CN109498668A - 一种甜叶菊发酵液提取物及其极性组分和在制备抑菌剂和添加剂中的应用 - Google Patents
一种甜叶菊发酵液提取物及其极性组分和在制备抑菌剂和添加剂中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种甜叶菊发酵液提取物及其极性组分和在制备抑菌剂和添加剂中的应用，所述甜叶菊发酵液提取物的制备方法如下：将植物乳杆菌接种到培养基培养；将甜叶菊粉末与蒸馏水混合，调节pH，水浴加热，冷却后接入植物乳杆菌，在培养箱培养；得到的甜叶菊发酵液用纱布过滤，离心，乙酸乙酯、正丁醇萃取，将产物冷冻干燥制得固体样品；将样品用硅胶柱进一步的分离，用氯仿和甲醇混合液进行洗脱得到乙酸乙酯相硅胶柱层析五个极性组分，冷冻干燥制得固体样品。本发明的甜叶菊发酵能提高原料利用率，进一步扩大了甜叶菊的应用范围，提供了安全、高效的天然抗菌剂。
Description
技术领域
本发明属于植物活性物质提取及应用技术领域，具体涉及一种甜叶菊发酵液提取物及其极性组分和在制备抑菌剂和添加剂中的应用。
背景技术
甜叶菊营养丰富，在多个行业中有很好的应用前景。将甜菊叶残渣按添加到禽类饲料中，能对禽类的痢疾等疾病发挥很好的预防作用，将甜菊叶残渣添加至饮料中作为奶牛、奶羊等牲畜的饮品，可有效增加其产奶量，增加了奶中的营养成分。邱光忠等研究了“甜叶菊提取物”对蛋鸡生产性能的影响，发现在蛋鸡基础日粮中添加1％“甜叶菊提取物”预混剂，能提高蛋鸡的生产性能。已有研究报道了甜叶菊发酵液的抗氧化、抗菌和抗组胺等活性，以及甜叶菊发酵液中新化合物的分离等。甜叶菊经发酵后，可获取活性产物，产生抑菌活性物质，从而有利于甜叶菊的综合开发利用。
乳房炎是奶牛的一种多发病，是造成奶牛业损失最严重的疾病之一。奶牛乳房炎能造成产奶量减少，降低鲜奶质量和增加牛群更替成本。乳房炎作为乳腺的一种炎症，其发生常与微生物感染有密切关系。目前奶牛乳房炎的治疗方法有：抗菌药物的治疗、中药治疗和疫苗治疗等。甜叶菊发酵液对奶牛乳房炎细菌的抑菌机理尚未有报导。研究抗菌剂的抑菌机理有助于其应用，开发安全、高效的天然抗菌剂，以及对甜菊发酵液进行安全性评价。
抗菌药物如青霉素类、头抱菌素、氟喳诺酮等，是防治奶牛乳房炎的一种有效手段，特别是在急性、多发性和亚急性乳房炎治疗、控制奶产品质量上或作为综合防治中的一个重要组成部分，具有重要应用价值。因此选择抗生素作为本实验阳性对照。侯晓申用复方阿莫西林乳房注入剂治疗临床型奶牛乳房炎，效果显著，奶牛临床疗效为92.00％。冯言言等用硫酸头孢喹肟乳房注入剂治疗奶牛乳房炎，注入剂对泌乳期奶牛乳房炎有良好的治疗作用，有效率高于80％，且安全性高，未引起泌乳期奶牛不良反应。
发明内容
本发明的目的是提供了一种甜叶菊发酵液提取物及其极性组分和在制备抑菌剂和添加剂中的应用。植物源天然抗菌剂具有广泛的应用前景，研究添加剂的抑菌机理有助于其应用，也有利于开发安全、高效的天然抗菌剂。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种甜叶菊发酵液提取物，所述甜叶菊发酵液提取物的制备方法包括如下步骤：
(1)将甜叶菊干燥并粉碎后，将甜叶菊粉末与水混合，调节pH为6.5-7.5，水浴加热；冷却后，接入植物乳杆菌，培养2-5d得到甜叶菊发酵液；
