CN109529129A - 内部包裹锌离子的纳米颗粒、其制备方法及应用 - Google Patents

内部包裹锌离子的纳米颗粒、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了内部包裹锌离子的纳米颗粒、其制备方法及应用，涉及纳米材料制备技术领域。该内部包裹锌离子的纳米颗粒的制备方法包括：将锌盐溶液与多聚赖氨酸溶液混合反应后得到锌离子螯合液；将锌离子螯合液与肝素盐溶液混合反应。内部包裹锌离子的纳米颗粒是由肝素包裹由多聚赖氨酸与锌离子形成的螯合物，制备得到的纳米颗粒中锌离子的含量可调，可以引入高剂量的锌元素，并且这种引入锌元素的方式可以延迟高剂量的锌发挥其生物作用。这种具有凝血功能且锌离子含量更高、锌离子释放效果缓慢的材料可以在制备含锌医用材料中得到应用。

Description

内部包裹锌离子的纳米颗粒、其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及纳米材料制备技术领域，且特别涉及内部包裹锌离子的纳米颗粒、其制备方法及应用。
背景技术
心血管材料在研发设计几代产品之后，仍然存在材料植入晚期及极晚期动脉再狭窄方面问题。常常需要在产品前期表面进行促表面细胞生长，晚期及极晚期动脉进行抗狭窄设计，以保证植入材料在服役环境下的自适应性，同时对平滑肌细胞具有惰性甚至抑制增殖的作用，以减少晚期及极晚期动脉再狭窄问题的出现。
但是，现有的使锌离子加载至医用材料表面的方法中存在着锌离子负载效果不佳、锌离子释放过快(导致毒性的产生)或者医用产品不具有凝血功能等问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种内部包裹锌离子的纳米颗粒的制备方法，制备得到的纳米颗粒具有抗凝血效果，且负载在材料表面后可以达到缓释的效果。
本发明的另一目的在于提供一种内部包裹锌离子的纳米颗粒，便于再次反应将锌离子引入材料表面，制备具有凝血效果且能够缓释的带锌离子的医用材料。
本发明的第三目的在于提供上述内部包裹锌离子的纳米颗粒在制备含锌医用材料中的应用。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本发明提出了一种内部包裹锌离子的纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
将锌盐溶液与多聚赖氨酸溶液混合反应后得到锌离子螯合液；
将锌离子螯合液与肝素盐溶液混合反应。
本发明还提出一种内部包裹锌离子的纳米颗粒，纳米颗粒的制备过程包括将锌盐溶液与多聚赖氨酸溶液混合反应后得到锌离子螯合液；
将锌离子螯合液与肝素盐溶液混合反应；
更优选地，锌离子螯合液的制备过程是将锌盐溶液滴加至多聚赖氨酸溶液中，且锌离子螯合液与肝素盐溶液的混合反应过程是将肝素盐溶液滴加至锌离子螯合液中。
本发明还提出上述纳米颗粒在制备含锌医用材料中的应用。
本发明实施例提供一种内部包裹锌离子的纳米颗粒的制备方法的有益效果是：其通过先将锌盐和多聚赖氨酸溶液混合使多聚赖氨酸上的氨基基团与锌离子配位形成螯合物，然后通过螯合物中多聚赖氨酸所带正电荷与具有很强负电荷的肝素进行静电结合形成纳米颗粒。通过锌离子和多聚赖氨酸的螯合可以引入更高剂量的锌元素，并且在加载于医用材料之后引入的锌元素可以延迟高剂量的锌发挥其生物作用。
