo teste descrito no Exemplo 7 ou Exemplo 8.

[00053] Em adição, a concentração de aptâmero (IC50) para proporcionar uma atividade de crescimento de neurite de 50% pode também ser determinada por realização do teste descrito no Exemplo 8 com concentrações diferentes de aptâmero. O IC50 do aptâmero da presente invenção é preferivelmente não mais do que 100 nM, mais preferivelmente não mais do que 10 nM.

[00054] O comprimento do aptâmero da presente invenção não é limitado, e pode usualmente ser cerca de 10 a cerca de 200 nucleotídeos, e pode ser, por exemplo, não mais do que cerca de 100 nucleotídeos, preferivelmente não mais do que cerca de 60 nucleotídeos, mais preferivelmente não mais do que cerca de 50 nucleotídeos, mais preferivelmente não mais do que cerca de 45 nucleotídeos. Quando o número total de nucleotídeos é menor, síntese química e produção de massa serão mais fáceis, e existe uma vantagem maior em termos de custo. É também pensado que modificação química é mais fácil, estabilidade no corpo é mais alta, e toxicidade é mais baixa.

[00055] Cada nucleotídeo contido no aptâmero da presente invenção é o mesmo ou diferente e pode ser um nucleotídeo compreendendo um grupo hidroxila na posição 2' de ribose (por exemplo, ribose de nucleotídeo de pirimidina, ribose de nucleotídeo de purina) (isto é, um nucleotídeo não-substituído) ou um nucleotídeo substituído por qualquer átomo ou grupo na posição 2' de ribose. Como exemplos de quaisquer tais átomo ou grupo, um nucleotídeo substituído por um átomo de hidrogênio, um átomo de flúor ou um grupo -O-alquila (por exemplo, grupo -O-Me), um grupo -O-acila (por exemplo, grupo -O-CHO), ou um grupo amino (por exemplo, grupo - NH2) pode ser mencionado.

[00056] O aptâmero da presente invenção pode também ser o nucleotídeo no qual pelo menos um tipo (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4 tipos) de nucleotídeo compreende um grupo hidroxila, ou o acima descrito qualquer átomo ou grupo, por exemplo, pelo menos dois tipos (por exemplo, 2, 3 ou 4 tipos) de grupos selecionados a partir do grupo consistindo em um átomo de hidrogênio, um átomo de flúor, um grupo hidroxila e um grupo -O-Me, na posição 2' de ribose.

[00057] Também, no aptâmero da presente invenção, todos os nucleotídeos de pirimidina são os mesmos ou diferentes e cada pode ser um nucleotídeo substituído por um átomo de flúor, ou um nucleotídeo substituído por qualquer átomo ou grupo acima mencionado, preferivelmente um átomo ou grupo selecionado a partir do grupo consistindo em um átomo de hidrogênio, um grupo hidroxila e um grupo metóxi na posição 2' de ribose.

[00058] Nos aptâmeros da presente invenção, além disso, todos os nucleotídeos de purina são os mesmos ou diferentes e cada pode ser um nucleotídeo substituído por um grupo hidroxila na posição 2' de ribose, ou um nucleotídeo substituído por qualquer átomo ou grupo acima mencionado, preferivelmente um átomo ou um grupo selecionado a partir do grupo consistindo em um átomo de hidrogênio, um grupo metóxi, e um átomo de flúor.

[00059] O aptâmero da presente invenção pode também ser um no qual todos os nucleotídeos compreendem um grupo hidroxila, ou qualquer átomo ou grupo acima mencionado, por exemplo, o grupo idêntico selecionado pelo grupo consistindo em um átomo de hidrogênio, um átomo de flúor, um grupo hidroxila e um grupo -O-Me, na posição 2' de ribose.

[00060] Neste relatório, os nucleotídeos que constituem o aptâmero são assumidos para serem RNAs (isto é, os grupos de açúcar são assumidos para serem ribose) na descrição como os grupos de açúcar são modificados nos nucleotídeos. Contudo, isto não significa que DNA é isento dos nucleotídeos que constituem aptâmero, e uma modificação de RNA deve se ler como uma modificação de DNA conforme apropriado. Quando o nucleotídeo que constitui o aptâmero é DNA, por exemplo, substituição do grupo hidroxila na posição 2' de ribose por X deve se ler como uma substituição de um átomo de hidrogênio na posição 2' de desoxirribose por X.

[00061] O aptâmero da presente invenção pode também ser: (a) um aptâmero compreendendo uma sequência de nucleotídeo selecionada de entre SEQ ID NO:1-9, 12, 24-55 e 57-90 (com a condição que a uracila pode ser timina); (b) um aptâmero compreendendo uma sequência de nucleotídeo selecionada de entre SEQ ID NO:1-9, 12, 24-55 e 57-90 (com a condição que a uracila pode ser timina), no qual um a vários nucleotídeos são substituídos, anulados, inseridos ou adicionados; (c) um aptâmero compreendendo uma sequência de nucleotídeo tendo uma identidade de 70% ou mais (preferivelmente 80% ou mais, mais preferivelmente 90% ou mais, mais preferivelmente 95% ou mais) a uma sequência de nucleotídeo selecionada de entre SEQ ID NO: 1-9, 12, 24-55 e 57-90 (com a condição que a uracila pode ser timina); ou (d) um conjugado selecionado a partir do grupo consistindo em um conjugado de uma pluralidade de aptâmeros (a) acima, um conjugado de uma pluralidade de aptâmeros (b) acima, um conjugado de uma pluralidade de aptâmeros (c) acima, e um conjugado de uma pluralidade de aptâmeros (a), (b) e (c) acima.

[00062] Os aptâmeros dos acima mencionados (b) - (d) podem se ligar a um NGF e/ou inibir a atividade de NGF (receptor de NGF atividade de ligação etc.).

[00063] Em adição, preferivelmente, os aptâmeros dos acima mencionados (b) - (d) se ligam ao NGF e inibir a ligação de NGF e receptor de NGF, e/ou se ligam ao NGF, e inibir a atividade de crescimento de neurite de NGF.

[00064] Mais preferivelmente, os aptâmeros dos acima mencionados (b) - (d) mostram uma concentração inibitória de crescimento de neurite de NGF de não mais do que 100 nM, mais preferivelmente não mais do que 10 nM.

[00065] No (b) acima, o número de nucleotídeos substituídos, anulados, inseridos ou adicionados não é particularmente limitado considerando-se que o aptâmero se liga ao NGF, e pode inibir a atividade de NGF (receptor de atividade de ligação de NGF, etc). Ele pode ser, por exemplo, não mais do que cerca de 30, preferivelmente não mais do que cerca de 20, mais preferivelmente não mais do que cerca de 10, ainda mais preferivelmente não mais do que 5, mais preferivelmente 4, 3, 2 ou 1.

[00066] Com relação ao (c) acima, "uma identidade" significa uma proporção (%) de resíduos de nucleotídeo idênticos a todos os resíduos de nucleotídeo de sobreposição no alinhamento ótimo onde duas sequências de nucleotídeos são alinhadas usando-se um algoritmo matemático conhecido no campo técnico (preferivelmente, o algoritmo considera introdução de folgas em uma ou ambas das sequências para o melhor alinhamento).

[00067] A identidade de sequência de nucleotídeo no presente relatório pode ser calculada por, por exemplo, alinhamento das duas sequências de nucleotídeos usando-se o algoritmo de cálculo de homologia NCBI BLAST-2 (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) sob as seguintes condições (abertura de folga = 5 penalidades; extensão de folga = 2 penalidades; x_ queda = 50; valor de expectativa = 10; filtragem = ON).

[00068] No (d) acima, conjugação pode ser alcançada por ligação em tandem. Na conjugação, um ligador pode ser utilizado. Como o ligador, cadeias de nucleotídeo (por exemplo, 1 a cerca de 20 nucleotídeos) e cadeias de não-nucleotídeo (por exemplo, ligador - (CH2)n-, ligador-(CH2CH2O)n-, ligador hexaetileno glicol, ligador TEG, ligador contendo peptídeo, ligador contendo ligação -S-S-, ligador contendo ligação -CONH-, ligador contendo ligação -OPO3-) podem ser mencionados. A pluralidade conforme mencionada nos conjugados plurais acima mencionados não é particularmente limitada, considerando que ela é duas ou mais, e a pluralidade pode ser, por exemplo, 2, 3 ou 4. Cada um dos nucleotídeos em (a) a (d) acima, se os mesmos ou diferentes, pode ser um nucleotídeo compreendendo um grupo hidroxila na posição 2' de ribose, ou um nucleotídeo substituído por quaisquer grupos (por exemplo, um átomo de hidrogênio, átomo de flúor ou grupo -O-Me) na posição 2' de ribose (por exemplo, ribose de nucleotídeo de pirimidina).

[00069] O aptâmero da presente invenção pode ser um no qual um resíduo de açúcar (por exemplo, ribose) de cada nucleotídeo foi modificado para aumentar a atividade de ligação de NGF, NGF- atividade inibitória de ligação de receptor de NGF, atividade inibitória de crescimento de neurite de NGF, estabilidade de aptâmero, distribuição de fármaco e similares. Como exemplos da modificação em um resíduo de açúcar, substituição de átomo de oxigênio na posição 2', posição 3' e/ou posição 4' do resíduo de açúcar com outro átomo, e similares, pode ser mencionada. Conforme o tipo da modificação, fluorinatação, O-alquilatação (por exemplo, O- metilatação, O-etilatação), O-arilatação, S-alquilatação (por exemplo, S-metilatação, S-etilatação), S-arilatação, e aminação (por exemplo, - NH2), podem ser mencionadas. Tais alterações no resíduo de açúcar podem ser realizadas por um método conhecido per se (ver, por exemplo, Sproat et al., (1991) Nucl. Acid. Res. 19, 733-738; Cotton et al., (1991) Nucl. Acid. Res. 19, 2629-2635; Hobbs et al., (1973) Biochemistry 12, 5138-5145).

[00070] O aptâmero da presente invenção pode também ter uma base de ácido nucleico (por exemplo, purina ou pirimidina) alterada (por exemplo, substituição química) para aumentar a atividade de ligação de NGF, NGF-atividade inibitória de ligação de receptor de NGF, atividade inibitória de crescimento de neurite de NGF, e similares. Como exemplos de tais alterações, alteração de pirimidina na posição 5, alteração de purina na posição(ões) 6- e/ou 8, alteração com uma amina extracíclica, substituição com 4-tiouridina, e substituição com 5-bromo ou 5-iodo-uracila, podem ser mencionadas. O grupo fosfato contido no aptâmero da presente invenção pode ser alterado para conferir resistência à nuclease e hidrólise. Por exemplo, o grupo P(O)O pode ser substituído com P(O)S (tioato), P(S)S (ditioato), P(O)NR2 (amidato), P(O)R, R(O) OU', CO ou CH2 (formacetal) ou 3'-amina (-NH-CH2-CH2-) [no qual cada unidade de R ou R' é independentemente H ou uma alquila substituída ou não- substituída (por exemplo, metila, etila)].

[00071] O grupo de união é, por exemplo, -O-, -N- ou -S-, e nucleotídeos podem se ligar a um nucleotídeo de união via estes grupos de união.

[00072] As alterações podem também incluir alterações tais como capeamento em 3' e 5'.

[00073] Uma alteração pode adicionalmente ser realizada por adição a uma extremidade de um polietilenoglicol, aminoácido, peptídeo, dT invertido, ácido nucleico, nucleosídeos, Miristoíla, Litocólico-oleíla, Docosanila, Lauroíla, estearoíla, Palmitoíla, Oleoíla, Linoleoíla, outros lipídeos, esteroides, colesterol, cafeína, vitaminas, pigmentos, substâncias fluorescentes, agente anticâncer, toxina, enzimas, substância radioativa, biotina e similares. Para cada alteração, ver, por exemplo, Patentes U.S. 5.660.985 e 5.756.703.

[00074] O aptâmero da presente invenção pode ser quimicamente sintetizado conforme aqui revelado e por um método conhecido per se na técnica. Um aptâmero se liga à molécula-alvo em uma ampla variedade de modos de ligação, tal como ligações iônicas baseadas na carga negativa do grupo fosfato, ligações hidrofóbicas e ligações de hidrogênio baseadas na ribose, e ligações de hidrogênio e interação de empilhamento baseada nas bases de ácido nucleico. Em particular, ligações iônicas baseadas na carga negativa do grupo fosfato, que estão presentes no mesmo número conforme o número de nucleotídeos constituintes, são fortes, e se ligam à lisina e arginina estando presentes na superfície da carga positiva de proteína. Por esta razão, bases de ácido nucleico não envolvidas na ligação direta da molécula-alvo podem ser substituídas. Em particular, devido à região de estrutura-tronco já ter formado pare bases e faces no lado interno da estrutura helicoidal dupla, bases de ácido nucleico são diferentemente para se ligarem diretamente à molécula-alvo. Portanto, mesmo quando um par de base é substituído com outro par de base, a atividade do aptâmero frequentemente não diminui. Em estruturas no qual nenhum par de base é formado, tais como estruturas de circuito fechado, provido que a base de ácido nucleico não é envolvida na ligação direta à molécula-alvo, substituição de base é possível. Com relação a modificações da posição 2' de ribose, o grupo funcional na posição 2' de ribose infrequentemente interage diretamente com a molécula-alvo, mas em muitos casos, não é de relevância, e pode ser substituído por outra molécula modificada. Consequentemente, um aptâmero, a menos que o grupo funcional envolvido na ligação direta à molécula-alvo é substituído ou anulado, frequentemente retém a atividade deste. É também importante que a estrutura tridimensional total não mude substancialmente.

