CN107486177B - 具有多亲和位点的磁性金属-有机骨架纳米球及其制备方法与应用 - Google Patents

具有多亲和位点的磁性金属-有机骨架纳米球及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有多亲和位点的磁性金属‑有机骨架纳米球及其制备方法与应用，该磁性金属‑有机骨架纳米球由Fe3O4磁球，包覆于磁球表面的高分子聚合物中间层、生长于高分子聚合物中间层上的金属‑有机骨架以及接枝于金属‑有机骨架上的精氨酸构成。本发明提供的磁性金属‑有机骨架纳米球，以Fe3O4磁球作为内核，具有很好的磁响应性能；在磁球表面引入金属‑有机骨架，并通过精氨酸对有机配体表面进行修饰，由于构成金属‑有机骨架的金属离子以及精氨酸上带有的胍基等均可作为富集磷酸化多肽的多个亲和位点，同时实现对于单磷酸化位点和多磷酸化位点的磷酸化多肽的富集，具有很高的富集效率，在研究生理行为蛋白磷酸化过程中具有十分重要的意义。

Description

具有多亲和位点的磁性金属-有机骨架纳米球及其制备方法 与应用
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，涉及磁性金属-有机骨架纳米球及其制备方法与应用。
背景技术
磁性金属-有机骨架纳米球由磁性纳米球及包裹在磁性纳米球表面的金属-有机骨架(Metal-Organic Frameworks,MOFs)构成，在具有良好磁响应性能的同时，兼具了MOFs的孔隙率高、机械性能优良、芳香配体丰富以及表面性能易于调整等独特性质，因此，近年来磁性金属-有机骨架纳米球备受关注，已经被广泛应用于生物医学领域，尤其是蛋白或多肽分离、药物传递、磁共振成像等方面。
磁性金属-有机骨架纳米球通常是通过层层自组装的技术来制备：(1)文献FacilePreparation of Core_Shell Magnetic Metal_Organic Framework Nanoparticles forthe Selective Capture of Phosphopeptides(ACS Appl.Mater.Interfaces 2015,7,16338-16347，Weibing Zhang等)公开了一种磁性金属-有机骨架纳米球的制备方法，以Fe3+作为金属离子，三甲基苯作为有机配体，首先用甲基丙烯酸甲酯(Methyl methacrylate，MMA)包裹磁性纳米球，然后将磁性纳米球加入到Fe3+溶液中搅拌15min，之后取出清洗，再在加入三甲基苯溶液中搅拌30min，完成一次自组装，如此重复31次，获得磁性金属-有机骨架纳米球，这种方法虽然可以调控金属-有机骨架层的厚度，但其操作非常繁琐、耗时，不利于批量化生产；(2)文献Fabrication of a magnetic nanoparticle embedded NH2-MIL-88BMOF hybrid for highly efficient covalent immobilization of lipase(RSC Adv.,2016,6,66385–66393,Sumanta Kumar Sahu等)公开了一种磁性金属-有机骨架纳米球的制备方法，直接将磁性纳米球、含有金属离子的溶液和有机配体加入到盛有二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide，DMF)溶剂的反应釜中，于高温高压(温度高达170℃)下反应制备得到磁性金属-有机骨架纳米球，虽然该制备方法比较简单，操作步骤较少，但其获得的磁性金属-有机骨架纳米球形貌较差，难以通过实验参数的调节来控制形貌，且高温高压条件相对比较苛刻，难以调控；(3)文献The design and synthesis of a hydrophilic core–shell–shell structured magnetic metal-organic framework as a novelimmobilized metal ion affinity platform for phosphoproteome research(Chem.Commun.,2014,50,6228-6231,Chunhui Deng等)公开了一种磁性金属-有机骨架纳米球制备方法，首先在四氧化三铁表面包裹一层对Zr4+金属离子有螯合作用的聚多巴胺(Polydopamine，PDA)，然后再通过一锅法在包裹了PDA的超顺磁性四氧化三铁表面原位生长一层金属-有机骨架，最终获得形貌规整的磁性金属-有机骨架纳米球，这种方法利用高分子层螯合金属离子，从而有利于金属-有机骨架的原位生长，这对合成磁性金属-有机骨架纳米球是至关重要的，然而由于PDA本身粘性大的缘故，导致磁球在表面包裹PDA后团聚现象比较明显，分散性能较差，不利于下一步磁球表面金属-有机骨架的合成。另一方面PDA对于二价或三价金属离子螯合作用没有对于四价金属离子螯合作用强，从而在一定程度上限制了其在磁性金属-有机骨架纳米球制备中的应用。
另外，从磁性金属-有机骨架纳米球对于磷酸化多肽(带有磷酸化基团的多肽)的富集应用方面看，几乎所有富集磷酸化多肽的亲和位点都只用到了磁性金属-有机骨架结构中的金属离子(参见文献Facile Preparation of Core_Shell Magnetic Metal_Organic Framework Nanoparticles for the Selective Capture of Phosphopeptides，ACS Appl.Mater.Interfaces 2015,7,16338-16347,Weibing Zhang等以及The designand synthesis of a hydrophilic core–shell–shell structured magnetic metal-organic framework as a novel immobilized metal ion affinity platform forphosphoproteome research，Chem.Commun.,2014,50,6228-6231,Chunhui Deng等)，而忽视了磁性金属-有机骨架结构中大量存在的有机配体，使得磁性金属-有机骨架纳米球对于磷酸化多肽的富集效率较低，继而限制了磁性金属-有机骨架纳米球在生物医学蛋白多肽分离富集方面的应用。
发明内容
本发明的目的旨在针对上述现有技术中存在的问题，提供一种具有多亲和位点的磁性金属-有机骨架纳米球，既可实现对具有单磷酸化位点的磷酸化多肽的富集，又可实现对具有多磷酸化位点的磷酸化多肽的富集，并可提高对磷酸化多肽的富集效率。
本发明另一目的旨在提供一种反应调节温和、操作简单、制备成本低的制备方法，用于制备上述具有多亲和位点的磁性金属-有机骨架纳米球。
本发明再一目的旨在提供上述具有多亲和位点的磁性金属-有机骨架纳米球在磷酸化多肽富集方面的应用。