(2)将所述甜叶菊发酵液过滤，离心，用乙酸乙酯以体积比1∶1萃取发酵液得到发酵液乙酸乙酯相；
(3)将所述发酵液乙酸乙酯相固体样品用硅胶柱进行进一步的分离，用氯仿和甲醇的混合液进行洗脱分别得到五个极性组分FSE1、FSE2、FSE3、FSE4和FSE5。
进一步的：所述步骤(1)中甜叶菊粉末与水混合的质量体积比为1∶15-1∶25。
进一步的：所述步骤(3)中混合液中氯仿和甲醇的体积比例分别为100∶0、100∶1、100∶4、100∶8和100∶16。
进一步的：所述步骤(3)中混合液中氯仿和甲醇的比例为100∶8得到的极性组分活性最高。
本发明提供了所述甜叶菊发酵液在制备抑菌剂中的应用，所述抑菌剂为抑制乳房炎芽孢杆菌的抑菌剂，所述甜叶菊发酵液的使用浓度为50mg/mL～100mg/mL。
本发明提供了所述发酵液乙酸乙酯相在制备抑菌剂中的应用，所述抑菌剂为抑制乳房炎芽孢杆菌的抑菌剂，所述发酵液乙酸乙酯相的使用浓度为25mg/mL～100mg/mL。
本发明提供了所述极性组分FSE4在制备抑菌剂中的应用，所述抑菌剂为抑制乳房炎芽孢杆菌的抑菌剂，所述极性组分FSE4的使用浓度为5mg/mL～100mg/mL。
本发明提供了所述甜叶菊发酵液在制备奶牛饲用添加剂中的应用。
本发明提供了所述发酵液乙酸乙酯相在制备奶牛饲用添加剂中的应用。
本发明提供了所述极性组分FSE4在制备奶牛饲用添加剂中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明提供了甜叶菊发酵液提取物及其极性组分和在制备抑菌剂和添加剂中的应用，从细胞膜通透性和结构方面对抑菌机理进行了实验，以便于促进甜叶菊的应用，因为本发明所述的甜叶菊发酵液提取物、所述发酵液乙酸乙酯相和所述极性组分FSE4均对乳房炎芽孢杆菌具有良好的抑菌效果，所以可以用于添加到奶牛饲料添加剂中，用于防治奶牛的乳房炎。通过本发明的技术方案，提高了甜叶菊发酵物的原料利用率，进一步扩大甜叶菊的应用范围，具有良好的市场应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
实施例1：甜叶菊发酵液提取物的制备
1、将MRS斜面保存的植物乳杆菌接种到灭菌的MRS液体培养基，在37℃培养箱以转速160r/m培养24h。
2、干燥甜叶菊用粉碎机粉碎，甜叶菊粉末与蒸馏水按1∶20混合，以40％装液量加入锥型瓶中，用NaOH调节pH为7.0。棉塞封口，并用保鲜膜密封。装液后的锥形瓶在60℃水浴锅中加热30min。冷却后，以7％接种量接入植物乳杆菌。装有接种液的锥形瓶在37℃培养箱以转速160r/m培养3d。
3、得到的甜叶菊发酵液(FS)用纱布过滤，过滤液以转速3000r/m离心10min以尽可能除去甜叶菊粉末，用乙酸乙酯以1∶1萃取发酵液三次得到发酵液乙酸乙酯相(FSE)，乙酸乙酯萃取剩余相再用正丁醇以1∶1萃取3次，得到发酵液正丁醇相(FSB)和剩余水相(FSW)。FS、FSE、FSB和FSW经冷冻干燥制得固体样品，用于下一步抑菌实验。