[00075] Um aptâmero pode ser preparado por utilização do método SELEX ou uma versão aperfeiçoada deste (por exemplo, Ellington et al., (1990) Nature, 346, 818-822; Tuerk et al., (1990) Science, 249, 505-510). No método SELEX, pelo aumento do número de etapas ou uso de uma substância de competição, um aptâmero exibindo um potencial de ligação mais forte para a molécula-alvo é concentrado e selecionado. Consequentemente, pelo ajuste do número de etapas de SELEX e/ou mudando a condição competitiva, os aptâmeros com forças de ligação diferentes, aptâmeros com modos de ligação diferentes, e aptâmeros com a mesma força de ligação ou modo de ligação, mas sequências de base diferentes, podem ser obtidos em alguns casos. O método SELEX compreende um processo de amplificação por PCR; causando uma mutação pelo uso de íons de manganês e similares no processo, é possível realizar SELEX com diversidade mais alta.

[00076] Os aptâmeros obtidos por SELEX são ácidos nucleicos que exibem alta afinidade para a substância-alvo, mas isto não significa ligação a um local ativo da substância-alvo. Portanto, os aptâmeros obtidos por SELEX não agem necessariamente na função da substância-alvo. NGF é uma proteína básica, e é pensado ser provavelmente para permitir que ácidos nucleicos se liguem a esta não-especificamente. Um aptâmero que não e liga a um local ativo não influencia a atividade da substância-alvo. De fato, o RNA usado para controle não inibe a ligação de NGF e receptor de NGF.

[00077] Baseado no aptâmero ativo assim selecionado, SELEX pode ser realizado por mudança adicional de um iniciador para adquirir um aptâmero possuindo atividade mais alta. Especificamente, após preparação de um molde no qual um aptâmero com uma sequência determinada é parcialmente randomizado ou um molde dopado com cerca de 10 a 30% de sequências aleatórias, SELEX é realizado novamente.

[00078] Um aptâmero obtido por SELEX tem um comprimento de cerca de 80 nucleotídeos, e este é difícil para preparar como um produto farmacêutico conforme ele é. Consequentemente, é necessário repetir esforços de tentativa e erro para encurtar o aptâmero a um comprimento de cerca de 50 nucleotídeos ou menos capacitando fácil síntese química. Dependendo do desenho de iniciador para um aptâmero obtido por SELEX, a facilidade da operação de minimização subsequente muda. A menos que o iniciador seja designado com sucesso, desenvolvimento subsequente será impossível mesmo se um aptâmero com atividade é selecionado por SELEX. Na presente invenção, um aptâmero retendo atividade mesmo com 38 nucleotídeos foi obtido.

[00079] Os aptâmeros são modificados facilmente visto que eles permitem síntese química. Para aptâmeros, por prognóstico da estrutura secundária usando o programa MFOLD, ou por prognóstico da estrutura estérica por análise de raios-X ou análise de RMN, é possível prognosticar a alguma extensão que o nucleotídeo pode ser substituído ou anulado, e onde inserir um novo nucleotídeo. Um aptâmero prognosticado com a nova sequência pode facilmente ser quimicamente sintetizado, e pode ser determinado se ou não o aptâmero retém a atividade usando um sistema de ensaio existente.

[00080] Se uma região importante para a ligação do aptâmero obtido com a molécula-alvo é identificada por esforços de tentativa e erro repetidos conforme descrito acima, a atividade permanece não- mudada em muitos casos mesmo quando uma nova sequência é adicionada a ambas as extremidades da sequência. O comprimento da nova sequência não é particularmente limitado. Particularmente, as sequências antes mencionadas mostradas por HGAANNNANCY (SEQ ID NO: 106), UGAAANNANCY (SEQ ID NO: 107), CGAANNAAACY (SEQ ID NO: 108), AGAANNAAACY (SEQ ID NO: 109), UGAAAAAAACY (SEQ ID NO: 110), UGAAAGAAACY (SEQ ID NO: 111), CGAACAAAAC (SEQ ID NO: 112) e CGAAAGAAAC (SEQ ID NO: 113) são porções importantes para a ligação do aptâmero da presente invenção ao NGF e inibição da ligação de NGF e receptor de NGF. Mesmo quando uma nova sequência é adicionada a ambas as extremidades destas sequências, a atividade permanece não-mudada em muitos casos.

[00081] Modificações, similares às sequências, proporcionam uma ampla faixa de desenho ou alterações.

[00082] Conforme citado acima, os aptâmeros permitem uma ampla faixa de desenho ou alterações de modificações. A presente invenção também proporciona um método de produção de um aptâmero que capacita uma ampla faixa de desenho ou alteração de um aptâmero compreendendo uma sequência especificada (por exemplo, uma sequência correspondendo a uma porção selecionada de entre regiões de tronco, regiões de circuito fechado internas, regiões de circuito fechado de grampo de cabelo e regiões de trançado simples: daqui por diante, abreviadas como sequência fixas conforme requerido).

[00083] Por exemplo, o método de produção de tal aptâmero inclui produção de um aptâmero compreendendo uma sequência fixa pelo uso de um tipo simples de molécula de ácido nucleico consistindo em uma sequência de nucleotídeo mostrada por: Sequência de iniciador (i)| -(N) a-sequência fixa-(N) b- I sequência de Iniciador (ii) no qual (N) a representa uma cadeia de nucleotídeo consistindo em "a" unidades de N; (N)b representa uma cadeia de nucleotídeo consistindo em "b" unidades de N; cada das unidades de N, se idêntica ou diferente, é um nucleotídeo selecionado a partir do grupo consistindo em A, G, C, U e T (preferivelmente, A, G, C e U). Cada de "a" e "b", se idêntico ou diferente, pode ser quaisquer números, e pode ser, por exemplo, 1 a cerca de 100, preferivelmente 1 a cerca de 50, mais preferivelmente 1 a cerca de 30, ainda mais preferivelmente 1 a cerca de 20 ou 1 a cerca de 10], ou tipos plurais de moléculas de ácido nucleico (por exemplo, biblioteca de molécula de ácido nucleico diferente no número de a, b etc.) e pares iniciadores correspondentes às sequências de iniciadores (i) e (ii), respectivamente.

[00084] A presente invenção também proporciona um complexo compreendendo o aptâmero da presente invenção e uma substância funcional ligada a este. A ligação entre o aptâmero e a substância funcional no complexo da presente invenção pode ser uma ligação covalente ou uma ligação não-covalente. O complexo da presente invenção pode ser um no qual o aptâmero da presente invenção e uma ou mais (por exemplo, 2 ou 3) de substâncias funcionais do mesmo tipo ou tipos diferentes são ligados juntos. A substância funcional não é particularmente limitada, visto que recentemente confere uma certa função a um aptâmero da presente invenção, ou é capaz de mudar (por exemplo, aperfeiçoando) uma certa característica que um aptâmero da presente invenção pode possuir. Como exemplos da substância funcional, proteínas, peptídeos, aminoácidos, lipídeos, açúcares, monossacarídeos, polinucleotídeos, e nucleotídeos, podem ser mencionados. Como exemplos da substância funcional, substâncias de afinidade (por exemplo, biotina, estreptavidina, polinucleotídeos possuindo afinidade par sequência complementar- alvo, anticorpos, glutationa Sefarose, histidina), substância par etiquetação (por exemplo, substâncias fluorescentes, substâncias luminescentes, radioisótopos), enzimas (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina), veículo de distribuição de fármacos (por exemplo, lipossomo, microesferas, peptídeos, polietilenoglicóis), fármacos (por exemplo, aqueles usados em terapia de arremesso tal como calicheamicina e duocarmicina; análogo de nitrogênio mostarda tais como ciclofosfamida, melfalan, ifosfamida ou trofosfamida; etileniminas tais como tiotepa; nitrosoureias tal como carmustina; agentes de alquilatação tais como temozolomida ou dacarbazina; antagonistas metabólicos similares a folato tais como metotrexato ou raltitrexed; análogos de purina tais como tioguanina, cladribina ou fludarabina; análogos de pirimidina tais como fluorouracila, tegafur ou gemcitabina; alcaloides de vinca tais como vinblastina, vincristina ou vinorelbina e análogos destes; derivados de podofilotoxina tais como etoposídeo, taxanos, docetaxel ou paclitaxel; antraciclinas tais como doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina e mitoxantrona, e análogos destes; outros antibióticos citotóxicos tais como bleomicina e mitomicina; compostos de platina tais como cisplatina, carboplatina e oxaliplatina; pentostatina, miltefosina, estramustina, topotecano, irinotecano e bicalutamida), e toxinas (por exemplo, ricina toxina, liatoxina e Vero toxina), podem ser mencionados. Estas moléculas funcionais são finalmente removidas em alguns casos. Além disso, as moléculas podem ser peptídeos que podem ser reconhecidos e clivados por enzimas tais como trombina, matriz metaloproteinase (MMP), e Fator X, e podem ser polinucleotídeos que podem ser clivados por nucleases ou endonuclease de restrição.

[00085] O aptâmero ou o complexo da presente invenção pode ser usado como, por exemplo, um medicamento ou um agente diagnóstico, um fármaco de teste, um reagente, um aditivo para água de beber e alimento, um intensificador e um mitigador.

[00086] O aptâmero e complexo da presente invenção podem ter uma atividade para inibir a função de NGF por ligação ao NGF e inibição da ligação de NGF e receptor de NGF. Conforme mencionado acima, NGF é profundamente envolvido na dor e inflamação. Portanto, o aptâmero e complexo da presente invenção são úteis como medicamentos para o tratamento ou profilaxia de doenças que acompanham dor ou inflamação (agente anti-dor, agente anti- inflamatório etc.).

[00087] Aqui, exemplos da dor incluem dor nociceptiva (dor muscular, dor das costas, dor do membro superior, dano de coluna, artralgia, osteoartrite, gota, artrite reumatoide crônica, dor de cabeça, enxaqueca, dor de cabeça catatônica, dor de cabeça de agrupamento, dor de cabeça secundária, dor orofacial, dor de dente, causalgia após extração de dente, dor de dente ilusória, dor visceral, dor cardíaca, dor abdominal, mittelschmerz, dismenorreia, dor de trabalho, nefralgia, ureteralgia, ostalgia e similares), dor inflamatória, dor neuropática (neuripatia diabética, neuropatia tóxica, dor após operação, dor de membro ilusória, dor de fragmento, distrofia simpatética de reflexo, causalgia, dor posterpética, neuralgia trigeminal, dor central), dor carcinomatosa (dor devido à infiltração de câncer em órgão visceral, dor causada por obstrução de vaso sanguíneo devido à infiltração de vaso sanguíneo de tecido com câncer, dor de metástase de osso, dor associada com metástase intracerebral, dor causada por infiltração de nervo periférico de tecido com câncer), dor de fibromialgia e similares.

[00088] Enquanto a doença associada com inflamação aqui não é particularmente limitada, lúpus eritematoso sistêmico, esclerose múltipla, psoríase, osteoartrite, artrite reumatoide crônica, cistite intersticial, asma e similares, podem ser mencionadas.

[00089] Enquanto o câncer acima mencionado não é particularmente limitado, câncer de esôfago, câncer de tireoide, câncer de urinário de bexiga, câncer colorretal, câncer gástrico, câncer pancreático, câncer torácico, câncer de fígado, câncer de pulmão, câncer de pulmão de célula não-pequena, câncer de mama, neuroblastoma, glioblastoma, câncer uterino, câncer cervical, câncer ovariano, tumor de Wilms, câncer de próstata, e similares, podem ser mencionados.

[00090] Quando NGF se liga a um receptor deste, TrkA, ele ativa fosforilação de tirosina de TrkA e Ras-MAPK, PLC-Y, PI3K e similares a jusante de TrkA, e exibe ações fisiológicas tais como sobrevivência e diferenciação de células nervosas. Por outro lado, ele induz morte celular na trajetória de sinal via receptor p75. Portanto, o aptâmero e complexo da presente invenção podem ser usados como medicamentos, agentes diagnósticos, fármacos de teste, ou reagentes para doenças relacionadas à ativação destas trajetórias de transição de sinal. Exemplos das doenças relacionadas à ativação de trajetórias de transdução de sinal incluem as dores e cânceres acima mencionados.

[00091] Quando o aptâmero e complexo da presente invenção são usados como medicamentos, agentes diagnósticos, fármacos testes, reagentes e similares, o objeto de administração do aptâmero não é particularmente limitado e, por exemplo, primatas (por exemplo, ser humano, macaco), roedores (por exemplo, camundongo, rato, porquinho-da-índia), e animais de companhia, animais domésticos e animais de trabalho (por exemplo, cão, gato, cavalo, bovino, cabra, ovelha, suíno), podem ser mencionados.

[00092] O aptâmero e complexo da presente invenção são capazes de se ligar especificamente a um NGF. Portanto, o aptâmero e complexo da presente invenção são úteis como sondas para detecção de NGF. As sondas são úteis em imagem in vivo de NGF, medições de concentrações de sangue, marcação de tecido, ELISA e similares. As sondas são também úteis como agentes diagnósticos, fármacos de teste, reagentes e similares para doenças envolvidas por NGF (doenças acompanhadas por dor ou inflamação, e similares).

[00093] Baseado em sua ligação específica a um NGF, o aptâmero e complexo da presente invenção podem ser usados como ligantes para purificação de NGF.

[00094] Em adição, o aptâmero e complexo da presente invenção podem ser usados como fármacos de teste para exame da condição mental de fascínio e similares, ou medicamentos, reguladores, intensificadores ou mitigadores para o controle da condição mental.

[00095] O aptâmero e complexo da presente invenção podem ser usados como veículos de distribuição de fármaco.

