BRPI0718913A2 - Aptâmero contra midkine e uso do mesmo - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "APTÂMERO CONTRA MIDKINE E USO DO MESMO".

Campo técnico

A presente invenção refere-se a um aptâmero contra midkine, 5 um método para uso deste e similares.

Antecedentes da Invenção

Midkine (daqui em diante abreviada como “MK”, conforme exigi- do) é um fator de crescimento/diferenciação que foi inicialmente descoberto como um produto gênico expresso transientemente no processo de indução 10 de diferenciação de células de tumores embrionários com ácido retinóico, é um polipeptídeo com peso molecular de 13 kDa, rico em aminoácidos bási- cos e cisteína (vide, por exemplo, documento 1 não-patente e documento 2 não-patente).

A estrutura estérica de MK foi determinada por RMN e relatada (vide, por exemplo, documento 3 não-patente). Quando caracterizada estru- turalmente, MK é configurada principalmente em dois domínios. Especifica- mente, MK consiste em um fragmento no lado N-terminal que consiste em resíduos de aminoácidos 1 a 52 (daqui em diante referido por “fragmento N- terminal”), um fragmento no lado C-terminal que consiste em resíduos de aminoácidos 62 a 121 (daqui em diante referido por “fragmento C-terminal”) e uma região de laço que conecta os fragmentos (resíduos de aminoácidos 53 a 61). Uma cauda que é rica em aminoácidos se encontra presa ao exte- rior de cada domínio. Na molécula MK, cada fragmento N-terminal e frag- mento C-terminal têm uma estrutura estérica que consiste principalmente em três estruturas de folha β reversas (daqui em diante referidas como “domí- nios”; um domínio consistindo nos resíduos de aminoácidos 15 a 52 no fragmento N-terminal referido como “o N-domínio”, um domínio compreen- dendo os resíduos de aminoácidos 62 a 104 no fragmento C-terminal referi- do por “o C-domínio”), e estruturas que se movem livremente e que não to- mam nenhuma forma particular (daqui em diante referidas por “caudas”; uma cauda compreendendo os resíduos de aminoácidos 1 a 14 do fragmento N- terminal referida por “a cauda-N”, e uma cauda compreendendo os resíduos de aminoácidos 105 a 121 do fragmento C-terminal referida por “a cauda- C”).

Receptores conhecidos de MK incluem tirosina fosfatase de pro- teína tipo receptor ζ (ΡΤΡζ), LRP (proteína relacionada a receptor de Iipopro- 5 teína de baixa densidade), ALK (quinase de leucemia anaplásica), integrina, sindecan e similares. MK é uma proteína altamente carregada positivamente que contém grandes quantidades dos aminoácidos básicos Iisina (K) e argi- nina (R). Ela possui um sítio de ligação de heparina em seu C-domínio, e é conhecida por se ligar fortemente a moléculas carregadas negativamente 10 tais como a heparina e o sulfato de condroitina E. Como resultado da análise mutagênica e análise de RMN, acredita-se que o cluster I, configurado com K79, R81 e K102, e o cluster II, configurado com K86, K87 e R89 são impor- tantes para a ligação com heparina. No entanto, está disponível um relatório reportando que somente a aglomeração I é importante para a ligação com 15 sulfato de condroitina E. Quando R81 do cluster I é substituído por A, a ativi- dade com a heparina diminui. Consequentemente, a redução da atividade de ligação a ΡΤΡζ e o alongamento de neurite induzido por MK e movimento de células nervosas é suprimido.

Alguns fatores de crescimento como o fator de crescimento de fibroblastos (bFGF) e o fator de crescimento de células endoteliais vascula- res (VEGF) possuem um sítio de ligação de heparina. Acredita-se que esses fatores de crescimento se ligam à proteoglicana de heparan sulfato, uma matriz extracelular, ficam em posições apropriadas e são liberados conforme exigidos. Também sabe-se que tais fatores se ligam ao heparan sulfato ex- presso nas células nervosas e células endoteliais vasculares para contribuir com o alongamento da neurite e elevação da atividade fibrinolítica. Quando uma placa de Petri é revestida com MK e células nervosas de camundongos são plantadas ali, as neurites se alongam. Nesta situação, a digestão das células nervosas com heparitinase suprime o alongamento da neurite. Entre- tanto, quando células endoteliais vasculares são cultivadas e MK é adiciona- da, a atividade do Ativador de plasminogênio das células cresce. Também nesse caso, a digestão das células com heparitinase suprime a elevação da atividade do plasminogênio.

Crê-se que MK se liga à ΡΤΡζ em dois sítios. Um sítio envolve uma ligação de alta afinidade com o sulfato de condroitina (Kd = 0,58 nM). Essa ligação desaparece quando da digestão com condroitinase. O outro 5 sítio envolve uma ligação com proteína, e é uma ligação de baixa afinidade que permanece após a digestão com condroitinase (Kd = 3 nM). MK promo- ve a migração de células nervosas fetais que expressam ΡΤΡζ; o tratamento das células nervosas com condroitinase ABC suprime a migração. Células UMR106 tipo osteoblastos são ΡΤΡζ expressoras, e são conhecidas por 10 possuírem sua migração dependente de MK suprimida por tratamento com a condroitinase ABC. A migração dependente de MK de macrófago também é suprimida pelo tratamento com a condrpitinase ABC, a condroitinase B ou a heparinase. Acredita-se que os macrófagos não exprimem ΡΤΡξ, acredita-se que outro receptor está envolvido.

Tudo negativamente carregado se liga ao sítio de ligação de he-

parina de MK. Quando MK é imobilizada por aminoacoplamento e sujeita à análise de ressonância de plasmônio de superfície, os resultados obtidos mostram que o sulfato de condroitina Eea heparina se ligam fortemente a MK, enquanto os sulfatos de condroitina A, B, C e D não se ligam a MK.

Sabe-se que a MK possui um amplo espectro de atividades bio-

lógicas. Por exemplo, sabe-se que em células cancerosas humanas, a ex- pressão de MK é aumentada. Essa expressão aumentada tem sido observa- da em vários cânceres, incluindo câncer de esôfago, câncer da tireóide, cân- cer da bexiga, câncer colorretal, câncer gástrico, câncer pancreático, câncer 25 de mama, câncer do fígado, câncer do pulmão, câncer de mama, glioblas- toma, câncer do útero, câncer do ovário e tumor de Wilms (vide, por exem- plo, o documento de patente 1 e o documento 4 não-patente). Também se acha que a MK promove a sobrevivência e o movimento das células de cân- cer e facilita neovascularização que ajuda o avanço do câncer.

MK também é conhecida por ser uma das moléculas que possui

um papel principal no processo de desenvolvimento de inflamações. Por e- xemplo, sabe-se que a formação de íntima nascente após dano a um vaso sanguíneo e o início de nefrite em lesões isquêmicas são mitigados em ca- mundongos nocaute carecendo de gene de MK. Também se sabe-se que no modelo de reumatismo, a adesão de pós-operatório também é considera- velmente mitigada em camundongo nocaute para MK (vide, por exemplo, 5 documento de patente 2, documento de patente 3 e documento de patente 4). Assim, MK é conhecida por estar envolvida em doenças inflamatórias tais como artrite, doença autoimune, artrite reumática (artrite reumatóide (RA), artrite óssea (OA)), esclerose múltipla, adesão de pós-operatório, colite in- flamatória, psoríase, lúpus, asma, e anormalidades funcionais dos neutrófi- 10 los. Além disso, sabe-se que a MK promove o movimento (migração) de cé- lulas inflamatórias tais quais macrófagos e neutrófilos. Como esse movimen- to é exigido para o desenvolvimento da inflamação, acha-se que na falta de midkine, doenças baseadas em inflamações são de ocorrência improvável. (Vide, por exemplo, documento de patente 5).

Como os níveis da MK são maiores no fluido peritoneal de fê-

meas com endometriose avançada, e também como a MK estimula a prolife- ração de células intersticiais endometriais cultivadas, sabe-se que a MK está envolvida no início e progressão da endometriose (vide, por exemplo, docu- mento de patente 6).

Ademais, por exibir ação de espessamento íntimo vascular, sa-

be-se que a MK está envolvida em doenças obstrutivas vasculares tais como a reestenose seguinte à cirurgia de reconstrução vascular, doença obstrutiva vascular da artéria coronária cardíaca, doença obstrutiva vascular cerebral, doença vascular obstrutiva periférica, arteriosclerose e infarto cerebral (vide, por exemplo, documento de patente 2).

Sabe-se que a migração de células é importante para o meca- nismo de infiltração/metástase de células de câncer, espessamento íntimo em focos arterioscleróticos, neovascularização e similares. Também sabe-se que a migração de células inflamatórias está profundamente associada a 30 doenças cardiovasculares como a angina do peito, infarto do miocárdio, in- farto cerebral, hemorragia cerebral e hipertensão.

Pleiotrofina (PTN ou HB-GAM) é a única proteína da família da MK, possuindo cerca de 50% de homologia em relação à MK. Tanto a MK quanto a PTN são proteínas que contêm grandes quantidades de cisteína e resíduos básicos. Todos os 10 resíduos de cisteína são conservados em MK e PTN, e estruturalmente, ambas podem ser divididas no N-domínio e C- 5 domínio. Conforme resultado da análise por RMN1 sabe-se que estas duas moléculas possuem estruturas tridimensionais bastante similares. Cada do- mínio consiste em 3 folhas β, conectadas por uma região Iigante flexível. K79, R81 e K102, que são consideradas importantes na ligação com o sulfa- to de condroitina e heparina, são conservadas entre as duas proteínas. K79 10 e R81 estão presentes na mesma folha β, enquanto K102 está presente em outra folha β. Quando MK e PTN formam uma estrutura estérica, esses resí- duos básicos aparecem na adjacência da superfície da proteína.

Em anos recentes, aplicações de aptâmeros de RNA a fármacos terapêuticos, reagentes diagnósticos e reagentes de teste têm chamado a- tenção; alguns aptâmeros de RNA já passaram pela etapa clínica ou pela etapa prática. Em dezembro de 2004, o primeiro fármaco do mundo de ap- tâmero de RNA, Macugen, foi aprovado como um fármaco terapêutico para degeneração macular relacionada à idade nos Estados Unidos. Um aptâme- ro de RNA refere-se a um RNA que se liga especificamente a uma substân- cia alvo tal como uma proteína, e pode ser preparado utilizando-se o método SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) (docu- mentos 5 e 6). O método SELEX é um método pelo qual um RNA que se liga especificamente a uma substância alvo é selecionado cerca de 1014 reuni- ões de RNA possuindo seqüências de nucleotídeos diferentes. O RNA utili- zado possui uma estrutura em que uma seqüência aleatória de cerca de 40 resíduos é espremida por seqüências de iniciadores. É permitido que tais reuniões de RNA se associem à substância alvo, e somente o RNA que pos- sui uma ligação com a substância alvo é recuperado utilizando-se um filtro ou similar. O RNA recuperado é amplificado por RT-PCR, e é utilizado como modelo para a próxima rodada. Através da repetição de tal operação por cerca de 10 vezes, um aptâmero de RNAque se liga especificamente a uma substância alvo pode ser às vezes obtido. [documento de patente 1] JP-A-6-172218 [documento de patente 2] W02000/10608 [documento de patente 3] W02004/078210 [documento de patente 4] W02004/085642 5 [documento de patente 5] W01999/03493 [documento de patente 6] W02006/016571

[documento 1 não-patente] Kadomatsu, K. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 151 :p. 1312-1318

[documento 2 não-patente] Tomokura, M. et al., : J. Biol. Chem, 265: p. 10765-10770

[documento 3 não-patente] Iwasaki, W., et al., (1997) EMBO J. 16, p. 6936- 6946

[documento 4 não-patente] Muramatsu, T., (2002) J. Biochem. 132, p. 359- 371

[documento 5 não-patente] Ellington et al., (1990) Nature, 346, 818-822 [documento 6 não-patente] Tuerk et al., (1990) Science, 249, 505-510 Descrição da Invenção Problemas a serem Resolvidos pela Invenção

A presente invenção é direcionada a proporcionar um aptâmero para midkine e um método para utilização de tal, e similares.

Meios para Resolução dos Problemas

Os presentes inventores investigaram de maneira diligente para resolver o problema descrito acima e, como resultado, tiveram sucesso na preparação de um aptâmero de boa qualidade para midkine, que resultou na conclusão da presente invenção.

Por conseguinte, a presente invenção proporciona o seguinte:

1. o aptâmero que possui atividade inibidora contra midkine,

2. o aptâmero de 1, em que o aptâmero não possui atividade inibidora contra pleiotrofina,

3. o aptâmero de 1, que possui atividade de ligação ao fragmen-

to N-terminal da midkine,

4. o aptâmero de 1, que possui atividade de ligação ao fragmen- to C-terminal da midkine,

5. o aptâmero de 2, que possui atividade de ligação ao fragmen- to N-terminal da midkine,

6. o aptâmero de 2, que possui atividade de ligação ao fragmen- to C-terminal da midkine,

7. o aptâmero que exibe atividade inibidora contra midkine atra- vés da inibição da ligação da midkine e ΡΤΡξ,

8. o aptâmero de 1, que é ou (a) ou (b) abaixo:

(a) um aptâmero compreendendo uma seqüência de nucleotídeos selecio-

nada de SEQ ID NO:1 a 70 (com a condição que o uracil possa ser timina), em que os nucleotídeos contidos no aptâmero são tais que,

(i) as posições 2' dos nucleotídeos de pirimidina, se idênticas ou diferentes, são átomos de flúor ou substituídas por átomos ou grupos sele- cionados do grupo que consiste em átomos de hidrogênio, grupos hidróxi e

grupos metóxi, e

(ii) as posições 2' dos nucleotídeos de purina, se idênticas ou diferentes, são grupos hidróxi ou substituídas por átomos ou grupos selecio- nados do grupo que consiste em átomos de hidrogênio, grupos metóxi e á- tomos de flúor;

(b) um aptâmero compreendendo uma seqüência de nucleotídeos selecio- nada de SEQ ID NO:1 a 70 (com a condição que o uracil possa ser timina), em que um ou vários nucleotídeos são substituídos, deletados, inseridos ou adicionados, em que os nucleotídeos contidos no aptâmero são tais que,

(i) as posições 2' dos nucleotídeos de pirimidina, se idênticas ou

diferentes, são átomos de flúor ou substituídas por átomos ou grupos sele- cionados do grupo que consiste em átomos de hidrogênio, grupos hidróxi e grupos metóxi, e

(ii) as posições 2' dos nucleotídeos de purina, se idênticas ou diferentes, são grupos hidróxi ou substituídas por átomos ou grupos selecio-

nados do grupo que consiste em átomos de hidrogênio, grupos hidróxi e grupos metóxi e átomos de flúor.

9. o aptâmero de qualquer um de 1 a 8, em que o nucleotídeo contido no aptâmero é modificado,

10. um complexo que compreende o aptâmero de qualquer um de 1 a 9 e uma substância funcional,

11. o complexo de 10, em que a substância funcional é uma substância de afinidade, uma substância para marcação, uma enzima, um

veículo para distribuição de fármacos ou um fármaco,

12. um fármaco, que compreende o aptâmero de qualquer um de 1 a 9 ou o complexo de 10 ou 11,

13. um inibidor de migração celular, que compreende o aptâmero de qualquer um de 1 a 9 ou o complexo de 10 ou 11,

14. um reagente para diagnóstico, que compreende o aptâmero de qualquer um de 1 a 9 ou o complexo de 10 ou 11,

15. um agente marcador, que compreende o aptâmero de qual- quer um de 1 a 9 ou o complexo de 10 ou 11, e

16. um método de detecção do aptâmero de qualquer um de 1 a

9 ou do complexo de 10 ou 11.

O aptâmero ou o complexo da presente invenção pode ser utili- zado como fármacos ou reagentes tais como reagentes para diagnósticos, para várias doenças como doença autoimune, câncer, aderência pós- 20 operatória e endometriose. O aptâmero ou complexo da presente invenção também pode ser utilizado na purificação e concentração de MK, e na detec- ção e quantificação de MK.

Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1A mostra uma das duas estruturas secundárias de RNA mostradas por SEQ ID NO:1 preditas pelo programa MFOLD.

A figura 1B mostra outra estrutura secundária de RNA mostradas por SEQ ID NO:1 preditas pelo programa MFOLD.

A figura 2A mostra uma das duas estruturas secundárias de RNA mostradas por SEQ ID NO:2 preditas pelo programa MFOLD, em que a par- te inclusa em um quadrado mostra uma região de consenso.

A figura 2B mostra a outra estrutura secundária de RNA mostra- da por SEQ ID NO:2 predita pelo programa MFOLD, em que a parte inclusa em um quadrado mostra uma região de consenso.

Afigura 3A mostra uma das duas estruturas secundárias de RNA mostradas por SEQ ID NO:3 preditas pelo programa MFOLD.

A figura 3B mostra outra estrutura secundária de RNA mostrada por SEQ ID NO:3 predita pelo programa MFOLD, em que a parte inclusa em um quadrado mostra uma região de consenso.

A figura 4 mostra a estrutura secundária de RNA mostrada por SEQ ID NO:4 predita pelo programa MFOLD, em que a parte inclusa em um quadrado mostra uma região de consenso.

A figura 5 mostra a estrutura secundária de RNA mostrada por

SEQ ID NO:5 predita pelo programa MFOLD.

A figura 6 mostra interações entre o RNA mostrado pela SEQ ID NO:5 e a midkine, e entre o RNA e IgGI humano (sensograma obtido utili- zando-se BIAcore 2000).

A figura 7 mostra interação entre o RNA mostrado por SEQ ID

NO:4 e a midkine (sensograma obtido utilizando-se BIAcore 2000).

A figura 8 mostra a estrutura secundária de RNA mostrada pela SEQ ID N0:20 predita pelo programa MFOLD.

A figura 9 mostra a estrutura secundária de RNA mostrada pela SEQ ID NO:61 predita pelo programa MFOLD.

Melhor Modalidade da Invenção

A presente invenção proporciona um aptâmero que possui ativi- dade de ligação para midkine (MK). Os aptâmeros da presente invenção são capazes de inibir as atividades de MK.

Um aptâmero refere-se a uma molécula de ácido nucleico que

possui afinidade de ligação para uma molécula alvo particular. O aptâmero pode inibir também a atividade de uma molécula alvo particular ao se ligar com a molécula alvo particular. O aptâmero da presente invenção pode ser um RNA, um DNA, um ácido nucleico modificado ou uma mistura destes. O 30 aptâmero da presente invenção também pode estar na forma linear ou circu- lar.