4、FSE用硅胶柱进行进一步的分离，分别用氯仿∶甲醇＝100∶0、100∶1、100∶4、100∶8和100∶16进行洗脱得到FSE硅胶柱层析五个极性组分(分别记为FSE1、FSE2、FSE3、FSE4和FSE5)，不同极性组分经冷冻干燥制得固体样品，用于下一步抑菌实验。
实施例2：甜叶菊发酵液提取物抑菌活性测定
抑菌圈通过琼脂扩散-打孔法进行测定。将供试菌接种到灭菌的LB肉汤，在37℃培养箱以转速160r/m培养24h，调节菌悬液浓度为1.5×108CFU/mL。在无菌平板中加入0.1mL上述菌液，再加入20mL灭菌融化的LB营养琼脂并与菌液混匀，室温静置至培养基凝固。凝固后用6mm打孔器打孔，每孔加样50μL，37℃培养24h，采用十字交叉法测量抑菌圈直径。
1：甜叶菊发酵液及有机溶剂萃取相对乳房炎芽孢杆菌的抑菌活性
研究发酵液及有机溶剂萃取相对乳房炎芽孢杆菌的抑菌活性。抑菌圈测定方法同上。FS、FSE、FSB和FSW用25、50和100mg/mL的浓度进行实验。除FS和FSW用无菌水溶解，其余样品均用二甲基亚砜溶解。以100μg/mL氯霉素(Chloramphenicol，Chl)为阳性对照。FS和FSW以水为溶剂对照，FSE和FSB以二甲基亚砜为溶剂对照。
方差能准确反映各组平行试验结果之间的离散程度，显示出试验结果的精确性。本试验以标准差为衡量基准，做出误差线，使得真实值能准确的反映在误差线范围之内。利用SPSS进行单因素方差和差异显著性分析。
通过实验发现抗菌剂对微生物的抑制作用可用抑菌圈反映，相同实验条件下，抑菌圈越大，抑菌作用越强。抑菌圈实验能在体外对不同来源的抗菌剂的抑菌活性进行比较，方便的对天然抗菌剂进行筛选。
表1.FS对乳房炎芽孢杆菌的抑菌活性
注：相同上标代表数值差异不显著，不同上标代表数值差异显著(P＜0.05)
表1表明，FS在100mg/mL时对菌株都有抑制效果，Bacillus.sp.1和2为市面销售的常见乳房炎芽孢杆菌，对Bacillus.sp.1的抑制作用最强，抑菌圈达到15mm。在浓度为50mg/mL时，对Bacillus.sp.2有抑制效果。而在25mg/mL时对菌株均无抑制作用，作用效果呈现浓度依赖性。具有抑菌活性的植物粗提物使用剂量往往较大，但粗提物的制备相对容易，且不混入有机溶剂，能够降低成本和扩大使用范围。
2、FSE对乳房炎芽孢杆菌的抑菌活性
为了充分提取和利用甜叶菊发酵液中的活性组分，用乙酸乙酯对发酵液进行萃取。与FS产生抑菌作用的浓度范围不同，FSE在25mg/mL～100mg/mL均显示出了抑菌活性，如表2所示。
表2.FSE对乳房炎芽孢杆菌的抑菌活性
注：相同上标代表数值差异不显著，不同上标代表数值差异显著(P＜0.05)。
由表2可以看出，随着使用剂量增大，对Bacillus.sp.1和Bacillus.sp.2的抑制作用均增强。FSE较好的抑菌活性说明有较多的具有抗菌活性的天然物质溶解在乙酸乙酯中，因此，选择FSE进行进一步的分离。
3、FSB对乳房炎芽孢杆菌的抑菌活性
如表3所示，FSB对Bacillus.sp.1和Bacillus.sp.2的抑菌效果与FS类似，但只有浓度达到100mg/mL时才产生抑制作用。在产生抑制作用的所有菌株中，对Bacillus.sp.1的抑制作用最明显，抑菌圈达到10.50mm，FSB在其它两个浓度无抑制效果。实验结果说明溶解在正丁醇中的产物未能产生很强的抑菌活性。