[00096] O produto farmacêutico da presente invenção pode ser um formulado com um veículo farmaceuticamente aceitável. Como exemplos do veículo farmaceuticamente aceitável, excipientes tais como sacarose, amido, manitol, sorbitol, lactose, glicose, celulose, talco, fosfato de cálcio, e carbonoato de cálcio; ligantes tais como celulose, metilcelulose, hidroxilpropilcelulose, polipropilpirrolidona, gelatina, goma arábica, polietileno glicol, sacarose, e amido; desintegrantes tais como amido, carboximetilcelulose, hidroxilpropilamido, sódio-glicol-amido, hidrogenocarbonato de sódio, fosfato de cálcio, e citrato de cálcio; lubrificantes tais como estearato de magnésio, Aerosil, talco, e lauril sulfato de sódio; agentes flavorizantes tais como ácido cítrico, mentol, sal de glicirrizina-amônia, glicina, e pó de laranja; conservantes tais como benzoato de sódio, hidrogenossulfito de sódio, metilparabeno, e propilparabeno; estabilizadores tais como ácido cítrico, citrato de sódio, e ácido acético; agente de suspensão tais como metilcelulose, polivinilpirrolidona, e estearato de alumínio; agentes de dispersão tais como tensoativos; diluentes tais como água, solução salina fisiológica, e suco de laranja; ceras bases tais como manteiga de cacau, polietileno glicol, e querosene; e similares, podem ser mencionados, mas estes não são limitativos.

[00097] Preparações adequadas para administração oral são uma solução preparada por dissolução de uma quantidade efetiva de ligante em um diluente tal como água, solução salina fisiológica, ou suco de laranja; cápsulas, sachês ou comprimidos compreendendo uma quantidade efetiva de ligante na forma sólida ou granular; uma suspensão preparada por suspensão de uma quantidade efetiva de ingrediente ativo em um dispersante apropriado; uma emulsão preparada por dispersão e emulsificação de uma solução de uma quantidade efetiva de ingrediente ativo em um dispersante apropriado, e similares.

[00098] O produto farmacêutico da presente invenção pode ser revestido por um método conhecido per se para a proposta de mascaramento de sabor, dissolução entérica, liberação sustentada e similares. Como exemplos de agentes de revestimento usados para o revestimento, hidroxipropilmetilcelulose, etilcelulose, hidroximetilcelulose, hidroxipropilcelulose, polioxietileno glicol, Tween 80, Pluronic F68, ftalato acetato de celulose, ftalato de hidroxipropilmetilcelulose, succinato acetato de hidroximetilcelulose, Eudragit (manufaturado por Rohm, Germany, copolímero de ácido metacrílico/ acrílico), pigmentos (por exemplo, óxido férrico vermelho, dióxido de titânio e similares) e similares são usados. O produto farmacêutico pode ser uma preparação de liberação rápida ou preparação de liberação sustentada. Exemplos de bases de liberação sustentada incluem lipossomo, atelocolágeno, gelatina, hidroxiapatita, PLGA e similares.

[00099] Como preparações adequadas para administração parenteral (por exemplo, administração intravenosa, administração subcutânea, administração intramuscular, administração tópica, administração intraperitoneal, administração intranasal, administração pulmonar e similares), líquidos estéreis aquosos e não-aquosos isotônicos são disponíveis, que podem compreender um antioxidante, uma solução tampão, um agente bacteriostático, um agente de isotonização e similares. Suspensões estéreis aquosas e não-aquosas podem também ser mencionadas, que podem compreender um agente de suspensão, um solubilizador, um espessador, um estabilizador, um antisséptico e similares. A preparação pode ser incluída em um recipiente tal como uma ampola ou um frasco em um volume de dose unitária ou em várias doses divididas. Um ingrediente ativo e um veículo farmaceuticamente aceitável podem também ser secados por congelamento e armazenados em um estado que pode ser dissolvido ou suspenso em um veículo estéril apropriado imediatamente antes do uso. Preparações de liberação sustentada são também preparações adequadas. As preparações de liberação sustentada incluem liberação sustentada de veículos ou recipientes embutidos no corpo, tais como ossos artificiais, esponjas biodegradáveis ou não-degradáveis, sacos, bombas de fármacos, bombas de pressão osmótica, e similares. Dispositivos para distribuição contínua ou intermitente, sistêmica ou tópica do exterior do corpo são também incluídos no escopo das preparações de liberação sustentada. Bases biodegradáveis incluem lipossomo, lipossomo catiônico, ácido poli (láctico-co-glicólico) (PLGA), aterocolágeno, gelatina, hidroxiapatita, polissacarídeo sizofiran. Em adição a injeções líquidas e preparação de liberação sustentada, inalantes e unguentos são também aceitáveis. No caso de um inalante, um ingrediente ativo em um estado secado por congelamento é micronizado e administrado por inalação usando um dispositivo de inalação apropriado. Um inalante pode ser formulado conforme apropriado com um tensoativo convencionalmente usado, óleo, tempero, ciclodextrina ou derivado destes e similares conforme requerido.

[000100] Aqui, como exemplos do tensoativo, ácido oleico, lecitina, dioleato de dietileno glicol, oleato de tetra-hidroflufurila , oleato de etila, miristato de isopropila, trioleato de glicerila, monolaurato de glicerila, mono-oleato de glicerila, monoestearato de glicerila, monolisinoato de glicerila, álcool cetílico, álcool estearílico, polietilenoglicol 400, cloreto de cetilpiridínio, trioleato de sorbitano (nome comercial, Span 85), mono-oleato de sorbitano (nome comercial, Span 80), monolaurato de sorbitano (nome comercial, Span 20), polioxietileno óleo de rícino endurecido (nome comercial, HCO-60), polioxietileno (20) monolaurato de sorbitano (nome comercial, Tween 20), polioxietileno (20) mono- oleato de sorbitano (nome comercial, Tween 80), lecitina de origem de recurso natural (nome comercial, EPICLON), oleilpolioxietileno (2) éter (nome comercial, Brij 92), estearil polioxietileno (2) éter (nome comercial, Brij 72), lauril polioxietileno (4) éter (nome comercial, Brij 30), oleilpolioxietileno (2) éter (nome comercial, Genapol 0-020), copolímero de bloco de oxietileno e oxipropileno (nome comercial, Synperonic) e similares, podem ser mencionados. Como exemplo do óleo, óleo de milho, óleo de oliva, óleo de semente de algodão, óleo de girassol e similares podem ser mencionados. No caso de um unguento, uma base farmaceuticamente aceitável adequada (petrolatum amarelo, petrolatum branco, parafina, plastibase, silicone, unguento branco, cera de abelha, gordura, óleos vegetais, unguento hidrofílico, petrolatum hidrofílico, lanolina purificada, lanolina hidrolisada, unguento de absorção de água, plastibase hidrofílica, unguento macrogol e similares) é misturada com um ingrediente ativo, e usada como uma preparação.

[000101] Um inalante pode ser produzido de acordo com um método convencional. Especificamente, um inalante pode ser produzido por pulverização ou liquefação do aptâmero e complexo acima descritos da presente invenção, misturando-os em um propelente de inalação e/ou veículo, e enchendo-os em um vaso de inalação apropriado. Quando o aptâmero e complexo acima descritos da presente invenção são um pó, um inalador de pó mecânico ordinário pode ser usado; no caso de um líquido, um inalador tal como um nebulizador pode ser usado. Aqui, como o propelente, propelente convencionalmente conhecido pode ser amplamente usado; compostos da série clorofluorocarbono tais como clorofluorocarbono-11, clorofluorocarbono-12, clorofluorocarbono-21, clorofluorocarbono-22, clorofluorocarbono-113, clorofluorocarbono-114, clorofluorocarbono- 123, clorofluorocarbono-142c, clorofluorocarbono-134a, clorofluorocarbono-227, clorofluorocarbono-C318, e 1,1,1,2- tetrafluoroetano, hidrocarbonetos tais como propano, isobutano, e n- butano, éteres tais como dietil éter, gases comprimidos tais como gás nitrogênio e gás dióxido de carbono e similares podem ser mencionados.

[000102] A dosagem do produto farmacêutico da presente invenção varia dependendo do tipo e atividade de ingrediente ativo, seriedade da doença, espécie animal sendo o objeto de administração, tolerabilidade de fármaco do objeto de administração, peso corpóreo, idade e similares, e a dosagem usual, baseado na quantidade de ingrediente ativo por dia para um adulto, pode ser cerca de 0,0001 a cerca de 100 mg/kg, por exemplo, cerca de 0,0001 a cerca de 10 mg/kg, preferivelmente cerca de 0,005 a cerca de 1 mg/kg.

[000103] A presente invenção também proporciona um veículo de fase sólida tendo o aptâmero e o complexo da presente invenção imobilizados neste. Como exemplos do veículo de fase sólida, um substrato, uma resina, uma placa (por exemplo, placa de multicavidade), um filtro, um cartucho, uma coluna, e um material poroso podem ser mencionados. O substrato pode ser um usado em chips de DNA, chips de proteína e similares; por exemplo, substratos de níquel-PTFE (politetrafluoroetileno), substratos de vidro, substratos de apatita, substratos de silício, substratos de alumina, e similares, e substratos preparados por revestimento destes substratos com um polímero e similares podem ser mencionados. Como exemplos da resina, partículas de agarose, partículas de sílica, um copolímero de acrilamida e N,N'-metilenobisacrilamida, partículas de poliestireno- reticulado divinilbenzeno, partículas de dextrano reticulado com epicloro-hidrina, fibra de celulose, polímeros reticulados de arildextrano e N,N'-metilenobisacrilamida, polímeros sintéticos monodispersos, polímeros hidrofílicos monodispersos, Sepharose, Toyopearl e similares podem ser mencionados, e também resinas preparadas por ligação de vários grupos funcionais a estas resinas foram incluídas. O veículo de fase sólida da presente invenção pode ser útil em, por exemplo, purificação de, detecção e quantificação de NGF.

[000104] O aptâmero e o complexo da presente invenção podem ser imobilizados em um veículo de fase sólida por um método conhecido per se. Por exemplo, um método que introduz uma substância de afinidade (por exemplo, aquele descrito acima) ou um grupo funcional predeterminado no aptâmero ou no complexo da presente invenção, e então imobiliza o aptâmero e complexo em um veículo de fase sólida via a substância de afinidade ou grupo funcional predeterminado podem ser mencionados. A presente invenção também proporciona tais métodos. O grupo funcional predeterminado pode ser um grupo funcional que pode ser submetido a uma reação de acoplamento; por exemplo, um grupo amino, um grupo tiol, um grupo hidroxila, e um grupo carboxila, podem ser mencionados. A presente invenção também proporciona um aptâmero tendo tal grupo funcional introduzido neste.

[000105] A presente invenção também proporciona um método de purificação de e concentração de NGF. Em particular, a presente invenção torna possível separar NGF das proteínas de outra família de proteínas. O método de purificação e concentração da presente invenção pode compreender adsorção de NGF ao veículo de fase sólida da presente invenção, e eluição do NGF adsorvido com um eluente. Adsorção de NGF ao veículo de fase sólida da presente invenção pode ser alcançada por um método conhecido per se. Por exemplo, uma amostra contendo NGF (por exemplo, cultura bacterial ou de célula ou sobrenadante de cultura, sangue) é introduzida no veículo de fase sólida da presente invenção ou uma composição contendo a mesma. O NGF pode ser eluído usando-se um eluente tal como uma solução neutra. Não existe limitação no eluente neutro, que pode ter um pH de, por exemplo, cerca de 6 a cerca de 9, preferivelmente cerca de 6,5 a cerca de 8,5, e, mais preferivelmente, cerca de 7 a cerca de 8. A solução neutra pode também compreender, por exemplo, ureia, um agente quelante (por exemplo, EDTA), um sal de potássio (por exemplo, KCl), um sal de magnésio (por exemplo, MgCl2), um tensoativo (por exemplo, Tween 20, Triton, NP40), e glicerina. O método de purificação e concentração da presente invenção pode adicionalmente compreender lavagem do veículo de fase sólida usando uma solução de lavagem após adsorção de NGF. Exemplos da solução de lavagem incluem aquelas contendo ureia, um agente quelante (por exemplo, EDTA), Tris, um ácido, um álcali, RNA de Transferência, DNA, tensoativos tais como Tween 20, sais tais como NaCl e similares. O método de purificação e concentração da presente invenção pode ainda adicionalmente compreender aquecimento do veículo de fase sólida. Esta etapa capacita a regeneração e esterilização do veículo de fase sólida.

[000106] A presente invenção também proporciona um método de detecção e quantificação de NGF. Em particular, a presente invenção torna possível detectar e quantificar NGF separadamente das proteínas de outra família de proteínas. O método de detecção e quantificação da presente invenção pode compreender medição de NGF por utilização do aptâmero da presente invenção (por exemplo, pelo uso do complexo e veículo de fase sólida da presente invenção). O método de detecção e quantificação de NGF pode ser realizado na mesma maneira como um método imunológico, exceto que o aptâmero da presente invenção é usado no lugar de um anticorpo. Portanto, pelo uso do aptâmero da presente invenção como uma sonda no lugar de um anticorpo, mesma maneira como tais métodos como enzima imunoensaio (EIA) (por exemplo, ELISA competitivo direto, ELISA competitivo indireto, ELISA de intercalagem), radioimunoensaio (RIA), imunoensaio fluorescente (FIA), técnica de Western blot, método de marcação imuno-histoquímica, e método de classificação de célula, detecção e quantificação, podem ser realizados. O aptâmero da presente invenção pode também ser usado como uma sonda molecular para PET e similares. Estes métodos podem ser úteis em, por exemplo, medição de teores de NGF em organismos vivos ou amostras biológicas, e em diagnose de uma doença associada com NGF.