Uma atividade inibidora contra MK significa inibição de qualquer atividade biológica da MK. Como exemplos das atividades biológicas da MK, atividades de migração para as células (por exemplo, macrófagos, neutrófi- los, eosinófilos, células da musculatura lisa vascular, células de tumor, oste- oblastos, células nervosas e células progenitoras destas) (Takada et al., 5 1997, J. Biochem. 122, 453-458, Horiba et al., 2000, J. Clin. Invest. 105, 489- 495, Maeda et al., 1999, J. Biol. Chem. 274, 12474-12479, Qi et al., 2001, J. Biol. Chem. 276, 15868-15875), atividades de promoção de diferenciação e proliferação de células (por exemplo, células de tumores, fibroblastos, quera- tinócitos, células nervosas, condrócitos e células progenitoras destes) (Mu- 10 ramatsu e Muramatsu1 1991, Biochem. Biophys. Commun. 177, 652-658, Muramtsu et al., 1993, Dev. Biol. 159, 392-402, Takei et al., 2001, Cancer Res. 61, 8486-8491, (atividades inibidoras contra a proliferação e funções das células T, atividades de promoção do alongamento dos neuritos de célu- las nervosas, atividades inibidoras contra apoptose de células (por exemplo, 15 células de tumores, células nervosas), atividades de indução de neovascula- rização de células (por exemplo, células de tumores), atividades de indução da formação de sinapses em mioblastos, atividades de promoção do sistema fibrinolítico para células endoteliais vasculares, atividades de promoção da produção do IL-8 para células da musculatura lisa vascular e similares po- 20 dem ser mencionadas. Portanto, como exemplo de atividades inibidoras con- tra a MK1 atividades inibidoras contra essas atividades podem ser mencio- nadas.

O aptâmero da presente invenção pode possuir atividades inibi- doras contra a MK derivada de quaisquer mamíferos. Como exemplos de 25 tais mamíferos, primatas (por exemplo, humanos, macacos), roedores (por exemplo, camundongos, ratos, porquinhos-da-índia), bem como animais de estimação, animais domesticados e animais de trabalho (por exemplo, ca- chorros, gatos, bovinos, cabras, carneiros, porcos) podem ser mencionados.

Os aptâmeros da presente invenção não são particularmente limitados, já que eles são capazes de se ligarem a uma parte opcionalmente escolhida da MK para inibir a atividade desta; por exemplo, ao se ligarem com o fragmento N-terminal ou o fragmento C-terminal da MK, os aptâmeros da presente invenção são capazes de inibir as atividades da MK. A seqüên- cia de aminoácidos da MK humana é mostrada no GenBank número de a- cesso BC011704, e a proteína secretora com 121 resíduos de aminoácidos da Iisina 23 ao ácido aspártico 143. Geralmente, o resíduo da Iisina 23 é de- 5 notado pelo resíduo de aminoácido na posição 1. A MK humana consiste em um fragmento N-terminal consistindo em resíduos de aminoácidos de 1 a 52, um fragmento C-terminal consistindo nos resíduos de aminoácidos de 62 a 121 e uma região de laço que conecta os fragmentos, mas os limites do fragmento N-terminal e do fragmento C-terminal podem ser qualquer parte 10 de laço da MK (53 a 61) e não podem ser precisamente definidos.

O comprimento do aptâmero da presente invenção não é limita- do e pode ser, normalmente, de cerca de 15 a cerca de 200 nucleotídeos, e pode ser, por exemplo, de não mais do que cerca de 100 nucleotídeos, pre- ferivelmente não mais do que cerca de 80 nucleotídeos, mais preferivelmen- 15 te não mais do que cerca de 60 nucleotídeos, ainda mais preferivelmente não mais do que cerca de 45 nucleotídeos. O comprimento do aptâmero da presente invenção pode ser de, por exemplo, não menos que 18, 20 ou 25 nucleotídeos. Se o número total de nucleotídeos for menor, a produção em massa e a síntese química serão mais fáceis e há uma grande vantagem em 20 termos de custo. Também sabe-se que a modificação química é fácil, a esta- bilidade no corpo é alta e a toxicidade é baixa.

Cada um dos nucleotídeos contidos no aptâmero da presente invenção, se idênticos ou diferentes, podem ser um nucleotídeo compreen- dendo um grupo hidroxila na posição 2' da ribose (por exemplo, a ribose do 25 nucleotídeo de pirimidina) (em outras palavras, um nucleotídeo não substitu- ído) ou um nucleotídeo que possui o grupo hidroxila substituído por um gru- po ou átomo opcionalmente escolhido na posição 2' da ribose. Como exem- plos de tal átomo ou grupo opcionalmente escolhido, um nucleotídeo substi- tuído por um átomo de hidrogênio, um átomo de flúor ou um grupo -O-alquila 30 (por exemplo, grupo -O-Me), um grupo -O-acila (por exemplo, o grupo -O- CHO), ou um grupo amino (por exemplo, o grupo -NH2) podem ser mencio- nados. O aptâmero da presente invenção também pode ser um em que ao menos um tipo (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4 tipos) de nucleotídeo compreende um nucleotídeo que compreende um grupo hidroxila ou o átomo ou grupo opcionalmente escolhido descrito acima, por exemplo, pelo menos dois tipos (por exemplo, 2, 3 ou 4 tipos) de grupos selecionados do grupo que consiste 5 em um átomo de hidrogênio, um átomo de flúor, um grupo hidroxila e um grupo -O-Me na posição 2' da ribose. Nos aptâmeros da presente invenção, todos os nucleotídeos podem ser nucleotídeos que compreendem um grupo hidroxila, ou um grupo ou átomo opcionalmente escolhido descrito acima, por exemplo, um grupo selecionado do grupo que consiste em um átomo de 10 hidrogênio, um átomo de flúor, um grupo hidroxila, ou um grupo -O-Me na posição 2' da ribose.

Um exemplo de um aptâmero da presente invenção pode ter uma estrutura secundária potencial que compreende uma ou mais regiões selecionadas do grupo que consiste em regiões de fita única (por exemplo, gggagaggaac), primeiras regiões tronco (por exemplo, gacg e cadeias com- plementares desta), regiões de laço internas (por exemplo, aggagua e gg), segundas regiões tronco (por exemplo, gcc e regiões complementares des- ta) e regiões de laço internas (por exemplo, ggaaagaa). Um outro exemplo de um aptâmero da presente invenção pode ter uma estrutura secundária potencial que compreende uma ou mais regiões selecionadas dentre o grupo que consiste em regiões de fita única (por exemplo, gggaaggaggaa), primei- ras regiões tronco (por exemplo, gugcac e cadeias complementares desta), regiões de laço internas (por exemplo, ag e gg), segundas regiões tronco (por exemplo, gg e regiões complementares desta) e regiões de laço inter- nas (por exemplo, guuggug).

Como utilizado aqui, “estrutura secundária potencial” refere-se a uma estrutura secundária capaz de ocorrer de maneira estável sob condi- ções fisiológicas; por exemplo, se uma estrutura secundária potencial está presente ou não pode ser determinada através do uso dos programas de 30 predição de estruturas descritas nos exemplos. Uma região tronco refere-se a uma parte em que uma fita dupla é formada por um par de bases em dois ou mais nucleotídeos contínuos (por exemplo, G-C, A-U, A-T). Uma porção de laço interna refere-se a uma região não-tronco formada entre duas regi- ões tronco diferentes. Uma região de laço em forma de grampo de cabelo refere-se a uma estrutura parcial formada por uma região tronco, sendo que uma região de laço é formada no lado oposto à extremidade 5' e à extremi- 5 dade 3' de uma cadeia do aptâmero. Uma região de fita única refere-se à parte terminal de uma cadeia de polinucleotídeo, sendo uma região que não corresponde à região tronco, região de laço interna ou região de laço em forma de grampo de cabelo descritas acima.

Os aptâmeros da presente invenção também podem ter a capa- cidade de se ligar ao fragmento N-terminal e/ou ao fragmento C-terminal da MK. O aptâmero mostrado pela SEQ ID NO:39 e formas alteradas deste, como a heparina e o sulfato de condroitina E, exibem alta atividade de liga- ção ao fragmento C-terminal. Acredita-se que a heparina se liga ao fragmen- to C-terminal nas regiões de aglomeração I e aglomeração II. Acredita-se que o sulfato de condroitina E se liga ao fragmento C-terminal na região de aglomeração I. Sabe-se que a MK interage com ΡΤΡζ, que compreende o sulfato de condroitina como uma de suas moléculas constituintes. ΡΤΡζ é expressa nas células nervosas fetais e células do tipo osteoblasto e na pre- sença da MK a migração destas células é promovida. Na presente invenção, são fornecidos um aptâmero capaz de se ligar ao fragmento C-terminal para inibir a migração celular e um aptâmero que se liga principalmente ao frag- mento C-terminal para inibir a migração celular.

Os aptâmeros da presente invenção são também capazes de inibir as atividades da MK (por exemplo, atividade de migração celular da 25 MK), e podem ter a característica de serem incapazes de inibir a atividade da PTN (por exemplo, atividade de migração celular da PTN). A PTN é a úni- ca família de proteína da MK que possui uma homologia de 50%, elas pos- suem estruturas tridimensionais bastante similares, e os resíduos de amino- ácidos importantes à ligação com o sulfato de condroitina e a heparina são 30 mantidos.

O aptâmero da presente invenção também pode ser (a) um ap- tâmero que compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada de uma de SEQ ID N0:1 a 70 (mas o uracil pode ser timina), (b) um aptâmero que compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada de SEQ ID NO:1 a 70 (mas o uracil pode ser timina) que possui um ou mais nucleotí- deos substituídos, deletados, inseridos ou adicionados, ou (c) um conjugado 5 selecionado de o grupo que consiste em um conjugado de uma pluralidade de unidades de (a) acima, um conjugado de uma pluralidade de unidades de

(b) acima ou um conjugado de uma pluralidade de unidades de (a) e (b) aci- ma. Em (b) acima, o número de nucleotídeos substituídos, deletados, inseri- dos ou adicionados não é particularmente limitado, contanto que sejam mui- 10 tos, e o número de nucleotídeos pode ser, por exemplo, não mais do que cerca de 30, preferivelmente não mais do que cerca de 20, mais preferivel- mente não mais do que cerca de 10, ainda mais preferivelmente não mais do que cerca de 5, e ainda mais preferivelmente 4, 3, 2 ou 1. Em (c) acima, a conjugação pode ser obtida através de ligação tandem. Na conjugação, um 15 Iigante pode ser utilizado. Como ligantes, cadeias de nucleotídeos (por e- xemplo, de 1 a cerca de 20 nucleotídeos) e cadeias que não são de nucleo- tídeos (por exemplo, Iigante -(CH2)n-, Iigante -(CH2CH20)n-, Iigante de he- xaetileno glicol, Iigante TEG, Iigante contendo peptídeos, Iigante contendo ligação S-S, Iigante contendo ligação -CONH-, Iigante contendo ligação - 20 0P03-) podem ser mencionadas. A pluralidade, conforme mencionada na pluralidade de conjugados descritos acima não é particularmente limitada, desde que sejam dois ou mais, e a pluralidade pode ser, por exemplo, 2, 3 ou 4. Cada um dos nucleotídeos em (a) a (c) acima, se idênticos ou diferen- tes, podem ser um nucleotídeo que compreende um grupo hidroxila na posi- 25 ção 2' da ribose ou um nucleotídeo que possui o grupo hidroxila substituído por um grupo selecionado opcionalmente (por exemplo, um átomo de hidro- gênio, átomo de flúor ou um grupo -O-Me) na posição 2' da ribose (por e- xemplo, ribose de nucleotídeo de pirimidina).

Em um aspecto particular, os aptâmeros da presente invenção são classificáveis, grosso modo, em três tipos de acordo com suas estrutu- ras. Um primeiro aptâmero é um aptâmero que consiste na seqüência de nucleotídeos mostrada por SEQ ID NO:61 ou um mutante desta. Um aptâ- mero que consiste na seqüência de nucleotídeos mostrada por SEQ ID NO:61, quando a estrutura secundária deste é predita pelo programa MFOLD, tem a estrutura secundária potencial mostrada na figura 9, sendo configurada com uma primeira região de fita única, uma primeira região tron- 5 co, uma região de laço interna, uma segunda região tronco e uma região de laço em forma de grampo de cabelo. Nesse aptâmero, substituição, deleção, inserção e/ou adição de vários nucleotídeos é aceitável na região de fita úni- ca, primeira região tronco, região de laço interna, segunda região tronco e região de laço em forma de grampo de cabelo. Por exemplo, nesse aptâme- 10 ro, a inserção de diversos nucleotídeos na região de fita única, inserção de vários nucleotídeos na primeira região tronco e adição de vários nucleotí- deos à região de fita única da extremidade 3’ (por exemplo, SEQ ID NO:5) são aceitáveis. Tal aptâmero quase não exibe afinidade para com o fragmen- to N-terminal da MK, e se liga fortemente ao fragmento C-terminal da MK.

Um segundo aptâmero é um aptâmero que consiste na seqüên-

cia de nucleotídeos mostrada pela SEQ ID N0:20 ou mutante desta. Um ap- tâmero que consiste na seqüência de nucleotídeos mostrada pela SEQ ID N0:20, a segunda estrutura predita pelo programa MFOLD tem a segunda estrutura potencial mostrada na Figura 9, sendo configurada com uma região 20 de fita única, uma primeira região tronco, um região de laço interna, uma se- gunda região tronco, e uma região de laço em forma de grampo de cabelo. Nesse aptâmero, substituição, deleção, inserção e/ou adição de vários nu- cleotídeos são aceitáveis na região de fita única, primeira região tronco, re- gião de laço interna, segunda região tronco, e região de laço em forma de 25 grampo de cabelo. Por exemplo, nesse aptâmero, a adição de vários nucleo- tídeos à região de fita única, a primeira região tronco e/ou a extremidade 3’ (por exemplo, SEQ ID NO:4) é aceitável. Tal aptâmero exibe quase nada de afinidade com o fragmento N-terminal da MK e se liga fortemente ao frag- mento C-terminal.

Um terceiro aptâmero pode ser um aptâmero que consiste em

uma seqüência de nucleotídeo mostrada por SEQ ID NO:1 ou um mutante desta. O aptâmero da presente invenção pode ser um em que um resí- duo de açúcar (por exemplo, ribose) de cada nucleotídeo foi modificado de forma a aumentar a atividade de ligação e a estabilidade da MK e a capaci- dade de distribuição do fármaco que contém MK e similares. Como exem- 5 pios dos sítios a serem modificados em um resíduo de açúcar, um que pos- sui o átomo de oxigênio na posição 2', posição 3' e/ou posição 4' do resíduo de açúcar substituído por outro átomo e similares podem ser mencionados. Como exemplos de modificações, fluoração, O-alquilação (por exemplo, O- metilação, O-etilação), O-arilação, S-alquilação (por exemplo, S-metilação, 10 S-etilação), S-arilação e aminação (por exemplo,-NH2) podem ser mencio- nados. Tais alterações no resíduo de açúcar podem ser realizadas por um método conhecido per se (veja, por exemplo, Sproat et al., (1991) Nucle. A- cid. Res. 19, 733-738; Cotton et al., (1991) Nucl. Acid. Res. 19, 2629-2635; Hobbs et al., (1973) Biochemistry 12, 5138-5145).

O aptâmero da presente invenção pode ter também uma base

de ácido nucleico (por exemplo, purina ou pirimidina) alterada (por exemplo, substituição química) para aumentar a atividade de ligação da MK e simila- res. Como exemplos de tais alterações, alteração da pirimidina na posição 5, alteração da purina na posição 6 e/ou 8, alteração com uma amina extrací- 20 clica, substituição com 4-tiouridina e substituição com 5-bromo ou 5-iodo- uracil podem ser mencionadas. O grupo fosfato contido no aptâmero da pre- sente invenção também pode ser alterado para conferir resistência à nuclea- seeà hidrólise. Por exemplo, o grupo P(O)O pode ser substituído por P(O)S (tioato), P(S)S (ditioato), P(O)NR2 (amidato), P(O)R, R(O)OR', CO ou CH2 25 (formacetal) ou 3’-amina (-NH-CH2-CH2-) [em que cada unidade de R ou R' é, independentemente, H ou uma alquila substituída ou não substituída (por exemplo, metila, etila)].

O grupo de junção é, por exemplo, -O-, -N- ou -S-, e os nucleotí- deos podem se ligar a um nucleotídeo adjacente através desses grupos de junção.

As alterações também podem incluir alterações tais quais cape- amento em 3' e 5'. Uma alteração pode também ser realizada através da adição de um polietileno glicol, aminoácido, peptídeo, dT invertido, ácido nucleico, nu- cleosídeos, Miristoíla, Litocólico-olíla, Docosanila, Lauroíla, Estearoíla, Pal- mitoíla, Oleoíla, Linoleoíla, outros lipídios, esteróides, colesterol, cafeína, 5 vitaminas, pigmentos, substâncias fluorescentes, agente anticâncer, toxina, enzimas, substâncias radioativas, biotina e similares. Para tais alterações, vide, por exemplo, as Patentes US 5.660.985 e 5.756.703.

Os aptâmeros da presente invenção podem ser quimicamente sintetizados pelas descrições aqui e por um método conhecido per se no estado da técnica. Um aptâmero se liga a uma substância alvo de vários modos, como ligações iônicas baseadas na carga negativa do grupo fosfato, ligações hidrofóbicas e pontes de hidrogênio baseadas em ribose, e ligações de hidrogênio e ligações de “empilhamento” baseadas em bases de ácido nucleico. Em particular, ligações iônicas baseadas na carga negativa do gru- po fosfato, que estão presentes no mesmo número que o número de nucleo- tídeos constituintes, são fortes e se ligam à Iisina e à arginina presentes na superfície da carga positiva da proteína. Por esse motivo, bases de ácido nucleico que não estão envolvidas na ligação direta à substância alvo podem ser substituídas. Em particular, devido ao fato de essa região de estrutura tronco já ter formado pares de base e tem a face para o interior da estrutura em dupla hélice, bases de ácido nucleico são improváveis de se ligarem di- retamente à substância alvo. Portanto, mesmo quando um par de bases é substituído por outro par de bases, a atividade do aptâmero frequentemente não é reduzida. Em estruturas nas quais pares de bases não são formados, tais como estruturas de laço, desde que a base de ácido nucleico não esteja envolvida na ligação direta à molécula alvo, a substituição de base é possí- vel. Em relação às modificações na posição 2' da ribose, o grupo funcional na posição 2’ da ribose interage, não frequentemente, diretamente com a molécula alvo, mas em muitos casos, não é de relevância e pode ser substi- tuída por outra molécula modificada. Assim, um aptâmero, a menos que o grupo funcional envolvido na ligação direta à molécula alvo seja substituído ou deletado, mantém frequentemente, sua atividade. Também é importante que a estrutura estérica geral não seja muito mudada.