本发明实施例还提供一种内部包裹锌离子的纳米颗粒，其由肝素包裹由多聚赖氨酸与锌离子形成的螯合物，制备得到的纳米颗粒中锌离子的含量可调，可以引入高剂量的锌元素，并且这种引入锌元素的方式可以延迟高剂量的锌发挥其生物作用。这种具有凝血功能且锌离子含量更高、锌离子释放效果缓慢的材料可以在制备含锌医用材料中得到应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明制备方法的原理示意图；
图2为包裹锌纳米颗粒的动态光散射粒径检测结果；
图3为包裹锌纳米颗粒的Zeta电位检测结果；
图4为反应产品的透射电镜图；
图5为内皮细胞的荧光图；
图6为平滑肌细胞的荧光图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例提供的内部包裹锌离子的纳米颗粒、其制备方法及应用进行具体说明。
本发明实施例提供的一种内部包裹锌离子的纳米颗粒的制备方法，包括：将锌盐溶液与多聚赖氨酸(PLL)溶液混合反应后得到锌离子螯合液；将锌离子螯合液与肝素盐溶液混合反应。
需要说明的是，请结合图1，将锌盐和多聚赖氨酸溶液混合使多聚赖氨酸上的氨基基团与锌离子配位形成螯合物，然后通过螯合物中多聚赖氨酸所带正电荷与具有很强负电荷的肝素进行静电结合形成纳米颗粒。通过锌离子和多聚赖氨酸的螯合可以引入更高剂量的锌元素，并且在加载于医用材料之后引入的锌元素可以延迟高剂量的锌发挥其生物作用。
肝素(Heparin)结构中含有大量的硫酸根基团，是目前发现的负电性最强的生物分子。在临床上常被用作抗凝剂，在治疗血栓症、血栓静脉炎及血栓栓塞症以及实施支架植入手术中都得到广泛应用。本发明充分利用了肝素本身显著的抗凝血效果，增加材料表面的抗凝血性能。同时，肝素通过和各类生长因子以及补体配体结合，更加多元化的调节机体。
锌是人体必需微量元素，是体内300多种酶的组成成分。锌离子在细胞内主要有三种作用：催化作用、结构作用、调节作用。锌离子能够有效促进细胞的增长，对内皮细胞的生长有一定的帮助。但是，锌离子对细胞有双向作用，低浓度可以促进细胞的增长，高浓度又会抑制细胞的生长，因此合适的锌对内皮细胞的生长有一定的帮助。发明人通过控制反应体系溶液中各组分的用量，控制锌离子的沉积量，使最终得到的产品中锌离子的浓度适宜，有效促进内皮细胞的生长。但是，高浓度的锌元素会对细胞产生促凋亡的生物作用，本专利介绍了一种通过包裹锌纳米颗粒的方式延迟高浓度锌与细胞接触方法，从而控制低浓度锌的发挥生物学作用时间的生物学应用。
优选地，锌离子螯合液的制备过程是将锌盐溶液滴加至多聚赖氨酸溶液中。同样，锌离子螯合液与肝素盐溶液的混合反应过程是将肝素盐溶液滴加至锌离子螯合液中；优选地，肝素盐溶液和锌离子螯合液的反应温度为20-30℃。采用滴加的方式避免反应速率过快形成团聚，影响纳米颗粒的粒径，以保证纳米颗粒在材料上的均匀负载。
具体地，多聚赖氨酸溶液中所用多聚赖氨酸的重均分子量为150-300KDa，多聚赖氨酸溶液的浓度为0.3-1.0mg/mL。多聚赖氨酸的分子量需要进行控制，分子量过大或过小均会导致制备得到的纳米颗粒负载后对细胞的增殖效果减弱。
同样，各组分的浓度和用量需要进行把控，以进一步促进最终得到的材料对细胞的增殖效果。锌盐溶液的浓度为0.0005-10mmol/L。肝素盐溶液的浓度为5-10mg/mL；优选地，多聚赖氨酸溶液、锌盐溶液和肝素盐溶液的体积比为1:0.9-1.1:1.8-2.2。
具体地，锌盐选自氯化锌、硫酸锌和硝酸锌中的任意一种，优选为氯化锌，采用氯化锌更容易控制反应体系的pH。肝素盐溶液为肝素钠溶液或肝素钾溶液，常见的肝素盐溶液均可以用于本反应体系中。
本发明实施例还提供了一种内部包裹锌离子的纳米颗粒，其可以通过上述方法制备而得，纳米颗粒中锌离子的含量可调，可以引入高剂量的锌元素，并且这种引入锌元素的方式可以延迟高剂量的锌发挥其生物作用。