本发明提供了一种具有多亲和位点的磁性金属-有机骨架纳米球，该磁性金属-有机骨架纳米球由Fe3O4磁球，包覆于Fe3O4磁球表面的高分子聚合物中间层、生长于高分子聚合物中间层上的金属-有机骨架以及接枝于金属-有机骨架上的精氨酸构成；所述高分子聚合物中间层含有用于螯合金属离子的聚乙烯吡咯烷酮；所述金属-有机骨架是由金属离子与含有至少一个氨基的氨基衍生有机配体通过配位作用形成；所述精氨酸接枝于氨基衍生有机配体上。
上述具有多亲和位点的磁性金属-有机骨架纳米球，呈现完整的球形，粒径均匀且分布较窄，平均粒径约为300nm～500nm，这种形状规整、尺寸均匀的纳米球比较适合用于蛋白多肽的富集与分离应用。该磁性金属-有机骨架纳米球以超顺磁性四氧化三铁(Fe3O4磁球)作为内核，具有高的磁饱和强度，从而对外加磁场具有很好的磁响应性能；本发明采用的Fe3O4磁球约占磁性金属-有机骨架纳米球质量的50-75％，从而使磁性金属-有机骨架纳米球的比饱和磁化强度达到50-70emu g-1。包裹在Fe3O4磁球表面的高分子聚合物中间层作为过渡层，高分子聚合物中间层中的聚乙烯吡咯烷酮用于螯合金属离子，促进金属-有机骨架在Fe3O4磁球表面生长，相比于已经报道过的聚多巴胺(PDA)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的优势在于：(1)使包裹高分子聚合物中间层后得磁球具有良好的分散性能，利于后面在磁球表面合成金属-有机骨架层；(2)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)能很好的螯合二价，三价或者四价的金属离子。为了进一步增加材料的亲水性，有利于聚乙烯吡咯烷酮包覆在Fe3O4磁球表面，高分子聚合物中间层还含有聚醚酰亚胺(PEI)或聚丙烯酸(PAA)。对于形成金属-有机骨架的金属离子和有机配体的选择需要满足以下要求：(1)金属离子本身就可以作为富集磷酸化多肽的一种亲和位点，(2)有机配体可以用于接枝精氨酸，为引入第二种富集磷酸化多肽的亲和位点做准备；因此，金属离子可以为具有磷酸化多肽富集功能的Zn2+、Fe3+或者Zr4+等，有机配体为氨基衍生有机配体，有机配体上的氨基与精氨酸的羧基发生缩合反应从而使精氨酸接枝到金属-有机骨架上，氨基衍生有机配体可以为2-氨基对苯二甲酸(NH2-BDC)、2-氨基-4,4’-联苯二甲酸(NH2-BPDC)或者2’-氨基-1,1’：4’，1”-三联苯,4,4”-二羧酸(NH2-TPBC)等。精氨酸上带有对磷酸化多肽具有富集作用的胍基，此外精氨酸上还带有对磷酸化多肽具有亲和作用的氨基，所以引入精氨酸一个分子相当于引入了两种亲和位点。由此可见本发明提供的磁性金属-有机骨架纳米球具有三种亲和位点，能同时实现对于单磷酸化位点和多磷酸化位点的磷酸化多肽的富集，具有很高的磷酸化多肽富集效率。
本发明通过选择合适的聚乙烯吡咯烷酮或者聚乙烯吡咯烷酮与另一亲水性聚合物的组合作为高分子聚合物中间层，可以实现对大多数多种价态金属离子(如Zn2+，Fe3+，Zr4 +等)的螯合；同时选择非传统的氨基衍生有机配体，并利用合成后修饰的技术在有机配体的氨基上接枝精氨酸，从而引入胍基，实现金属离子和有机配体同时作为磷酸化多肽亲和位点的目标。基于上述思路，本发明进一步提供了一种所述具有多亲和位点的磁性金属-有机骨架纳米球的制备方法，主要是通过外延生长和合成后修饰结合的策略来实现，具体步骤如下：
(1)制备Fe3O4/Polymer纳米粒子
在搅拌条件下于室温，按照聚乙烯吡咯烷酮与Fe3O4磁球的质量比(5～10)：1，向含有聚乙烯吡咯烷酮的高分子聚合物溶液中加入Fe3O4磁球，继续搅拌至少6小时得到第一混合液，对第一混合液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物洗涤去除未包覆在Fe3O4磁球表面的高分子聚合物，得到高分子聚合物中间层包覆的Fe3O4磁球，即Fe3O4/Polymer纳米粒子；所述高分子聚合物溶液的质量浓度为8mg/ml～80mg/ml，是由聚乙烯吡咯烷酮溶解于去离子水中形成，或者由聚乙烯吡咯烷酮与聚醚酰亚胺或聚丙烯酸按照质量比(1～10)：1溶解于去离子水中形成；
(2)制备Fe3O4/Polymer/MOFs
将Fe3O4/Polymer纳米粒子均匀分散到DMF中，得到Fe3O4/Polymer纳米粒子悬浮液，将DMF和去离子水混合均匀得到混合溶剂，在搅拌条件下于100～150℃将Fe3O4/Polymer纳米粒子悬浮液加入到混合溶剂中得到第二混合液，向第二混合液中加入含有金属离子的可溶性无机盐，搅拌3min～10min后再加入氨基衍生有机配体，继续在搅拌条件下于100～150℃反应至少1小时得到第一反应液，对第一反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物洗涤去除未反应的物料得到生长于高分子聚合物中间层上的金属-有机骨架，即Fe3O4/Polymer/MOFs；
用于分散Fe3O4/Polymer纳米粒子的DMF以及混合溶剂中DMF之和与混合溶剂中去离子水的体积比为(5～8)：1，混合溶剂的用量为能完全溶解无机盐和氨基衍生有机配体；所述Fe3O4/Polymer纳米粒子与无机盐中金属离子的质量比为200：(11～110)；所述金属离子与氨基衍生有机配体摩尔比为(1～3)：1；
(3)在Fe3O4/Polymer/MOFs上接枝精氨酸
将精氨酸溶解于去离子水中，得到精氨酸的水溶液；在搅拌条件下于室温向溶剂DMF或去离子水中加入精氨酸的水溶液和缩合剂，继续搅拌至缩合剂完全溶解得到第一溶液；随后在搅拌条件下于室温向第一溶液中加入有机碱，继续搅拌至有机碱和第一溶液混合均匀得到第二溶液；继后在搅拌条件下于室温向第二溶液中加入步骤(2)得到的Fe3O4/Polymer/MOFs，在搅拌条件下于室温进行缩合反应，反应时间为至少12h，反应结束得到第二反应液，对第二反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物洗涤去除未反应的物料得到接枝有精氨酸的磁性金属-有机骨架纳米球；
所述溶剂DMF或去离子水的用量为能完全溶解缩合剂和有机碱；所述精氨酸与缩合剂摩尔比1：(1-3)；所述缩合剂为由1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺按照摩尔比(1～3)：1组成的复合缩合剂、由1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑按照摩尔比(1～3)：1组成的复合缩合剂或者由N,N’-二环己基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑按照摩尔比(1～3)：1组成的复合缩合剂；所述有机碱与缩合剂中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐或N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比大于1；所述精氨酸与Fe3O4/Polymer/MOFs质量比为(0.2～2)：1。