Um aptâmero pode ser preparado através da utilização do méto- do SELEX ou de uma versão aprimorada deste (por exemplo, Ellington et al., (199) Nature, 346, 818-822; Tuerk et al., (1990) Science, 249, 505-510). No método SELEX, através do aumento do número de rodadas ou utilizando-se uma substância competidora, um aptâmero que exibe uma força de ligação mais forte para com a molécula alvo é concentrado e selecionado. Assim, pelo ajuste do número de rodadas do SELEX, e/ou mudando-se a condição de competição, aptâmeros com forças de ligação diferentes, aptâmeros com modos de ligação diferentes, e aptâmeros com a mesma força de ligação e mesmo modo de ligação, porém com seqüências de bases diferentes podem ser obtidos em alguns casos. O método SELEX compreende um processo de amplificação por PCR; por causar uma mutação utilizando íons de man- ganês e similares no processo, é possível realizar o SELEX com uma diver- sidade maior.

Os aptâmeros obtidos por SELEX são ácidos nucleicos que exi- bem maior afinidade para com a substância alvo, e isso não implica na liga- ção destes ao sítio ativo da substância alvo. Portanto, os aptâmeros obtidos por SELEX nem sempre agem sobre uma função da substância alvo. A MK 20 possui uma região rica em Iisina na região de cauda de cada extremidade N e na extremidade C desta, à qual acredita-se que um ácido nucleico se liga de maneira não específica. Não se considera que tal parte da cauda seja importante na ligação da heparina ou do sulfato de condroitina. Não é fácil preparar um aptâmero que inibe eficazmente uma atividade da MK em tal 25 meio. De fato, na presente invenção, as atividades inibidoras de migração celular de 23 tipos de aptâmeros foram examinadas, e somente 4 tipos de aptâmeros retiveram não menos que 50% da atividade.

Os aptâmeros com atividade assim selecionados podem ser fei- tos para terem um desempenho ainda maior através da realização de SE- LEX otimizado. SELEX otimizado refere-se ao método no qual SELEX é rea- lizado novamente após o preparo de um modelo em que um aptâmero com certa seqüência fixa é parcialmente alterado para incluir seqüências aleató- rias, ou um modelo dosado com cerca de 10 a 30% de seqüências aleató- rias.

Um aptâmero obtido por SELEX tem um comprimento de cerca de 80 nucleotídeos, e é de difícil preparação enquanto fármaco. Assim, é necessário que se repitam os esforços de tentativa-e-erro para encurtar o aptâmero a um comprimento de cerca de 50 nucleotídeos ou menos para permitir uma síntese química fácil.

Dependendo do desenho de iniciadores de um aptâmero obtido por SELEX, a facilidade da operação de minimização subsequente muda. A menos que o iniciador seja projetado com sucesso, o desenvolvimento sub- sequente será impossível ainda que um aptâmero com atividade seja sele- cionado por SELEX.

Aptâmeros são facilmente alteráveis porque permitem a síntese química. Para aptâmeros, através da predição da estrutura secundária utili- 15 zando-se o programa MFOLD, ou através da predição da estrutura estérica utilizando-se a análise de raio X ou análise RMN, é possível prever, até certo ponto, qual nucleotídeo pode ser substituído ou deletado, e onde inserir um novo nucleotídeo. Um aptâmero com a nova seqüência predita pode ser fácil e quimicamente sintetizado, e pode ser determinado se o aptâmero retém a 20 atividade utilizando-se um sistema de ensaio existente.

Se uma região importante para a ligação do aptâmero obtido com a substância alvo é identificada por repetidos esforços tipo tentativa-e- erro conforme descrição acima, a atividade permanece não modificada em muitos casos mesmo quando a nova seqüência é adicionada a ambas às 25 extremidades da seqüência. O comprimento da nova seqüência não é parti- cularmente limitado.

Modificações, como em seqüências, rendem uma larga faixa de projetos ou alterações.

Conforme dito acima, aptâmeros permitem uma ampla faixa de projeto ou alterações. A presente invenção também proporciona um método de produção de aptâmero que capacita uma ampla faixa de projeto ou alte- rações em um aptâmero que compreende uma seqüência específica (por exemplo, uma seqüência que corresponde a uma parte selecionada de regi- ões tronco, regiões de laço internas, regiões de laço em forma de grampo de cabelo e regiões de fita única: daqui em diante, referida por seqüência fixa, conforme exigido).

5 Por exemplo, o método para a produção de tal aptâmero inclui a

produção de um aptâmero que compreende uma seqüência fixa através da utilização de um único tipo de molécula de ácido nucleico (por exemplo, uma biblioteca de moléculas de ácido nucleico com números diferentes para “a” ou “b”) que consiste em uma seqüência de nucleotídeos mostrada pela fór- mula:

Seqüência de iniciadores (i) - (N)a-sequência fixa- (N)b- Seqüência de inici- adores (ii)

em que (N)a representa uma cadeia de nucleotídeo que consiste em “a” unidades de N; (N)b representa uma cadeia de nucleotídeos que 15 consiste em “b” unidades de N; cada uma das unidades de N, se idênticas ou diferentes, é um nucleotídeo selecionado de o grupo que consiste em A, G, C, U e T (preferivelmente, A, G, C e U). Cada um de “a” e “b”, se idênticos ou diferentes, pode ser um número opcionalmente escolhido e pode ser, por exemplo, de 1 a cerca de 100, preferivelmente de 1 a cerca de 50, mais pre- 20 ferivelmente de 1 a cerca de 30, ainda mais preferivelmente de 1 a cerca de 20 ou de 1 a cerca de 10, e pares de iniciadores correspondentes às se- qüências de iniciadores (i) e (ii), respectivamente.

A presente invenção proporciona também um complexo que compreende o aptâmero da presente invenção e uma substância funcional 25 ligada a ele. A ligação entre o aptâmero e a substância funcional no comple- xo da presente invenção pode ser uma ligação covalente ou uma ligação não covalente. O complexo da presente invenção pode ser um em que o aptâmero da presente invenção e um ou mais (por exemplo, 2 ou 3) de subs- tâncias funcionais do mesmo tipo ou de tipos diferentes são ligados juntos. A 30 substância funcional não é particularmente limitada, desde que confira uma nova função específica a um aptâmero da presente invenção, ou seja, capaz de alterar (por exemplo, melhorar) certa característica que um aptâmero da presente invenção pode possuir. Como exemplos de substâncias funcionais, proteínas, peptídeos, aminoácidos, lipídios, açúcares, monossacarídeos, polinucleotídeos e nucleotídeos podem ser mencionados. Como exemplos da substância funcional, substâncias de afinidade (por exemplo, biotina, es- treptavídina, polinucleotídeos que possuem afinidade para com a seqüência complementar alvo, anticorpos, Sepharose glutationa, histidina), substâncias para a marcação (por exemplo, substâncias fluorescentes, substâncias Iumi- nescentes, radioisótopos), enzimas (por exemplo, peroxidase de raiz forte, fosfatase alcalina), veículos para distribuição de fármacos (por exemplo, Ii- possomo, microesferas, peptídeos, polietileno glicóis), fármacos (por exem- plo, aqueles utilizados em terapia com míssil tais como caliqueamicina e du- ocarmicina; análogos da mostarda nitrogenada tais como a ciclofosfamida, melfalano, ifosfamida ou trofosfamida; etileniminas tais como a tiotepa; nitro- soureias tal como a carmustina; agentes alquilantes como a temozolamida ou dacarbazina; antagonistas metabólicos do tipo folato, tal como o metotre- xato ou raltitrexedo; análogos da purina tal como a tioguanina, cladribina ou fludarabina; análogos da pirimidina como o fluouracil, tegafur ou gencitabina; alcalóides da vinca tal como a vimblastina, vincristina ou vinorrelbina e aná- logos destes; derivados de podofilotoxina tal como o etoposídeo, taxanos, docetaxel ou paclitaxel; antraciclinas tais como a doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina e mitoxantrona e análogos destes; outros antibióticos citotóxicos tais como a bleomicina e mitomicina; compostos de platina tais como a cis- platina, carboplatina e oxaliplatina; pentostatina, miltefosina, estramustina, topotecano, irinotecano e bicalutamida) e toxinas (por exemplo, toxina do rícino, Iiatoxina e toxina Vero) podem ser mencionados. Essas moléculas funcionais são finalmente removidas em alguns casos. Ademais, as molécu- las podem ser peptídeos que podem ser reconhecidos e decompostos por enzimas como a trombina, protease de metal matriz (MMP) e Fator X, poli- nucleotídeos que podem ser decompostos por nucleases ou endonucleases de restrição.

O aptâmero ou o complexo da presente invenção pode ser usa- do, por exemplo, como um fármaco ou um reagente (por exemplo, reagentes diagnósticos, reagentes de teste (incluindo-se reagentes experimentais)). Por exemplo, os aptâmeros ou o complexo da presente invenção podem ser utilizados como inibidores de migração celular, promotores da proliferação das células T reguladoras, promotores da função supressora das células T 5 reguladoras, supressores de inibição da apoptose, inibidores da proliferação celular, inibidores de diferenciação celular, agentes para a diatribuição de fármacos, sondas para filmagens in vivo, sondas para a medição de concen- trações de MK no sangue, sondas para colorir tecidos, sondas para ELISA, e Iigantes para a separação e purificação de MK.

Os aptâmeros ou o complexo da presente invenção podem tam-

bém ser utilizados na prevenção ou tratamento de diversas doenças como doenças autoimunes (por exemplo, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico (SL)1 doença de Sjogren1 polimiosite (PM), dermatomiosite (DM)1 artrite reumática (artrite reumatóide (RA), osteoartrite (OA)), enterite inflama- 15 tória (doença de Crohn e similares), esclerose sistêmica progressiva (PSS), periarterite nodosa (PN), doenças da tireóide (doença de Basedow e simila- res), síndrome de Guillain-Barré, cirrose biliar primária (PBC)1 púrpura trom- bocitopênica idiopática, anemia hemolítica autoimune, miastenia grave (MG), esclerose lateral amiotrófica (ALS), diabetes do tipo I1 psoríase, asma, anor- 20 malidades funcionais dos neutrófilos), cânceres (por exemplo, câncer do e- sôfago, câncer da tireóide, câncer da bexiga, câncer colorretal, câncer gás- trico, câncer pancreático, câncer do peito, câncer do fígado, câncer do pul- mão, câncer da mama, glioblastoma, câncer do útero, câncer do ovário e tumor de Wilms, câncer da próstata), aderência de pós-operatório, endome- 25 triose, rejeições em transplantes, alergias, reestenose seguinte à cirurgia de reconstrução vascular, doença obstrutiva vascular arterial coronária cardía- ca, doença obstrutiva vascular cerebral, doença obstrutiva vascular renal, doença obstrutiva vascular periférica, arteriosclerose e infarto cerebral. Em particular, os aptâmeros da presente invenção inibem a atividade de migra- 30 ção celular da MK e são, portanto, úteis na prevenção ou tratamento da es- clerose múltipla, adesão de pós-operatório, endometriose, artrite reumatóide e estenose vascular. O fármaco da presente invenção pode ser um formulado com um veículo farmaceuticamente aceitável. Como exemplos do veículo farmaceuti- camente aceitável, excipientes tais como açúcar, amido, manitol, sorbitol, lactose, glicose, celulose, talco, fosfato de cálcio e carbonato de cálcio; Ii- 5 gantes tais como a celulose, metilcelulose, hidroxipropilcelulose, polipropil- pirrolidona, gelatina, goma arábica, polietileno glicol, sacarose e amido; de- sintegradores tais como o amido, carboximetilcelulose, hidroxipropilamido, glicolamido sódico, bícarbonato de sódio, fosfato de cálcio e citrato de cálcio; lubrificantes como o estearato de magnésio, Aerosil, talco e Iauril sulfato de 10 sódio; agentes aromatizantes tais como o ácido cítrico, mentol, sal de glicirri- zina-amônio, glicina e pó de laranja; conservantes tais como o benzoato de sódio, sulfito de hidrogênio de sódio, metilparabeno e propilparabeno; estabi- Iizantes tais como o ácido cítrico, citrato de sódio e ácido acético; agentes de suspensão tais como a metilcelulose, polivinilpirrolidona e o estearato de 15 alumínio; agentes dispersantes como tensoativos; diluentes tais como água, soro fisiológico e suco de laranja; ceras de base como a manteiga de cacau, polietileno glicol e querosene; e similares podem ser mencionados, mas tais não são limitativos.

Preparações adequadas para administração oral incluem uma 20 preparação líquida preparada pela dissolução de uma quantidade eficaz de um Iigante em um diluente como a água, soro fisiológico ou suco de laranja; cápsulas, sachês e comprimidos compreendendo uma quantidade eficaz do Iigante na forma sólida ou granular; uma suspensão preparada pela suspen- são de uma quantidade eficaz de um ingrediente ativo em um dispersante 25 adequado; uma emulsão preparada por dispersão e emulsificação de uma solução de uma quantidade eficaz de um ingrediente ativo em um dispersan- te apropriado e similar.

O fármaco da presente invenção pode ser revestido por um mé- todo conhecido per se para objetivos de mascaramento de sabor, dissolução entérica, liberação constante e similar, conforme necessário. Como exem- plos de agentes de revestimento utilizados no revestimento, hidroxipropilme- tilcelulose, etilcelulose, hidroximetilcelulose, hidroxipropilcelulose, polioxieti- Ieno glicol, Tween 80, Pluronic F68, ftalato de acetato de celulose, ftalato de hidroxipropilmetilcelulose, etilcelulose, succinato de acetato de hidroximetil- celulose, Eudragit (fabricado por Rohm, Alemanha, copolímero de ácido me- tacrílico/ácido acrílico), pigmentos (por exemplo, óxido de ferro vermelho, 5 dióxido de titânio e similares) e similares são utilizados. Como exemplos de materiais de base para liberação rápida, lipossomo, aterocolágeno, gelatina, hidroxiapatita, PLGAe similares podem ser mencionados.

Como preparações adequadas para administração parenteral (por exemplo, administração intravenosa, administração subcutânea, admi- nistração intramuscular, administração tópica, administração intranasal, ad- ministração pulmonar e similar), líquidos injetáveis estéreis isotônicos não aquosos e aquosos estão disponíveis, os quais podem compreender um an- tioxidante, uma solução tampão, um agente bacteriostático, um agente iso- tonizador e similares. Suspensões aquosas e não aquosas estéreis também podem ser mencionadas, as quais podem compreender um agente de sus- pensão, um solubilizador, um espessante, um estabilizador, um antisséptico e similares. A preparação pode ser incluída em um recipiente como uma am- pola ou um frasco em volume de dose unitária ou em várias doses divididas. Um ingrediente ativo e um veículo farmaceuticamente aceitável podem tam- bém ser Iiofilizados e armazenados em um estado que podem ser dissolvi- dos ou suspensos em um veículo estéril apropriado até logo antes do uso. Ademais, além de líquidos injetáveis, inaladores e pomadas também são possíveis. No caso de um inalador, um ingrediente ativo em um estado Iiofili- zado é micronizado e administrado por inalação utilizando-se um dispositivo inalador apropriado. Um inalador pode ser formulado conforme apropriado com um tensoativo, óleo, tempero, ciclodextrina ou derivados destes ou simi- lares comumente utilizados conforme necessário.

Aqui, como exemplos do tensoativo, ácido oléico, lecitina, diolea- to de dietilenoglicol, dioleato de tetraidrofufurila, oleato de etila, miristato de isopropilíco, trioleato de glicerila, monolaureato de glicerila, monoestereato de glicerila, monoleato de glicerila, monolisinoato de glicerila, álcool cetílico, álcool estearílico, polietileno glicol 400, cloreto de cetilpiridínio, trioleato de 1 sorbitano (marca registrada Span 85), monoleato de sorbitan (marca regis- trada Span 80), monolaureato de sorbitano (marca registrada Span 20), óleo de rícino endurecido com polioxietileno (marca registrada HCO-60), mono- Iaurato de sorbitano (20) polioxietileno (marca registrada Tween 20), mono- 5 Ieato de sorbitano (20) polioxietileno (marca registrada Tween 80), Iecitina de de fontes de origem natural (marca registrada EPICLON), éter oleilpolioxieti- lênico (2) (marca registrada Brij 92), éter (2) estearil polioxietilênico (marca registrada brij 72), Iauril éter de polioxietilênico (4) (marca registrada Brij 30), éter (2) oleilpolioxietilênico (marca registrada Genapol 0-020), copolímero 10 em bloco de oxietileno e oxipropileno (marca registrada Synperonic) e simila- res podem ser mencionados. Como exemplos do óleo, podem ser mencio- nados óleo de milho, óleo de oliva, óleo de semente de algodão, óleo de gi- rassol e similares. No caso de uma pomada, uma base farmaceuticamente aceitável apropriada (parafina amarela, parafina branca, parafina, plastibase, 15 silicone, pomada branca, cera de abelha, banha, óleos vegetais, pomada hidrofílica, parafina hidrofílica, Ianolina purificada, Ianolina hidrolisada, po- mada absorvedora de água, plastibase hidrofílica, pomada macrogol e simi- lares) é misturada com um ingrediente ativo e utilizada como uma prepara- ção.