这种具有凝血功能且锌离子含量更高、锌离子释放效果缓慢的材料可以在制备含锌医用材料中得到应用。
优选地，该内部包裹锌离子的纳米颗粒有上述制备方法制备而得。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种内部包裹锌离子的纳米颗粒的制备方法，其包括以下步骤：将0.0005mmol/L的氯化锌溶液滴加入浓度为0.3mg/mL、重均分子量为150KDa的多聚赖氨酸溶液中，搅拌2h；然后在磁力搅拌的条件下，在反应后的混合溶液中滴加5mg/mL的肝素钠溶液室温下反应2h，其中，氯化锌溶液、多聚赖氨酸溶液和肝素钠溶液的体积比约为1:0.9:1.8。
实施例2
本实施例提供一种内部包裹锌离子的纳米颗粒的制备方法，其包括以下步骤：将10mmol/L的硝酸锌溶液滴加入浓度为1.0mg/mL、重均分子量为300KDa的多聚赖氨酸溶液中，搅拌3h；然后在磁力搅拌的条件下，在反应后的混合溶液中滴加10mg/mL的肝素钾溶液室温下反应3h，其中，硝酸锌溶液、多聚赖氨酸溶液和肝素钾溶液的体积比约为1:1.1:2.2。
实施例3
本实施例提供一种内部包裹锌离子的纳米颗粒的制备方法，其包括以下步骤：将0.005mmol/L的氯化锌溶液滴加入浓度为0.5mg/mL、重均分子量为200KDa的多聚赖氨酸溶液中，搅拌3h；然后在磁力搅拌的条件下，在反应后的混合溶液中滴加8mg/mL的肝素钠溶液室温下反应3h，其中，氯化锌溶液、多聚赖氨酸溶液和肝素钠溶液的体积比约为1:1:2。
实施例4
本实施例提供一种内部包裹锌离子的纳米颗粒的制备方法，其具体步骤与实施例3大致相同，不同之处在于氯化锌溶液的浓度为0.01mmol/L。
实施例5
本实施例提供一种内部包裹锌离子的纳米颗粒的制备方法，其具体步骤与实施例3大致相同，不同之处在于氯化锌溶液的浓度为0.025mmol/L。
实施例6
本实施例提供一种内部包裹锌离子的纳米颗粒的制备方法，其具体步骤与实施例3大致相同，不同之处在于氯化锌溶液的浓度为0.05mmol/L。
实施例7
本实施例提供一种内部包裹锌离子的纳米颗粒的制备方法，其具体步骤与实施例3大致相同，不同之处在于氯化锌溶液的浓度为0.10mmol/L。
实施例8
本实施例提供一种内部包裹锌离子的纳米颗粒的制备方法，其具体步骤与实施例3大致相同，不同之处在于氯化锌溶液的浓度为0.5mmol/L。
实施例9
本实施例提供一种内部包裹锌离子的纳米颗粒的制备方法，其具体步骤与实施例3大致相同，不同之处在于氯化锌溶液的浓度为1.0mmol/L。
实施例10
本实施例提供一种内部包裹锌离子的纳米颗粒的制备方法，其具体步骤与实施例3大致相同，不同之处在于氯化锌溶液的浓度为2.5mmol/L。
实施例11
本实施例提供一种内部包裹锌离子的纳米颗粒的制备方法，其具体步骤与实施例3大致相同，不同之处在于氯化锌溶液的浓度为5mmol/L。
实施例12
本实施例提供一种医用材料的制备方法，其包括以下步骤：
首先，将2mg/mL的三羟甲基氨基甲烷溶液与等体积的3mg/mL的多巴胺溶液混合形成混合溶液，将316L不锈钢板在混合溶液中静置12h，并经过三次水洗后37℃烘干备用。
其次，制备内部包裹锌离子的纳米颗粒，具体方法与实施例3相同。
最后，将表面沉积有聚多巴胺涂层的不锈钢板浸泡在纳米颗粒悬浊液中，在室温下震荡反应24小时，然后分别用磷酸盐缓冲液和双蒸水漂洗。
实施例13
本实施例提供一种医用材料的制备方法，具体步骤与实施例12大致相同，不同之处在于：内部包裹锌离子的纳米颗粒的制备过程中氯化锌溶液的浓度为0.05mmol/L。