[000107] As revelações e todas as publicações aqui mencionadas, incluindo patentes e relatórios de pedido de patente, são incorporados por referência aqui na presente invenção para a extensão que todos deles foram dados expressamente.

Exemplos

[000108] A presente invenção é daqui por diante descrita em mais detalhes por meio dos seguintes Exemplos, que, contudo, nunca limitam o escopo da invenção. Exemplo 1: Preparação de aptâmeros de RNA que se ligam especificamente ao NGF 1

[000109] Aptâmeros de RNA que se ligam especificamente ao NGF foram preparados usando-se o método SELEX. O SELEX foi realizado por referência ao método de Ellington et al. (Ellington and Szostak, Nature 346, 818-822, 1990) e ao método de Tuerk et al. (Tuerk and Gold, Science 249, 505-510, 1990). NGF humano (manufaturado por R&D Systems) foi usado como uma substância-alvo.

[000110] O RNA usado na primeira etapa (40N-RNA) foi obtido por transcrição de um DNA quimicamente sintetizado usando o Kit DuraScribeTM T7 Transcription (manufaturado por Epicentre). O RNA obtido por este método tem a posição 2' da ribose do nucleotídeo de pirimidina fluoro-substituído. Os DNAs de 79 nucleotídeos longos mostrados abaixo, tendo uma sequência de iniciador em cada extremidade de uma sequência aleatória de 40 nucleotídeos, foram usados como molde de DNA. O molde de DNA e os iniciadores foram preparados por síntese química.

[000111] Molde de DNA: 5'-ccagttgttggtgacaatgc-40N- gcagctccacaggc ttccc-3' (SEQ ID NO: 114) iniciador direto: 5'-taatacgactcactatagggaagcctgtggagctgc-3' (SEQ ID NO: 115) iniciador Reverso: 5'-ccagttgttggtgacaatgc-3' (SEQ ID NO: 116) N representa qualquer um de A, G, C e T. O iniciador direto compreende uma sequência promotora de T7 RNA polimerase. A variação da reunião de RNA usada na primeira etapa foi teoricamente 1014.

[000112] Após 10 etapas de SELEX, as sequências foram sequenciadas; convergência de sequência foi vista. Em 48 clones, 6 sequências mostradas por SEQ ID NO: 1, e 5 sequências mostradas por SEQ ID NO: 2 estavam presentes. Três sequências mostradas por SEQ ID NOs: 3 - 5, e duas sequências mostradas por SEQ ID NOs: 6 - 8 estavam presentes. Somente uma sequência foi mostrada por SEQ ID NOs: 9 - 23. Muitas sequências continham uma Sequência consenso de UGAAAAAAACC (SEQ ID NO: 91). As estruturas secundárias destas sequências foram prognosticadas usando o programa MFOLD (M. Zuker, Ácido nucleicos Res. 31(13), 3406-3415, 2003) e estruturas de volume tendo porções de Sequência consenso foram prognosticadas. Estruturas secundárias putativas dos aptâmeros das sequências mostradas por SEQ ID NOs: 1-9 e 12 são dadas nas figuras 1-10, no qual as sequências de consenso são encerradas em um círculo.

[000113] As sequências de nucleotídeos atualmente obtidas, que correspondem a cada SEQ ID NO são mostradas abaixo. O parêntese em cada nucleotídeo mostra modificações na posição 2' e F é átomo de flúor (daqui por diante o mesmo).

[000114] SEQ ID NO: 1: gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaa aac (F)c(F)c(F)aaaaac(F)aaagac(F)aau(F)gau(F)u(F)gagu(F)agc(F)au(F)u( F)gu (F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg

[000115] SEQ ID NO: 2: gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)c(F)u(F)ac(F)ac( F)u (F)u(F)u(F)agu(F)au(F)gac(F)aaac(F)c(F)u(F)agagu(F)gu(F)aaau(F)gc( F)u(F)u(F)c(F)gc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg

[000116] SEQ ID NO: 3: gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaa aac (F)c(F)c(F)aaaau(F)aagu(F)agaaau(F)gac(F)agaau(F)ggc(F)au(F)u(F)g u(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg

[000117] SEQ ID NO: 4: gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaa aac (F)c(F)c(F)aaau(F)au(F)gac(F)aaau(F)aaaac(F)ggc(F)aac(F)gc(F)au(F) u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg

[000118] SEQ ID NO: 5: gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)u(F)u(F)aaac(F) aagc(F)aa gu(F)gaaaaaaac(F)c(F)ac(F)agc(F)aaau(F)gu(F)aaaaagc(F)au (F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg

[000119] SEQ ID NO: 6: gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaa aac (F)c(F)c(F)aaaau(F)u(F)aaau(F)aaaaaau(F)agac(F)ggu(F)gc(F)au(F)u( F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg

[000120] SEQ ID NO: 7: gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaa aac (F)c(F)c(F)aaaau(F)u(F)agau(F)aaaaaau(F)agac(F)ggu(F)gc(F)au(F)u( F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg

[000121] SEQ ID NO: 8: gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)ggau(F)aaaaau( F) agagu(F)u(F)u(F)gau(F)aaac(F)ac(F)c(F)u(F)gu(F)au(F)u(F)aaaac(F)c( F)gc(F) au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg

[000122] SEQ ID NO: 9: gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)u(F)c(F)c(F)ac(F ) aaggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaau(F)aau(F)au(F)au(F)u(F)u(F)aau( F) c(F)agc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg

[000123] SEQ ID NO: 10: gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaa aac (F)c(F)c(F)aaau(F)u(F)aaagagc(F)u(F)u(F)gac(F)aaaac(F)au(F)gc(F)a u(F)u (F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg

[000124] SEQ ID NO: 11: gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)u(F)c(F)c(F)ac(F )aag gau(F)gaaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaau(F)aau(F)au(F)au(F)u(F)u(F)aau(F)c (F)agc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg

[000125] SEQ ID NO: 12: gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)gaaac(F)agu(F) gaa ac(F)aaac(F)c(F)ac(F)agac(F)u(F)gagaaagc(F)agu(F)aac(F)agc(F)au(F )u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg

[000126] SEQ ID NO: 13: gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaa aac (F)c(F)c(F)aaaau(F)u(F)aaau(F)aaaaaaaaau(F)ggac(F)ggu(F)gc(F)au( F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg

[000127] SEQ ID NO: 14: gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)u(F)gaau(F)u(F) ggau (F)ac(F)agau(F)agu(F)u(F)gaaaaaaac(F)c(F)aau(F)gau(F)c(F)agc(F)au (F)u (F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg

[000128] SEQ ID NO: 15: gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)u(F)c(F)c(F)ac(F )aag gau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaau(F)aau(F)au(F)au(F)u(F)u(F)gau(F)c( F)agc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg

[000129] SEQ ID NO: 16: gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)u(F)c(F)c(F)ac(F )aag gau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)c(F)aaau(F)aau(F)gu(F)au(F)u(F)u(F)aau( F)c(F)agc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg

[000130] SEQ ID NO: 17: gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)ggaaaa aac (F)c(F)c(F)aaaau(F)aagu(F)agaaau(F)gac(F)agaau(F)ggc(F)au(F)u(F)g u(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg

[000131] SEQ ID NO: 18: gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)c(F)gaaau(F)gg ac (F)u(F)gu(F)aaagc(F)au(F)gaaaaaaac(F)c(F)au(F)u(F)c(F)aau(F)c(F)g aggc (F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg

[000132] SEQ ID NO: 19: gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaa aac (F)c(F)c(F)aaac(F)u(F)aaagu(F)u(F)u(F)aaaac(F)u(F)gau(F)ac(F)gagc( F)au (F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg

[000133] SEQ ID NO: 20: gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaa aac (F)c(F)c(F)aaau(F)u(F)aaaaac(F)u(F)u(F)gc(F)c(F)gagc(F)au(F)u(F)gu( F)c (F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg

[000134] SEQ ID NO: 21: gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaa aaac (F)c(F)c(F)aaaaac(F)aaagac(F)aac(F)gau(F)u(F)gagu(F)agc(F)au(F)u( F)gu (F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg

[000135] SEQ ID NO: 22: gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaa aac (F)c(F)c(F)aaaau(F)u(F)gu(F)c(F)c(F)ac(F)agaaaau(F)ggau(F)u(F)gc(F )au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg

[000136] SEQ ID NO: 23: gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)gaaac(F)agu(F) gaa ac(F)aaac(F)c(F)ac(F)agac(F)u(F)gagaaagc(F)agu(F)aaaagc(F)au(F)u( F)gu (F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg

[000137] As atividades de ligação para NGF dos ácidos nucleicos mostradas por SEQ ID NOs:1-9 e 12 foram avaliadas pelo método de ressonância de plasmon de superfície. As medições foram tomadas usando-se BIAcore 2000 (manufaturado por BIAcore). O chip SA foi usado como o chip de sensor, que tinha estreptavidina imobilizado neste. Ligado a este estava cerca de 1500 RU de um 16-nucleotídeo Poli dT com biotina ligado à 5' extremidade deste. O ácido nucleico de ligante tinha um 16-nucleotídeo Poli A adicionado à 3' extremidade deste, e foi imobilizado no chip SA via uma ligação entre T e A. A quantidade imobilizada foi cerca de 1000 RU. 20 μL de NGF para analito, preparada a 0,5 μM, foi injetada, com a adição de uma concentração final de 0,3 M NaCl para diminuir adsorção não- específica. A solução A foi usada como um tampão de operação. Aqui, a solução A é uma solução misturada de 145 mM de cloreto de sódio, 5,4 mM de cloreto de potássio, 1,8 mM de cloreto de cálcio, 0,8 mM de cloreto de magnésio, 20 mM de Tris (pH 7,6), e 0,05% de Tween 20. Como um resultado da medição, foi verificado que todos os ácidos nucleicos mostrados por SEQ ID NOs:1-9 e 12 ligam um NGF significantemente maior do que o controle 40N. Aqui, 40N se refere à reunião de ácido nucleico usada para a primeira etapa, compreendendo uma sequência aleatória de 40-nucleotídeos. Como um exemplo, um sensorgrama mostrando um estado da ligação do aptâmero mostrado por SEQ ID NO:6 e NGF é mostrada na figura 11. A partir do acima, foi mostrado que estes ácidos nucleicos são aptâmeros que se ligam ao NGF. Exemplo 2: Preparação de aptâmeros de RNA que se ligam especificamente ao NGF 2

[000138] SELEX foi realizado na mesma maneira como no exemplo 1, exceto que um molde tendo uma sequência aleatória de 30 nucleotídeos e sequências iniciadores diferentes daquelas usadas no exemplo 1 foi usado. O molde e as sequências iniciadores usados são mostrados abaixo. Como o molde, uma sequência aleatória de 30 nucleotídeos foi usada. O molde de DNA e iniciadores foram produzidos por síntese química.

[000139] Molde de DNA: 5'-tgaggatccatgtatgcgcacata-30N- cttctggtcgaa gttctccc-3' (SEQ ID NO: 117) Iniciador direto: 5'-cggaattctaatacgactcactatagggagaacttc gaccagaag-3' (SEQ ID NO: 118) iniciador Reverso: 5'-tgaggatccatgtatgcgcacata-3' (SEQ ID NO: 119)

[000140] Após 13 etapas de SELEX, as sequências foram sequenciadas. Embora a convergência de sequência não fosse vista ainda, muitas sequências contidas em uma Sequência consenso de UGAAAAAAACC (SEQ ID NO: 91). Em adição, algumas sequências continham mutação na Sequência consenso de UGAAAAAAACC (SEQ ID NO: 91) tais como UGAAAGAAA CC (SEQ ID NO: 92), UGAAAAGAACC (SEQ ID NO: 95), UGAAAGGAACC (SEQ ID NO: 105), e similares.

[000141] Enquanto a sequência primária é um tanto diferente, AGAAUG AAACU (SEQ ID NO: 102) estava presente como uma sequência esperada para ter uma estrutura volume similar pelo programa MFOLD.

[000142] Um subconjunto destas sequências é mostrado por SEQ ID NOs: 37 - 42.

[000143] Após 16 etapas de SELEX, as sequências foram sequenciadas novamente. A convergência de outras sequências não foi vista, mas duas sequências mostradas por SEQ ID NOs: 43 e 51 estavam presentes. Muitas destas sequências continham, similares às sequências após 13 etapas, a Sequência consenso de UGAAAAAAACC (SEQ ID NO: 91). Em adição, algumas sequências continham mutação na Sequência consenso de UG AAAAAAACC (SEQ ID NO: 91) tais como UGAAAGAAACC (SEQ ID NO: 92), UGAAACAAACC (SEQ ID NO: 94), UGAAAAGAACC (SEQ ID NO: 95), UGAAAGGAACC (SEQ ID NO: 105), UGAAAAAACCU (SEQ ID NO: 97), e similares.

[000144] Um subconjunto destas sequências é mostrado por SEQ ID NOs: 43 - 53.

[000145] Após 19 etapas de SELEX, as sequências foram sequenciadas novamente. Embora 3 sequências mostradas por SEQ ID NO: 56 e 2 sequências mostradas por cada de SEQ ID NOs: 54, 57 e 67 estivessem presentes, a convergência de outras sequências não foi ainda vista. Muitas destas sequências continham uma Sequência consenso tais como UGAAAAA AACC (SEQ ID NO: 91), UGAAAGAAACC (SEQ ID NO: 92) e UGAAAAGAA CC (SEQ ID NO: 95).