Um inalador pode ser produzido de acordo com um método con-

vencional. Especificamente, um inalador pode ser produzido por pulveriza- ção ou liquefação do aptâmero ou do complexo da presente invenção acima descrito, mistura com um veículo ou propelente de inalação apropriado e preenchimento em um vaso de inalação apropriado. Quando o aptâmero ou 25 complexo da presente invenção acima descrito é um pó, um inalador de pó mecânico comum pode ser utilizado; caso seja um líquido, um inalador tal qual um nebulizador pode ser utilizado. Aqui, como propelente, um conven- cionalmente conhecido pode ser amplamente utilizado; podem ser mencio- nados compostos da série do clorofluorcarboneto tais como o clorofluorcar- 30 boneto 11, clorofluorcarboneto 12, clorofluorcarboneto 21, clorofluorcarbone- to 22, clorofluorcarboneto 113, clorofluorcarboneto 114, clorofluorcarboneto 123, clorofluorcarboneto 142c, clorofluorcarboneto 134a, clorofluorcarboneto 227, clorofluorcarboneto 318 e 1,1,1,2-tetrafluoretano, hidrocarbonetos como o propano, isobutano e n-butano, éteres como o éter dietílico, gases com- primidos tais como nitrogênio gasoso e dióxido de carbono gasoso e simila- res.

5 A dosagem do fármaco da presente invenção varia dependendo

do tipo e da atividade do ingrediente ativo, gravidade da doença, espécie do animal que está se submetendo á administração, tolerabilidade ao fármaco do animal que está se submetendo à administração, peso corporal, idade e similares, e a dose habitual, baseada na quantidade de ingrediente ativo por 10 dia para um adulto, pode ser de cerca de 0,0001 a cerca de 100 mg/kg, por exemplo, cerca de 0,0001 a cerca de 10 mg;kg, preferivelmente de cerca de

0,005 a cerca de 1 mg/kg.

A presente invenção também proporciona um veículo de fase sólida contendo o aptâmero e/ou o complexo da presente invenção imobili- zado lá. Como exemplos do veículo de fase sólida, um substrato, uma resi- na, uma chapa (por exemplo, uma placa de multiplacas), um filtro, um cartu- cho, uma coluna e um material poroso podem ser mencionados. O substrato pode ser um utilizado em chips de DNA, chips de proteínas e similares; por exemplo, substratos de níquel-PTFE (politetrafluoretileno), substratos de vi- dro, substratos de apatita, substratos de silício, substratos de alumínio e si- milares, e substratos preparados a partir do revestimento desses substratos com um polímero e similares podem ser mencionados. Como exemplos da resina, partículas de agarose, partículas de sílica, um copolímero de acrila- mida e Ν,Ν'-metileno-bis-acrilamida, partículas de divinil-benzeno reticulado com poliestireno, partículas de dextrana ligadas com epicloridrina, fibra de celulose, polímeros reticulados de arildextrana e N,N'-metilenobisacrilamida, polímeros sintéticos monodispersos, polímeros hidrofílicos monodispersos, Sepharose, Toyopearl e similares podem ser mencionados, assim como re- sinas preparadas pela ligação de vários grupos funcionais a essas resinas foram incluídas. O veículo de fase sólida da presente invenção pode ser útil na purificação, detecção e quantificação da MK, por exemplo.

O aptâmero e/ou o complexo da presente invenção podem ser imobilizados em um veículo de fase sólida por um método conhecido per se. Por exemplo, um método que introduz uma substância de afinidade (por e- xemplo, aquelas descritas acima) ou um grupo funcional predeterminado no aptâmero e/ou no complexo da presente invenção, e então imobiliza-se o ap- 5 tâmero e/ou o complexo em um veículo de fase sólida via a substância de afi- nidade ou grupo funcional predeterminado pode ser mencionado. A presente invenção também proporciona tais métodos. O grupo funcional predetermina- do pode ser um grupo funcional que pode ser submetido a uma reação de acoplamento; por exemplo, um grupo amino, um grupo tiol, um grupo hidroxila 10 e um grupo carboxila podem ser mencionados. A presente invenção também proporciona um aptâmero que possui tal grupo funcional introduzido nele.

A presente invenção também proporciona um método para puri- ficar e concentrar a MK. O método de purificação e concentração da presen- te invenção pode compreender adsorver a MK ao veículo de fase sólida da 15 presente invenção, e eluir a MK adsorvida com um eluente. A adsorção da MK ao veículo de fase sólida da presente invenção pode ser realizada atra- vés de um método conhecido per se. Por exemplo, uma amostra contendo MK (por exemplo, cultura de bactérias ou de células, sobrenadante de cultu- ra, sangue) é introduzida no veículo de fase sólida da presente invenção ou 20 em uma composição contendo tal. A eluição da MK pode ser realizada utili- zando-se um eluente tal qual uma solução neutra. O eluente neutro não é particularmente limitado, e pode possuir um pH de, por exemplo, cerca de 6 a cerca de 9, preferivelmente de cerca de 6,5 a cerca de 8,5, e mais preferi- velmente de cerca de 7 a cerca de 8. A solução também pode ser uma com- 25 preendendo, por exemplo, um sal de potássio (por exemplo, NaCI, KCI), um sal de magnésio (por exemplo, MgCI2), um tensoativo (por exemplo, Tween 20, Triton, NP40), ou glicerina. O método para purificação e concentração da presente invenção também pode compreender lavar o veículo de fase sólida utilizando uma solução de lavagem após a adsorção da MK. Como exemplos 30 das soluções de lavagem, aquelas contendo ureia, um agente quelante (por exemplo, EDTA), Tris, um ácido, ou um álcali e similares podem ser mencio- nados. O método para a purificação e concentração da presente invenção pode também compreender aquecer o veículo de fase sólida. Essa etapa possibilita a regeneração e esterilização do veículo de fase sólida.

A presente invenção também fornece um método para detectar e quantificar a MK. O método para detectar e quantificar a presente invenção pode compreender medir a MK através da utilização do aptâmero da presen- te invenção (por exemplo, pelo uso do complexo e do veículo de fase sólida da presente invenção). O método para detectar e quantificar a MK pode ser realizado da mesma maneira que um método imunológico, exceto pelo fato de que um aptâmero da presente invenção é colocado no lugar de um anti- corpo. Portanto, através do uso do aptâmero da presente invenção no lugar de um anticorpo, da mesma forma que métodos tais quais o imunoensaio de enzima (EIA) (por exemplo, ELlSAcompetitivo direto, ELlSAcompetitivo indi- reto, ELISA sanduíche), radioimunoensaio (RIA), imunoensaio fluorescente (FIA), técnica de Western blot (por exemplo, uso como substituto para o an- ticorpo secundário de tal técnica), método de coloração imunoistoquímica e método de seleção celular, a detecção e quantificação pode ser realizada. Tais métodos podem ser úteis, por exemplo, na medição do teor de MK em uma amostra biológica ou organismo vivo e no diagnóstico de doenças rela- cionadas à MK.

As descrições de todas as publicações mencionadas aqui, inclu- indo patentes e relatórios descritivos de patentes, são incorporadas a título de referência na presente invenção de modo que todos eles foram citados expressamente.

A presente invenção é daqui por diante descrita em mais deta- lhes por meio dos exemplos que se seguem, que entretanto não limitam o escopo da invenção Exemplo 1

Preparação de ácidos nucleicos que se ligam especificamente à

midkine.

Ácidos nucleicos que se ligam especificamente à midkine foram preparados utilizando-se o método SELEX. SELEX foi realizado com aper- feiçoamentos do método de Ellington et al. (Ellington e Szostak, Nature 346, < 818-822, 1990) e do método de Tuerk et al. (Tuerk e Gold, Science 249, 505- 510, 1990). Como substância alvo, midkine humana foi preparada utilizando- se levedura com referência ao método de Murasagi et al. (Murasagi e Toh- ma-Aiba, Protein Expression and Purification 27, 244-252, 2003). Daqui por 5 diante, a não ser que seja indicado o contrário, midkine significa midkine humana. A mdikine foi imobilizada em uma resina de agarose (NHS- Sepharose, fabricada por Amersham Bioscience) por aminoacoplamento. O aminoacoplamento foi realizado conforme está indicado nas especificações da Amersham Bioscience. A quantidade imobilizada foi confirmada através 10 do exame da solução de midkine logo antes da imobilização e o sobrenadan- te logo depois da imobilização por SDS-PAGE. Como resultado do SDS- PAGE, nenhuma banda de midkine foi detectada no sobrenadante; foi con- firmado que quase toda a midkine utilizada foi acoplada. Isso significa que cerca de 175 pg de midkine foi imobilizado para cerca de 70 pLda resina.

15 O RNA utilizado na primeira rodada (40N-RNA) foi obtido pela

transcrição de um DNA sintetizado quimicamente utilizando-se Kit de Trans- crição DuraScribe® T7 (fabricado pela Epicentre). O RNA obtido por esse método tem a posição 2' da ribose do nucleotídeo de pirimidina flúor- substituído. O DNA de 94 nucleotídeos de comprimento mostrado abaixo, 20 possuindo uma seqüência de iniciadores em cada extremidade de uma se- qüência aleatória de 40 nucleotídeos foi utilizado como modelo de DNA. O modelo de DNA e os iniciadores foram preparados por síntese química (fa- bricada por Operon).

Modelo de DNA: 5’-tcctcattcctgtcctcta-40N-ttcctcttctcctctccc-3’ (SEQ ID 25 NO:71)

Iniciador de Avanço: 5’-taatacgactcactatagggagaggagaagaggaa-3’ (SEQ ID NO:72)

Iniciador Reverso: 5’-tcctcattcctgtcctcta-3’ (SEQ ID NO:73)

N representa qualquer um de A, G, C e T. O iniciador de avanço 30 compreende uma seqüência promotora de polimerase de RNA T7. A varia- ção do conjunto de RNA utilizado na primeira rodada foi de, teoricamente, 1014. A reunião de RNAfoi adicionada à resina com midkine imobiliza- da, e deixada em repouso à temperatura ambiente por 30 minutos. Após 30 minutos, para que o RNA não ligado à midkine fosse removido, a resina foi lavada com uma solução A. Aqui, a solução A era uma solução mista de so- 5 lução 145 mM de cloreto de cálcio, 5,4mM de cloreto de potássio, 0,8 mM de cloreto de magnésio e 20 mM de Tris (pH 7,6). O RNA ligado à midkine foi recuperado através do aquecimento a 95°C por 10 minutos com a adição de um eluente. Como eluente, foi usada uma solução mista de 7M de ureia, 3 mM de EDTAe 100 mM de Tris, ajustada para um pH de 6,6. O RNA recupe- 10 rado foi amplificado por RT-PCR e transcrito utilizando Kit de Transcrição DuraScribe T7, e isto foi utilizado como a reunião para a rodada seguinte. Sendo esse procedimento considerado como uma rodada, a mesma opera- ção foi realizada em 7 rodadas. Após a conclusão do SELEX, o produto do PCR foi clonado em um vetor pGEM-T Easy (fabricado por Promega) e as 15 cepas de Escherichia coli DH5a (fabricado por Toyobo) foram transformada com ele. Depois que o plasmídeo foi extraído de uma única colônia, as se- qüências base de 48 clones foram determinadas utilizando-se um sequenci- adorde DNA (ABI PRISM 3100, fabricado por ABI).

Depois que o SELEX foi realizado em 7 rodadas, as seqüências foram examinadas; as seqüências exibiram convergência. Vinte cópias da seqüência mostrada em SEQ ID NO:1 existiram, e uma cópia da forma subs- tituída com 2 bases existiu. Duas cópias da seqüência mostrada em SEQ ID NO:2 existiram. Uma cópia de cada uma das seqüências mostradas em SEQ ID NO:3 a 5 existiram. As estruturas secundárias das RNAs mostradas em SEQ ID NO:1 a 5 foram estimadas utilizando-se o programa MFOLD (M. Zu- ker, NucIeicAcid Res. 31 (13), 3406-3415, 2003). Consequentemente, estru- turas internas de reunião-tronco-laço em forma de grampo de cabelo morfo- Iogicamente similares aos RNAs mostrados em SEQ ID NO:2, 3 e 4 foram vistas (Figuras. 1 a 5). Todos os laços em forma do grampo de cabelo eram constituídos por 8 nucleotídeos; 2 e 3 eram formas substituídas de uma base

1 comparadas com SEQ ID NO:4. Com relação aos troncos, SEQ ID NO:2 foi configurada com dois pares de base, e SEQ ID NO:3 e 4 foram configu- radas com três pares de base.

Cada seqüência de nucleotídeos é mostrada a seguir. Os parên- teses em cada nucleotídeo mostram modificações na posição 2' e F é o á- tomo de flúor (o mesmo, daqui em diante).

SEQ ID NO:1:

gggagaggagaagaggaa-

au(F)agu(F)u(F)aagggu(F)gaau(F)u(F)u(F)gc(F)gaaagc(F)u(F)au(F)u(F)u(F)

u(F)agu(F)c(F)gc(F)agu(F)agaggac(F)aggaau(F)gagga

SEQ ID NO:2:

gggagaggagaagaggaag-

gac(F)u(F)aagu(F)aagagaac(F)ac(F)c(F)ggaau(F)gaagggac(F)u(F)u(F)ac(F) gu(F)gu(F)agaggac(F)aggaau(F)gagga SEQ ID NO:3: gggagaggagaagaggaa- 15 agc(F)c(F)u(F)u(F)c(F)u(F)ac(F)c(F)gaaagu(F)gggaaagc(F)ac(F)ac(F)au(F)a aau(F)c(F)u(F)ggu(F)agaggac(F)aggaau(F)gaga SEQ ID NO:4: gggagaggagaagagga-

ac(F)gu(F)gc(F)u(F)c(F)u(F)gu(F)ac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F )ggu(F)gu(F)gu(F)agaggac(F)aggaau(F)gaga SEQ ID NO:5: gggagaggagaagaggaa-

gu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F)a gu(F)au(F)aagau(F)agaggac(F)aggaau(F)gaga [0068]

seqüência de laço em forma de grampo de cabelo SEQ ID NO:2 -ggaaugaa- SEQ ID NO:3 -ggaaagca- SEQ ID NO:4 -ggaaagaa- Exemplo 2

Preparação de ácidos nucleicos que se ligam especificamente à

midkine 2 Para preparar os aptâmeros que se ligam à midkine, mas não se ligam à pleiotrofina, uma proteína da família da midkine, SELEX incluindo pré-subtração utilizando pleiotrofina foi realizado. Primeiramente, como com a midkine, a pleiotrofina foi imobilizada em uma resina de agarose por ami- 5 noacoplamento. A seguir, a reunião de RNA foi adicionada à resina ligada à pleiotrofina e deixada em repouso à temperatura ambiente por 30 minutos. Depois disso, esse sobrnadante foi recuperado. Em teoria, esse sobrena- dante não deveria conter um RNA que se ligasse à pleiotrofina. Esse sobre- nadante foi adicionado à resina ligada à midkine e SELEX foi realizado da 10 mesma maneira que no Exemplo 1. A pleiotrofina utilizada havia sido ex- pressa em levedura conforme o método de Murasugi et al. (Murasugi, Kido, Kumai, and Asami, Biosci. Biotech. Biochem. 67 (10), 2288-2290, 2003). O modelo de DNA e iniciadores usados foram os mesmos que os do Exemplo

1.

Após a conclusão de 7 rodadas, as seqüências de 48 clones fo-

ram checadas; foi observada convergência nas seqüências. Entre elas, dez cópias da mesma seqüência que SEQ ID NO:3 obtida no exemplo 1 existi- ram, e uma cópia da forma substituída na base-1 existia. Seis cópias da mesma seqüência que SEQ ID NO:2 existiam, e duas cópias da forma subs- 20 tituída na base 1 existiram. Além disso, uma cópia da mesma seqüência que SEQ ID NO:5 existiu.

Exemplo 3

Preparação de ácidos nucleicos que se ligam especificamente à

midkine.

Quando a midkine é imobilizada por aminoacoplamento, porções

importantes podem colapsar dependendo do sítio do aminoacoplamento. Assim, SELEX de ligação de filtro utilizando uma membrana de nitrocelulose, o qual não envolve imobilização em um veículo foi realizado. A intenção é separar ácidos nucleicos que se ligam á proteína alvo de ácidos que não se 30 ligam, baseado no fato de que é provável que proteínas se liguem a mem- branas de nitrocelulose, enquanto não é provável que ácidos nucleicos se liguem. Uma reunião de RNA e a midkine foram misturadas e deixadas em repouso por 30 minutos à temperatura ambiente, e então a mistura foi filtra- da utilizando-se a membrana de nitrocelulose. Depois que a membrana de nitrocelulose foi cuidadosamente lavada com a solução A, a membrana de nitrocelulose foi imersa em eluente B e aquecida a 90°C por 5 minutos. A 5 seguir, da mesma forma que no Exemplo 1, o RNA foi recuperado por preci- pitação em etanol, amplificado por RT-PCR e transcrito à reunião de RNA para a próxima rodada. O modelo de DNA e iniciadores utilizados foram os mesmos que os do Exemplo 1. O eluente B é um líquido misturado de 50% de fenol e 6M de ureia.

Após a conclusão das 6 rodadas, as seqüências de 48 clones

foram checadas; não se obteve convergência suficiente. Assim, SELEX foi realizado por mais três rodadas; após a conclusão de nove rodadas, as se- qüências de 48 clones foram checadas; foi observada convergência suficien- te. Entre elas, 21 cópias da mesma seqüência que SEQ ID NO:2 existiam, e 15 quatro cópias da forma substituída de uma base 1 existiam. Dez cópias da mesma seqüência que SEQ ID NO:4 existiam. Três novas seqüências foram descobertas, nenhuma das quais exibiu convergência.

Exemplo 4

Avaliação da atividade de ligação pelo método da ressonância plasmática de superfície

As atividades de ligação dos RNAs mostradas em SEQ ID NO:1 a 5 para a midkine foram examinadas pelo método de ressonância de plas- mônio de superfície. As medições foram realizadas utilizando-se BIAco- re2000, fabricado por BIAcore. O chip sensor utilizado foi o chip SA, que 25 possui estreptavidina imobilizada. Ligado a ele estava cerca de 1.000 RU de um Poly dT nucleotídeo 16 com biotina ligada à extremidade 5’ deste. O RNA era o Iigante e possuía um PoIyAde 16 nucleotídeos adicionado à extremi- dade 3’ e imobilizado junto ao chip SA via uma ligação entre dT e A. A quan- tidade imobilizada foi de cerca de 1.000 RU. 70 pL de midkine para analito, 30 preparado a 0,5 μΜ, foi injetado. O tampão de corrida utilizado para BIAcore foi a solução A. Como resultado das medições, descobriu-se que todos os RNAs mostrados por SEQ ID NO:1 a 5 ligaram-se à midkine (figura 6). Para controle negativo, uma medição similar foi realizada com 40N-RNA, que compreendia uma seqüência aleatória de 40 nucleotídeos, imobilizada. Co- mo resultado, descobriu-se que o 40N-RNA também possuía afinidade para com a midkine. O grau era alto a níveis similares para a afinidade dos RNAs 5 mostrados em SEQ ID NO:1 a 5. Já que a midkine contém grandes quanti- dades de aminoácidos básicos como a lisina, espera-se que se ligue de ma- neira não específica a ácidos nucleicos carregados negativamente.