上述具有多亲和位点的磁性金属-有机骨架纳米球的制备方法，所述Fe3O4磁球主要是以氯化铁、醋酸铵、柠檬酸钠为原料，以乙二醇为溶剂的水热法合成粒径大概在200nm～300nm的超顺磁性四氧化三铁纳米球，通过加入柠檬酸钠可以调节磁球表面修饰上羧基从而带负电位，为下一步通过静电吸附原理包覆高分子聚合物中间层做准备；此外通过调节水热反应时间可调控磁球粒径分布。制备Fe3O4磁球的具体实现方式可以参考现有技术中已经披露的常规制备方法得到，参见The design and synthesis of a hydrophiliccore–shell–shell structured magnetic metal-organic framework as a novelimmobilized metal ion affinity platform for phosphoproteome researchChem.Commun.,2014,50,6228—6231,Chunhui Deng等以及Ti4+-immobilized multilayerpolysaccharide coated magnetic nanoparticles for highly selective enrichmentof phosphopeptides J.Mater.Chem.B 2014,2,4473-4480,Hanfa Zou等。
上述具有多亲和位点的磁性金属-有机骨架纳米球的制备方法，所述步骤(1)采用磁力搅拌方式，在磁力搅拌600rpm～700rpm转速下，首先用去离子水作为溶剂溶解聚乙烯吡咯烷酮或聚乙烯吡咯烷酮与另一种亲水性聚合物配制成高分子聚合物溶液，然后加入Fe3O4磁球，利用物理包覆原理(高分子聚合物溶液仅含有聚乙烯吡咯烷酮时)或静电吸附与物理包覆结合原理(高分子聚合物溶液同时含有聚乙烯吡咯烷酮和另一种亲水性聚合物)在Fe3O4磁球表面包裹一层高分子聚合物中间层。当高分子聚合物溶液中含有另一种亲水性聚合物(聚醚酰亚胺或聚丙烯酸)时，具有以下优势：(1)聚醚酰亚胺或聚丙烯酸具有良好亲水性，有助于聚乙烯吡咯烷酮包裹在Fe3O4磁球表面；(2)聚醚酰亚胺或聚丙烯酸带正电，可以与带负电的Fe3O4磁球通过静电吸附原理，提高聚乙烯吡咯烷酮和聚醚酰亚胺/聚丙烯酸对Fe3O4磁球的包覆效果，还可以根据得到的Fe3O4/Polymer纳米粒子带电性对聚乙烯吡咯烷酮/聚醚酰亚胺或聚丙烯酸的包覆效果进行表征；聚乙烯吡咯烷酮与聚醚酰亚胺或聚丙烯酸质量比优选为(1～5)：1，当聚醚酰亚胺或聚丙烯酸太少时，会使Fe3O4/Polymer纳米粒子亲水性变差，从而使Fe3O4/Polymer纳米粒子在水中分散，会影响制备的最终材料的形貌。所述步骤(1)可以用磁铁对第一混合液进行磁分离，分离出的固体产物，需要进一步用去离子水对固体产物清洗3～5遍，除去吸附在固体产物表面未包覆在Fe3O4磁球表面的高分子聚合物。
上述具有多亲和位点的磁性金属-有机骨架纳米球的制备方法，所述步骤(2)采用一锅法，在搅拌条件下向DMF和去离子水组成的混合溶剂中加入含有金属离子的无机盐，再加入氨基衍生有机配体反应得到Fe3O4/Polymer/MOFs。混合溶剂中DMF为主要溶剂，去离子水可以加强金属离子的电离；加入无机盐后搅拌3min～10min，可以使金属离子尽量螯合在Fe3O4/Polymer纳米粒子表面，以有利于Fe3O4/Polymer纳米粒子表面合成MOFs。本发明采用油浴加热以提供恒定的温度。为了避免Fe3O4/Polymer纳米粒子在混合溶剂中产生团聚，确保Fe3O4/Polymer纳米粒子在混合溶剂中的分散性，上述搅拌方式采用的是机械搅拌，转速为700rpm～800rpm。本发明通过调整反应时间可以控制生长在Fe3O4/Polymer纳米粒子表面金属-有机骨架的厚度。所述步骤(2)可以用磁铁对第一反应液进行磁分离，分离出的固体产物，需要进一步依次用DMF、乙醇和去离子水对固体产物清洗，除去吸附在固体产物表面未反应的物料(包括无机盐、氨基衍生有机配体等)，一般每种洗液洗涤3～5遍。所述氨基衍生有机配体为2-氨基对苯二甲酸、2-氨基-4,4’-联苯二甲酸或者2’-氨基-1,1’：4’，1”-三联苯,4,4”-二羧酸等；所述含有金属离子的可溶性无机盐为含Zn2+、Fe3+或者Zr4+等的盐酸盐、硝酸盐或者硫酸盐。
上述具有多亲和位点的磁性金属-有机骨架纳米球的制备方法，所述步骤(2)中，将Fe3O4/Polymer纳米粒子悬浮液加入到混合溶剂之前，先向混合溶剂中加入有机酸调节混合溶剂pH值为4.6～5.8，有利于金属-有机骨架在Fe3O4磁球表面原位生长，从而避免生产游离的金属-有机骨架；所述有机酸为乙酸、柠檬酸或抗坏血酸。
上述具有多亲和位点的磁性金属-有机骨架纳米球的制备方法，所述步骤(3)通过缩合反应，将精氨酸接枝于Fe3O4/Polymer/MOFs的有机配体上。本发明缩合反应采用的缩合剂是由1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)按照摩尔比(1～3)：1组成的复合缩合剂、由1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和1-羟基苯并三唑(HOBT)按照摩尔比(1～3)：1组成的复合缩合剂或者由N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)和1-羟基苯并三唑(HOBT)按照摩尔比(1～3)：1组成的复合缩合剂。缩合反应采用的溶剂可以为去离子水或DMF，当采用DMF时，可以有效保证缩合反应的效率。本发明缩合反应中所采用的有机碱可以在为缩合反应提供碱性环境的同时，起到稳定缩合剂的作用，所述有机碱可以为三乙胺或N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)等；所述三乙胺或N,N-二异丙基乙胺与缩合剂中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐或N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为(1.5～3)：1。缩合反应时间可以根据原料量进行调整，本发明缩合反应时间为12-72h。所述步骤(3)可以用磁铁对第二反应液进行磁分离，分离出的固体产物，需要进一步用去离子水对固体产物清洗3～5遍，除去吸附在固体产物表面未反应的物料(包括精氨酸、缩合剂、有机碱等)。