实施例14
本实施例提供一种医用材料的制备方法，具体步骤与实施例12大致相同，不同之处在于：内部包裹锌离子的纳米颗粒的制备过程中氯化锌溶液的浓度为0.5mmol/L。
实施例15
本实施例提供一种医用材料的制备方法，具体步骤与实施例12大致相同，不同之处在于：内部包裹锌离子的纳米颗粒的制备过程中氯化锌溶液的浓度为5mmol/L。
对比例1
本对比例提供一种纳米颗粒的制备方法，其具体步骤与实施例3大致相同，不同之处在于：氯化锌溶液用等体积的去离子水代替。
对比例2
本对比例提供一种材料的制备方法，其包括以下步骤：将0.05mmol/L的氯化锌溶液和5mg/mL的肝素钠溶液混合后，将混合液滴加至浓度为0.5mg/mL、重均分子量为200KDa的多聚赖氨酸溶液中，搅拌6h。其中，氯化锌溶液、多聚赖氨酸溶液和肝素钠溶液的体积比约为1:1:2。
对比例3
本对比例提供一种医用材料的制备方法，其包括：将2mg/mL的三羟甲基氨基甲烷溶液与等体积的3mg/mL的多巴胺溶液混合形成混合溶液，将316L不锈钢板在混合溶液中静置12h，并经过三次水洗后37℃烘干备用。(即只包括聚多巴胺涂层)
试验例1
将实施例3-11以及对比例1中制备的产品过滤后得到的固体进行动态光散射粒径检测、以及Zeta电位检测，结果见图2和图3。图中，NPZn0表示对比例1，NPZn0-NPZn5依次代表实施例3-11。
由图2可知，纳米颗粒的粒径直径大概分布在120nm-160nm，尺寸比较均一。由图3可知，纳米颗粒的ZETA电位为20mV到25mV之间，颗粒有一定稳定性。
试验例2
实施例11和对比例1中得到的产品进行透射电镜分析，结果如图4。图4显示纳米颗粒有一定分散性，分散效果较好。而对比例2中变化反应顺序后制备得到的产品并不是包裹锌离子的纳米颗粒的形式，不具有延迟高剂量的锌发挥其生物作用的效果。
试验例3
测试实施例13-15中制备得到的医用材料中锌元素的密度。测试结果显示，实施例13-15中锌离子密度依次为3.61ng/cm2、115.08ng/cm2和273.94ng/cm2可见，样品表面锌的密度与引入锌离子的浓度成剂量依赖性，说明锌离子成功引入材料表面，且样品表面锌有差异。
试验例4
测试实施例13-15以及对比例1和对比例3中制备的产品对内皮细胞活性的影响，并用不锈钢板进行对照，采用荧光显微镜测试材料表面培养内皮细胞的荧光图，结果见图5。图5中，SS表示不锈钢材料、DM表示对比例3(材料上仅负载聚多巴胺涂层)、NPZn0表示对比例1、NPZn0.05表示实施例13、NPZn0.5表示实施例14、NPZn5表示实施例15。
测试方法：在材料表面种同种浓度的内皮细胞株，生长一天，通过罗丹明染料对细胞的线粒体染色，采用荧光显微镜测试材料表面培养内皮细胞的荧光图。
从图5可知，随着接枝纳米颗粒中锌离子含量的增加，材料表面内皮细胞数量增加，细胞形态更加铺展，展现更好的内皮细胞友好性。
试验例5
测试实施例13-15以及对比例1和对比例3中制备的产品对平滑肌细胞活性的影响，并用不锈钢板进行对照，采用荧光显微镜测试材料表面培养平滑肌细胞的荧光图，测试方法参照试验例4，测试结果见图6。
从图6可知，随着接枝纳米颗粒中锌离子含量的增加，材料表面平滑肌细胞数量增加，细胞形态更加铺展，展现更好的平滑肌细胞友好性。
综上所述，本发明提供了一种内部包裹锌离子的纳米颗粒的制备方法，其通过先将锌盐和多聚赖氨酸溶液混合使多聚赖氨酸上的氨基基团与锌离子配位形成螯合物，然后通过螯合物中多聚赖氨酸所带正电荷与具有很强负电荷的肝素进行静电结合形成纳米颗粒。通过锌离子和多聚赖氨酸的螯合可以引入更高剂量的锌元素，并且在加载于医用材料之后引入的锌元素可以延迟高剂量的锌发挥其生物作用。