Assim, uma medição foi realizada utilizando como o tampão de corrida para o BIAcore um tampão com uma alta concentração de sal (solu- 10 ção B) preparado mudando-se a concentração de cloreto de sódio da solu- ção A para 500 nM. Foi antecipado que através do uso de um tampão com uma alta concentração de sal, adsorção não específica de ligação iônica po- dia ser reduzida. Como resultado da medição, descobriu-se que o 40N-RNA quase não se liga à midkine. Por outro lado, os RNAs mostrados nas SEQ ID 15 NO:2 a 5 se ligam à midkine em níveis mais altos que os de 40N-RNA (figura 7). O fato da ligação na alta concentração significa que a ligação provavel- mente é uma ligação hidrofóbica. Isto sugere que esses RNAs podem não se ligar de maneira não específica à parte da lisina, mas especificamente reconhecer a midkine.

A seguir, um experimento foi realizado em que a midkine foi imo-

bilizada junto ao chip sensor CM4 por aminoacoplamento, e o RNA mostrado em SEQ ID NO:4 ou 5, como analito, foi injetado, por onde a afinidade do RNA e midkine foi analisada. A imobilização da midkine foi realizada utilizan- do-se N-hidróxi-sucinamida (NHS, 11 mg/L) e cloridrato de N-etil-N'-(3- 25 dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC, 75 mg/L) pelas especificações de BI- Acore, a midkine foi diluída com o tampão HBS-EP (fabricado por BIAcore) e usado em uma concentração de 20 pg/L. Para o bloqueio, 1M de cloridrato de etanolamina (pH 8,5) foi utilizado. MK (1-59, MK-N, fabricado por Peptide Institute, Inc.) foi imobilizada à célula de fluxo 2 de um chip sensor, MK (60- 30 121, MK-C, fabricada por Peptide Institute Inc.) foi imobilizada à célula de fluxo 3, e midkine de comprimento inteiro (MK-NC) foi imobilizada à célula de fluxo 4. A célula de fluxo 1 foi utilizada como célula de controle. Através da imobilização de três tipos de midkine e fragmento de midkine a um chip sensor como descrito acima, as afinidades para os 3 tipos de Iigantes pode ser medida de uma vez. Como resultado da medição, descobriu-se que o RNA mostrado pela SEQ ID NO:4 ligou-se à midkine de comprimento inteiro 5 (daqui por diante, escrita MK-NC) e ao C-domínio da midkine (daqui por di- ante, escrito MK-C), mas não se ligou ao N-domínio da midkine (daqui por diante, escrito MK-N) (Tabela 1). Enquanto isso, o RNA mostrado em SEQ ID NO:5 ligou-se a MK-NC, MK-N e MK-C, mas a afinidade foi mais alta para MK-N do que para MK-C.

Tabela 1

Afinidade para midkine e vários analitos

Midkine

Comprimento inteiro

SEQ ID NO:4 +++

SEQ ID NO:5 +++

Heparina +++

Sulfato de condroitina E +++

Sulfato de condroitina C +

tRNA +++

MK-N MK-C - ++ ++ + + +++ + +++ - + +++ Medido pelo método de ressonância plasmônio de superfície. A midkine foi imobilizada ao chip sensor CM4 e vários outros analitos foram injetados. A afinidade é maior na ordem +++, ++, + e -.

Experimentos similares foram realizados utilizando-se como ana-

litos, no lugar de RNA, heparina (heparina, sal de sódio, Porcine Intestinal Mucosa, peso molecular baixo, p.m.: 5000, fabricado por Calbiochem), sulfa- to de condroitina E (de cartilagem de lula, fabricado por Seikagaku Corpora- tion), sulfato de condroitina C (de cartilagem de tubarão, p.m.: 40.000 a 20 80.000, fabricado por Seikagaku Corporation) ou tRNA (fabricado por Sig- ma). Como resultado, descobriu-se que todos esses analitos possuíam baixa afinidade com MK-N e se ligavam principalmente a MK-C (tabela 1).

Do mencionado acima, descobriu-se que o RNA mostrado em SEQ ID NO:4, assim como a heparina e similares, se liga ao C-domínio da midkine. Por outro lado, descobriu-se que o RNA mostrado em SEQ ID NO:5 possuía baixa afinidade com o C-domínio e se ligava com mais força ao N- domínio. Isso mostra que os RNAs mostrados nas SEQ ID N0:4 e 5 se ligam 5 a diferentes sítios da midkine. Sabe-se que a midkine possui em seu C- domínio um sítio ativo que é um sítio de ligação de heparina (Muramatsu H et al., Biochem Biophys Res Commun. 15 de setembro 1994;203(2):1131-9., 106.; Iwasaki W et al., EMBO J. 1 de dezembro 1997;16(23):6936-46.).

Foi determinado se o RNA mostrado em SEQ ID NO:5 possuía ou não atividade de ligação para a pleiotrofina, proteína da família da midkine, pelo método da ressonância de plasmônio de superfície conforme descrito acima. O RNAfoi imobilizado junto ao chip sensor SAe 0,5 μΜ de pleiotrofina foi injetada. Para reduzir a adsorção não específica, 0,4 mg/mL de tRNA foi adicionado à solução de pleiotrofin. Como resultado da medição, descobriu-se que o RNA mostrado em SEQ ID NO:5 possuía uma atividade de ligação para a pleiotrofina, mas o grau foi mais baixo que o para a midkine. Utilizando-se 40N-RNA como o ligante, uma medição similar foi realizada. Ambas a midkine e a pleiotrofina se ligaram ao 40N-RNA, mas o grau foi mais baixo que o do RNA mostrado em SEQ ID N0:5. O 40N-RNA exibiu maior afinidade com a midkine que com a pleiotrofina. Do mencionado acima, verificou-se que a pleiotrofina, assim como a midkine, era propensa a se ligar a ácidos nucleicos. Também foi verificado que o RNA mostrado em SEQ ID NO:5 possuía uma maior afinidade com a midkine do que com a pleiotrofina.

A seguir, determinou-se se os RNAs mostrados em SEQ ID NO: 25 4 e 5 possuíam ou não afinidades para com outras proteínas. Como proteí- nas, IgGI humano (fabricado por Calbiochem) e albumina humana (fabrica- do por Sigma) foram utilizados. Cada RNA foi imobilizado utilizando-se o chip sensor SA conforme descrito acima e cada proteína como analito foi injetada. Como resultado, IgGI humano e albumina humana não se ligaram 30 a quaisquer dos RNAs mostrados em SEQ ID NO:4 ou 5. Do exposto acima, foi constataso que os RNAs mostrados em SEQ ID NO: 4 e 5 não se ligam à albumina humana e IgG humano, que estão presentes em grandes quanti- dades no sangue.

As atividades Iigantes dos RNAs mostrados em SEQ ID NO:2 a

7, 31, 32, 36, 40-1 e 40-2 com a MK foram medidas. Conforme descrito aci- ma, a medição foi realizada com a MK imobilizada junto ao chip sensor CM4.

5 Como resultado, foi verificado que todos esses RNAs possuíam afinidade com a MK.

Exemplo 5

Avaliação de aptâmeros de RNA pelo experimento da inibição da migração celular.

Sabe-se que a midkine possui ação de infiltração nas células

progenitoras de osteoblastos (Qi et al., J. Biol. Chem. 276 (19), 15868- 15875, 2001). Assim, foi examinado se os aptâmeros de RNA preparados inibiam ou não a atividade de migração celular da midkine utilizando-se célu- las UMR106 de uma linha de células progenitoras de osteoblastos de ratos 15 (ATCC No. CRL1661). 30 μΙ_ de midkine a 1,5μΜ foram aplicados à superfí- cie externa da membrana da Chemotaxicell (diâmetro dos poros da mem- brana 8 μιτι, fabricada por Kurabo) para imobilizar a midkine à superfície ex- terna da membrana. A Chemotaxicell com midkine imobilizada foi colocada em uma placa de cultura 24 poços contendo 500 μΙ_ de um meio (suplemen- 20 tado com 0,3% de albumina de soro bovino, meio Eagle modificado por Dul- becco) suplementado com cada aptâmero de RNA adicionado a 100 nM. 200 μΙ_ de células UMR106 foram colocados na camada interna da câmara da Chemotaxicell a uma densidade de 1x106 células/mL, e foram cultivadas a 37°C por 4 horas. As células que continuaram na camada interna da câmara 25 da Chemotaxicell foram removidas, e as células que haviam se infiltrado e aderido à superfície a qual midkine foi aplicada foram fixadas com metanol. A câmara da Chemotaxicell foi imersa em uma solução aquosa a 1% de Viole- ta Cristal por 30 minutos para que as células fossem coloridas. Depois que a câmara da Chemotaxicell foi lavada com água destilada e secada, o pigmen- 30 to foi extraído com uma solução mista de 200 μΙ_ de SDS a 1% e Triton X100 a 1%. 150 μΙ_ do extrato foram transferidos para uma microplaca de 96 po- ços, e sua absorbância a 590 nm foi determinada. Como resultado da medição, foi verificado que os RNAs mostra- dos em SEQ ID NO:1, 2, 4 e 5 possuíam notável atividade de inibição da migração celular. Os resultados são mostrados na Tabela 2. O aptâmero mostrado em SEQ ID NO:5 exibiu a maior atividade inibidora, a média para 5 14 medições foi 76%. O 40N-RNA, utilizado como controle negativo, quase não exibiu atividade inibidora.

Tabela 2

Atividades de inibição da migração celular dos aptâmeros preparados contra

a_midkine_e_a pleiotrofina _ _ _

SEQID NO Midkine Pleiotrofina

Atividade Ini¬ Número de Atividade Ini¬ Número de bidora % medições bidora % medições 1 36 4 0 2 2 45 4 - - 4 63 6 8 2 _ í . _ 5 ' 76 14 ' 17 6 40N-RNA 8 6 28 j___ ___ ______.. 2 Concentração de RNA: 100 nM

Aqui, a porcentagem da atividade inibidora é um valor obtido subtraindo-se o número de células movendo-se com a adição do aptâmero, do número de células se movendo sem a adição do aptâmero (absorbância do extrato de células coloridas) tomado como 100. Na tabela, cada valor em % é a média para o número de amostras indicado.

A seguir foi medido se os aptâmeros mostrados pela SEQ ID NOÇ 4 e 5 possuíam ou não um atividade inibidora de migração celular con- tra pleiotrofina. O experimento foi realizado como descrito acima, exceto que a pleiotrofina foi usada no lugar de midikine. Como resultado do experimen- 20 to, foi verificado que esses aptâmeros não exibiam um atividade inibidora marcante contra a pleiotrofina (Tabela 2).

A seguir, foi medido se a heparina, o sulfato de condroitina Eeo sulfato de condroitina C inibiam ou não as atividades de migração celular da < midkine e da pleiotrofina. O experimento foi realizado conforme descrito aci- ma, exceto pelo fato de que os aptâmeros foram substituídos por heparina, sulfato de condroitina E ou sulfato de condroitina C. O suprimento de hepari- na utilizada foi um produto fabricado por Nacalai Tesque. Os suprimentos de 5 sulfato de condroitina CeE utilizadas foram os mesmos que aqueles utiliza- dos no Exemplo 4. As concentrações de heparina e sulfato de condroitina E foram 0,1, 1, 10 e 100 pg/mL. Como resultado do experimento, a heparina a 0,1 pg/mL inibiu as atividades de migração celular da midkine e da pleiotrofi- na. Em uma concentração de 1 pg/mL, a heparina inibiu as atividades de

10 migração celular da midkine e da pleiotrofina em não menos que 80%. Por outro lado, o sulfato de condroitina E em uma concentração de 10 pg/mL inibiu a midkine em 49% e a pleiotrofina em 69%. Assumindo que o peso molecular do sulfato de condroitina C fosse 40.000, o experimento foi reali- zado a 500nM (20 pg/mL). Como resultado, quando a atividade inibidora do 15 aptâmero mostrado em SEQ ID NO:4 (500 nM) foi tomada como 100, a ativi- dade inibidora do sulfato de condroitina C foi 44.

Do exposto acima, foi constatado que os aptâmeros mostrados em SEQ ID NO:1, 2, 4 e 5 se ligaram de maneira específica à midkine para inibir sua atividade de migração celular. O 40-RNA adsorveu à midkine de > 20 maneira não específica eletrostaticamente, mas não inibiu a atividade de migração celular. Isso mostra que os RNAs que foram obtidos por SELEX não são atribuíveis à adsorção não específica, mas se ligam a um sítio im- portante associado à atividade de adsorção celular. A heparina e o sulfato de condroitina E inibiram de maneira equivalente a atividade de migração celu- 25 Iar sem distinção entre a midkine e a pleiotrofina. Enquanto isso, os aptâme- ros mostrados em SEQ ID NO:4 e 5 inibiram somente a atividade da midki- ne. Como a midkine e a pleiotrofina possuem uma homologia de 50%, e co- mo o sítio de ligação da heparina é conservado em um nível alto, as altas especificidades dos aptâmeros são compreensíveis.

30 Exemplo 6

Miniaturização e estabilização do aptâmero mostrado em SEQ

ID NO:4 O aptâmero mostrado em SEQ ID NO:4 tem 77 nucleotídeos de comprimento, e possui a posição 2' da ribose do seu nucleotídeo de pirimidi- na flúor-substituído. Para possibilitar a síntese química, reduzir a toxicidade e melhorar a estabilidade no sangue, miniaturização e estabilização foram realizadas baseadas na estrutura secundária estimada pelo programa MFOLD, e a atividade foi avaliada por um experimento de inibição da migra- ção celular. No experimento de inibição da migração celular, a concentração de RNAfoi de IOOnM ou 500nM. Como alguns erros ocorrem em resultados experimentais dependendo da condição da célula, uma amostra previamente avaliada foi incluída como controle positivo em cada medição. As atividades inibidoras obtidas quando a concentração de RNA foi de 500 nM são mos- tradas na Tabela 3 (Tabelas 3-1 e 3-2). As atividades inibidoras são expres- sas como valores relativos sendo a atividade do aptâmero mostrada pela SEQ ID NO:4 tomada como 100, de modo a esclarecer as diferenças de ati- vidades entre as formas alteradas. A porcentagem de atividade inibidora do aptâmero mostrado em SEQ ID NO:4 (um valor obtido pela subtração do número de células se movendo com a adição do aptâmero a partir de 100, que é o número de células se movendo sem a adição do aptâmero) foi 73% quando a concentração de RNA era 500nM. Essa é a média para 4 medi- ções. A média para 6 medições da atividade inibidora foi 63% quando a con- centração de RNA era de 100 nM. Tabela 3-1

Atividades inibidora da migração celular de formas alteradas do RNA mos- trado em SEQ ID NO:4 contra a midkine

SEQ ID NO Atividade Número de medições Comprimento (nt) 4 100 2 77 57 (camundongo) 2 6 110 2 67 7 91 2 64 8 100 2 69 9 57 2 66 81 2 73 11 100 2 77 SEQ ID NO Atividade Número de medições Comprimento (nt) 12 100 2 58 13 100 2 50 14 100 2 54 75 2 56 16 61 2 57 17 68 2 46 18 88 2 37 19 94 2 44 97 2 42 20-1 109 2 42 20-2 84 2 42 20-3 60 2 42 20-4 60 2 42 20-5 88 2 42 20-6 69 2 42 20-7 88 2 42 20-8 99 2 42 20-9 130 2 42 20-10 86 2 42 20-11 76 2 42 20-12 53 2 42 20-13 89 2 42 Tabela 3-2 SEQ ID NO Atividade Número de medições Comprimento (nt) 21 0 2 44 22 70 6 33 23 66 2 38 24 65 2 38 . 81 2 41 26 18 2 41 27 78 2 41 28 71 2 31 29 74 2 31 Cond-C 44 2 A concentração de RNA era de 500 nM. As atividades são ex- pressas como valores relativos, sendo a atividade do RNA mostrado em SEQ ID NO:4 tomada como 100. A porcentagem de atividade inibidora do RNA mostrado na SEQ ID NO:4 foi de 73%. Esse valor que é a média de 4 medições, (camundongo) indica um valor relativo à midkine de camundongo. Cond-C indica sulfato de condroitina C.

As partes alteradas nas formas alteradas (SEQ ID NOs:6 a 29) são explicadas a seguir.