[000146] Um subconjunto destas sequências é mostrado por SEQ ID NOs: 54 - 59.

[000147] Após 22 etapas de SELEX, as sequências foram sequenciadas novamente. 6 sequências mostradas por SEQ ID NO: 67 e 3 sequências mostradas por SEQ ID NO: 68 estavam presentes. Estas sequências continham sequências de CGAACAAAACU (SEQ ID NO: 103) e CGAAAGAAAC U (SEQ ID NO: 104) similares à Sequência consenso mostrada por SEQ ID NO: 91. Convergências de outras sequências não foram vistas, mas muitas sequências continham as sequências de consenso de UGAAAAAAACC (SEQ ID NO: 91) e UGAAAGAAACC (SEQ ID NO: 92).

[000148] Um subconjunto destas sequências é mostrado por SEQ ID NOs: 60 - 68.

[000149] As sequências de nucleotídeos atualmente obtidas que correspondem a SEQ ID NOs acima mencionadas são mostradas abaixo. O parêntese nos nucleotídeos mostra a modificação na posição 2' e F é um átomo de flúor.

[000150] SEQ ID NO: 37: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaa gaa ac(F)c(F)c(F)aaaggu(F)gaaac(F)aac(F)aau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au( F)AC (F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a

[000151] SEQ ID NO: 38: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagagaau(F)gaaac(F) u(F) c(F)c(F)ac(F)aaagu(F)ac(F)au(F)aaaac(F)au(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au (F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a

[000152] SEQ ID NO: 39: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)gu(F)gaaaaga ac (F)c(F)c(F)aaau(F)aaaac(F)aac(F)aau(F)gu(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au( F)ac (F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a

[000153] SEQ ID NO: 40: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaa aaa ac(F)c(F)c(F)aggaaaau(F)ggaagac(F)gu(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)a c(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a

[000154] SEQ ID NO: 41: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaa gga ac(F)c(F)c(F)aaagc(F)gaaac(F)aaaac(F)gu(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au( F)ac (F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a

[000155] SEQ ID NO: 42: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaa aaa ac(F)c(F)c(F)aaaagagc(F)agc(F)agagau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)a c(F) au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a

[000156] SEQ ID NO: 43: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagc(F)u(F)u(F)gaaa aaac (F)c(F)c(F)c(F)aau(F)au(F)gagaau(F)c(F)au(F)au(F)au(F)gu(F)gc(F)gc( F)au (F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a

[000157] SEQ ID NO: 44: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaa gaa ac(F)c(F)c(F)aaaau(F)u(F)agc(F)ac(F)c(F)au(F)aau(F)au(F)gu(F)gc(F) gc(F) au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a

[000158] SEQ ID NO: 45: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagagaau(F)gaaac(F) u(F) c(F)c(F)c(F)aaau(F)c(F)aaggac(F)aau(F)gau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au (F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a

[000159] SEQ ID NO: 46: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaa c(F) aaac(F)c(F)c(F)aaagu(F)u(F)ac(F)gc(F)ac(F)aaaau(F)au(F)gu(F)gc(F)g c (F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a

[000160] SEQ ID NO: 47: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagaagu(F)u(F)u(F)g aaaa gaac(F)c(F)c(F)aaaau(F)gagc(F)aaaau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac (F) au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a

[000161] SEQ ID NO: 48: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaa aga ac(F)c(F)c(F)gaaaaac(F)gc(F)au(F)aau(F)aau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)a u(F) ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a

[000162] SEQ ID NO: 49: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)gaaagaaac(F) u (F)c(F)c(F)c(F)aagac(F)ggu(F)aac(F)gaaagu(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au (F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a

[000163] SEQ ID NO: 50: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)gaaaaaac(F)c (F)u (F)c(F)c(F)c(F)aau(F)ac(F)aaac(F)ac(F)aaaaau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F )au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a

[000164] SEQ ID NO: 51: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaa gaa ac(F)c(F)c(F)aaaaaaac(F)aac(F)au(F)au(F)gaac(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F) gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a

[000165] SEQ ID NO: 52: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaa gaa ac(F)c(F)c(F)aaau(F)au(F)ac(F)aaaac(F)ac(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F )au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a

[000166] SEQ ID NO: 53: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaa gga ac(F)c(F)c(F)aaaaac(F)ac(F)aaaau(F)gu(F)c(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc( F)au (F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a

[000167] SEQ ID NO: 54: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)c(F)gaaagu(F )gaa agaaac(F)u(F)c(F)c(F)aac(F)gaaagc(F)au(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F) ac(F) au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a

[000168] SEQ ID NO: 55: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaa gaa ac(F)c(F)c(F)aaaaau(F)gaau(F)gc(F)aac(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au (F)ac(F)au(F)ggac(F)c(F)u(F)c(F)a

[000169] SEQ ID NO: 56: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)gaaagaaac(F) u(F) c(F)c(F)c(F)aac(F)ac(F)aaau(F)gc(F)ac(F)aac(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc (F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a

[000170] SEQ ID NO: 57: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaa aaa ac(F)c(F)c(F)aaac(F)ac(F)c(F)gaagc(F)ac(F)aaau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc (F)au (F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a

[000171] SEQ ID NO: 58: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaa aga ac(F)c(F)c(F)aaau(F)ac(F)agaau(F)aaau(F)gu(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F) au(F) ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a

[000172] SEQ ID NO: 59: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)c(F)gaaac(F) gu (F)u(F)u(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaggaggau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au (F)ac (F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a

[000173] SEQ ID NO: 60: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagau(F)u(F)u(F)gaa aaaa ac(F)c(F)c(F)gaau(F)aaagau(F)aac(F)agu(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F )ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a

[000174] SEQ ID NO: 61: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaaggu(F)c(F)gu(F)aa c(F) gaau(F)aaaac(F)u(F)c(F)c(F)u(F)gc(F)ac(F)aaaaau(F)au(F)gu(F)gc(F) gc(F) au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a

[000175] SEQ ID NO: 62: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaa gaa ac(F)c(F)c(F)aaau(F)u(F)aaagu(F)gaac(F)agu(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F) au(F) ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a

[000176] SEQ ID NO: 63: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagau(F)u(F)u(F)gaa agaa ac(F)c(F)c(F)aaac(F)u(F)aagc(F)ac(F)aaaau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au (F)ac (F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a

[000177] SEQ ID NO: 64: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaa gaa ac(F)c(F)c(F)aaaac(F)au(F)u(F)agc(F)ac(F)ac(F)au(F)au(F)gu(F)gc(F) gc(F) au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a

[000178] SEQ ID NO: 65: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)gu(F)gaaaaaa ac (F)c(F)c(F)aaau(F)c(F)gagc(F)ac(F)aaaau(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F) au(F) ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a

[000179] SEQ ID NO: 66: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaa aaa ac(F)c(F)c(F)aaagc(F)aagc(F)ac(F)aac(F)au(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc( F)au (F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a

[000180] SEQ ID NO: 67: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)c(F)gau(F)aa c(F) gaac(F)aaaac(F)u(F)c(F)c(F)c(F)aaaggaau(F)au(F)au(F)gu(F)gc(F)gc( F)au (F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a

[000181] SEQ ID NO: 68: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)c(F)gagagc(F )ga aagaaac(F)u(F)c(F)c(F)c(F)aaaac(F)ac(F)agu(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)a u(F) ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a

[000182] As atividades de ligação para NGF dos ácidos nucleicos mostradas por SEQ ID NOs: 37 - 68 foram avaliadas pelo método de ressonância de plasmon de superfície. Um método similar àquele mostrado no exemplo 1 foi usado para o experimento. Como um resultado, todas as sequências foram verificadas se ligarem mais significantemente ao NGF do que 30N do controle. Exemplo 3: Preparação de aptâmero de mosaico de RNA-DNA que se liga especificamente ao NGF

[000183] Aptâmero de mosaico no qual RNA é nucleotídeo de purina e DNA é nucleotídeo de pirimidina foi produzido de acordo com o método SELEX. O molde usado continha uma sequência aleatória de 40 nucleotídeos e os iniciadores usados foram diferentes daqueles usados nos exemplos 1 e 2. A reunião de ácido nucleico de mosaico de RNA-DNA na primeira etapa foi obtida por transcrição de DNA quimicamente sintetizado como um molde, e rATP, rGTP, dCTP e dTTP como substratos. Aqui, rNTP é ribonucleotídeo, e dNTP é deoxiribonucleotídeo. Outros métodos de experimento são quase os mesmos conforme aqueles mostrados no exemplo 1. O molde e sequências iniciador usados são mostrados abaixo.

[000184] DNA-RNA molde: 5'-tcctaatgtctcttctcttcac-40N- gccctattcttgcctc tccc-3' (SEQ ID NO: 120) iniciador direto: 5'-taatacgactcactatagggagaggcaagaatagg gc-3' (SEQ ID NO: 121) iniciador Reverso: 5'-tcctaatgtctcttctcttcac-3' (SEQ ID NO: 122)

[000185] Após 7 etapas de SELEX, as sequências foram sequenciadas. A convergência de sequência não foi vista, mas muitas sequências continham a Sequência consenso de TGAAAAAAACC (SEQ ID NO: 91). Após 10 etapas de SELEX, as sequências foram sequenciadas novamente. Seis sequências mostradas por SEQ ID NO: 72, 5 sequências mostradas por cada de SEQ ID NOs: 70 e 71, e 2 sequências mostradas por SEQ ID NOs: 69 e 73 estavam presentes. Em adição, 22 sequências foram encontradas somente uma vez (incluindo uma sequência mostrada por SEQ ID NO: 74), muitas das quais continham a Sequência consenso de TGAAAAAAACC (SEQ ID NO: 91).

[000186] As sequências de nucleotídeos atualmente obtidas, que correspondem a SEQ ID NOs: 69 - 74, são mostradas abaixo. T e C em letras capitais mostram deoxiribonucleotídeos, e a e g nas letras de caso inferior mostram ribonucleotídeos.

[000187] SEQ ID NO: 69: gggagaggCaagaaTagggCCCagCTgaaaaaaaCCTggaCgTa CaCCgTTCgCCgagCgggTgaagagaagagaCaTTagga

[000188] SEQ ID NO: 70: gggagaggCaagaaTagggCTggaaaTagaaCCgCgCTgTCTTC aTTaagCCgCCCaaCggTgaagagaagagaCaTTagga

[000189] SEQ ID NO: 71: gggagaggCaagaaTagggCaCTTgaaaaaaaCCCaaaTTTaCCg TCTTCagCgTCgggTgTgaagagaagagaCaTTagga

[000190] SEQ ID NO: 72: gggagaggCaagaaTagggCTggaTgggCagTaaCCTgaaaaaaa CCaCCCaCCTCTaCCgTgaagagaagagaCaTTagga

[000191] SEQ ID NO: 73: gggagaggCaagaaTagggCaCTTgaaaaaaaCCCaaagaaagaa TaCTTaCCCggCgCgTgaagagaagagaCaTTagga

[000192] SEQ ID NO: 74: gggagaggCaagaaTagggCaTagTgTagaCCCCTCTCaagaTa CCCCaTgaaTTgCCCCgTgaagagaagagaCaTTagga As atividades de ligação para NGF dos ácido nucleicos mostradas por SEQ ID NOs: 69 - 74 foram avaliadas pelo método de ressonância de plasmon de superfície. Um método similar àquele mostrado no Exemplo 1 foi usado para o experimento. Como um resultado, todos deles foram verificados se ligarem mais significantemente ao NGF do que 40N do controle. Exemplo 4: Preparação de aptâmeros de NGF tendo atividade mais alta

[000193] SELEX foi realizado usando-se uma reunião de RNA contendo uma sequência mostrada por SEQ ID NO: 36 dopada com 30% de sequência aleatória e adicionado com novas sequências de iniciador às ambas extremidades desta. SELEX foi realizado quase na mesma maneira como no exemplo 1. As sequências do molde e iniciadores são mostrados abaixo.

[000194] molde: 5'- GAGGATCCATGTATGCGCACATAgggtttttttcatcctgcagctccaca ggcttcccCTTCTGGTCGAAGTTCT-3' a: a (70%), g (10%), c (10%), t (10%) g: g (70%), a (10%), c (10%), t (10%) c: c (70%), a (10%), g (10%), t (10%) t: t (70%), a (10%), c (10%), g (10%) (SEQ ID NO: 123) iniciador direto: 5'- CGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAACTTCGA CCAGAAG-3' (SEQ ID NO: 124) iniciador Reverso: 5'-GAGGATCCATGTATGCGCACATA-3' (SEQ ID NO: 125)

[000195] Após 10 etapas, as sequências de 48 clones foram sequenciadas. A convergência de sequência não foi vista, mas muitas sequências continham a Sequência consenso de UGAAAAAAACC (SEQ ID NO: 91).

[000196] Em adição, UGAAAGAAACC (SEQ ID NO: 92), UGAAAGAAACU (SEQ ID NO: 93), UGAAAACAACC (SEQ ID NO: 98), UGAAAUAAACC (SEQ ID NO: 99), UGAAAUAAACU (SEQ ID NO: 100), UGAAAAAAUCU (SEQ ID NO: 101) e similares, que continham mutação na Sequência consenso de UGAAAAAAACC (SEQ ID NO: 91), estavam também presentes.

[000197] A partir daqui foram selecionadas 12 sequências em aleatório, e as atividades de ligação para NGF foi medida pelo método de ressonância de plasmon de superfície. O método de medição é conforme mostrado no exemplo 1. Como um resultado da medição, todas destas 12 sequências foram verificadas se ligarem mais significantemente ao NGF do que o primeiro molde dopado com 30% de sequência aleatória. As sequências de nucleotídeos atualmente obtidas, que correspondem a cada SEQ ID NO, são mostradas abaixo.

