CN109511554A - 一种藤三七茎段快速诱导再生植株的方法 - Google Patents

一种藤三七茎段快速诱导再生植株的方法 Download PDF

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胡文芳
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何婷
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Abstract

本发明提供了一种藤三七茎段快速诱导再生植株的方法，方法如下：(1)外植体的预处理；(2)外植体的消毒；(3)将无菌外植体切成0.45‑0.55cm，并接种于含诱导培养基的培养瓶中进行愈伤组织的形成与不定芽的生长；诱导培养基的配方为：MS+25g/L蔗糖+7g/L琼脂+1.0mg/L 6‑BA+0.8mg/L IBA，pH5.8；(4)待不定芽长至0.8‑1.2cm，移至生根培养基。本发明的优点在于：不同于常规的诱导培养基，本发明是添加6‑BA和IBA来诱导愈伤组织的形成与不定芽的发生，更容易诱导藤三七不定芽的发生。经试验证明，本发明的最终出愈率达85％，出芽率达80％。

Description

一种藤三七茎段快速诱导再生植株的方法
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种藤三七茎段快速诱导再生植株的方法。
背景技术
藤三七是落葵科(Basellaceae)落葵薯属(Anredera)多年生肉质缠绕植物，广泛分布于全球温带地区，我国江苏、浙江、福建、广东等地均有分布。藤三七的珠芽、叶及根可做药用，具有补肾、活血、散瘀等功效，可用于治疗腰膝痹痛、病后体弱、跌打损伤及骨折。藤三七，同时作为一种食用的新兴保健蔬菜，珠芽入药，水煮后味微甜，嚼之有黏性，性平，能消肿散瘀，补虚止血，可治无名肿毒、外伤出血、吐血，腰膝无力，一般当作健胃保肝、骨折跌打损伤等症状之偏方使用，具有药用价值和食用养生价值。
关于藤三七的栽培方式，一般采用肉质根或珠芽繁殖以及扦插繁殖这两种，然而，这两种方式下的种质运输与保存将大大受限。因此，建立藤三七的组培快繁体系，将成为藤三七优良种质保存和种苗批量生产的一种有力途径，其具有潜在的应用前景。在藤三七组培快繁体系的建立过程中，“利用藤三七的茎段快速诱导再生植株”是一个有效途径，然而，其中对出愈率和出芽率的把握却是个难点。只有保持良好的出愈率和出芽率，才能得到相应的优质藤三七再生植株。
据此，目前急需一种能保持良好的出愈率和出芽率的藤三七茎段快速诱导再生植株的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种能保持良好的出愈率与出芽率的藤三七茎段快速诱导再生植株的方法。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种藤三七茎段快速诱导再生植株的方法，包括如下具体步骤：
(1)外植体的预处理：
采摘新鲜的藤三七带腋芽茎段，并利用洗衣粉冲洗0.8-1.2min；接着，流水冲洗1.8-2.2h，直至外植体表面无残留污垢；最后，将其置于超净工作台中，并用75％酒精浸泡28-32s；浸泡结束后，无菌水冲洗2-4次，备用；
(2)外植体的消毒：
将预处理后的外植体，采用1％次氯酸钠浸泡3.8-4.2min，再用无菌水冲洗4-6次，即得接种所需的无菌外植体；
(3)愈伤组织的形成与不定芽的生长：
无菌条件下，将步骤(2)中所得的无菌外植体切成0.45-0.55cm大小，并进一步接种于含诱导培养基的培养瓶中进行愈伤组织的形成与不定芽的生长；其中，诱导培养基的配方具体为：MS+25g/L蔗糖+7g/L琼脂+1.0mg/L 6-BA+0.8mg/L IBA，pH5.8；培养条件为：培养温度25±1℃，光照时间14-16h/d，光照强度1500-2000Lx；
(4)生根培养：
待不定芽长至0.8-1.2cm，将其移至生根培养基，进行生根培养；其中，生根培养基的配方具体为：1/2MS+25g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.8mg/L IBA，pH5.8；培养条件为：培养温度25±1℃，光照时间14-16h/d，光照强度1500-2000Lx。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中，采摘新鲜的藤三七带腋芽茎段，并利用洗衣粉冲洗1min；接着，流水冲洗2h，直至外植体表面无残留污垢；最后，将其置于超净工作台中，并用75％酒精浸泡30s；浸泡结束后，无菌水冲洗3次，备用。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中，将预处理后的外植体，采用1％次氯酸钠浸泡4min，再用无菌水冲洗5次，即得接种所需的无菌外植体。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中，将无菌外植体具体切成0.5cm大小，再进一步接种于含诱导培养基的培养瓶中；并且，在每个培养瓶中接种4个切割后的藤三七带腋芽茎段。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中，培养条件具体为：培养温度25℃，光照时间15h/d，光照强度1750Lx。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中，当培养至6-8d时，出现愈伤组织并长出小芽，出愈率达85％，出芽率达80％；培养至14-16d时，小芽生长良好，并长出新的茎和叶片。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中，待不定芽具体长至1cm长时，将其移至生根培养基，进行生根培养。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中，培养条件具体为：培养温度25℃，光照时间15h/d，光照强度1750Lx。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中，当移至生根培养基培养的第6-8d后，长出根。