SEQ ID NO:6: 10 nucleotídeos foram deletados da parte de fita única no lado da extremidade 3' do RNA mostrado pela SEQ ID NO:4. gggagaggagaagagga-

ac(F)gu(F)gc(F)u(F)c(F)u(F)gu(F)ac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F )ggu(F)gu(F)gu(F)agaggac(F)a

SEQ ID NO:7: 14 nucleotídeos foram deletados da parte de fita única no lado da extremidade 3' do RNA mostrado em SEQ ID NO:4, e um G foi adiciona- do para transcrição, ggga-

ac(F)gu(F)gc(F)u(F)c(F)u(F)gu(F)ac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F )ggu(F)gu(F)gu(F)agaggac(F)aggaau(F)gagga

SEQ ID NO:8: 4 pares de base foram deletados do tronco no lado da extre- midade do RNA mostrado pela SEQ ID NO:4. gggagaggagaagagga-

ac(F)gc(F)u(F)gu(F)ac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggu(F)gu(F) gu(F)agc(F)aggaau(F)gagga

SEQ ID NO:9: 8 nucleotídeos do laço interno e CGG no seu lado oposto fo- ram deletados do RNA mostrado em SEQ ID NO:4. gggagaggagaagagga-

ac(F)gu(F)gc(F)u(F)c(F)u(F)gu(F)ac(F)gc(F)c(F)ggaaagaaggu(F)gu(F)gu(F)a gaggac(F)aggaau(F)gagga

SEQ ID N0:10: a parte de laço foi substituída por um tetralaço GAAA no

RNA mostrado pela SEQ ID NO:4.

gggagaggagaagagga- ac(F)gu(F)gc(F)u(F)c(F)u(F)gu(F)ac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)gaaaggc(F)ggu( F)gu(F)gu(F)agaggac(F)aggaau(F)gagga [0086]

SEQ ID NO:11: 3 pares de base G-U foram substituídos por pares de base G-C no tronco no lado terminal do RNA mostrado pela SEQ ID NO:4. gggagaggagaagagga-

ac(F)gu(F)gc(F)u(F)c(F)u(F)gc(F)ac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F )ggc(F)gu(F)gc(F)agaggac(F)aggaau(F)gagga

SEQ ID NO: 12: três pares de base G-U foram substituídos por pares de ba- se G-C no tronco no lado terminal e 11 nucleotídeos foram deletados da par- te de fita única no lado da extremidade 3' do RNA mostrado em SEQ ID NO:8.

gggagaggagaagagga-

ac(F)gc(F)u(F)gc(F)ac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)g c(F)agc(F)

SEQ ID NO:13: 11 nucleotídeos foram deletados da parte de fita única no lado da extremidade 5' do RNA mostrado pela SEQ ID NO:12, e GGG foi adicionado para a transcrição, gggagagga-

ac(F)gc(F)u(F)gc(F)ac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)g c(F)agc(F)

SEQ ID NO: 14: um par de bases G-C e um par bases C-G foram deletados do tronco no lado da extremidade do RNA mostrado em SEQ ID NO: 12. gggagaggagaagagga- ac(F)gc(F)u(F)ac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)agc(F) SEQ ID NO: 15: A36 e A37 foram deletados da parte do laço do RNA mostra- do em SEQ ID NO:12. gggagaggagaagagga-

ac(F)gc(F)u(F)gc(F)ac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagggc(F)ggc(F)gu(F)gc( F)agc(F)

SEQ ID NO: 16: A23 foi deletado da parte do laço interno do RNA mostrado em SEQ ID NO:12. gggagaggagaagagga-

ac(F)gc(F)u(F)gc(F)ac(F)gagggu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)gc (F)agc(F)

SEQ ID N0:17: um par de bases G-C e um par de bases C-G foram deleta- dos do tronco no lado da extremidade do RNA mostrado em SEQ ID NO:13. gggagagga-

ac(F)gc(F)u(F)ac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)agc(F) SEQ ID NO: 18: 11 nucleotídeos foram deletados da parte de fita única no lado da extremidade 5' do RNA mostrado em SEQ ID NO: 17, e GG foi adi- cionado para a transcrição.

gggc(F)u(F)ac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)agc(F) SEQ ID NO:19: um par de bases C-G foi deletado do tronco no lado da ex- tremidade do RNA mostrado em SEQ ID NO:17. gggagagga-

ac(F)gu(F)ac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)ac(F)

SEQ ID N0:20: um par de bases G-C e um par de bases U-A foram deleta- dos do tronco no lado da extremidade do RNA mostrado em SEQ ID NO:17. gggagagga-

ac(F)gac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)c(F) SEQ ID N0:20-1: a parte de fita única do RNA mostrado em SEQ ID N0:20 foi completamente modificada com OMe.

g(M)g(M)g(M)a(M)g(M)a(M)g(M)g(M)a(M)a(M)c(F)gac(F)gaggagu(F)agc(F)c( F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)c(F)

SEQ ID NO:20-2: o primeiro tronco do RNA mostrado em SEQ ID N0:20 foi modificado com Ome. gggagagga-

ac(F)g(M)a(M)c(F)g(M)aggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)g(M)u(F)c

(F)

SEQ ID NO:20-3: o segundo tronco do RNA mostrado em SEQ ID N0:20 foi modificado com Ome. gggagagga-

ac(F)gac(F)gaggagu(F)ag(M)c(F)c(F)ggaaagaag(M)g(M)c(F)ggc(F)gu(F)c(F) 1 SEQ ID NO:20-4: G na parte do laço do RNA mostrado em SEQ ID N0:20 foi substituído por OMe. gggagagga-

ac(F)gac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)g(M)g(M)aaag(M)aaggc(F)ggc(F)gu(F)c(F) SEQ ID NO:20-5: A na parte volumosa do RNA mostrado em SEQ ID N0:20- 1 foi substituído por Ome.

g(M)g(M)g(M)a(M)g(M)a(M)g(M)g(M)a(M)a(M)c(F)gac(F)ga(M)gga(M)gu(F)a (M)gc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)c(F)

SEQ ID NO:20-6: G na parte volumosa do RNA mostrado em SEQ ID N0:20-1 foi substituído por Ome.

g(M)g(M)g(M)a(M)g(M)a(M)g(M)g(M)a(M)a(M)c(F)gac(F)gag(M)g(M)ag(M)u( F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)c(F)

SEQ ID NO:20-7: A na parte do laço do RNA mostrado em SEQ ID N0:20-1 foi modificado com OMe. g(M)g(M)g(M)a(M)g(M)a(M)g(M)g(M)a(M)a(M)c(F)gac(F)gaggagu(F)agc(F)c( F)gga(M)aa(M)gaaggc(F)ggc(F)gu(F)c(F)

SEQ ID NO:20-8: A na parte do laço do RNA mostrado em SEQ ID NO:20-5 foi modificado com OMe.

g(M)g(M)g(M)a(M)g(M)a(M)g(M)g(M)a(M)a(M)c(F)gac(F)ga(M)gga(M)gu(F)a (M)gc(F)c(F)gga(M)aa(M)gaaggc(F)ggc(F)gu(F)c(F)

SEQ ID NO:20-9: o primeiro tronco do RNA mostrado em SEQ ID NO:20-5 foi modificado com Ome.

g(M)g(M)g(M)a(M)g(M)a(M)g(M)g(M)a(M)a(M)c(F)g(M)a(M)c(F)ga(M)gga(M) gu(F)a(M)gc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)g(M)u(F)c(F) SEQ ID N0:20-10: algumas partes do RNA mostrado em SEQ ID NO:20-5 foram modificadas com OMe.

g(M)g(M)g(M)a(M)g(M)a(M)g(M)g(M)a(M)a(M)c(F)gac(F)ga(M)gga(M)gu(F)a (M)gc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)g(M)g(M)c(F)gu(F)c(F)

SEQ ID N0:20-11: algumas partes do RNA mostrado em SEQ ID NO:20-5 foram modificadas com OMe.

g(M)g(M)g(M)a(M)g(M)a(M)g(M)g(M)a(M)a(M)c(F)g(M)a(M)c(F)ga(M)gga(M) gu(F)a(M)gc(F)c(F)gga(M)aa(M)gaaggc(F)g(M)g(M)c(F)g(M)u(F)c(F) SEQ ID N0:20-12: algumas partes do RNA mostrado em SEQ ID Ν0:20·5 foram modificadas com OMe.

g(M)g(M)g(M)a(M)g(M)a(M)g(M)g(M)a(M)a(M)c(F)g(M)a(M)c(F)ga(M)gga(M)

gu(F)a(M)gc(F)c(F)gga(M)aa(M)g(M)aaggc(F)ggc(F)g(M)u(F)c(F)

SEQ ID N0:20-13: algumas partes do RNA mostrado em SEQ ID N0:20-õ

foram modificadas com OMe.

g(M)g(M)g(M)a(M)g(M)a(M)g(M)g(M)a(M)a(M)c(F)g(M)a(M)c(F)ga(M)gga(M)

gu(F)a(M)gc(F)c(F)gga(M)aa(M)gaag(M)gc(F)ggc(F)g(M)u(F)c(F)

SEQ ID NO:21: um par de bases G-C foi excluído da parte do tronco no lado

do laço do RNA mostrado em SEQ ID NO: 17.

gggagagga-

ac(F)gc(F)u(F)ac(F)gaggagu(F)agc(F)ggaaagaagc(F)ggc(F)gu(F)agc(F) SEQ ID NO:22: 11 nucleotídeos foram excluídos da parte de fita única no lado da extremidade 5' do RNA mostrado em SEQ ID N0:20, e dois Gs fo- ram adicionados para a transcrição.

gggac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)c(F)

SEQ ID NO:23: A parte de laço foi substituída por um tetralaço GAAA no

RNA mostrado em SEQ ID N0:20.

gggagaggaac(F)gac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)gaaaggc(F)ggc(F)gu(F)c(F) SEQ ID NO:24: A parte de laço foi substituída por um tetralaço UUCG no RNA mostrado em SEQ ID N0:20. gggagagga-

ac(F)gac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)u(F)u(F)c(F)gggc(F)ggc(F)gu(F)c(F) SEQ ID NO:25: a parte do laço interno do RNA mostrado em SEQ ID N0:20 foi substituído pelo laço interno do aptâmero mostrado em SEQ ID N0:2. gggagaggaac(F)gac(F)gagaac(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)c(F) SEQ ID N0:26: G18 do laço interno do RNA mostrado em SEQ ID N0:20 foi deletado.

gggagaggaac(F)gac(F)gagagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)c(F) SEQ ID NO:27: A19 do laço interno do RNA mostrado em SEQ ID N0:20 foi deletado.

gggagaggaac(F)gac(F)gagggu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)c(F) SEQ ID NO:28: dois G foram removidos da extremidade 5' e o segundo par

de bases A-U foi modificado para G-C no RNA mostrado em SEQ ID NO:22.

ggc(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gc(F)c(F)

SEQ ID NO:29: dois G foram removidos da extremidade 5' do RNA mostrado

em SEQ ID NO:22.

gac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)c(F)

A atividade inibidora da migração celular do aptâmero mostrado em SEQ ID NO:4 contra a midkine de camundongo foi examinada. O método experimental foi o mesmo que o experimento na midkine humana descrito acima. Como resultado desse experimento, a porcentagem de atividade ini- bidora deste aptâmero foi de 50%. Isso é equivalente à cerca de 57 relativo à atividade inibidora deste aptâmero contra a midkine humana tomada como 100; a atividade diminui claramente em comparação com a atividade contra a midkine humana. Assim, verificou-se que este aptâmero é um aptâmero que exibe uma maior atividade inibidora contra a midkine humana.

Conforme é mostrado na tabela 3, o aptâmero mostrado em SEQ ID NO:4, que tinha originalmente 77 nucleotideos de comprimento, pô- de ser sofrer miniatuarização para 31 nucleotideos, sem que a redução das atividades fosse considerável (SEQ ID NO:28, 29). A parte de laço em forma de grampo de cabelo deste aptâmero obtido não precisa ser sempre GGAA- AGAA; o aptâmero reteve a atividade mesmo quando a parte do laço em forma de grampo de cabelo era o tetralaço GAAA ou UUCG (SEQ ID NO:23, 24). Mesmo quando a parte do laço interno foi substituída pela parte de laço interno do aptâmero mostrado em SEQ ID NO:2, a atividade se manteve, mas quando G18 foi excluído, a atividade diminuiu de modo extremo (SEQ ID NO:26, 27). Enquanto isso foi verificado que quando o par de bases C-G do tronco na parte do laço foi excluído, a estrutura secundária foi amplamen- te alterada e a atividade inibidora foi perdida (SEQ ID NO:21). Do exposto acima, foi constatado que o aptâmero de 42 nucleotideos mostrado em SEQ ID N0:20 (figura 8) reteve a atividade mesmo quando alguns nucleotideos foram substituídos por outros nucleotideos ou deletados, desde que a estru- tura básica deles não fosse muito alterada. Exemplo 7

Miniaturização e estabilização do aptâmero mostrado por SEQ ID NO:5

O aptâmero mostrado em SEQ ID NO:5 tem 77 nucleotídeos de comprimento, e possui a posição 2' da ribose do nucleotídeo de pirimidina flúor-substituído. Para possibilitar a síntese química, reduzir a toxicidade e melhorar a estabilidade no sangue, miniaturização e estabilização foram rea- lizadas. As operações de miniaturização e estabilização foram baseadas na estrutura secundária estimada pelo programa MFOLD, e a atividade foi ava- liada por um experimento de inibição da migração celular. No experimento de inibição da migração celular, a concentração de RNA foi de 100 nM ou 500 nM. Como alguns erros ocorrem em resultados experimentais depen- dendo da condição da célula, uma amostra previamente avaliada foi incluída como controle positivo em cada medição. As atividades inibidoras obtidas quando a concentração de RNA foi de 100 nM são mostradas na Tabela 4-1. As atividades inibidoras são expressas como valores relativos, sendo a ativi- dade do aptâmero mostrado em SEQ ID NO:5 tomada como 100, de modo a esclarecer as diferenças de atividades entre as formas alteradas. A porcen- tagem de atividade inibidora do aptâmero mostrado em SEQ ID NO:5 (um valor obtido pela subtração do número de células se movendo com a adição do aptâmero de 100, que é o número de células se movendo sem a adição do aptâmero) foi 76% quando a concentração de RNA era 100nM. Essa é a média para 14 medições. Com a concentração de RNA alterada para 500nM, um experimento similar foi realizado. Os resultados são mostrados na Tabela 4-2 (Tabela 4-2-1, Tabela 4-2-2). A média para 6 medições da atividade inibi- dora foi 63% quando a concentração de RNA era de 100 nM. As atividades inibidoras são expressas como valores relativos sendo a atividade do aptâ- mero mostrado em SEQ ID N0:40 tomada como 100. A porcentagem de ati- vidade inibidora do aptâmero mostrado em SEQ ID N0:40 foi de 82%. Essa é uma média de 4 medições Tabela 4-1

SEQ Midkine Pleiotrofina Compri- ID NO Atividad- Número de Me- Atividade Número de mento (nt) de dições Medições 100 14 13 6 77 44 2 - - 71 31 94 6 17 4 67 32 100 6 11 4 57 33 40 6 5 4 61 34 0 2 - - 46 90 4 0 2 51 36 91 4 27 2 53 36-1 60 4 0 2 53 37 0 2 - - 49 38 0 2 - - 57 39 52 2 - - 45 40 98 4 0 2 49 40-1 80 2 - - 49 40-2 31 2 - - 49 40-3 65 2 - - 49 41 97 4 8.1 2 52 42 110 4 8.7 2 52 43 42 2 - - 52

A concentração de RNA era de 100 nM. As atividades são ex-

pressas como valores relativos, sendo a atividade do RNA mostrada em SEQ ID NO:5 contra midkine tomada como 100. A porcentagem de atividade inibidora do RNA mostrado em SEQ ID NO:5 contra a midkine foi de 76%. Esse valor é uma média de 14 medições.

Tabela 4-2-1

SEQ ID NO Atividade Número de medições Comprimento (nt) 61 100 2 39 61-1 45* 2 39 61-2 55* 2 39 61-3 80 2 39 SEQ ID NO Atividade Número de medições Comprimento (nt) 61-4 86 4 39 61-5 40 4 39 61-6 57 2 39 61-7 46 2 39 61-8 54 4 39 61-9 39 2 39 62 44 2 39 63 97 2 45 64 55* 2 37 65 0 2 39 66 51 2 38 67 110 2 38 68 72 2 39 69 60 2 39 70 110 2 39 tRNA 28 2 Trombina-S 0 2 HIV-S 48 2

A contração de RNA era de 500 nM. As atividades são expressas como valores relativos, sendo a atividade do RNA mostrada em SEQ ID N0:40 contra midkine tomada como 100. A porcentagem de atividade inibi-

dora do RNA mostrado em SEQ ID N0:40 contra a midkine foi de 82%. Esse valor é uma média de 4 medições. *: Valor identificado por tentativa

As partes alteradas nas formas alteradas (SEQ ID Nos: 30-70) são explicadas a seguir.

SEQ ID N0:30: 6 nucleotídeos foram deletados da parte de fita única no lado da extremidade 5' do RNA mostrado em SEQ ID NO:12, e um G foi adicio- nado para a transcrição, ggagaagaggaa-

gu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F)a gu(F)au(F)aagau(F)agaggac(F)aggaau(F)gagga SEQ ID NO:31: 10 nucleotídeos foram deletados da parte de fita única no lado da extremidade 3' do RNA mostrado em SEQ ID NO:5. gggagaggagaagaggaa-

gu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F)a gu(F)au(F)aagau(F)agaggac(F)a SEQ ID NO:32: 20 nucleotídeos foram deletados da parte de fita única no lado da extremidade 3' do RNA mostrado em SEQ ID NO:5. gggagaggagaagaggaa-

gu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F)a gu(F)au(F)aag

SEQ ID NO:33: 6 nucleotídeos foram deletados da parte de fita única no lado da extremidade 5' e 10 nucleotídeos foram deletados da parte de fita única no lado da extremidade 3' do RNA mostrado em SEQ ID NO:5. ggagaagaggaa-

gu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F)a gu(F)au(F)aagau(F)agaggac(F)a

SEQ ID NO:34: 12 nucleotídeos foram deletados da parte de fita única no lado da extremidade 5' e 20 nucleotídeos foram deletados da parte de fita única no lado da extremidade 3' do RNA mostrado em SEQ ID NO:5. ggaggaa-

• 20 gu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F)a gu(F)au(F)aag

SEQ ID NO:35: 6 nucleotídeos foram deletados da parte de fita única no lado da extremidade 3' do RNA mostrado em SEQ ID NO:32. gggagaggagaagaggaa- gu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F)a 9

SEQ ID NO:36: dois pares de bases foram deletados do tronco no lado da extremidade do RNA mostrado em SEQ ID NO:32. gggagaggagaagaggaa- gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)agu(F)au(F) aag

SEQ ID NO:36-1: a parte de fita única no lado da extremidade 5' do RNA mostrado em SEQ ID NO:36 foi completamente modificada com OMe.. g(M)g(M)g(M)a(M)g(M)a(M)g(M)g(M)a(M)g(M)a(M)a(M)g(M)a(M)g(M)g(M)a( M)a(M)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)agu( F)au(F)aag

SEQ ID NO:37: quatro pares de bases foram deletados do tronco no lado da extremidade do RNA mostrado em SEQ ID NO:32. gggagaggagaagagga-

agc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)agu(F)au(F)aag SEQ ID NO:38: a parte de fita única no lado da extremidade 5' do RNA mos- trado em SEQ ID NO:32 foi alterado para poli U em que U mostra ribose flu- orada na posição 2'.

gg-

gu(F)u(F)u(F)u(F)u(F)u(F)u(F)u(F)u(F)u(F)u(F)u(F)u(F)u(F)u(F)gu(F)gu(F)gc( F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F)agu(F)au(F)aa g

SEQ ID NO:39: 6 nucleotídeos foram deletados da parte de fita única no lado da extremidade 3' e um par de bases foi deletado do tronco no lado da ex- tremidade do RNA mostrado em SEQ ID NO:36. gggagaggagaagagga- aggc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)c(F)ag