[000198] SEQ ID NO: 75: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)gaaagaau(F)c (F)u (F)c(F)c(F)aaagac(F)aagau(F)aaaaac(F)aac(F)c(F)gu(F)au(F)gu(F)gc( F)gc (F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)

[000199] SEQ ID NO: 76: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaaggau(F)aaac(F)gc( F)au (F)gu(F)au(F)u(F)u(F)gc(F)agu(F)au(F)u(F)aaaaau(F)gc(F)c(F)u(F)u(F) au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)

[000200] SEQ ID NO: 77: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)gaaaaaau(F)c (F)u (F)c(F)c(F)agu(F)u(F)gc(F)aagac(F)gaaac(F)aaac(F)c(F)u(F)u(F)au(F) gu(F) gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)

[000201] SEQ ID NO: 78: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)gu(F)gu(F)au( F)u (F)gu(F)u(F)c(F)agggu(F)gu(F)gc(F)c(F)c(F)agc(F)c(F)u(F)au(F)aac(F) c(F) au(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)

[000202] SEQ ID NO: 79: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaaggau(F)agc(F)c(F) au(F) gu(F)ggaggu(F)gaagac(F)u(F)gaaau(F)aaac(F)c(F)au(F)au(F)gu(F)gc( F)gc (F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)

[000203] SEQ ID NO: 80: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)gaaaac(F)aac (F)c (F)u(F)c(F)c(F)c(F)aau(F)aau(F)gau(F)c(F)ac(F)agaaau(F)c(F)c(F)u(F) au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)

[000204] SEQ ID NO: 81: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaaggagau(F)gac(F)u( F)gu (F)gu(F)aac(F)c(F)ac(F)agu(F)au(F)gaaau(F)aaac(F)u(F)c(F)u(F)au(F) gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)

[000205] SEQ ID NO: 82: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagaggau(F)gc(F)u(F )u(F) gu(F)u(F)u(F)ggu(F)u(F)ac(F)aagc(F)u(F)gaaagaaac(F)c(F)u(F)u(F)au( F)gu (F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)

[000206] SEQ ID NO: 83: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)gaagc(F) u(F)u (F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aggau(F)u(F)aaac(F)agac(F)agu(F)au(F)gu(F) gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)

[000207] SEQ ID NO: 84: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)gaaagaaac(F) u(F) c(F)c(F)c(F)gau(F)gaaagau(F)gu(F)aac(F)aaac(F)c(F)au(F)au(F)gu(F) gc(F) gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)

[000208] SEQ ID NO: 85: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagc(F)ggaagc(F)c(F) u(F) gc(F)gu(F)aac(F)c(F)gc(F)aggau(F)gaaaac(F)aac(F)c(F)gu(F)au(F)gu( F)gc (F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)

[000209] SEQ ID NO: 86: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaaggagu(F)agc(F)c(F )agu (F)gaac(F)c(F)u(F)ggaau(F)au(F)gaaaaaaac(F)c(F)u(F)u(F)au(F)gu(F) gc(F) gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F) Exemplo 5: Preparação de aptâmeros de DNA que segam especificamente ao NGF

[000210] Aptâmeros de DNA que se ligam especificamente ao NGF foram preparados usando-se o método SELEX. O método SELEX usado foi um método aperfeiçoado do método de Fitzwater, Polisky et al. (Fitzwater and Polisky, Methods Enzymol. 267, 275-301, 1996). Como uma substância alvo, NGF humano usado no exemplo 1 foi usado. A reunião para a primeira etapa foi DNA com comprimento 71 (40N-DNA) obtido por adição de sequências de iniciador para ambas as extremidades de 40 sequência aleatória de nucleotídeo. Para obter- se DNA de trançado simples, biotina (bio) foi adicionado ao 5' terminal de iniciador Reverso.

[000211] molde: 5'-GGGATCGACAGGGCT-40N- CCGAGTCGTGCCAT CT-3' (SEQ ID NO: 126) iniciador direto: 5'-GGGATCGACAGGGCT-3' (SEQ ID NO: 127) iniciador Reverso: bio-AGATGGCACGACTCGG-3' (SEQ ID NO: 128)

[000212] Após o término de 7 etapas, as sequências de 46 clones foram sequenciadas na mesma maneira como no exemplo 1. Como um resultado, 20 sequências mostradas por SEQ ID NO: 87 estavam presentes. As sequências destas são mostradas abaixo.

[000213] SEQ ID NO: 87: GGGATCGACAGGGCTGCAGCACTGGCGTAGGTTGGAA TATGGGTATTTTTGTGGTCCGAGTCGTGCCATCT Exemplo 6: Aptâmeros que inibem a ligação de NGF e receptor de NGF

[000214] Se os aptâmeros mostrados por SEQ ID NOs:1-9, 12 37-55 e 57-87 inibem a ligação de NGF e receptor de NGF (TrkA e P75) foram determinados usando-se o método de ressonância de plasmon de superfície. Como direcionado no protocolo de BIAcore Company, Proteína A (21181, PIERCE) foi imobilizada em um chip sensor CM5. Cerca de 1100 RU de Trk A-Fc humano fundido com a porção Fc de IgG (175-TK, R&D systems) foi imobilizado neste. Como o analito, uma mistura de NGF (0,1 μM) e cada aptâmero (0,33 μM) foi injetado após ser permitido suportar por 30 minutos. Se o aptâmero inibe a ligação de NGF e TrkA, o sinal no sensor grama é esperado não ocorrer; se o aptâmero não inibe a ligação, um complexo triplo será formado e o sinal é esperado ocorrer. Quando NGF se liga mais forte a um receptor do que um aptâmero, o aptâmero pode ser removido e NGF pode se ligar ao receptor. Antes do início do experimento de inibição, a ligação de TrkA e NGF foi confirmada. Usando-se a quantidade de ligação de NGF e receptor de NGF sem um aptâmero como 100, a quantidade de ligação de NGF e receptor de NGF adicionados com um aptâmero foi determinada como um valor de correção. Aqui, a quantidade de ligação é o valor de RU no topo de pico do sensor grama de BIAcore (valor de RU imediatamente após o término de injeção de NGF). O valor de correção foi subtraído de 100 para dar uma atividade inibitória%, onde não menos do que 60% mostra a presença de atividade inibitória. Como um resultado do experimento, todos os aptâmeros mostrados por SEQ ID NOs: 1 - 9, 12, 37 - 55, 57 - 87 foram verificados inibirem a ligação de NGF e TrkA (Tabela 1). Como um exemplo, a inibição de ligação de NGF e TrkA pelo aptâmero mostrado por SEQ ID NO: 6 é mostrada na Figura 12. Um experimento similar foi realizado para outro receptor P75 (p75-Fc; R&D systems). Como um resultado, todos os aptâmeros mostrados por SEQ ID NOs: 1 - 9, 12, 37 - 55, 57 - 87 foram verificados inibirem a ligação de NGF e P75 por não menos do que 60% (Tabela 1). Como um exemplo, a inibição de ligação de NGF e P75 pelo aptâmero mostrado por SEQ ID NO: 6 é mostrada na Figura 13. Tabela 1

[000215] A tabela 1 mostra aptâmeros que inibem ligação de TrkA ou p75 e NGF. "+" mostra uma atividade inibitória (%) de não menos do que 60%, e "-" mostra aquela de menos do que 60%.

[000216] Como para o aptâmero mostrado por SEQ ID NO: 87, um experimento inibitório similar ao acima mencionado foi realizado sob condições de proporção molar de NGF-aptâmero de 1:1 (0,1 μM). A mesma solução misturada preparada de NGF e aptâmero foi usada para os experimentos de TrkA e P75, e o experimento foi realizado sob nenhuma influência de variação na preparação da amostra. Como um resultado, o aptâmero mostrado por SEQ ID NO: 87 inibiu a ligação de NGF e TrkA por 93%, mas inibiu a ligação de NGF e p75 somente por 29%. Exemplo 7: Avaliação de atividade fisiológica de aptâmero pelo uso de células PC-12

[000217] A atividade fisiológica de aptâmero foi avaliada por um experimento supressivo de crescimento de neurite usando-se células PC-12. Célula PC-12, que é uma linha de célula derivada de feocromocitoma de glândula adrenal de rato, é uma célula modelo do sistema nervoso, alonga neurite por estimulação de NGF, e se diferencia similar a células nervosas. Se ou não um aptâmero inibe o crescimento de neurite foi avaliado. Células PC-12 foram semeadas em uma placa de fundo plano de 96 cavidades revestida com colágeno, e uma solução misturada de NGF (concentração final 25 ng/mL ou 1,9 nM) pré-reagida por 1 hora a 37°C e um aptâmero (concentração final 500 nM) foi adicionado para iniciar a cultura da célula. Em seguida, a mesma quantidade do aptâmero foi adicionada duas vezes toda 24 horas e o nível de crescimento de neurite foi observado e avaliado no dia 3 com um microscópio. Para avaliação, contagens 0 - 3 foram usadas, onde contagem 0 não é crescimento de neurite, contagem 1 é leve crescimento de neurite, contagem 2 é crescimento de neurite para a célula mais próxima, e contagem 3 é marcadamente crescimento de neurite reticulado. O sistema no qual células PC-12 foram cultivadas por 3 dias com a adição de NGF sozinho foi tomado como um controle negativo, e sistema capaz no qual as células por 3 dias sem adição de NGF foi tomado como um controle positivo. Para confirmar supressão de crescimento de neurite por um inibidor de NGF, 133 nM de anticorpo anti-NGF (MAB2561, R&D Systems) como um controle de inibidor de NGF foi adicionado com NGF, as células foram cultivadas por 3 dias e supressão de crescimento de neurite foi confirmada. O ajuste da contagem do controle negativo como atividade inibitória 0%, e a contagem do controle positivo como atividade inibitória 100%, a atividade inibitória (%) do aptâmero foi calculada. Os resultados são mostrados na tabela 2. Uma atividade inibitória de não menos do que 50% é mostrada com +, e aquela de menos do que 50% é mostrada com -. Foi esclarecido que os aptâmeros mostrados por SEQ ID NOs: 1, 3 - 9 e 12 inibem marcadamente o crescimento de neurite (Tabela 2). O aptâmero mostrado por SEQ ID NO: 2 livre de uma Sequência consenso não mostrou uma atividade inibitória. Por outro lado, os aptâmeros mostrados por SEQ ID NOs: 5, 6 e similares contendo uma Sequência consenso mostraram uma atividade inibitória. O aptâmero mostrado por SEQ ID NO: 8 mostrou uma atividade inibitória, mesmo embora estivesse livre de uma Sequência consenso. O precedente mostra que os aptâmeros mostrados por SEQ ID NOs: 1, 3 - 9 e 12 podem ser inibidores de NGF. Tabela 2

[000218] A tabela 2 mostra aptâmeros capazes de inibirem crescimento de neurite de células PC12. Uma atividade inibitória de não menos do que 50% é "+", e aquela menor do que 50% é "-". Exemplo 8: Avaliação de atividade fisiológica de aptâmero pelo uso de células Neuroscreen-1

[000219] A atividade inibitória de crescimento de neurite de aptâmero foi avaliada pelo uso de célula Neuroscreen-1, que é um subclone de células PC-12. 2500 Células por cavidade foram cultivadas por um dia em um meio RPMI-1640 contendo 2,5% de soro de cavalo e 1,25% de soro bovino fetal em uma placa de fundo plano de 96 cavidades revestida com colágeno tipo IV. Uma solução misturada de NGF (concentração final 15 ng/mL ou 1,1 nM) pré-reagida em um meio RPMI-1640 livre de soro a temperatura ambiente ou 37°C por 30 minutos a 1 hora e um aptâmero (concentração final 500 - 3 nM) foi adicionado. Dois ou três dias mais tarde, o citoplasma e núcleo foram manchados usando-se Kits de Crescimento de neurite Cellomics (fabricado por Thermo Scientific), e comprimento de neurite por célula foi medido por Cellomics ArrayScan VTI (fabricado por Thermo Scientific). Com o comprimento de neurite por célula obtido por cultura da célula por 2 dias com a adição de NGF sozinho como atividade inibitória 0%, e aquela da célula obtida por cultura livre de NGF como atividade inibitória 100%, a atividade inibitória do aptâmero foi calculada a partir do comprimento de neurite por célula obtido por cultura com a adição de NGF e o aptâmero em mistura. A atividade inibitória quando as concentrações de aptâmero foram 100 nM e 10 nM, e os 50% de concentração inibitória (IC50) são mostrados na Tabela 3. Quando a atividade inibitória foi 0% ou abaixo, '0%' é indicado. Quando ela não foi menor do que 100%, '100%' é indicado. Os 50% de concentração inibitória foram determinados a partir das concentrações em dois, pontos acima e abaixo intercalando os 50% de atividade inibitória. Um valor IC50 indicado como < significa uma atividade inibitória de não menos do que 50% mesmo na concentração de medição mais baixa, e o número indicado mostra a concentração de medição mais baixa. Como um resultado do experimente, a presença de aptâmeros tendo uma alta atividade mostrando um IC50 de 10 nM ou abaixo foi confirmada.