本发明进一步提供了所述具有多亲和位点的磁性金属-有机骨架纳米球在磷酸化多肽富集中的应用；所述磁性金属-有机骨架纳米球能够实现同时对单磷酸化位点和多磷酸化位点的磷酸化多肽的富集，且磁性金属-有机骨架纳米球对生物样本脱脂牛奶中的磷酸化多肽也具有很好的富集效果，因此本发明提供的磁性金属-有机骨架纳米球在研究生理行为蛋白磷酸化过程中具有很重要的意义。其具体方式为：首先要将磷酸化蛋白β-酪蛋白或者脱脂牛奶用胰蛋白酶消化成磷酸化多肽，用缓冲液进行稀释，然后加入磁性金属-有机骨架纳米球混合搅拌，在室温下利用摇床摇动20min-2h使磷酸化多肽都富集在磁球表面，再在外加磁场的作用下利用磁分离将纳米球从混合液中分离出来，将表面吸附了磷酸化多肽的纳米球加入到解吸附缓冲液中将磷酸化多肽从纳米球上解吸附下来。吸附磷酸化多肽的是纳米球表面接枝有精氨酸的金属-有机骨架，其中基于固定金属离子亲和色谱层析法(IMAC)原理的金属离子，结合有机配体利用氨基和胍基对于磷酸化多肽的亲和作用共同实现了对于磷酸化多肽的富集。通过减小缓冲溶液的pH实现了被吸附磷酸化多肽从纳米球表面脱离，从而实现了磷酸化多肽的富集和分离。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供的磁性金属-有机骨架纳米球，以Fe3O4磁球作为内核，具有很好的磁响应性能；在Fe3O4磁球表面引入金属-有机骨架，并通过精氨酸对有机配体表面进行修饰，由于构成金属-有机骨架的金属离子以及精氨酸上带有的胍基等均可作为富集磷酸化多肽的多个亲和位点，从而能同时实现对于单磷酸化位点和多磷酸化位点的磷酸化多肽的富集，具有很高的磷酸化多肽富集效率，在研究生理行为蛋白磷酸化过程中具有十分重要的意义；
2、本发明提供的磁性金属-有机骨架纳米球，呈现规则的球形，粒径均匀且分布较窄，平均粒径在300～500nm，适合用于蛋白多肽的富集和分离应用；
3、本发明提供的磁性金属-有机骨架纳米球，在Fe3O4磁球表面引入金属-有机骨架，其有机无机杂化的网络结构使得纳米球具有极好的稳定性，有利于纳米球不容易降解或者坍塌，可以长时间保持其形貌，便于磁性金属-有机骨架纳米球的推广应用；
4、本发明提供的磁性金属-有机骨架纳米球的制备方法，首先在Fe3O4磁球表面包裹上高分子聚合物中间层，然后通过外延生长方式包裹一层金属-有机骨架，最后在金属-有机骨架结构中的有机配体上修饰具有磷酸化多肽亲和位点的精氨酸，整个过程操作简单、反应条件温和，并且可在短时间内制备得到磁性金属-有机骨架纳米球，因此易于在生物医药领域内推广；
5、本发明提供的磁性金属-有机骨架纳米球的制备方法，在Fe3O4/Polymer纳米粒子外延生长金属-有机骨架过程中，以DMF和去离子水作为的混合溶剂，有助于金属离子的电离及熬合，进一步通过添加有机酸调节反应体系的pH值，更有利于金属-有机骨架在Fe3O4/Polymer纳米粒子表面原位生长，从而提高金属-有机骨架在Fe3O4/Polymer纳米粒子表面的螯合效果。
附图说明
图1为本发明所述磁性金属-有机骨架纳米球的结构表征及其制备方法流程图。
图2为本发明实施例8制备的Fe3O4/Polymer纳米粒子(a)以及实施例14制备的Fe3O4/Polymer/MOFs(b)的形貌表征图。
图3为Fe3O4磁球(a)、实施例8制备的Fe3O4/Polymer纳米粒子(b)、实施例14制备的Fe3O4/Polymer/MOFs(c)以及实施例16制备的接枝有精氨酸的磁性金属-有机骨架纳米球(d)的粒径表征图。
图4为Fe3O4磁球(a)、实施例8制备的Fe3O4/Polymer纳米粒子(b)、实施例14制备的Fe3O4/Polymer/MOFs(c)以及实施例16制备的接枝有精氨酸的磁性金属-有机骨架纳米球(d)的表面电位表征图。
图5为Fe3O4磁球(a)、实施例8制备的Fe3O4/Polymer纳米粒子(b)以及实施例14制备的Fe3O4/Polymer/MOFs(c)的X射线衍射图谱。
图6为Fe3O4磁球(a)、实施例16制备的Fe3O4/Polymer/MOFs(b)以及实施例16制备的接枝有精氨酸的磁性金属-有机骨架纳米球(c)在-18000Oe到18000Oe范围内的磁滞回线图谱。
图7为本发明所述磁性金属-有机骨架纳米球对于磷酸化多肽的富集与分离过程示意图。
图8为未经富集处理的β-酪蛋白消化液(a)、经实施例14制备的Fe3O4/Polymer/MOFs富集处理的β-酪蛋白消化液(b)以及经实施例16制备的接枝有精氨酸的磁性金属-有机骨架纳米球富集处理的β-酪蛋白消化液(c)的MS图。
图9为未经富集处理的生物样本脱脂牛奶消化液(a)以及经实施例16制备的接枝有精氨酸的磁性金属-有机骨架纳米球富集处理的生物样本脱脂牛奶消化液(b)的MS图。
具体实施方式
以下将结合附图对本发明各实施例的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明所保护的范围。
本发明提出的磁性金属-有机骨架纳米球结构，如图1(D)所示，该磁性金属-有机骨架纳米球由Fe3O4磁球，包覆于Fe3O4磁球表面的高分子聚合物中间层、生长于高分子聚合物中间层上的金属-有机骨架以及接枝于金属-有机骨架上的精氨酸构成。本发明是基于图1给出的工艺流程制备磁性金属-有机骨架纳米球的，首先利用溶剂热法制备表面显负电性的Fe3O4纳米粒子；再依据静电作用、范德华力等相互作用，在制得的Fe3O4纳米粒子表面包覆一层高分子聚合物中间层，得到高分子聚合物中间层包覆的Fe3O4纳米球(Fe3O4/Polymer纳米粒子)；然后将金属无机盐、氨基衍生有机配体与Fe3O4/Polymer纳米粒子一起通过一锅法制备得到Fe3O4/Polymer/MOFs复合纳米材料；最后通过缩合反应，将精氨酸接枝到氨基衍生有机配体上。
为了对本发明提供的技术方案更加清楚，下面结合实施例给出更加详细的说明和解释。
以下实施例中采用的Fe3O4磁球的具体制备过程为：将原料1.157gFeCl3·6H2O、3.303g
NH4Ac(醋酸铵)和0.4gNa3CT(柠檬酸钠)加入到盛有60mL溶剂乙二醇的反应釜中，磁力搅拌1小时使上述原料混合均匀；然后移除搅拌子，将反应釜温度升至200℃，反应16小时；再将反应釜冷却至室温，对反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物；然后依次用乙醇对固体产物重复洗涤五次(10mL×5)、用去离子水对产物重复洗涤五次(10mL×5)即得到Fe3O4磁球。通过调节水热反应时间12～16h，可以调节得到的Fe3O4磁球粒径在200～300nm之间。
通过上述方法得到的纳米磁球可以很好的分散在水中，形成稳定的超顺磁性纳米颗粒悬浮液。对得到的Fe3O4磁球进行DLS(Dynamic Light Scattering，动态光散射)分析和Zeta电位分析，分析结果如图3(a)及图4(a)所示，从图中可以看出，Fe3O4磁球粒径在300nm左右，Fe3O4磁球表面电位为-20mV左右。
实施例1-实施例8制备Fe3O4/Polymer纳米粒子