SEQ ID N0:40: 8 nucleotídeos foram deletados da parte de fita única no lado da extremidade 3' do RNA mostrado em SEQ ID NO:36. gggagaggagaagaggaa-

gu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F) SEQ ID N0:40-1: polietileno glicol com peso molecular de 2.000 foi adicio- nado à extremidade 5' via Iigante C12 e idT foi adicionado à extremidade 3' do RNA mostrado em SEQ ID N0:40. PEG2000-C12- gggagaggagaagaggaa- gu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F)- idT

SEQ ID N0.40-2: Todo G na parte de fita única no lado da extremidade 5' do < RNA mostrado em SEQ ID N0:40 foi modificado com OMe.

g(M)g(M)g(M)ag(M)ag(M)g(M)ag(M)aag(M)ag(M)g(M)aagu(F)gu(F)gc(F)ac(F )aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F) SEQ ID NO:40-3: Todo A na parte de fita única no lado da extremidade 5' do RNA mostrado em SEQ ID N0:40 foi modificado com OMe.

gg-

ga(M)ga(M)gga(M)ga(M)a(M)ga(M)gga(M)a(M)gu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu( F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F)

SEQ ID N0:41: G5 foi deletado da parte de fita única no lado da extremidade 5' do RNA mostrado em SEQ ID NO:36. gggaaggagaagaggaa-

gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)agu(F)au(F) aag

SEQ ID NO:42: Tudo foi deletado da parte de fita única no lado da extremi- dade 5' do RNA mostrado em SEQ ID NO:36. gggagaggagagaggaa-

gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)agu(F)au(F) aag [0102]

SEQ ID NO:43: A17 foi deletado da parte de fita única no lado da extremida- de 5' do RNA mostrado em SEQ ID NO:36. gggagaggagaagagga-

gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)agu(F)au(F) aag

SEQ ID NO:44: um par de bases foi deletado do tronco no lado da extremi- dade do RNA mostrado em SEQ ID N0:40. gggagaggagaagaggaa-

gu(F)u(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)aac(F) SEQ ID NO:45: dois pares de bases foram deletados do tronco no da extre- midade do RNA mostrado em SEQ ID N0:40. gggagaggagaagaggaa-

gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F) SEQ ID NO.45-1: polietileno glicol com peso molecular de 2.000 foi adicio- nado à extremidade 5' via Iigante C12 e idT foi adicionado à extremidade 3' do RNA mostrado em SEQ ID NO:45. PEG2000-C12-

gg-

ga(M)ga(M)gga(M)ga(M)a(M)ga(M)gga(M)a(M)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F )ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)-idT

SEQ ID NO:45-2: Todo o A na parte de fita única e todo o G na parte do tron- co da extremidade 5' do RNAmostrado em SEQ ID NO:45 foi completamen- te modificado com OMe.

gg-

ga(M)ga(M)gga(M)ga(M)a(M)ga(M)gga(M)a(M)gu(F)gc(F)ac(F)agggg(M)u(F) u(F)g(M)g(M)u(F)g(M)u(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)

SEQ ID NO:45-3: Todo o A na parte de fita única e todo o G na parte do laço interno no lado da extremidade 5' do RNA mostrado em SEQ ID NO:45 foi completamente modificado com OMe.

gg-

ga(M)ga(M)gga(M)ga(M)a(M)ga(M)gga(M)a(M)gu(F)gc(F)ac(F)a(M)g(M)ggg u(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)g(M)g(M)gu(F)gc(F)ac(F)

SEQ ID NO:45-4: Todo o A na parte de fita única e todo o A e G na parte do tronco da extremidade 5' do RNA mostrado em SEQ ID NO:45 foi completa- mente modificado com OMe.

gg-

ga(M)ga(M)gga(M)ga(M)a(M)ga(M)gga(M)a(M)gu(F)g(M)c(F)a(M)c(F)agggg u(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)g(M)c(F)a(M)c(F)

SEQ ID NO:45-4-1: Todo o G na parte do laço do RNA mostrado em SEQ ID NO:45-4 foi completamente modificado com OMe.

gg-

ga(M)ga(M)gga(M)ga(M)a(M)ga(M)gga(M)a(M)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)agg g(M)g(M)u(F)u(F)g(M)g(M)u(F)g(M)u(F)c(F)gggu(F)g(M)c(F)a(M)c(F) SEQ ID NO:45-4-1-1: C24 do RNA mostrado em SEQ ID NO:45-4-1 foi alte- rado para nucleotídeo de RNA. gg-

ga(M)ga(M)gga(M)ga(M)a(M)ga(M)gga(M)a(M)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)caggg( M)g(M)u(F)u(F)g(M)g(M)u(F)g(M)u(F)c(F)gggu(F)g(M)c(F)a(M)c(F) SEQ ID NO:46: O par de bases A-U foi substituído pelo par de bases C-G no tronco no lado da extremidade do RNA mostrado em SEQ ID N0:40. gggagaggagaagaggaa-

gu(F)gc(F)gc(F)gc(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggc(F)gc(F)gu(F)ac(F) SEQ ID NO:47: U32 foi deletado do laço do RNA mostrado em SEQ ID N0:40.

gggagaggagaagaggaa-

gu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F) SEQ ID NO:48: G34 foi excluído do laço do RNA mostrado em SEQ ID N0:40.

gggagaggagaagaggaa- gu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)gu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F) SEQ ID NO:49: U36 foi deletado do laço do RNA mostrado em SEQ ID N0:40.

gggagaggagaagaggaa-

gu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)gggu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F) SEQ ID N0:50: G4 e G10 foram deletados da parte de fita única no lado da extremidade 5' do RNA mostrado em SEQ ID NO:45. gggaaggaaagaggaa-

gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F) SEQ ID NO:51: G5 e A11 foram deletados da parte de fita única no lado da extremidade 5' do RNA mostrado em SEQ ID NO:36. gggaaggagagaggaa-

gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)agu(F)au(F) aag

SEQ ID NO:52: G1 e G5 foram deletados da parte de fita única no lado da extremidade 5' do RNA mostrado em SEQ ID NO:36. ggaaggagaagaggaa-

gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)agu(F)au(F) aag

SEQ ID NO:53: G5 e G10 foram deletados da parte de fita única no lado da extremidade 5' do RNA mostrado em SEQ ID NO:36. gggaaggaaagaggaa- gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)agu(F)au(F) aag

SEQ ID NO:54: Todo o G foi modificado com F e todo o Afoi modificado com Ome na parte de fita única do RNA mostrado em SEQ ID NO:45. g(F)g(F)g(F)a(M)g(F)a(M)g(F)g(F)a(M)g(F)a(M)a(M)g(F)a(M)g(F)g(F)a(M)a( M)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)

SEQ ID NO:55: A11e A12 foram deletados da parte de fita única no lado da extremidade 5' do RNA mostrado em SEQ ID NO:45. gggagaggaggaggaa-

gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F) SEQ ID NO:56: G13 e A14 foram deletados da parte de fita única no lado da extremidade 5' do RNA mostrado em SEQ ID NO:45. gggagaggagaaggaa-

gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F) SEQ ID NO:57: G15 e G16 foram deletados da parte de fita única no lado da extremidade 5' do RNA mostrado em SEQ ID NO:45. gggagaggagaagaaa-

gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F) SEQ ID NO:58: A17 e A18 foram deletados da parte de fita única no lado terminal 5' do RNA mostrado em SEQ ID NO:45. gggagaggagaagagg-

gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F) SEQ ID NO:59: 18 nucleotídeos foram deletados da parte de fita única no lado da extremidade 5' do RNA mostrado em SEQ ID NO:45, e dois G foram adicionados para transcrição. gggu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)

SEQ ID N0:60: a parte de fita única no lado da extremidade 5' do RNA mos- trado em SEQ ID NO:45 foi alterada para GGGAAGGA. gggaaggagu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F) SEQ ID NO:61: G5, G10, A11, A12, G13 e A14 foram deletados da parte de fita única no lado da extremidade 5' do RNA mostrado em SEQ ID NO:45. gggaaggaggaa-

gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)

SEQ ID NO:61-1: G foi modificado com o nucleotídeo de DNA e Afoi modifi- cado com Ome na parte da fita única, e a o G na parte de laço foi modificado com Ome na extremidade 5' do RNA mostrado em SEQ ID N0:61. g(H)g(H)g(H)a(M)a(M)g(H)g(H)a(M)g(H)g(H)a(M)a(M)gu(F)gc(F)ac(F)agggg u(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)

SEQ ID NO:61-2: G e A na parte da fita única e G na parte de laço do lado da extremidade 5' do RNA mostrado em SEQ ID N0:61 foram modificados com Ome.

g(M)g(M)g(M)a(M)a(M)g(M)g(M)a(M)g(M)g(M)a(M)a(M)gu(F)gc(F)ac(F)aggg gu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)

SEQ ID NO:61-3: uma parte do RNA mostrado em SEQ ID NO:61 foi modifi- cada com F e Ome.

g(F)g(F)g(F)a(M)a(M)g(F)g(F)a(M)g(F)g(F)a(M)a(M)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c( F)a(M)g(F)g(M)g(M)g(M)u(F)u(F)g(M)g(M)u(F)g(M)u(F)c(F)g(F)g(F)g(M)u(F) g(M)c(F)a(M)c(F)

SEQ ID NO:61-4: uma parte do RNA mostrado em SEQ ID N0:61 foi modifi- cada com OMe.

gg-

ga(M)a(M)gga(M)gga(M)a(M)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)aggg(M)g(M)u(F)u(F) g(M)g(M)u(F)g(M)u(F)c(F)gggu(F)g(M)c(F)a(M)c(F) [0107]

SEQ ID NO:61-5: 40 kDa de cadeia de polietileno glicol ramificado foram adicionados à extremidade 5' e idT foi adicionado à extremidade 3' do RNA mostrado em SEQ ID NO:61-5. PEG40k-

gg-

ga(M)a(M)gga(M)gga(M)a(M)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)aggg(M)g(M)u(F)u(F) g(M)g(M)u(F)g(M)u(F)c(F)gggu(F)g(M)c(F)a(M)c(F)-idT

SEQ ID NO:61-6: 30 kDa de cadeia de polietileno glicol fora adicionados a

ambas as extremidades do RNA mostrado em SEQ ID NO:61-5.

PEG30k-

gg-

ga(M)a(M)gga(M)gga(M)a(M)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)aggg(M)g(M)u(F)u(F) g(M)g(M)u(F)g(M)u(F)c(F)gggu(F)g(M)c(F)a(M)c(F)-PEG30k SEQ ID NO:61-7: uma parte do RNA mostrado em SEQ ID NO:61 foi modifi- cada com OMe.

gg-

ga(M)a(M)gga(M)gga(M)a(M)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)aggg(M)g(M)u(F)u(F) g(M)g(M)u(F)g(M)u(F)c(F)g(M)g(M)gu(F)g(M)c(F)a(M)c(F) SEQ ID NO:61-8: uma parte do RNA mostrado em SEQ ID NO:61 foi modifi- cada com OMe.

gg-

ga(M)a(M)gga(M)gga(M)a(M)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)a(M)g(M)gg(M)g(M)u (F)u(F)g(M)g(M)u(F)g(M)u(F)c(F)gggu(F)g(M)c(F)a(M)c(F) SEQ ID NO:61-9: uma parte do RNA mostrado em SEQ ID NO:61 foi modifi- cada com OMe e 2 kDa de propileno glicol foram adicionado à extremidade 5'.

PEG2000-

gg-

ga(M)a(M)gga(M)gga(M)a(M)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)a(M)gg(M)g(M)g(M)u

(F)u(F)g(M)g(M)u(F)g(M)u(F)c(F)ggg(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)

SEQ ID NO:62: G13, A14, G15, G16, A17 eA18 foram deletados da parte de

fita única no lado da extremidade 5' do RNA mostrado em SEQ ID NO:45.

gggagaggagaa-

gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F) SEQ ID NO:63: A25 e G26 no RNA mostrado em SEQ ID NO:45 foram alte- rados para C para fazer com que o laço interno fosse tronco, gggagaggagaagaggaa-

gu(F)gc(F)ac(F)c(F)c(F)gggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F) <■ SEQ ID ΝΟ:64: U-Afoi deletado do tronco no lado da extremidade 5' do RNA mostrado em SEQ ID N0:61.

gggaaggaggaaggc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)c(F) SEQ ID NO:65: A19 e G20 no laço interno do RNA mostrado em SEQ ID N0:61 foram substituídos porC. gggaaggaggaa-

gu(F)gc(F)ac(F)c(F)c(F)gggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F) SEQ ID NO:66: uma parte do RNA mostrado em SEQ ID NO:61 foi modifica- da com OMe e o G foi modificado com F. g(F)g(F)a(M)a(M)g(F)g(F)a(M)g(F)g(F)a(M)a(M)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)a( M)gg(M)g(M)g(M)u(F)u(F)g(M)g(M)u(F)g(M)u(F)c(F)g(F)g(F)g(M)u(F)g(M)c(F )a(M)c(F)

SEQ ID NO:67: a modificação do RNA mostrado em SEQ ID NO:66 foi alte- rada.

gga(M)a(M)gga(M)gga(M)a(M)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)aggg(M)g(M)u(F)u( F)g(M)g(M)u(F)g(M)u(F)c(F)gggu(F)g(M)c(F)a(M)c(F)

SEQ ID NO:68: uma parte do RNA mostrado em SEQ ID NO:61 foi modifica- da com OMe e U28 foi substituído por A(M).

gg-

ga(M)a(M)gga(M)gga(M)a(M)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)aggg(M)g(M)u(F)u(F) g(M)g(M)a(M)g(M)u(F)c(F)gggu(F)g(M)c(F)a(M)c(F)

SEQ ID NO:69: uma parte do RNA mostrado em SEQ ID NO:61 foi modifica- da com OMe e U25 foi substituído por A(M).

gg-

ga(M)a(M)gga(M)gga(M)a(M)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)aggg(M)g(M)u(F)a(M )g(M)g(M)u(F)g(M)u(F)c(F)gggu(F)g(M)c(F)a(M)c(F)

SEQ ID N0:70: uma parte do RNA mostrado em SEQ ID NO:61 foi modifica- da com OMe e U24 foi substituído por A(M).

gg-

ga(M)a(M)gga(M)gga(M)a(M)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)aggg(M)g(M)a(M)u(F )g(M)g(M)u(F)g(M)u(F)c(F)gggu(F)g(M)c(F)a(M)c(F)

Aqui, η (M) representa a ribose modificada com Ome na posição 2', η (F) representa a ribose modificada com F na posição2', η (H) representa a desoxirribose, PEG2000 representa 2000-Da de polietileno glicol, PEG40k representa 40kDa de polietileno glicol ramificado, PEG 30k representa 30kDa de polietileno glicol, C12 representa um Iigante C12 e idT representa dT invertido.

Um experimento na inibição da migração celular para a pleiotro- fina pelo aptâmero mostrado na SEQ ID NO:5 e suas formas alteradas foi realizado. O método experimental deu-se conforme descrito acima, exceto pelo fato de que foi utilizada pleiotrofina ao invés da midkine. A concentração do aptâmero era de 100nM, e a atividade inibidora do aptâmero mostrado em DEQ ID NO:5 contra a midkine foi tomada como 100. Como resultado do experimento, a atividade inibidora contra a pleiotrofina foi 13 (tabela 4-1). Essa é uma média de 6 medições. Nas formas alteradas, nenhuma atividade inibidora notável contra a pleiotrofina foi observada. A atividade de inibição da migração celular do aptâmero mostra-

do em SEQ ID NO:35 contra a midkine de camundongos foi examinada. O experimento foi o mesmo que o método experimental descrito acima para a midkine humana. Como resultado do experimento, o percentual de atividade inibidora deste aptâmero foi de 84%. Assim, verificou-se que esse aptâmero possui uma atividade contra a midkine de camundongo equivalente a ativi- dade inibidora contra a midkine humana.

Utilizando-se tRNA (fabricado por Sigma), Trombina-S e HIV-S, que são de improvável ligação específica à midkine ao invés dos aptâmeros, um experimento de inibição da migração celular para a midkine humana foi realizado conforme descrito acima. Aqui, a Trombina-S é um aptâmero de DNA de t'ggttggtgtggttgg'taaaaaaaaaaaaaaaa (SEQ ID NO:74), e HIV-S é um aptâmero de DNA de g'tggtgggtgggtggg't (SEQ ID NO:75). Cada.....repre- senta uma ligação de fosforotioato. As ligações de fosforotioato foram adi- cionadas para que se aumentasse a resistência das nucleases. Esses RNAs foram usados a 500 nM. Quando a atividade inibidora do aptâmero mostrado em SEQ ID NO:45 contra a midkine humana foi tomada como 100, determi- nou-se que a atividade do tRNA era 28, da Trombina-S era 0 e a do HIV-S era 48. Assim, sugeriu-se que os aptâmeros preparados no presente estudo pudessem se ligar especificamente a locais importantes associados à ativi- dade de migração celular da midkine.

O aptâmero mostrado em SEQ ID NO:5, que possuía 77 nucleo- tídeos de comprimento, pode ser miniaturizado para 39 nucleotídeos sem que a atividade fosse consideravelmente reduzida (SEQ ID NO:61). A parte da fita única na extremidade 5' não pôde ser completamente excluída; postu- la-se que esta parte da fita única esteja envolvida na formação da estrutura estérica do aptâmero. Embora o G desta parte da fita única possa ser um nucleotídeo F-modificado, verificou-se que a atividade diminuía para nucleo- tídeos Ome-modificados (SEQ ID N0.40-2, 54, 61-2). Enquanto isso, mesmo quando o A era um nucleotídeo Ome-modificado, a atividade permanecia inalterada (SEQ ID NO:40-3). Mesmo quando alguns pares de base A-U e- ram substituídos por pares de base G-C no tronco na extremidade 5', a ativi- dade não era muito influenciada (SEQ ID NO:46). Mesmo quando AeG des- ta parte do tronco eram substituídos por nucleotídeos Ome-modificados, a atividade se mantinha (SEQ ID NO:45-4). Mesmo quando a parte do laço interno era substituída por uma estrutura de tronco G-C por substituição de nucleotídeo, a atividade não mudava (SEQ ID NO:63); entretanto, quando a parte da fita única era encurtada, a atividade diminuía (SEQ ID NO:59). Quando o G e o A do laço interno eram substituídos por um nucleotídeo Ome-modificados, a atividade diminuía (SEQ ID NO:45-3). Quando a parte do laço era privada de um nucleotídeo, a atividade diminuía (SEQ ID NO:47 a 49). Mesmo quando o G da parte do laço era substituído com um nucleotí- deo Ome-modificado, a atividade se mantinha (SEQ ID NO:45-2).