[000220] Tais aptâmeros continham sequências de consenso de UGAAAA AAACC (SEQ ID NO: 91), UGAAAGAAACC (SEQ ID NO: 92), UGAAAGAAA CU (SEQ ID NO: 93), UGAAAAGAACC (SEQ ID NO: 95), UGAAAAAACCC (SEQ ID NO: 96), UGAAAGGAACC (SEQ ID NO: 105), CGAACAAAACU (SEQ ID NO: 103), CGAAAGAAACU (SEQ ID NO: 104) e AGAAUGAAACU (SEQ ID NO: 102). Seis tipos e 5 tipos de aptâmeros continham UGAAAAAA ACC (SEQ ID NO: 91) e UGAAAGAAACC (SEQ ID NO: 92), respectivamente. Tabela 3

[000221] A tabela 3 mostra a atividade inibitória (%) quando as concentrações do aptâmero que inibe o crescimento de neurite das células Neuroscreen-1 foram 100 nM e 10 nM, e 50% de concentração inibitória (IC50). Exemplo 9: encurtamento de cadeia de aptâmero

[000222] O encurtamento de cadeia dos aptâmeros mostrados por SEQ ID NOs: 2, 5, 6, 8 foi realizado. Os aptâmeros mostrados por SEQ ID NOs: 5, 6 contêm uma Sequência consenso de UGAAAAAAACC (SEQ ID NO: 91). Os aptâmeros mostrados por SEQ ID NOs: 2 e 8 não contêm tal Sequência consenso. As sequências das variantes são conforme descritas abaixo.

[000223] SEQ ID NO: 24: 69 aptâmeros de nucleotídeo que é uma variante do aptâmero mostrado por SEQ ID NO: 2 gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)c(F)u(F)ac(F)ac( F)u (F)u(F)u(F)agu(F)au(F)gac(F)aaac(F)c(F)u(F)agagu(F)gu(F)aaau(F)gc( F)u (F)u(F)c(F)gc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)

[000224] SEQ ID NO: 25: 47 aptâmeros de nucleotídeo que é uma variante do aptâmero mostrado por SEQ ID NO: 2 ggagc(F)u(F)gc(F)c(F)u(F)ac(F)ac(F)u(F)u(F)u(F)agu(F)au( F)gac(F)aaac(F)c(F)u(F)agagu(F)gu(F)aaau(F)gc(F)u(F)u(F)c(F)

[000225] SEQ ID NO: 26: 46 aptâmeros de nucleotídeo que é uma variante do aptâmero mostrado por SEQ ID NO: 5 gggc(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)u(F)u(F)aaac(F)aagc(F) aagu(F)gaaaaaaac(F)c(F)ac(F)agc(F)c(F)c(F)

[000226] SEQ ID NO: 27: 45 aptâmeros de nucleotídeo que é uma variante do aptâmero mostrado por SEQ ID NO: 6 gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaa aac (F)c(F)c(F)aaaau(F)u(F)aaau(F)

[000227] SEQ ID NO: 28: 40 aptâmeros de nucleotídeo que é uma variante do aptâmero mostrado por SEQ ID NO: 6 gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaa aac (F)c(F)c(F)aaaau(F)

[000228] SEQ ID NO: 29: 61 aptâmeros de nucleotídeo que é uma variante do aptâmero mostrado por SEQ ID NO: 8 ggu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)ggau(F)aaaaau(F)agagu(F)u(F)u(F )gau(F)aaac(F)ac(F)c(F)u(F)gu(F)au(F)u(F)aaaac(F)c(F)gc(F)au(F)u(F) gu(F)c(F)ac(F)c(F)

[000229] SEQ ID NO: 30: 41 aptâmeros de nucleotídeo que é uma variante do aptâmero mostrado por SEQ ID NO: 8 gggau(F)aaaaau(F)agagu(F)u(F)u(F)gau(F)aaac(F)ac(F)c(F )u (F)gu(F)au(F)u(F)aaaac(F)c(F)c(F)

[000230] SEQ ID NO: 31: 34 aptâmeros de nucleotídeo que é uma variante do aptâmero mostrado por SEQ ID NO: 26 gggagc(F)u(F)gc(F)u(F)u(F)aaac(F)aagc(F)aagu(F)gaaaaaa ac (F)c(F)c(F)

[000231] SEQ ID NO: 32: 38 aptâmeros de nucleotídeo que é uma variante do aptâmero mostrado por SEQ ID NO: 26 u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)u(F)u(F)aaac(F)aagc(F)aagu(F) gaaaaaaac(F)c(F)ac(F)a

[000232] SEQ ID NO: 33: 36 aptâmeros de nucleotídeo que é uma variante do aptâmero mostrado por SEQ ID NO: 26 u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)u(F)aaac(F)agc(F)aagu(F)gaaa aaaac(F)c(F)ac(F)a

[000233] SEQ ID NO: 34: 34 aptâmeros de nucleotídeo que é uma variante do aptâmero mostrado por SEQ ID NO: 26 gu(F)ggagc(F)u(F)gu(F)u(F)aaac(F)aac(F)aagu(F)gaaaaaa ac(F)c(F)ac(F)

[000234] SEQ ID NO: 35: 38 aptâmeros de nucleotídeo que é uma variante do aptâmero mostrado por SEQ ID NO: 28 gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaa aac (F)c(F)c(F)aaa

[000235] SEQ ID NO: 36: 35 aptâmeros de nucleotídeo que é uma variante do aptâmero mostrado por SEQ ID NO: 28 gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaa aac (F)c(F)c(F)

[000236] SEQ ID NO: 88: 33 aptâmeros de nucleotídeo que é uma variante do aptâmero mostrado por SEQ ID NO: 36 gggaagc(F)c(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)ggau(F)gaaaaaaac( F)c (F)c(F)

[000237] SEQ ID NO: 89: 34 aptâmeros de nucleotídeo que é uma variante do aptâmero mostrado por SEQ ID NO: 36 gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)aaac(F)agc(F)aggau(F)gaaaaaaac (F)c (F)c(F)

[000238] SEQ ID NO: 90: 32 aptâmeros de nucleotídeo que é uma variante do aptâmero mostrado por SEQ ID NO: 36 gggagc(F)c(F)u(F)gu(F)aaac(F)agc(F)aggu(F)gaaaaaaac(F) c (F)c(F)

[000239] As estruturas secundárias putativas dos aptâmeros mostrados por SEQ ID NOs: 31 e 36 são mostradas na figura 14 e figura 15. A Sequência consenso é mostrada com um círculo negro.

[000240] Aptâmeros com um comprimento de 40 nucleotídeos ou mais longos foram preparados por transcrição e aptâmeros com um comprimento mais curto do que aquele foram preparados por síntese química. Se estes ácidos nucleicos inibem a ligação de NGF e receptor de NGF foi examinado na mesma maneira como no exemplo 6 por método de ressonância de plasmon de superfície. Como um resultado, todos estes ácidos nucleicos foram verificados retém uma atividade inibitória (Tabela 1).

[000241] Em adição, a atividade inibitória de crescimento de neurite contra células PC12 foi examinada na mesma maneira como no exemplo 7. Como um resultado, uma atividade inibitória forte foi verificada na SEQ ID NOs: 28 - 30, 32, 35 (Tabela 2).

[000242] O aptâmero mostrado por SEQ ID NO: 32 foi encurtado para 38 nucleotídeos mantendo a Sequência consenso do aptâmero mostrado por SEQ ID NO: 5. Em adição, o aptâmero mostrado por SEQ ID NO: 35 foi encurtado para 38 nucleotídeos mantendo a Sequência consenso do aptâmero mostrado por SEQ ID NO: 6. A partir do acima, foi mostrado que a Sequência consenso é importante pelo menos para SEQ ID NOs: 5 e 6.

[000243] Por outro lado, o aptâmero mostrado por SEQ ID NO: 30 é uma sequência do aptâmero de cadeia encurtada mostrada por SEQ ID NO: 8 livre da Sequência consenso, e a atividade foi confirmada com o comprimento de 41 nucleotídeos. Estes aptâmeros foram mostrados serem utilizáveis como inibidores de NGF. Exemplo 10: Modificação de aptâmeros de cadeia encurtada

[000244] Para intensificar a estabilidade dos aptâmeros mostrados por SEQ ID NOs: 30, 32, 35 no sangue, variantes no qual o grupo hidroxila na posição 2' de ribose foram substituídas por um grupo o- metila foram preparadas. Na mesma maneira como no exemplo 7, a inibição de crescimento de neurite por células PC12 foi examinada. Como um resultado, todos estes aptâmeros permitiram uma forte atividade inibitória.

[000245] As sequências das formas modificadas são mostradas abaixo. O parêntese nos nucleotídeos mostra a modificação de posição 2', F é átomo de flúor, M é grupo o-metila, e idT é dT invertido.

[000246] SEQ ID NO: 30(1): idT- gggau(F)aaaaau(F)a(M)g(M)a(M)g(M)u(F)u(F)u(F)g(M)a(M)u(F)a(M)a( M)a (M)c(F)a(M)c(F)c(F)u(F)gu(F)au(F)u(F)aaaac(F)c(F)c(F)-idT

[000247] SEQ ID NO: 30(2): gggau(F)aaaa(M)a(M)u(F)agagu(F)u(F)u(F)gau(F)aaac(F)a c(F) c(F)u(F)gu(F)au(F)u(F)aaaac(F)c(F)c(F)

[000248] SEQ ID NO: 30(3): gggau(F)aaaaau(F)agagu(F)u(F)u(F)gau(F)aaac(F)ac(F)c(F )u (F)gu(F)au(F)u(F)a(M)a(M)aac(F)c(F)c(F)

[000249] SEQ ID NO: 30(4): idT- gggau(F)aaaa(M)a(M)u(F)a(M)g(M)a(M)g(M)u(F)u(F)u(F)g(M)a(M)u(F) a(M)a(M)a(M)c(F)a(M)c(F)c(F)u(F)gu(F)au(F)u(F)a(M)a(M)aac(F)c(F)c( F)-idT

[000250] SEQ ID NO: 30(5): idT- gggau(F)aaaa(M)a(M)u(F)a(M)g(M)a(M)g(M)u(F)u(F)u(F)g(M)a(M)u(F) a(M)a(M)a(M)c(F)a(M)c(F)c(F)u(F)gu(F)a(F)u(F)u(F)a(M)a(M)a(F)a(F)c (F)c(F)c(F)-idT

[000251] SEQ ID NO: 30(6): idT- g(M)g(M)g(M)au(F)a(M)aa(M)a(M)a(M)u(F)a(M)g(M)a(M)g(M)u(F)u(F)u (F)g (M)a(M)u(F)a(M)a(M)a(M)c(F)a(M)c(F)c(F)u(F)gu(F)a(M)u(F)u(F)a(M)a (M)a (F)a(F)c(F)c(F)c(F)-idT

[000252] SEQ ID NO: 32(1): idT- u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)g(M)c(F)u(F)u(F)a(M)a(M)a(M)c(F)a(M)a(M)g(M )c(F)a(M)a(M)g(M)u(F)gaaaaaaac(F)c(F)ac(F)a-idT

[000253] SEQ ID NO: 32(2): u(F)g(M)u(F)ggagc(F)u(F)gc(F)u(F)u(F)aaac(F)aagc(F)aagu (F)gaaaaaaac(F)c(F)ac(F)a(M)

[000254] SEQ ID NO: 32(3): u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)u(F)u(F)aaac(F)aagc(F)aagu(F) gaaaa(M)a(M)aac(F)c(F)ac(F)a

[000255] SEQ ID NO: 32(4): u(F)gu(F)gga(M)gc(F)u(F)gc(F)u(F)u(F)aaac(F)aagc(F)aagu (F)gaaaaaaac(F)c(F)ac(F)a

[000256] SEQ ID NO: 32(5): idT- u(F)g(M)u(F)gga(M)gc(F)u(F)g(M)c(F)u(F)u(F)a(M)a(M)a(M)c(F)a(M)a( M)g(M)c(F)aagu(F)gaaaa(M)a(M)a(M)a(M)c(F)c(F)ac(F)a-idT

[000257] SEQ ID NO: 32(6): idT- u(F)g(M)u(F)g(M)ga(M)gc(F)u(F)g(M)c(F)u(F)u(F)a(M)a(M)a(M)c(F)a( M)a(M)g(M)c(F)a(M)a(M)g(M)u(F)gaaaa(M)a(M)a(M)a(M)c(F)c(F)ac(F) a-idT

[000258] SEQ ID NO: 35(1): idT- ggga(M)a(M)g(M)c(F)c(F)u(F)g(M)u(F)g(M)g(M)a(M)g(M)c(F)u(F)g(M)c (F)a(M)g(M)g(M)au(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaa-idT

[000259] SEQ ID NO: 35(2): idT- ggga(M)a(M)g(M)c(F)c(F)u(F)g(M)u(F)ggagc(F)u(F)g(M)c(F)a(M)g(M)g (M)au(F)gaaaa(M)a(M)a(M)a(M)c(F)c(F)c(F)aaa-idT

[000260] SEQ ID NO: 35(3): gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaa aac (F)c(F)c(F)a(M)a(M)a(M)

[000261] SEQ ID NO: 35(4): idT- ggga(M)a(M)g(M)c(F)c(F)u(F)g(M)u(F)g(M)g(M)a(M)g(M)c(F)u(F)g(M)c (F)a (M)g(M)g(M)au(F)gaaaa(M)a(M)a(M)a(M)c(F)c(F)c(F)a(M)a(M)a(M)- idT

[000262] SEQ ID NO: 35(5): idT- g(M)g(M)ga(M)a(M)g(M)c(F)c(F)u(F)g(M)u(F)g(M)g(M)a(M)g(M)c(F)u(F )g(M)c(F)a(M)g(M)g(M)au(F)gaaaa(M)a(M)a(M)a(M)c(F)c(F)c(F)a(M)a( M)a(M)-idT

[000263] SEQ ID NO: 35(6): idT- g(M)g(M)ga(M)a(M)g(M)c(F)c(F)u(F)g(M)u(F)g(M)g(M)a(M)g(M)c(F)u(F )g(M)c(F)a(M)g(M)g(M)a(F)u(F)gaaaa(M)a(M)a(M)a(M)c(F)c(F)c(F)a(M )a(M)a(M)-idT Exemplo 11: Identificação de local de ligação de NGF de método de pegada de aptâmero

[000264] Para confirmar que a Sequência consenso é um local de ligação de NGF, um experimento de digestão de enzima foi realizado na ausência de NGF e na presença de NGF. Quando a Sequência consenso é um local de ligação de NGF, os resultados devem ser que digestão de enzima ocorre na ausência de NGF; nuclease não pode e ligar a uma Sequência consenso na presença de NGF e digestão de enzima não ocorre. Usando-se um aptâmero no qual uma substância fluorescente (FAM6) foi conjugada com o 5' terminal ou 3' terminal do aptâmero mostrado por SEQ ID NO: 62, o experimento foi realizado. O aptâmero mostrado por SEQ ID NO: 62 contém uma Sequência consenso de UGAAAGAAACC (SEQ ID NO: 92). Como a nuclease, 3 tipos de S1 nuclease (manufaturada por TAKARA BIO) que cliva seletivamente trançados simples, V1 nuclease (manufaturada por Ambion) que cliva seletivamente trançados duplos, e T1 nuclease (manufaturada por Ambion) que cliva seletivamente G de trançados simples foram usados. Cada reação de enzima foi realizada sob as condições da Tabela 4 em referência ao documento de relatório em anexo. À solução de reação de S1 nuclease foi adicionado 0,833 mM de ZnCl2. Tabela 4

[000265] No experimento com adição de NGF, a proporção molar de aptâmero e NGF foi ajustada para 1:2, e eles foram dissolvidos na solução B, um tampão de ligação. Aqui, a solução B é uma solução misturada de 145 mM de cloreto de sódio, 5,4 mM de cloreto de potássio, 1,8 mM de cloreto de cálcio, 0,8 mM de cloreto de magnésio, e 20 mM de Tris (pH 7,6).