本发明还提供了一种内部包裹锌离子的纳米颗粒，其由肝素包裹由多聚赖氨酸与锌离子形成的螯合物，制备得到的纳米颗粒中锌离子的含量可调，可以引入高剂量的锌元素，并且这种引入锌元素的方式可以延迟高剂量的锌发挥其生物作用。这种具有凝血功能且锌离子含量更高、锌离子释放效果缓慢的材料可以在制备含锌医用材料中得到应用。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种内部包裹锌离子的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将锌盐溶液与多聚赖氨酸溶液混合反应后得到锌离子螯合液；
将所述锌离子螯合液与肝素盐溶液混合反应。
2.根据权利要求1所述的内部包裹锌离子的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述多聚赖氨酸溶液中所用多聚赖氨酸的重均分子量为150-300KDa，所述多聚赖氨酸溶液的浓度为0.3-1.0mg/mL。
3.根据权利要求2所述的内部包裹锌离子的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述锌盐溶液的浓度为0.0005-10mmol/L。
4.根据权利要求3所述的内部包裹锌离子的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述肝素盐溶液的浓度为5-10mg/mL；
优选地，所述多聚赖氨酸溶液、所述锌盐溶液和所述肝素盐溶液的体积比为1:0.9-1.1:1.8-2.2。
5.根据权利要求1所述的内部包裹锌离子的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述锌盐选自氯化锌、硫酸锌和硝酸锌中的任意一种，优选为氯化锌。
6.根据权利要求1所述的内部包裹锌离子的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述肝素盐溶液为肝素钠溶液或肝素钾溶液。
7.根据权利要求1所述的内部包裹锌离子的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述锌离子螯合液的制备过程是将所述锌盐溶液滴加至所述多聚赖氨酸溶液中。
8.根据权利要求1所述的内部包裹锌离子的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述锌离子螯合液与所述肝素盐溶液的混合反应过程是将所述肝素盐溶液滴加至所述锌离子螯合液中；
优选地，所述肝素盐溶液和所述锌离子螯合液的反应温度为20-30℃。
9.一种内部包裹锌离子的纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒的制备过程包括将锌盐溶液与多聚赖氨酸溶液混合反应后得到锌离子螯合液；
将所述锌离子螯合液与肝素盐溶液混合反应；
更优选地，所述锌离子螯合液的制备过程是将所述锌盐溶液滴加至所述多聚赖氨酸溶液中，且所述锌离子螯合液与所述肝素盐溶液的混合反应过程是将所述肝素盐溶液滴加至所述锌离子螯合液中。
10.根据权利要求9中所述的纳米颗粒或权利要求1-8中任一项所述的制备方法制备得到的所述纳米颗粒在制备含锌医用材料中的应用。
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