Do exposto acima, foi constatado que a atividade deste aptâme- ro obtido não era nem mesmo influenciada pela substituição de algumas ba- ses ou pela alteração da modificação. Também foi verificado que este aptâ- mero se liga especificamente à midkine para inibir a atividade de migração celular. Enquanto isso, foi verificado que esse aptâmero também se ligou à proteína da família da pleiotrofina, mas não possuía atividade inibidora da migração celular marcante. Exemplo 8

Efeito inibidor do aptâmero na aderência ao órgão utilizando-se o modelo de formação de aderência de pós-operatório em camundongos.

O abdômen de um camundongo normal é aberto, e é feito uma incisão no peritônio com uma faca cirúrgica ou similar, a seguir os órgão in- ternos são secados e a parte Iaparatomizada é suturada; até 5 dias depois, aderência ao órgão pode ser observada (Am J Obstet Gynecol, 438-443, 1998). Foi relatado que quando camundongos nocauteados com midkine foram tratados com esse método para que a aderência de pós-operatório ao órgão fosse formada, tal aderência de pós-operatório ao órgão não ocorreu (Biochemical and Biophysical Research Communication, 317, 108-113, 2004). Assim, utilizando-se o modelo de formação de aderência de pó- operatório em camundongos, o efeito de prevenção da aderência de pós- operatório ao órgão do aptâmero mostrado em SEQ ID NO:76 foi investiga- do. Sob anestesia, um camundongo fêmea C57BL/6 de 8 semanas de idade foi laparatomizado, e a seguir o peritônio foi limpo com algodão absorvente. A seguir, uma fissura de cerca de 2 cm foi feita no peritônio em cinco posi- ções utilizando-se tesouras, o ferimento foi suturado com linha e agulha de costura. Após a emergência, o aptâmero mostrado em SEQ ID NO:76 foi administrado de forma intraperitoneal a uma dose de 1 mg/25 mL/kg. Para um grupo de controle, soro contendo 1 mM MgCI2 foi administrado de forma intraperitoneal a uma dose de 25 mL/kg da mesma forma. A administração se deu uma vez por dia por um total de 3 vezes no dia de pós-operatório 0, 1 e 2, a seguir o animal foi laparatomizado sob anestesia no dia 3, e o grau de adesão de órgão ao ferimento foi avaliado usando o critério a seguir. 0: nenhuma aderência 1: com aderência, aderência leve (leve) 2: com aderência, aderência moderada (moderada) 3: com aderência, adesão severa que não pode ser solta mesmo ao se puxar o órgão na parte aderida.

Os resultados são mostrados como as médias e erros padrões dos valores dos graus de aderência para 9 a 10 animais em cada grupo (Ta- < bela 5). Como resultado, o valor foi de 3 em todos os animais no grupo que estava recebendo soro fisiológico, em passo que a valor médio do grupo que estava recebendo o aptâmero mostrado na SEQ ID NO:76 foi de 2,4. No grupo que estava recebendo o aptâmero mostrado pela SEQ ID NO:76, em comparação com o grupo que estava recebendo soro fisiológico, foi obser- vada uma diferença estatisticamente significante (p<0,05%). Para o proces- samento estatístico, o teste U da Mann-Whitney foi usado. A partir dos resul- tados acima, foi demonstrado que o aptâmero mostrado na SEQ ID NO:76 possuía uma atividade de prevenção de aderência no órgão pós-operatória. O aptâmero mostrado pela SEQ ID NO:76 é como a seguir.

SEQ ID NO:76: o RNA mostrado pela SEQ ID N0:40, em que todos os "A"s da parte de fita única da extremidade 5' estão modificados com OMe, com colesterol (ChoI) adicionado à extremidade 5' via um Iigante de cadeia de hidrocarboneto saturada (C12) tendo 12 átomos de carbono, e dT invertido (idT) adicionado à extremidade 3'.Chol-Cl 2

ggga(M)ga(M)gga(M)ga(M)a(M)a(M)ga(M)gga(M)a(M)gu(F)gu(F)gc(F)ac(F)a

ggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)-idt

Tabela 5

Resultados do experimento de aderência a órgão usando mode- Io de camundonqo

Administração Valor Soro fisiológico 3,0 +/- 0,0 SEQ ID NO:76 2,4 +/- 0,3*

*; p<0,05 Teste U de Mann-Whitney

Esse pedido tem como base o pedido de patente JP 2006- 308482 depositado em 14 de novembro de 2006, cujo conteúdo é aqui inte- gralmente incorporado, a título de referência. Seqüência de Listagem

<110> RIBOMIC INC.

<120> APTÂMERO CONTRA MIDKINE E USO DO MESMO <130> 091160 <150> JP 2006-308482 <151 > 2006-11-14 <160> 76

<170> Patentln versão 3.3 <210> 1 <211 > 77 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 1

gggagaggag aagaggaaau aguuaagggu gaauuugcga aagcuauuuu agucgcagua 60

gaggacagga augagga 77

<210> 2 <211> 77 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 2

gggagaggag aagaggaagg acuaaguaag agaacaccgg aaugaaggga cuuacgugua 60

gaggacagga augagga 77

<210> 3 <211> 75 <212> RNA <213> Artificiai <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 3

gggagaggag aagaggaaag ccuucuaccg aaagugggaa agcacacaua aaucugguag 60

aggacaggaa ugaga 75

<210> 4 <2*11 > 76 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 4

gggagaggag aagaggaacg ugcucuguac gaggaguagc cggaaagaag gcggugugua 60

gaggacagga augaga 76

<210> 5 <211> 76 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 5

gggagaggag aagaggaagu gugcacaggg guuggugucg ggugcauaca guauaagaua 60

gaggacagga augaga 76

<210> 6 <211> 67 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 6

gggagaggag aagaggaacg ugcucuguac gaggaguagc cggaaagaag gcggugugua 60

gaggaca 67 <210> 7 <211> 64 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 7

gggaacgugc ucuguacgag gaguagccgg aaagaaggcg guguguagag gacaggaaug 60

agga 64

<210> 8 <211> 69 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 8

gggagaggag aagaggaacg cuguacgagg aguagccgga aagaaggcgg uguguagcag 60

gaaugagga 69 <210> 9 <211> 66 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 9

gggagaggag aagaggaacg ugcucuguac gccggaaaga agguguguag aggacaggaa 60

ugagga 66 <210> 10 <211> 73 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 10 1 gggagaggag aagaggaacg ugcucuguac gaggaguagc cgaaaggcgg uguguagagg 60

acaggaauga gga 73

<210> 11 <211> 77 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 11

gggagaggag aagaggaacg ugcucugcac gaggaguagc cggaaagaag gcggcgugca 60

gaggacagga augagga 77

<210> 12 <211> 58 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 12

gggagaggag aagaggaacg cugcacgagg aguagccgga aagaaggcgg cgugcagc 58

<210> 13 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 13

gggagaggaa cgcugcacga ggaguagccg gaaagaaggc ggcgugcagc 50

<210> 14 <211> 54 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Aptâmero para midkine <400> 14

gggagaggag aagaggaacg cuacgaggag uagccggaaa gaaggcggcg uagc <210> 15 <211> 56 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 15

gggagaggag aagaggaacg cugcacgagg aguagccgga aagggcggcg ugcagc <210> 16 <211> 57 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 16

gggagaggag aagaggaacg cugcacgagg guagccggaa agaaggcggc gugcagc <210> 17 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 17

gggagaggaa cgcuacgagg aguagccgga aagaaggcgg cguagc <210> 18 <211> 37 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Aptâmero para midkine <400> 18

gggcuacgag gaguagccgg aaagaaggcg gcguagc 37

<210> 19 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 19

gggagaggaa cguacgagga guagccggaa agaaggcggc guac 44

<210> 20 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 20

gggagaggaa cgacgaggag uagccggaaa gaaggcggcg uc 42

<210> 21 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 21

gggagaggaa cgcuacgagg aguagcggaa agaagcggcg uagc 44

<210> 22 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Aptâmero para midkine <400> 22

gggacgagga guagccggaa agaaggcggc guc 33

<210> 23 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 23

gggagaggaa cgacgaggag uagccgaaag gcggcguc 38

<210> 24 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 24

gggagaggaa cgacgaggag uagccuucgg gcggcguc 38

<210> 25 <211> 41 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 25

gggagaggaa cgacgagaac agccggaaag aaggcggcgu c 41

<210> 26 <211> 41 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Aptâmero para midkine <400> 26

gggagaggaa cgacgagagu agccggaaag aaggcggcgu c 41

<210> 27 <211> 41 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 27

gggagaggaa cgacgagggu agccggaaag aaggcggcgu c 41

<210> 28 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 28

ggcgaggagu agccggaaag aaggcggcgc c 31

<210> 29 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 29

gacgaggagu agccggaaag aaggcggcgu c 31

<210> 30 <211> 71 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Aptâmero para midkine <400> 30

ggagaagagg aagugugcac agggguuggu gucgggugca uacaguauaa gauagaggac 60

aggaaugagg a 71 <210> 31 <211> 67 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 31

gggagaggag aagaggaagu gugcacaggg guuggugucg ggugcauaca guauaagaua 60

gaggaca 67 <210> 32 <211> 57 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 32

gggagaggag aagaggaagu gugcacaggg guuggugucg ggugcauaca guauaag 57

<210> 33 <211> 61 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 33

ggagaagagg aagugugcac agggguuggu gucgggugca uacaguauaa gauagaggac 60

a 61

<210> 34 <211> 46 ' <212> RNA

<213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 34

ggaggaagug ugcacagggg uuggugucgg gugcauacag uauaag 46

<210> 35 <211> 51 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 35

gggagaggag aagaggaagu gugcacaggg guuggugucg ggugcauaca g 51

<210> 36 <211> 53 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 36

gggagaggag aagaggaagu gcacaggggu uggugucggg ugcacaguau aag 53

<210> 37 <211> 49 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 37

gggagaggag aagaggaagc acagggguug gugucgggug caguauaag 49

<210> 38 <211> 57 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 38

ggguuuuuuu uuuuuuuugu gugcacaggg guuggugucg ggugcauaca guauaag <210> 39 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 39

gggagaggag aagaggaagg cacagggguu ggugucgggu gccag <210> 40 <211> 49 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 40

gggagaggag aagaggaagu gugcacaggg guuggugucg ggugcauac <210> 41 <211> 52 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 41

gggaaggaga agaggaagug cacagggguu ggugucgggu gcacaguaua ag <210> 42 <211> 52 < <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 42

gggagaggag agaggaagug cacagggguu ggugucgggu gcacaguaua ag 52

<210> 43 <211> 52 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 43

gggagaggag aagaggagug cacagggguu ggugucgggu gcacaguaua ag 52

<210> 44 <211> 47 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 44

gggagaggag aagaggaagu ugcacagggg uuggugucgg gugcaac 47

<210> 45 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 45

gggagaggag aagaggaagu gcacaggggu uggugucggg ugcac 45

<210> 46 <211> 49 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 46

gggagaggag aagaggaagu gcgcgcaggg guuggugucg ggcgcguac 49

<210> 47 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 47

gggagaggag aagaggaagu gugcacaggg guggugucgg gugcauac 48

<210> 48 <211 > 48 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 48

gggagaggag aagaggaagu gugcacaggg guugugucgg gugcauac 48

<210> 49 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 49

gggagaggag aagaggaagu gugcacaggg guugggucgg gugcauac 48

<210> 50 <211> 43 <■ <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 50

gggaaggaaa gaggaagugc acagggguug gugucgggug cac 43

<210> 51 <211> 51 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 51

gggaaggaga gaggaagugc acagggguug gugucgggug cacaguauaa g 51

<210> 52 <211 > 51 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 52

ggaaggagaa gaggaagugc acagggguug gugucgggug cacaguauaa g 51

<210> 53 <211> 51 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 53

gggaaggaaa gaggaagugc acagggguug gugucgggug cacaguauaa g 51

<210> 54 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 54

gggagaggag aagaggaagu gcacaggggu uggugucggg ugcac

<210> 55

<211> 43

<212> RNA

<213> Artificial

<220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 55

gggagaggag gaggaagugc acagggguug gugucgggug cac <210> 56 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 56

gggagaggag aaggaagugc acagggguug gugucgggug cac <210> 57 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 57

gggagaggag aagaaagugc acagggguug gugucgggug cac <210> 58 <211> 43 * <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 58

gggagaggag aagagggugc acagggguug gugucgggug cac 43

<210> 59 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 59

gggugcacag ggguuggugu cgggugcac 29

<210> 60 <211 > 35 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 60

gggaaggagu gcacaggggu uggugucggg ugcac 35

<210> 61 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 61

gggaaggagg aagugcacag ggguuggugu cgggugcac 39

<210> 62 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 62

gggagaggag aagugcacag ggguuggugu cgggugcac <210> 63 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 63

gggagaggag aagaggaagu gcacccgggu uggugucggg ugcac <210> 64 <211> 37 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 64

gggaaggagg aaggcacagg gguugguguc gggugcc

<210> 65

<211> 39

<212> RNA

<213> Artificial

<220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 65

gggaaggagg aagugcaccc ggguuggugu cgggugcac <210> 66 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 66

ggaaggagga agugcacagg gguugguguc gggugcac 38

<210> 67 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 67

ggaaggagga agugcacagg gguugguguc gggugcac 38

<210> 68 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 68

gggaaggagg aagugcacag ggguuggagu cgggugcac 39

<210> 69 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 69

gggaaggagg aagugcacag ggguaggugu cgggugcac 39

<210> 70 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 70

gggaaggagg aagugcacag gggauggugu cgggugcac 39

<210> 71 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> DNA padrão para produzir aptâmero para midkine <220>

<221 > misc_feature <223> nisa, c, gort <220>

<221 > miscjeature <222> (20)..(59) <223> η is a, c, g, ort <400> 71

tcctcattcc tgtcctctan nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnt 60

tcctcttctc ctctccc 77

<210> 72 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> primer para produzir aptâmero para midkine <400> 72

taatacgact cactataggg agaggagaag aggaa 35

<210> 73 <211> 19 *■ <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> Primer reverso para produzir aptâmero para midkine <400> 73

tcctcattcc tgtcctcta 19

<210> 74 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> DNA aptâmero para trombina (Thrombin-S) <400> 74

tggttggtgt ggttggtaaa aaaaaaaaaa aaa 33

<210> 75 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> DNA aptâmero para HIV (HIV-S) <400> 75

gtggtgggtg ggtgggt 17

<210> 76 <211> 49 <212> RNA <213> Artificial <220>

<223> Aptâmero para midkine <400> 76

gggagaggag aagaggaagu gugcacaggg guuggugucg ggugcauac 49

Claims (16)

1. Aptâmero que possui atividade inibidora contra midkine.

2. Aptâmero, de acordo com a reivindicação 1, em que o aptâ- mero não possui atividade inibidora contra pleiotrofina.

3. Aptâmero, de acordo com a reivindicação 1, que possui ativi- dade de ligação ao fragmento N-terminal da midkine.

4. Aptâmero, de acordo com a reivindicação 1, que possui ativi- dade de ligação ao fragmento C-terminal da midkine.

5. Aptâmero, de acordo com a reivindicação 2, que possui ativi- dade de ligação ao fragmento N-terminal da midkine.

6. Aptâmero, de acordo com a reivindicação 2, que possui ativi- dade de ligação ao fragmento C-terminal da midkine.

7. Aptâmero que exibe atividade inibidora contra midkine através da inibição da ligação da midkine e ΡΤΡξ.

8. Aptâmero, de acordo com a reivindicação 1, que é ou (a) ou (b) abaixo: (a) um aptâmero compreendendo uma seqüência de nucleotí- deos selecionada de SEQ ID NO:1 a 70 (com a condição que o uracil possa ser timina), em que os nucleotídeos contidos no aptâmero são tais que, (i) as posições 2' dos nucleotídeos de pirimidina, se idênticas ou diferentes, são átomos de flúor ou substituídas por átomos ou grupos sele- cionados do grupo que consiste em átomos de hidrogênio, grupos hidróxi e grupos metóxi, e (ii) as posições 2' dos nucleotídeos de pirina, se idênticas ou di- ferentes, são grupos hidróxi ou substituídas por átomos ou grupos selecio- nados do grupo que consiste em átomos de hidrogênio, grupos metóxi e á- tomos de flúor; (b) um aptâmero compreendendo uma seqüência de nucleotí- deos selecionada de SEQ ID NO:1 a 70 (com a condição que o uracil possa ser timina), em que um ou vários nucleotídeos são substituídos, deletados, inseridos ou adicionados, em que os nucleotídeos contidos no aptâmero são tais que, (i) as posições 2' dos nucleotídeos de pirimidina, se idênticas ou diferentes, são átomos de flúor ou substituídas por átomos ou grupos sele- cionados do grupo que consiste em átomos de hidrogênio, grupos hidróxi e grupos metóxi, e (ii) as posições 2' dos nucleotídeos de purina, se idênticas ou diferentes, são grupos hidróxi ou substituídas por átomos ou grupos selecio- nados do grupo que consiste em átomos de hidrogênio, grupos hidróxi e grupos metóxi e átomos de flúor.

9. Aptâmero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que o nucleotídeo contido no aptâmero é modificado.

10. Complexo que compreende o aptâmero conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, e uma substância funcional.

11. Complexo, de acordo com a reivindicação 10, em que a substância funcional é uma substância de afinidade, uma substância para marcação, uma enzima, um veículo para distribuição de fármacos ou um fármaco.

12. Fármaco, que compreende o aptâmero conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, ou o complexo conforme definido na reivindicação 10 ou 11.

13. Inibidor de migração celular, que compreende o aptâmero conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, ou o com- plexo conforme definido na reivindicação 10 ou 11.

14. Reagente para diagnóstico, que compreende o aptâmero conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, ou o com- plexo conforme definido na reivindicação 10 ou 11.

15. Agente marcador, que compreende o aptâmero conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, ou o complexo con- forme definido na reivindicação 10 ou 11.

16. Método de detecção do aptâmero conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, ou do complexo conforme defini- do na reivindicação 10 ou 11.