[000266] Após uma reação de enzima, a reação foi descontinuada por um tratamento de fenol.clorofórmio, e uma fração solúvel em água foi recuperada e concentrada. Em seguida, o ácido fosfórico terminal foi removido por fosfatase alcalina (manufaturada por TAKARA BIO). O tratamento de enzima com fosfatase alcalina foi realizado a 37 °C por 1,5 horas referência ao documento de relatório anexado. Estas amostras foram analisadas por 20% de eletroforese de poliacrilamida desnaturada. Para detecção de fluorescência, Storm850 (fabricado por GE Healthcare) foi usado. Como um resultado do experimento, GAAAGA de UGAAAGAAACC (SEQ ID NO: 92) foi clivado por S1 e T1 nucleases na ausência de NGF. Por outro lado, a clivagem foi marcadamente suprimida na presença de NGF. Aqui, nucleotídeo de pirimidina é uma forma fluoro-modificada. As revelações acima mostram que a parte da Sequência consenso é um local de ligação de NGF. Exemplo 12: Mudanças na atividade por introdução de mutação na arte de Sequência consenso

[000267] A mutação foi introduzida na parte de Sequência consenso, e mudanças na atividade foram avaliadas usando-se células Neuroscreen-1 na mesma maneira como no exemplo 8. Como um aptâmero contendo uma Sequência consenso UGAAAAAAACC (SEQ ID NO: 91), uma sequência longa de 38 nucleotídeos mostrada por SEQ ID NO: 35 foi usada. Os resultados destes são mostrados na tabela 5.

[000268] Quando um aptâmero livre de introdução de mutação foi adicionado a 300 nM, inibição de crescimento de neurite por 92% foi vista. Por outro lado, a atividade desapareceu completamente pela introdução de uma mutação de um nucleotídeo. Quando A na 3a a 5a de UGAAAAAAACC (SEQ ID NO: 91) foi substituído por tipo de DNA, a atividade desapareceu completamente. A partir do acima, foi mostrado que a Sequência consenso é importante para inibição de atividade de NGF. Tabela 5

[000269] A tabela 5 mostra os resultados do experimento inibitório de crescimento de neurite usando-se células Neuroscreen-1. O aptâmero mostrado por SEQ ID NO: 35 e uma variante deste foram adicionados a 300 nM. O nucleotídeo de pirimidina é uma forma fluoro-modificada, as letras capitais de nucleotídeo de purina mostra tipo de RNA, e as letras de caso inferior mostram tipo de DNA. A mutação foi introduzida nas partes sublinhadas. Exemplo 13: Consideração relacionada a sequências de consenso

[000270] Neste experimento, as sequências de consenso apareceram em alta frequência em SELEX sob condições diferentes tais como reuniões diferentes, sequências iniciador e similares (Exemplos 1 - 4). Das 74 sequências obtidas por SELEX, 59 sequências contêm aptâmeros tendo uma Sequência consenso de UGAAANNANCY (SEQ ID NO: 107), no qual N é qualquer nucleotídeo de A, G, C e U, e U pode ser T. Y é um nucleotídeo de pirimidina. Destes, 29 sequências contêm UGAAAAAAACY (SEQ ID NO: 110) e 13 sequências contêm UGAAAGAAACY (SEQ ID NO: 111).

[000271] Por outro lado, sequências de consenso mostradas pelas fórmulas CGAANNAAACY (SEQ ID NO: 108) e AGAANNAAACY (SEQ ID NO: 109) foram encontradas em 3 sequências e 2 sequências, respectivamente. Destes, uma sequência contém CGAACAAAACY (SEQ ID NO: 112), e uma sequência contém CGAAAGAAACY (SEQ ID NO: 113). Elas podem ser mostradas pela fórmula HGAANNNANCY (SEQ ID NO: 106).

[000272] Desde que estas sequências de consenso necessárias para 38 nucleotídeos formam cadeia encurtada (Exemplo 9), protegida pela adição de NGF em um experimento de digestão de enzima (Exemplo 11), e atividade fisiológica diminui marcadamente pela introdução de uma mutação (Exemplo 12), é claro que elas são importantes para inibição de função de NGF. Exemplo 14: Introdução de mutação em aptâmero de cadeia encurtada

[000273] Se a atividade pode ser mantida após introdução de uma mutação em um aptâmero, cadeia encurtada foi confirmada. O aptâmero de SEQ ID NO: 30(6) tem um comprimento de 41 nucleotídeos e não contém uma Sequência consenso. dT invertido é adicionado aos terminais 5' e 3'. A atividade foi avaliada usando-se células Neuroscreen-1 na mesma maneira como no exemplo 8. Os resultados são mostrados na tabela 6.

[000274] Quando pares bases G1:C41, A10:U33, A12:U31 na parte de tronco prognosticada pelo programa MFOLD foram substituídos por C1:G41, U10:A33, U12:A31, a atividade não diminui marcadamente. Quando G20 e G23 na parte de circuito fechado foram substituídos por A20 e A23, atividade não diminui marcadamente. A partir do acima, foi mostrado que a atividade do aptâmero mostrada por SEQ ID NO: 30(6) foi mantida mesmo após introdução de várias mutações. Tabela 6 (% de Inibição)

Exemplo 15: Comparação com aptâmero de GN F descrito na referência da técnica anterior

[000275] Os aptâmeros mostrados por SEQ ID NOs: 30, 32, 35 e aptâmeros de NGF descritos na referência da técnica anterior (Binkley J et al., (1995) Acid nucleics Res. 23, 3198) foram comparados para atividade de ligação de NGF, NGF-atividade inibitória de ligação de receptor de NGF e atividade inibitória de crescimento de neurite.

[000276] Os aptâmeros descritos na referência da técnica anterior foram todos RNAs não modificados, e as sequências destes não se equiparam com as sequências descritas no presente relatório. Como os aptâmeros descritos na referência da técnica anterior, H1, L2 e L6 mostrando alta atividade de ligação foram selecionados e transcritos com T7 polimerase. A atividade de ligação foi avaliada por um método similar àquele no exemplo 1, NGF-atividade inibitória de ligação de receptor de NGF foi avaliada por um método similar àquele no exemplo 6, e a atividade inibitória de crescimento de neurite foi avaliada por um método similar àquele no exemplo 8.

[000277] Como um resultado, foi verificado que H1, L2 e L6 se liga ao NGF, mas a atividade é mais baixa do que os aptâmeros mostrados por SEQ ID NOs: 30, 32, 35 (Tabela 7). Além disso, H1, L2 e L6 não inibem ligação de NGF e receptor de NGF, e não mostram uma atividade inibitória mesmo quando adicionados a 500 nM no experimento inibitório de crescimento de neurite (Tabela 7). A partir do acima, foi mostrado que os aptâmeros descritos no presente relatório têm atividade mais alta do que os aptâmeros descritos na referência da técnica anterior. Tabela 7

[000278] A tabela 7 mostra atividade de ligação de NGF, inibição de ligação de NGF-receptor de NGF, e atividade inibitória de crescimento de neurite de NGF dos aptâmeros mostrados por SEQ ID NOs: 30, 32, 35 e dos aptâmeros H1, L2, L6 descritos no documento de não patente 1.

[000279] A atividade de ligação de NGF foi avaliada baseado no valor máximo de RU obtido pela ligação de NGF e SEQ ID NO: 35 como 100%. Quando ele não é menor do que 80%, "++" é indicado, quando ele não é menor do que 50%, "+" é indicado, e quando ele é 50% ou abaixo, "-" é indicado. Como para inibição de ligação de NGF- receptor de NGF, "+" significa uma atividade inibitória (%) de não menos do que 60%, e "-" significa uma atividade inibitória (%) de menos do que 60%.

[000280] A atividade inibitória de crescimento de neurite de NGF é a atividade inibitória (%) quando a concentração final do aptâmero é 500 nM ou 250 nM.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

[000281] Os aptâmero e o complexo da presente invenção podem ser úteis como medicamentos, agentes diagnósticos ou reagentes para doenças tais como dor, doença inflamatória e similares. O aptâmero e o complexo da presente invenção podem também serem úteis para a purificação e concentração de NGF, bem como detecção e quantificação de NGF.

[000282] Este pedido é baseado em um pedido de patente N° 2008244982, depositado no Japão (data do depósito: 24 de setembro de 2008), os conteúdos do qual são incorporados no todo aqui.

Claims (10)

1. Aptâmero que se liga ao NGF, caracterizado pelo fato de que inibe a ligação de NGF a um receptor de NGF, e compreende uma sequência UGAAAAAAACC (SEQ ID NO: 91), UGAAAGAAACC (SEQ ID NO: 92), UGAAAGAAACU (SEQ ID NO: 93), UGAAACAAACC (SEQ ID NO: 94), UGAAAAGAACC (SEQ ID NO: 95), UGAAAAAACCC (SEQ ID NO: 96), UGAAAAAACCU (SEQ ID NO: 97), UGAAAACAACC (SEQ ID NO: 98), UGAAAUAAACC (SEQ ID NO: 99), UGAAAUAAACU (SEQ ID NO: 100), UGAAAAAAUCU (SEQ ID NO: 101), AGAAUGAAACU (SEQ ID NO: 102), CGAACAAAACU (SEQ ID NO: 103), CGAAAGAAACU (SEQ ID NO: 104), UGAAAGGAACC (SEQ ID NO: 105), UGAAAAAAACY (SEQ ID NO: 110), UGAAAGAAACY (SEQ ID NO: 111), CGAACAAAACY (SEQ ID NO: 112), ou CGAAAGAAACY (SEQ ID NO: 113),, em que Y é um nucleotídeo de pirimidina, e pelo menos um nucleotídeo é modificado.

2. Aptâmero de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência mostrada por UGAAAAAAACY (SEQ ID NO: 110), UGAAAGAAACY (SEQ ID NO: 111), CGAACAAAACY (SEQ ID NO: 112), CGAAAGAAACY (SEQ ID NO: 113) ou AGAAUGAAACU (SEQ ID NO: 102), em que Y é um nucleotídeo de pirimidina e pelo menos um nucleotídeo da sequência antes mencionada é modificado.

3. Aptâmero de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência mostrada por UGAAAAAAACC (SEQ ID NO: 91), UGAAAGAAACC (SEQ ID NO: 92), UGAAAGAAACU (SEQ ID NO: 93), CGAACAAAACU (SEQ ID NO: 103), CGAAAGAAACU (SEQ ID NO: 104) ou AGAAUGAAACU (SEQ ID NO: 102), em que pelo menos um nucleotídeo da sequência antes mencionada é modificado.

4. Aptâmero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que seu comprimento é 100 bases ou menos.

5. Aptâmero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que seu comprimento é 60 bases ou menos.

6. Aptâmero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que os grupos hidroxila na posição 2' de uma ribose dos respectivos nucleotídeos de pirimidina são os mesmos ou diferentes e não substituídos ou substituídos por um átomo ou grupo selecionado a partir do grupo consistindo em um átomo de hidrogênio, um átomo de flúor e um grupo metóxi.

7. Aptâmero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que os grupos hidroxila na posição 2' de uma ribose dos respectivos nucleotídeos de purina são os mesmos ou diferentes e não substituídos ou substituídos por um átomo ou grupo selecionado a partir do grupo consistindo em um átomo de hidrogênio, um átomo de flúor e um grupo metóxi.

8. Aptâmero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que inibe uma atividade de crescimento de neurito pelo NGF.

9. Aptâmero de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que apresenta uma concentração inibitória de 50% (IC50) não superior a 100 nM para a inibição da atividade de crescimento de neurito pelo NGF.

10. Medicamento, caracterizado pelo fato de que compreende o aptâmero como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9

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