表3.FSB对乳房炎芽孢杆菌的抑菌活性
注：相同上标代表数值差异不显著，不同上标代表数值差异显著(P＜0.05)。
4、FSW对乳房炎芽孢杆菌的抑菌活性
如表4所示，FSW对Bacillus.sp.1和Bacillus.sp.2在三个浓度均未显示出抑菌活性。甜叶菊发酵液中的抗菌组分，经乙酸乙酯和正丁醇萃取后，在相应溶剂中得到进一步浓缩，使FSW中具有抑制作用的产物浓度低于FS，FSW抗菌组分含量较低而未能显示出抑制作用。
表4.FSW对乳房炎芽孢杆菌的抑菌活性
注：相同上标代表数值差异不显著，不同上标代表数值差异显著(P＜0.05)。
实施例3：FSE层析分离组分对乳房炎芽孢杆菌的抑菌活性
研究FSE层析分离组分对乳房炎芽孢杆菌的抑菌活性。抑菌圈测定方法同实施例2。FSE硅胶柱层析得到的五个极性组分用5、10和25mg/mL的浓度进行实验。样品用二甲基亚砜溶解。以100μg/mL氯霉素为阳性对照，二甲基亚砜为溶剂对照。
1、FSE1对乳房炎芽孢杆菌的抑菌活性
选用硅胶柱对FSE进一步分离，对五个极性组分产物选择5、10和25mg/mL三个浓度进行抑菌试验。实验结果如表5所示。
表5.FSE1对乳房炎芽孢杆菌的抑菌活性
注：相同上标代表数值差异不显著，不同上标代表数值差异显著(P＜0.05)。
如表5所示，FSE1对乳房炎芽孢杆菌株Bacillus.sp.1和Bacillus.sp.2的抑制作用较弱，只在25mg/mL时才产生抑制效果。与未经硅胶柱层析处理的同浓度FSE相比，FSE1的抑制小于FSE，说明FSE中主要的抗菌成分未洗脱到FSE1中，产物中含有较多的色素等杂质，但FSE1的抑制作用强于FSB和FSW。
2、FSE2对乳房炎芽孢杆菌的抑菌活性
FSE2的抑菌活性如表6所示，FSE2对Bacillus.sp.1和Bacillus.sp.2只在10和25mg/mL有抑制作用。FSE2比FSE1产生抑制作用的浓度更低。随着洗脱剂极性的增大，洗脱液中抗菌组分含量增加，使抗菌活性逐渐增强。
表6.FSE2对乳房炎芽孢杆菌的抑菌活性
注：相同上标代表数值差异不显著，不同上标代表数值差异显著(P＜0.05)。
3、FSE3对乳房炎芽孢杆菌的抑菌活性
FSE3的抗菌活性与FSE2接近，如表7所示。FSE3对Bacillus.sp.1和Bacillus.sp.2在5mg/mL时不产生抑制作用，只在10和25mg/mL浓度下产生抑制效果。其中，在25mg/mL时对Bacillus.sp.1的抑菌圈达到12.75mm。
表7.FSE3对乳房炎芽孢杆菌的抑菌活性
注：相同上标代表数值差异不显著，不同上标代表数值差异显著(P＜0.05)。
4、FSE4对乳房炎芽孢杆菌的抑菌活性
FSE4对乳房炎芽孢杆菌的抑菌活性实验结果如表8所示。
表8.FSE4对乳房炎芽孢杆菌的抑菌活性
注：相同上标代表数值差异不显著，不同上标代表数值差异显著(P＜0.05)。
由表8可以看出，FSE4对Bacillus.sp.1和Bacillus.sp.2在三个浓度均产生了抑制作用，抑制效果随浓度增大而增强，其中，对Bacillus.sp.1的抑制作用最强，在5和25mg/mL时抑菌圈分别为10.5和15mm。
5、FSE5对乳房炎芽孢杆菌的抑菌活性
表9.FSE5对乳房炎芽孢杆菌的抑菌活性