按照表1称取原料，并结合表1中给出的工艺参数依据下述方法制备Fe3O4/Polymer纳米粒子：在搅拌条件下于室温，按照聚乙烯吡咯烷酮与Fe3O4磁球的质量比(5～10)：1，向含有聚乙烯吡咯烷酮的高分子聚合物溶液中加入Fe3O4磁球，继续搅拌至少6小时得到第一混合液，对第一混合液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物洗涤去除未包覆在Fe3O4磁球表面的聚合物，得到高分子聚合物中间层包覆的Fe3O4磁球，即Fe3O4/Polymer纳米粒子；所述高分子聚合物溶液的质量浓度为8mg/ml～80mg/ml，是由聚乙烯吡咯烷酮溶解于去离子水中形成，或者由聚乙烯吡咯烷酮与聚醚酰亚胺或聚丙烯酸按照质量比(1～10)：1溶解于去离子水中形成。
表1制备Fe3O4/Polymer纳米粒子的原料及其配比和工艺参数
对实施例2、实施例3、实施例7、实施例8得到的Fe3O4/Polymer纳米粒子进行DLS(Dynamic Light Scattering，动态光散射)分析和Zeta电位分析，分析结果如表2所示。
表2制备的Fe3O4/Polymer纳米粒子尺寸及带电性能表征
从表2中可以看出，通过调节聚乙烯吡咯烷酮和聚醚酰亚胺/聚丙烯酸的配比以及反应搅拌时间，可以调整包裹在Fe3O4磁球表面的高分子聚合物中间层的厚度；且采用大分子量的PVP更利于合成Fe3O4/Polymer纳米粒子，也更利于控制高分子聚合物中间层的厚度；由于PEI具有很好的亲水性，PEI的加入更有利于高分子聚合物中间层的形成，使高分子聚合物中间层的厚度调控范围更大，从而有利于后续金属-有机骨架的形成。此外，PEI本身显正电，可以用于表征包覆于Fe3O4表面的高分子聚合物中间层的多少。
实施例9-实施例12制备Fe3O4/Polymer/MOFs
按照表3称取原料，并结合表3中给出的工艺参数依据下述方法制备Fe3O4/Polymer/MOFs：将Fe3O4/Polymer纳米粒子均匀分散到DMF中，得到Fe3O4/Polymer纳米粒子悬浮液，在搅拌条件下于100～150℃将Fe3O4/Polymer纳米粒子悬浮液加入到DMF溶剂或由DMF与去离子水混合均匀得到的混合溶液中得到第二混合液，向第二混合液中加入含有金属离子的可溶性无机盐，搅拌3min～10min后再加入氨基衍生有机配体，继续在搅拌条件下于100～150℃反应至少1小时得到第一反应液，对第一反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物依次用DMF、乙醇、去离子水洗涤去除未反应的物料得到生长于高分子聚合物中间层上的金属-有机骨架，即Fe3O4/Polymer/MOFs。
表3制备Fe3O4/Polymer/MOFs的原料及其配比和工艺参数
实施例13制备Fe3O4/Polymer/MOFs
本实施例制备Fe3O4/Polymer/MOFs的步骤如下：将400mg实施例8制备的Fe3O4/Polymer纳米粒子均匀分散到1ml DMF中，得到Fe3O4/Polymer纳米粒子悬浮液，将13mlDMF、2ml去离子水混合均匀得到混合溶剂，向混合溶剂中加入乙酸调节混合溶剂的pH值为4.6，在转速为800rmp搅拌条件下于100℃将Fe3O4/Polymer纳米粒子悬浮液加入到调节pH值后的混合溶剂中得到第二混合液，向第二混合液中加入2.24mmolZn(NO3)2·6H2O，在转速为800rmp条件下搅拌5min后再加入1.12mmol NH2-BDC，继续在转速为800rmp搅拌条件下于100℃反应1小时得到第一反应液，对第一反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物依次用DMF、乙醇、去离子水洗涤(每种洗液用量及清洗次数为10ml×5次)去除未反应的物料得到生长于高分子聚合物中间层上的金属-有机骨架，即Fe3O4/Polymer/MOFs。
实施例14制备Fe3O4/Polymer/MOFs
本实施例制备Fe3O4/Polymer/MOFs的步骤如下：将400mg实施例8制备的Fe3O4/Polymer纳米粒子均匀分散到1ml DMF中，得到Fe3O4/Polymer纳米粒子悬浮液，将13mlDMF、2ml去离子水混合均匀得到混合溶剂，向混合溶剂中加入柠檬酸调节混合溶剂的pH值为5.8，在转速为800rmp搅拌条件下于100℃将Fe3O4/Polymer纳米粒子悬浮液加入到调节pH值后的混合溶剂中得到第二混合液，向第二混合液中加入3.36mmolZn(NO3)2·6H2O，在转速为800rmp条件下搅拌5min后再加入1.12mmol NH2-BDC，继续在转速为800rmp搅拌条件下于100℃反应2小时得到第一反应液，对第一反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物依次用DMF、乙醇、去离子水洗涤(每种洗液用量及清洗次数为10ml×5次)去除未反应的物料得到生长于高分子聚合物中间层上的金属-有机骨架，即Fe3O4/Polymer/MOFs。
对实施例9-实施例14得到的Fe3O4/Polymer/MOFs进行DLS(Dynamic LightScattering，动态光散射)分析和Zeta电位分析，分析结果如表4所示。
表4制备的Fe3O4/Polymer/MOFs尺寸及带电性能表征
从表4中可以看出，在Fe3O4/Polymer/MOFs制备中，当溶剂仅为DMF时(实施例9)，制备的Fe3O4/Polymer/MOFs粒径与Fe3O4/Polymer纳米粒子粒径差不多，Fe3O4/Polymer/MOFs表面电位与Fe3O4/Polymer纳米粒子表面电位相比，变化不大，说明合成的金属-有机骨架基本是游离状态，合成在Fe3O4/Polymer纳米粒子表面的很少。在Fe3O4/Polymer/MOFs制备中，当以DMF和去离子水的混合液作为混合溶剂时，制备的Fe3O4/Polymer/MOFs平均粒径在340nm～350nm左右(实施例10-实施例12)，表明生长在Fe3O4/Polymer纳米粒子表面的金属-有机骨架厚度在10nm-20nm左右，Fe3O4/Polymer/MOFs表面电位在5mV～-10mV左右，说明带负电的金属-有机骨架合成在Fe3O4/Polymer纳米粒子表面；这是由于水可以提高金属离子的电离，有利于Fe3O4/Polymer纳米粒子高分子聚合物中间层对金属离子的熬合作用，从而促进金属-有机骨架在Fe3O4/Polymer纳米粒子表面的原位生长，避免生成过多的游离的金属-有机骨架。在Fe3O4/Polymer/MOFs制备中，在以DMF和去离子水的混合液作为混合溶剂同时，加入有机酸调控反应体系在pH值为4.6～5.8，制备的Fe3O4/Polymer/MOFs平均粒径在360nm左右(实施例13-实施例14)，表明生长在Fe3O4/Polymer纳米粒子表面的金属-有机骨架厚度在20nm-30nm左右，Fe3O4/Polymer/MOFs表面电位可以达到-23mV，说明带负电的金属-有机骨架合成在Fe3O4/Polymer纳米粒子表面；这是由于偏酸性的反应环境，可以进一步促进金属-有机骨架在Fe3O4/Polymer纳米粒子表面的原位生长；由此可见，通过调控反应体系的pH值可以进一步控制合成金属-有机骨架层的厚度。