本发明相比现有技术的优点在于：
(1)本发明采用藤三七带腋芽茎段作为外植体诱导不定芽的发生，继而将不定芽接种在生根培养基上进行生根培养；不同于常规的诱导培养基中添加6-BA和NAA，本发明是添加6-BA和IBA来诱导愈伤组织的形成与不定芽的发生；较常规的培养基，本发明更容易诱导藤三七不定芽的发生；经试验证明，本发明的最终出愈率达85％，出芽率达80％；
(2)本发明建立的藤三七离体快繁体系，取材方便、稳定性好、重复性高，为实现藤三七优良种质的快速繁殖提供了有效途径。
附图说明
图1是实施例1中藤三七带腋芽茎段的诱导过程图(图中，a为第1天的观察结果，b为第7天的观察结果，c为第15天的观察结果)；
图2是实施例1中藤三七带腋芽茎段的诱导过程图(图中，a为第1天的观察结果，b为第7天的观察结果)。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例的一种藤三七茎段快速诱导再生植株的方法，包括如下具体步骤：
(1)外植体的预处理：
采摘新鲜的藤三七带腋芽茎段，并利用洗衣粉冲洗1min；接着，流水冲洗2h，直至外植体表面无残留污垢；最后，将其置于超净工作台中，并用75％酒精浸泡30s；浸泡结束后，无菌水冲洗3次，备用。
(2)外植体的消毒：
将预处理后的外植体，采用1％次氯酸钠浸泡4min，再用无菌水冲洗5次，即得接种所需的无菌外植体。
(3)愈伤组织的形成与不定芽的生长：
无菌条件下，将步骤(2)中所得的无菌外植体切成0.5cm大小，再进一步接种于含诱导培养基的培养瓶中进行愈伤组织的形成与不定芽的生长，每个培养瓶中接种4个切割后的藤三七带腋芽茎段；如图1所示，当培养至7d时，出现愈伤组织并长出小芽，出愈率达85％，出芽率达80％；当培养至15d时，小芽生长良好，并长出新的茎和叶片。
其中，诱导培养基的配方具体为：MS+25g/L蔗糖+7g/L琼脂+1.0mg/L6-BA+0.8mg/LIBA，pH5.8；培养条件为：培养温度25℃，光照时间15h/d，光照强度1750Lx。
(4)生根培养：
待不定芽长至1cm，将其移至生根培养基进行生根培养；如图2所示，当培养到7d后，长出根。其中，生根培养基的配方具体为：1/2MS+25g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.8mg/L IBA，pH5.8；培养条件为：培养温度25℃，光照时间15h/d，光照强度1750Lx。
实施例2
本实施例的一种藤三七茎段快速诱导再生植株的方法，包括如下具体步骤：
(1)外植体的预处理：
采摘新鲜的藤三七带腋芽茎段，并利用洗衣粉冲洗0.8min；接着，流水冲洗1.8h，直至外植体表面无残留污垢；最后，将其置于超净工作台中，并用75％酒精浸泡28s；浸泡结束后，无菌水冲洗2次，备用。
(2)外植体的消毒：
将预处理后的外植体，采用1％次氯酸钠浸泡3.8min，再用无菌水冲洗4次，即得接种所需的无菌外植体。
(3)愈伤组织的形成与不定芽的生长：
无菌条件下，将步骤(2)中所得的无菌外植体切成0.45cm大小，再进一步接种于含诱导培养基的培养瓶中进行愈伤组织的形成与不定芽的生长，每个培养瓶中接种4个切割后的藤三七带腋芽茎段；当培养至6d时，出现愈伤组织并长出小芽，出愈率达85％，出芽率达80％；当培养至14d时，小芽生长良好，并长出新的茎和叶片。
其中，诱导培养基的配方具体为：MS+25g/L蔗糖+7g/L琼脂+1.0mg/L6-BA+0.8mg/LIBA，pH 5.8；培养条件为：培养温度24℃，光照时间14h/d，光照强度1500Lx。
(4)生根培养：
待不定芽长至0.8cm，将其移至生根培养基进行生根培养，6d后，长出根。其中，生根培养基的配方具体为：1/2MS+25g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.8mg/L IBA，pH 5.8；培养条件为：培养温度24℃，光照时间14h/d，光照强度1500Lx。
实施例3
本实施例的一种藤三七茎段快速诱导再生植株的方法，包括如下具体步骤：
(1)外植体的预处理：
采摘新鲜的藤三七带腋芽茎段，并利用洗衣粉冲洗1.2min；接着，流水冲洗2.2h，直至外植体表面无残留污垢；最后，将其置于超净工作台中，并用75％酒精浸泡32s；浸泡结束后，无菌水冲洗4次，备用。
(2)外植体的消毒：
将预处理后的外植体，采用1％次氯酸钠浸泡4.2min，再用无菌水冲洗6次，即得接种所需的无菌外植体。
(3)愈伤组织的形成与不定芽的生长：
无菌条件下，将步骤(2)中所得的无菌外植体切成0.55cm大小，再进一步接种于含诱导培养基的培养瓶中进行愈伤组织的形成与不定芽的生长，每个培养瓶中接种4个切割后的藤三七带腋芽茎段；当培养至8d时，出现愈伤组织并长出小芽，出愈率达85％，出芽率达80％；当培养至16d时，小芽生长良好，并长出新的茎和叶片。