注：相同上标代表数值差异不显著，不同上标代表数值差异显著(P＜0.05)。
如表9所示，FSE5对Bacillus.sp.1和Bacillus.sp.2在三个浓度均有抑制效果，抑制作用随浓度增大而增强，抑制效果与FSE4接近。FSE5对Bacillus.sp.1的抑制作用最强，在5和25mg/mL浓度下的抑菌圈分别为10和14.25mm。
实施例4：甜叶菊发酵液提取物对乳房炎芽孢杆菌的MIC
以MIC判断甜叶菊发酵液提取物对乳房炎芽孢杆菌的抗菌活性。MIC测定方法同实施例3。FS选择浓度为62.50-8000.00μg/mL进行实验，FSB选择浓度为15.63-2000.00μg/mL进行实验，FSW用浓度为125.00-16000.00μg/mL进行实验，FSE及其硅胶柱层析分离组分用浓度为7.81-1000.00μg/mL进行实验。除FS和FSW用无菌水溶解，其余样品均用二甲基亚砜溶解。以未加菌液的LB肉汤作空白对照，加入氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)的肉汤为阳性对照，FS和FSW选择加入无菌水的肉汤为溶剂对照，其余样品以加入二甲基亚砜的肉汤为溶剂对照。
表10.甜叶菊发酵液提取物对乳房炎芽孢杆菌的MIC
不同于抑菌圈的定性测量，抗菌剂的MIC是对抗菌活性的定量描述。MIC较小的抗菌剂，对微生物更加敏感，发挥抑制作用的浓度低，抑菌作用更强。结合抑菌圈和MIC值，能更好反映抗菌剂对微生物的抑制作用。
甜叶菊发酵液提取物对乳房炎芽孢杆菌的MIC如表10所示，FSE和FSE硅胶柱层析分离组分的MIC最低，在31.25-250μg/mL之间，FS和FSB虽然具有抗菌活性，但MIC远大于FSE及其硅胶柱层析分离组分。研究发现中药蒲公英对奶牛隐性乳房炎的杀菌作用最强，对金黄色葡萄球菌MIC和MBC分别为8mg/mL。胡少辉等发现中草药黄连和鱼腥草对奶牛隐形乳房炎致病菌金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度达到1.91mg/mL。与中草药相比，甜叶菊发酵液提取物中的FSE和FSE分离组分有更低的最小抑菌浓度。
实施例5、所述甜叶菊发酵提取物用于替代抗生素制备奶牛饲用添加剂
1、甜叶菊发酵物用于制备奶牛饲用添加剂
将实施例1步骤(2)制得的甜叶菊发酵液先用纱布过滤后，滤液在3000rpm/min转速下离心10min，澄清液进行冷冻干燥。甜叶菊发酵物对乳房炎芽孢杆菌的抑菌活性(抑菌圈，mm)分别为10.80±0.71和9.60±0.50，达氯霉素阳性对照抑菌圈(17.75±1.06)的60.8％和54.1％。甜叶菊发酵物对乳房炎芽孢杆菌的抑菌活性(抑菌圈，mm)测定浓度为100mg/mL，氯霉素为100ug/mL。
2、甜叶菊发酵液乙酸乙酯相用于制备奶牛饲用添加剂
将实施例1步骤(2)制得的甜叶菊发酵液先用纱布过滤后，滤液在3000rpm/min转速下离心10min，澄清液浓缩至发酵液的1/3，按体积1∶2比例添加乙酸乙酯进行萃取，重复三次后，将萃取液进行合并，旋转浓缩至干燥，残余的萃取剂通过冷冻干燥除掉，得到甜叶菊发酵液乙酸乙酯相。甜叶菊发酵液乙酸乙酯相对对乳房炎芽孢杆菌的抑菌活性(抑菌圈，mm)分别为14.50±0.71和14.00±0.00，达氯霉素阳性对照抑菌圈(17.75±1.06)的81.7％和78.9％。甜叶菊发酵液乙酸乙酯相对乳房炎芽孢杆菌的抑菌活性(抑菌圈，mm)测定浓度为100mg/mL，氯霉素为100ug/mL。