实施例15在Fe3O4/Polymer/MOFs上接枝精氨酸
将100mg精氨酸溶解于2ml去离子水中，得到精氨酸的水溶液；在磁力搅拌条件下于室温向13ml DMF中加入精氨酸的水溶液、73mg EDCI和22mg NHS，继续搅拌至EDCI和NHS完全溶解得到第一溶液；随后在磁力搅拌条件下于室温向第一溶液中加入80ul三乙胺，继续搅拌至三乙胺和第一溶液混合均匀得到第二溶液；继后在磁力搅拌条件下于室温向第二溶液中加入500mg实施例10制备的Fe3O4/Polymer/MOFs，在磁力搅拌条件下于常温反应12h得到第二反应液，对第二反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物依次用DMF、乙醇和去离子水洗涤(每种洗液用量及清洗次数为10ml×3次)去除未反应的物料得到接枝有精氨酸的磁性金属-有机骨架纳米球。
实施例16在Fe3O4/Polymer/MOFs上接枝精氨酸
将208mg精氨酸溶解于2ml去离子水中，得到精氨酸的水溶液；在磁力搅拌条件下于室温向13ml DMF中加入精氨酸的水溶液、345mg EDCI和243mg HOBT，继续搅拌至EDCI和HOBT完全溶解得到第一溶液；随后在磁力搅拌条件下于室温向第一溶液中加入590ulDIPEA，继续搅拌至DIPEA和第一溶液混合均匀得到第二溶液；继后在磁力搅拌条件下于室温向第二溶液中加入500mg实施例14制备的Fe3O4/Polymer/MOFs，在磁力搅拌条件下于常温反应24h得到第二反应液，对第二反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物依次用DMF、乙醇和去离子水洗涤(每种洗液用量及清洗次数为10ml×5次)去除未反应的物料得到接枝有精氨酸的磁性金属-有机骨架纳米球。
实施例17在Fe3O4/Polymer/MOFs上接枝精氨酸(Arg)
将1g精氨酸溶解于2ml去离子水中，得到精氨酸的水溶液；在磁力搅拌条件下于室温向13ml去离子水中加入精氨酸的水溶液、1.76g DCC和385mg HOBT，继续搅拌至DCC和HOBT完全溶解得到第一溶液；随后在磁力搅拌条件下于室温向第一溶液中加入4.46mlDIPEA，继续搅拌至三乙胺和第一溶液混合均匀得到第二溶液；继后在磁力搅拌条件下于室温向第二溶液中加入500mg实施例13制备的Fe3O4/Polymer/MOFs，在磁力搅拌条件下于常温反应72h得到第二反应液，对第二反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物依次用DMF、乙醇和去离子水洗涤(每种洗液用量及清洗次数为50ml×5次)去除未反应的物料得到接枝有精氨酸的磁性金属-有机骨架纳米球。
对实施例15-实施例17得到的接枝有精氨酸的磁性金属-有机骨架纳米球进行DLS(Dynamic Light Scattering，动态光散射)分析和Zeta电位分析，分析结果如表5所示。
表5制备的接枝有精氨酸的磁性金属-有机骨架纳米球尺寸及带电性能表征
从表5中可以看出，虽然接枝有精氨酸的磁性金属-有机骨架纳米球与Fe3O4/Polymer/MOFs相比，粒径变化不大，但是接枝有精氨酸的磁性金属-有机骨架纳米球表面电位为正，说明精氨酸已经被成功接枝到了Fe3O4/Polymer/MOFs表面上。在制备接枝有精氨酸的磁性金属-有机骨架纳米球过程中，当采用DMF作为溶剂时，缩合反应具有较高的反应效率，可以缩短磁性金属-有机骨架纳米球的制备时间，节约制备成本。
为了探究高分子聚合物中间层以及接枝有精氨酸的金属-有机骨架是否成功复合到Fe3O4纳米磁球上，对Fe3O4磁球、实施例8制备的Fe3O4/Polymer纳米粒子、实施例14制备的Fe3O4/Polymer/MOFs以及实施例16制备的接枝有精氨酸的磁性金属-有机骨架纳米球的形貌尺寸和微观结构进行了表征如图2至图4所示。
(1)形貌
将实施例8制备的Fe3O4/Polymer纳米粒子和实施例14制备的Fe3O4/Polymer/MOFs纳米球悬浮滴加到铜网上，自然干燥后用JEM-CX100透射电子显微镜(TEM)进行观察，结果如图2所示；从图2可以看出，制备的Fe3O4/Polymer纳米粒子以及Fe3O4/Polymer/MOFs均成大小均一、形貌规整的球形；此外，从图2(a)看出，Fe3O4/Polymer纳米粒子由于高分子聚合物中间层的包覆，其表面十分光滑，而图2(b)中，纳米球表面呈现粗糙的网络结构，这证明金属-有机骨架成功地合成到了Fe3O4/Polymer纳米粒子表面。
(2)尺寸分布
对Fe3O4磁球、实施例8制备的Fe3O4/Polymer纳米粒子、实施例14制备的Fe3O4/Polymer/MOFs以及实施例16制备的接枝有精氨酸的磁性金属-有机骨架纳米球进行DLS(Dynamic Light Scattering，动态光散射)分析，分析结果附图3所示，Fe3O4磁球、Fe3O4/Polymer纳米粒子、Fe3O4/Polymer/MOFs以及接枝有精氨酸的磁性金属-有机骨架纳米球平均粒径分别为302.2±5.1nm、320.8±4.6nm、360.6±8.4nm、365.4±6.8nm，因此包裹在Fe3O4磁球表面的高分子聚合物中间层厚度为10nm左右、生长在Fe3O4/Polymer纳米粒子表面的金属-有机骨架层厚度为20nm左右；从而说明金属-有机骨架成功地合成到了Fe3O4/Polymer纳米粒子表面；此外，接枝有精氨酸的磁性金属-有机骨架纳米球平均粒径相比于Fe3O4/Polymer/MOFs粒径变化不大，说明金属-有机骨架受缩合反应环境影响不大，可以使磁球保持良好的形貌。
(3)微观结构
对Fe3O4磁球、实施例8制备的Fe3O4/Polymer纳米粒子、实施例14制备的Fe3O4/Polymer/MOFs以及实施例16制备的接枝有精氨酸的磁性金属-有机骨架纳米球进行Zeta电位分析，分析结果附图4所示，Fe3O4磁球、Fe3O4/Polymer纳米粒子、Fe3O4/Polymer/MOFs以及接枝有精氨酸的磁性金属-有机骨架纳米球表面电位分别为-20mV、+34.8mv、-23mV、+18.8mV，说明金属-有机骨架成功地合成到了Fe3O4/Polymer纳米粒子表面，同时精氨酸也已经被成功接枝到了Fe3O4/Polymer/MOFs表面上。
进一步采用X,Pert Pro MPD型X射线(XRD)仪分别对Fe3O4磁球、实施例8制备的Fe3O4/Polymer纳米粒子以及实施例14制备的Fe3O4/Polymer/MOFs进行检测，得到如图5所示的X射线衍射图谱，从图中可以看出，Fe3O4的衍射峰都出现在三个样本中，说明三种产物中都有Fe3O4，而图5(c)出现了金属-有机骨架的衍射峰，证明金属-有机骨架成功地合成到了Fe3O4/Polymer纳米粒子表面。