其中，诱导培养基的配方具体为：MS+25g/L蔗糖+7g/L琼脂+1.0mg/L6-BA+0.8mg/LIBA，pH 5.8；培养条件为：培养温度26℃，光照时间16h/d，光照强度2000Lx。
(4)生根培养：
待不定芽长至1.2cm，将其移至生根培养基进行生根培养，8d后，长出根。其中，生根培养基的配方具体为：1/2MS+25g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.8mg/L IBA，pH 5.8；培养条件为：培养温度26℃，光照时间16h/d，光照强度2000Lx。
实施例4
本实施例用以说明不同激素配比对藤三七带腋芽茎段诱导效果的影响。本实验以“MS+25g/L蔗糖+7g/L琼脂”为基础培养基，并在其基础上添加不同种类或浓度的激素进行(诱导方法同上述实施例1-3)，结果如表1、表2所示。
表1不同浓度的6-BA、NAA激素组合对藤三七带腋芽茎段的诱导效果对比
表2不同浓度的6-BA、IBA激素组合对藤三七带腋芽茎段的诱导效果对比
结果表明：“MS+25g/L蔗糖+7g/L琼脂+1.0mg/L 6-BA+0.8mg/L IBA”培养基条件下，藤三七的出愈率与出芽率最佳，出愈率达85％，出芽率达80％。
其中，MS培养基的配方见表3。
表3 MS培养基配方
注：1/2MS培养基为MS培养基大量元素减半即可。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种藤三七茎段快速诱导再生植株的方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
(1)外植体的预处理：
采摘新鲜的藤三七带腋芽茎段，并利用洗衣粉冲洗0.8-1.2min；接着，流水冲洗1.8-2.2h，直至外植体表面无残留污垢；最后，将其置于超净工作台中，并用75％酒精浸泡28-32s；浸泡结束后，无菌水冲洗2-4次，备用；
(2)外植体的消毒：
将预处理后的外植体，采用1％次氯酸钠浸泡3.8-4.2min，再用无菌水冲洗4-6次，即得接种所需的无菌外植体；
(3)愈伤组织的形成与不定芽的生长：
无菌条件下，将步骤(2)中所得的无菌外植体切成0.45-0.55cm大小，并进一步接种于含诱导培养基的培养瓶中进行愈伤组织的形成与不定芽的生长；其中，诱导培养基的配方具体为：MS+25g/L蔗糖+7g/L琼脂+1.0mg/L 6-BA+0.8mg/L IBA，pH5.8；培养条件为：培养温度25±1℃，光照时间14-16h/d，光照强度1500-2000Lx；
(4)生根培养：
待不定芽长至0.8-1.2cm，将其移至生根培养基，进行生根培养；其中，生根培养基的配方具体为：1/2MS+25g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.8mg/L IBA，pH5.8；培养条件为：培养温度25±1℃，光照时间14-16h/d，光照强度1500-2000Lx。
2.根据权利要求1所述的藤三七茎段快速诱导再生植株的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，采摘新鲜的藤三七带腋芽茎段，并利用洗衣粉冲洗1min；接着，流水冲洗2h，直至外植体表面无残留污垢；最后，将其置于超净工作台中，并用75％酒精浸泡30s；浸泡结束后，无菌水冲洗3次，备用。
3.根据权利要求1所述的藤三七茎段快速诱导再生植株的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，将预处理后的外植体，采用1％次氯酸钠浸泡4min，再用无菌水冲洗5次，即得接种所需的无菌外植体。
4.根据权利要求1所述的藤三七茎段快速诱导再生植株的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，将无菌外植体具体切成0.5cm大小，再进一步接种于含诱导培养基的培养瓶中；并且，在每个培养瓶中接种4个切割后的藤三七带腋芽茎段。
5.根据权利要求1所述的藤三七茎段快速诱导再生植株的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，培养条件具体为：培养温度25℃，光照时间15h/d，光照强度1750Lx。
6.根据权利要求1所述的藤三七茎段快速诱导再生植株的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，当培养至6-8d时，出现愈伤组织并长出小芽，出愈率达85％，出芽率达80％；培养至14-16d时，小芽生长良好，并长出新的茎和叶片。
7.根据权利要求1所述的藤三七茎段快速诱导再生植株的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，待不定芽具体长至1cm长时，将其移至生根培养基，进行生根培养。
8.根据权利要求1所述的藤三七茎段快速诱导再生植株的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，培养条件具体为：培养温度25℃，光照时间15h/d，光照强度1750Lx。
9.根据权利要求1所述的藤三七茎段快速诱导再生植株的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，当移至生根培养基培养的第6-8d后，长出根。
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