3、甜叶菊发酵物分离组分奶牛饲用添加剂的制备
将实施例1步骤(2)中得到的甜叶菊发酵乙酸乙酯萃取物，通过硅胶柱进一步分离，以氯仿∶甲醇＝100∶8比例进行洗脱后的洗脱液进行冷冻干燥，获得甜叶菊发酵物极性组分FSE4用于制备奶牛饲用添加剂。极性组分FSE4对乳房炎芽孢杆菌的抑菌活性(抑菌圈，mm)分别为15.00±0.11和14.50±0.00，达氯霉素阳性对照抑菌圈(17.25±0.35)的87.0％和84.1％。极性组分FSE4对乳房炎芽孢杆菌的抑菌活性(抑菌圈，mm)测定浓度为25mg/mL，氯霉素为100ug/mL。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种甜叶菊发酵液提取物，其特征在于所述甜叶菊发酵液提取物的制备方法包括如下步骤：
（1）将甜叶菊干燥并粉碎后，将甜叶菊粉末与水混合，调节pH为6.5-7.5 ，水浴加热；冷却后，接入植物乳杆菌，培养2-5d得到甜叶菊发酵液；
（2）将所述甜叶菊发酵液过滤，离心，用乙酸乙酯以体积比1:1萃取发酵液得到发酵液乙酸乙酯相；
（3）将所述发酵液乙酸乙酯相固体样品用硅胶柱进行进一步的分离，用氯仿和甲醇的混合液进行洗脱分别得到五个极性组分FSE1、FSE2、FSE3、FSE4和FSE5。
2.根据权利要求1所述的甜叶菊发酵液提取物，其特征在于：所述步骤（1）中甜叶菊粉末与水混合的质量体积比为1:15-1:25。
3.根据权利要求1所述的甜叶菊发酵液提取物，其特征在于：所述步骤（3）中混合液中氯仿和甲醇的体积比例分别为100:0、100:1、100:4、100:8和100:16。
4.根据权利要求3所述的甜叶菊发酵液提取物，其特征在于：所述步骤（3）中混合液中氯仿和甲醇的比例为100:8得到的极性组分活性最高。
5.权利要求1步骤（1）制得的所述甜叶菊发酵液在制备抑菌剂中的应用，其特征在于所述抑菌剂为抑制乳房炎芽孢杆菌的抑菌剂，所述甜叶菊发酵液的使用浓度为50mg/mL ~100mg/mL。
6.权利要求1步骤（2）制得的所述发酵液乙酸乙酯相在制备抑菌剂中的应用，其特征在于所述抑菌剂为抑制乳房炎芽孢杆菌的抑菌剂，所述发酵液乙酸乙酯相的使用浓度为25mg/mL ~100mg/mL。
7.权利要求1步骤（3）制得的所述极性组分FSE4在制备抑菌剂中的应用，其特征在于所述抑菌剂为抑制乳房炎芽孢杆菌的抑菌剂，所述极性组分FSE4的使用浓度为5mg/mL ~100mg/mL。
8.权利要求1步骤（1）制得的所述甜叶菊发酵液在制备奶牛饲用添加剂中的应用。
9.权利要求1步骤（2）制得的所述发酵液乙酸乙酯相在制备奶牛饲用添加剂中的应用。
10.权利要求1步骤（3）制得的所述极性组分FSE4在制备奶牛饲用添加剂中的应用。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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