为了探究接枝有精氨酸的磁性金属-有机骨架纳米球的磁性能，采用Model BHV-525型振动样品磁强计(VSM)分别检测了Fe3O4磁球、实施例14制备的Fe3O4/Polymer/MOFs以及实施例16制备的接枝有精氨酸的磁性金属-有机骨架纳米球在-18000Oe到18000Oe范围内的磁滞回线，结果如图6所示，其中所得磁滞回线在磁场-100Oe至100Oe之间的部分见图6的插图所示；从图中可以看出，所有样品的磁滞回线均经过原点，无剩磁和矫顽力，说明Fe3O4磁球、Fe3O4/Polymer/MOFs、接枝有精氨酸的磁性金属-有机骨架纳米球都具有超顺磁性，其中接枝有精氨酸的磁性金属-有机骨架纳米球的饱和磁化强度达到63emu-1g-1。
本发明进一步提供了磁性金属-有机骨架纳米球在富集磷酸化多肽方面的应用，磁性金属-有机骨架纳米球对于磷酸化多肽的富集与分离过程，如图7所示，首先将接枝了精氨酸的磁性金属-有机骨架纳米球加入到待处理的样本中，然后在摇床中进行富集，时间可以根据样本多少进行调整，富集过程结束后通过磁分离方式将固体产物分离出来，之后再用解吸附的缓冲液对表面吸附有磷酸化多肽的磁球进行解吸附，从而得的含有磷酸化多肽的缓冲液。可以对得到的含有磷酸化多肽的缓冲液进行MS(Mass Spectrometry，质谱)分析，以进一步确定磁性金属-有机骨架纳米球对磷酸化多肽的富集效果。
应用例1β-酪蛋白消化液中磷酸化多肽的富集
取1mgβ-酪蛋白溶解在1ml 50Mm pH为8.2的NH4HCO3缓冲液里，再加入25ug的胰蛋白酶，37℃条件下消化16h；然后用第一缓冲液(体积浓度为50％的乙腈水溶液,其中含有摩尔浓度为0.1mol L-1的乙酸，即50％ACN-H2O，0.1mol L-1Hac)稀释到10-7M的浓度得到β-酪蛋白消化液。分别取1mg实施例14制备的Fe3O4/Polymer/MOFs纳米球以及实施例16制备的接枝了精氨酸(Arg)的磁性金属-有机骨架纳米球加入到两份100μlβ-酪蛋白消化液样本中，然后在摇床150-200rpm条件下于室温富集45min；之后用第一缓冲液清洗3遍(每次400μl)把非特异性吸附的多肽从磁球表面除去；最后将吸附了磷酸化多肽的磁球加入到20ul第二缓冲液(体积浓度为50％的乙腈水溶液,其中含有体积浓度为2％的三氟乙酸，即50％ACN-H2O containing 2％TFA)中，在摇床800-1200rpm剧烈摇动状态下解吸附20min，利用磁分离分离出磁球，得到解吸附液。然后每份样本取1μl解吸附液并取1μl未经富集处理的β-酪蛋白消化液进行质谱分析，分析结果如图8所示。
从图8可以看出，未经富集处理的β-酪蛋白消化液，用质谱检测得不到磷酸化多肽的信号【见图8(a)】；用未接枝精氨酸的Fe3O4/Polymer/MOFs纳米球只能特异性的富集单磷酸化位点的磷酸化多肽【见图8(b)，β1s、β2s为两个不同位置的单磷酸化位点的磷酸化多肽的特征峰】；而接枝了精氨酸的磁性金属-有机骨架纳米球能同时富集单磷酸化位点的磷酸化多肽和多磷酸化位点的磷酸化多肽【见图8(c)，β3m为多磷酸化位点的磷酸化多肽的特征峰】。同时从质谱特征峰的强度(选择同一条多肽β1s作为标记)可以看出接枝了精氨酸的磁性金属-有机骨架纳米球富集后的信号强度(6868)相对对于未接枝精氨酸的磁性金属-有机骨架纳米球富集后的信号强度(3632)明显更高。上述分析结果表明本发明所述的磁性金属-有机骨架纳米球实现同时对于单磷酸化位点和多磷酸化位点的磷酸化多肽的富集，同时具有很高的效率。
应用例2生物样本脱脂牛奶消化液中磷酸化多肽的富集
为了进一步考察磁性金属-有机骨架纳米球在富集磷酸化多肽方面的实用性，下面以脱脂牛奶消化液为生物样本，进行进一步的研究。
取30ul脱脂牛奶加入到1ml 25Mm pH为8.2的NH4HCO3缓冲液里，先14000rpm高速离心处理20min；取上清液在100℃高温下进行蛋白变性处理，时间为10min；然后向变性处理后的溶液中加入40ug胰蛋白酶，在37℃条件下消化16h，得到脱脂牛奶消化液；接下来取20μl消化液用200μl第一缓冲液(体积浓度为50％的乙腈水溶液,其中含有摩尔浓度为0.1mol L-1的乙酸，即50％ACN-H2O，0.1mol L-1Hac)进行稀释，将1mg实施例16制备的接枝有精氨酸的磁性金属-有机骨架纳米球加入到100ul上述稀释后的消化液中，然后在摇床150-200rpm条件下于室温富集45min，之后用第一缓冲液清洗3遍(每次400μl)，把非特异性吸附的多肽从磁球表面除去。最后将吸附了磷酸化多肽的磁球加入到20μl第二缓冲液(体积浓度为50％的乙腈水溶液,其中含有体积浓度为2％的三氟乙酸，即50％ACN-H2O containing2％TFA)中，在摇床800-1200rpm剧烈摇动状态下解吸附20min，利用磁分离分离出磁球，得到解吸附液。取1μl解吸附液和1μl未经富集处理的脱脂牛奶消化液进行质谱分析，分析结果如图9所示。
从图9可以看出，未经富集处理的脱脂牛奶消化液，用质谱检测几乎得不到磷酸化多肽的信号【见图9(a)】；经接枝有精氨酸的磁性金属-有机骨架纳米球富集处理的，能检测出10个信号相对较高的磷酸化多肽的特征峰【见图9(b)】。说明本发明提供的磁性金属-有机骨架纳米球对于复杂的生物样本也能特异性的选择性富集磷酸化多肽，有一定的实用性，在生物医药领域具有推广实用的潜在能力。

Claims (9)

1.具有多亲和位点的磁性金属-有机骨架纳米球，其特征在于该磁性金属-有机骨架纳米球由Fe3O4磁球，包覆于Fe3O4磁球表面的高分子聚合物中间层、生长于高分子聚合物中间层上的金属-有机骨架以及接枝于金属-有机骨架上的精氨酸构成；所述高分子聚合物中间层含有用于螯合金属离子的聚乙烯吡咯烷酮；所述金属-有机骨架是由金属离子与含有至少一个氨基的氨基衍生有机配体通过配位作用形成；所述精氨酸接枝于氨基衍生有机配体上。
2.根据权利要求1所述具有多亲和位点的磁性金属-有机骨架纳米球，其特征在于所述纳米球平均粒径为300nm～500nm。
3.根据权利要求1所述具有多亲和位点的磁性金属-有机骨架纳米球，其特征在于所述高分子聚合物中间层还含有聚醚酰亚胺或聚丙烯酸。
4.根据权利要求1至3任一权利要求所述具有多亲和位点的磁性金属-有机骨架纳米球，其特征在于所述金属-有机骨架中的金属离子为Zn2+、Fe3+或者Zr4+，氨基衍生有机配体为2-氨基对苯二甲酸、2-氨基-4,4’-联苯二甲酸或者2’-氨基-1,1’：4’,1”-三联苯,4,4”-二羧酸。
5.一种权利要求1至4中任一权利要求所述具有多亲和位点的磁性金属-有机骨架纳米球的制备方法，其特征在于步骤如下：
(1)制备Fe3O4/Polymer纳米粒子
在搅拌条件下于室温，按照聚乙烯吡咯烷酮与Fe3O4磁球的质量比(5～10)：1，向含有聚乙烯吡咯烷酮的高分子聚合物溶液中加入Fe3O4磁球，继续搅拌至少6小时得到第一混合液，对第一混合液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物洗涤去除未包覆在Fe3O4磁球表面的高分子聚合物，得到高分子聚合物中间层包覆的Fe3O4磁球，即Fe3O4/Polymer纳米粒子；所述高分子聚合物溶液的质量浓度为8mg/ml～80mg/ml，是由聚乙烯吡咯烷酮溶解于去离子水中形成，或者由聚乙烯吡咯烷酮与聚醚酰亚胺或聚丙烯酸按照质量比(1～10)：1溶解于去离子水中形成；
(2)制备Fe3O4/Polymer/MOFs
将Fe3O4/Polymer纳米粒子均匀分散到DMF中，得到Fe3O4/Polymer纳米粒子悬浮液，将DMF和去离子水混合均匀得到混合溶剂，在搅拌条件下于100～150℃将Fe3O4/Polymer纳米粒子悬浮液加入到混合溶剂中得到第二混合液，向第二混合液中加入含有金属离子的可溶性无机盐，搅拌3min～10min后再加入氨基衍生有机配体，继续在搅拌条件下于100～150℃反应至少1小时得到第一反应液，对第一反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物洗涤去除未反应的物料得到生长于高分子聚合物中间层上的金属-有机骨架，即Fe3O4/Polymer/MOFs；
用于分散Fe3O4/Polymer纳米粒子的DMF以及混合溶剂中DMF之和与混合溶剂中去离子水的体积比为(5～8)：1，混合溶剂的用量为能完全溶解无机盐和氨基衍生有机配体；所述Fe3O4/Polymer纳米粒子与无机盐中金属离子的质量比为200：(11～110)；所述金属离子与氨基衍生有机配体的摩尔比为(1～3)：1；
(3)在Fe3O4/Polymer/MOFs上接枝精氨酸
将精氨酸溶解于去离子水中，得到精氨酸的水溶液；在搅拌条件下于室温向溶剂DMF或去离子水中加入精氨酸的水溶液和缩合剂，继续搅拌至缩合剂完全溶解得到第一溶液；随后在搅拌条件下于室温向第一溶液中加入有机碱，继续搅拌至有机碱和第一溶液混合均匀得到第二溶液；继后在搅拌条件下于室温向第二溶液中加入步骤(2)得到的Fe3O4/Polymer/MOFs，在搅拌条件下于室温进行缩合反应，反应时间为至少12h，反应结束得到第二反应液，对第二反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物洗涤去除未反应的物料得到接枝有精氨酸的磁性金属-有机骨架纳米球；
所述溶剂DMF或去离子水的用量为能完全溶解缩合剂和有机碱；所述精氨酸与缩合剂摩尔比1：(1-3)；所述缩合剂为由1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺按照摩尔比(1～3)：1组成的复合缩合剂、由1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑按照摩尔比(1～3)：1组成的复合缩合剂或者由N,N’-二环己基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑按照摩尔比(1～3)：1组成的复合缩合剂；所述有机碱与缩合剂中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐或N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比大于1；所述精氨酸与Fe3O4/Polymer/MOFs质量比为(0.2～2)：1。
6.根据权利要求5所述具有多亲和位点的磁性金属-有机骨架纳米球的制备方法，其特征在于所述氨基衍生有机配体为2-氨基对苯二甲酸、2-氨基-4,4’-联苯二甲酸或者2’-氨基-1,1’：4’，1”-三联苯,4,4”-二羧酸；所述含有金属离子的可溶性无机盐为含Zn2+、Fe3+或者Zr4+的盐酸盐、硝酸盐或者硫酸盐。
7.根据权利要求5所述具有多亲和位点的磁性金属-有机骨架纳米球的制备方法，其特征在于所述有机碱为三乙胺或N,N-二异丙基乙胺；所述三乙胺或N,N-二异丙基乙胺与缩合剂中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐或N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为(1.5～3)：1。
8.根据权利要求5至7中任一权利要求所述具有多亲和位点的磁性金属-有机骨架纳米球的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中将Fe3O4/Polymer纳米粒子悬浮液加入到混合溶剂之前，先向混合溶剂中加入有机酸调节混合溶剂pH值为4.6～5.8；所述有机酸为乙酸、柠檬酸或抗坏血酸。
9.权利要求1至4中任一权利要求所述具有多亲和位点的磁性金属-有机骨架纳米球在磷酸化多肽富集中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108176384B (zh) * 2018-01-17 2020-08-14 四川大学 接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球及其制备方法与应用
CN109517181B (zh) * 2018-11-23 2022-03-18 浙江海洋大学 一种氨基化磁性纳晶纤维素的制备方法
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CN110104757B (zh) * 2019-06-10 2021-09-07 青岛大学 基于摇铃型纳米复合材料的废水中有机污染物去除方法
CN114717227A (zh) * 2022-04-20 2022-07-08 南方科技大学 核酸的封装及去封装方法和核酸存储微流控芯片

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103203207A (zh) * 2012-01-12 2013-07-17 安徽大学 一种磁性纳米孔洞金属-有机骨架核-壳材料的制备、功能化设计及应用
CN104722274A (zh) * 2015-01-26 2015-06-24 北京化工大学 一种磁性mof-5纳米复合吸附剂的制备及应用
CN105233802A (zh) * 2015-10-19 2016-01-13 南京信息工程大学 一种掺杂l-精氨酸的铜基金属有机骨架材料及其制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103203207A (zh) * 2012-01-12 2013-07-17 安徽大学 一种磁性纳米孔洞金属-有机骨架核-壳材料的制备、功能化设计及应用
CN104722274A (zh) * 2015-01-26 2015-06-24 北京化工大学 一种磁性mof-5纳米复合吸附剂的制备及应用
CN105233802A (zh) * 2015-10-19 2016-01-13 南京信息工程大学 一种掺杂l-精氨酸的铜基金属有机骨架材料及其制备方法

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