CN109498666A - 一种响应面法优化三七茎叶皂苷提取液的除杂方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种响应面法优化三七茎叶皂苷提取液的除杂方法，包括：1:2.5浓度的三七茎叶皂苷提取原液制备；1%浓度的壳聚糖溶液制备；将所述皂苷提取原液稀释成质量浓度为1:6的提取液，在50℃下加入0.8mL/g的所述壳聚糖溶液；搅拌20min后放入水浴锅中65℃保温1h；之后放置在室温下静置12h，离心、过滤、取滤液装瓶，置于4℃保存。使用该方法进行三七茎叶皂苷提取液除杂，不仅成本低，还能够有效减少皂苷有效成分的损失，保证良好的皂苷提取液澄清效果，皂苷保留率和固形物去除率较高，能够适用于工业化大生产。
Description
技术领域
本发明涉及中药有效成分提取技术领域，具体涉及一种响应面法优化三七茎叶皂苷提取液的除杂方法。
背景技术
近年的药理研究表明，三七茎叶(leaves and stems of Panax notoginseng)中含有的皂苷具有治疗酒精肝、肥胖症、抑制芳香化酶活性等作用，其毒性较低，对心脑血管疾病的治疗效果显著。在三七茎叶皂苷分离的操作中发现，茎叶中所含的淀粉、蛋白质等物质会对皂苷的提取产生影响，一般提取工艺多采用水煎醇沉法来除去蛋白等杂质，要消耗大量乙醇，成本比较高，而且会造成非常多的皂苷有效成分流失。
壳聚糖是天然阳离子型絮凝剂，具有优良的絮凝效果，先前虽有部分关于壳聚糖澄清三七茎叶水煎液的研究，比如潘育方等应用澄清剂壳聚糖，对三七茎叶粗粉的煎煮液进行澄清条件试验，但其考察因素较少，也没有通过澄清前后的皂苷保留率这一重要检测指标来考察实验有效性。
另外，也有通过膜分离方法纯化三七叶皂苷的研究，比如李维莉等采用无机陶瓷膜-树脂联用技术分离纯化三七叶苷，虽然该方法可以取得较好的效果，但是滤膜抗污染能力弱，使用寿命短，不适用于工业化大生产。
发明内容
有鉴于此，本发明实施例期望提供一种响应面法优化三七茎叶皂苷提取液的除杂方法，不仅成本低，还能够有效减少皂苷有效成分的损失，保证良好的皂苷提取液澄清效果，皂苷保留率和固形物去除率较高，能够适用于工业化大生产。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
本发明实施例提供了一种响应面法优化三七茎叶皂苷提取液的除杂方法，包括以下步骤：
a)1:2.5浓度的三七茎叶皂苷提取原液制备；
b)1％浓度的壳聚糖溶液制备；
c)将所述皂苷提取原液稀释成质量浓度为1:6的提取液，在50℃下加入0.8mL/g的所述壳聚糖溶液；
d)搅拌20min后放入水浴锅中65℃保温1h；
e)之后放置在室温下静置12h，离心、过滤、取滤液装瓶，置于4℃保存。
进一步地，所述40％浓度的三七茎叶皂苷提取原液制备包括：取三七茎叶200g置烧杯中，以10倍量的蒸馏水加热回流提取3次，第1次2h，第2～3次各1.5h，每次以绸布趁热过滤掉残渣，合并提取液、浓缩、定容至500mL。
进一步地，所述1％浓度的壳聚糖溶液制备包括：取壳聚糖10.0g，先以1％醋酸溶液搅拌为糊状，再定容至1000mL，溶胀24h以上，搅拌均匀，制备成1％浓度的壳聚糖溶液。
进一步地，所述响应面法包括二次多项回归方程：
Y＝81.32-1.77A-2.35B+17.69C+0.60AB+0.30AC-1.14BC-2.69A2+1.11B2-17.53C2。
本发明有益效果如下：1)使用本发明方法能够有效减少皂苷有效成分的损失，皂苷保留率较高；2)使用本发明方法能够保证良好的皂苷提取液澄清效果，固形物去除率较高；3)使用本发明方法不需要消耗乙醇，成本低，能够适用于工业化大生产。
附图说明
图1为本发明实施例响应面法优化三七茎叶皂苷提取液的除杂方法流程示意图；
图2为各试验因素对三七茎叶皂苷提取液除杂效果的影响。
具体实施方式
为了能够更加详尽地了解本发明的特点与技术内容，下面对本发明的实现进行详细阐述。
试验用药物
三七茎叶、壳聚糖、香草醛
方法
三七茎叶皂苷提取原液的制备
称取三七茎叶200g，置烧杯中，以10倍量的蒸馏水加热回流提取3次，第1次2h，第2、3次各1.5h，每次以绸布趁热过滤掉残渣，合并提取液，浓缩，定容至500mL，即为三七茎叶皂苷提取原液，此时的药液质量浓度为1:2.5。
这里，所述药液质量浓度为1:2.5，即生药质量(g)与提取原液体积(mL)之比为1:2.5。
这里，所述生药质量就是所述三七茎叶的质量。
壳聚糖溶液的制备
称取壳聚糖10.0g，先以l％醋酸溶液搅拌为糊状，再定容至1000mL，溶胀24h以上，搅拌均匀，制备成1％壳聚糖溶液备用。
三七茎叶皂苷提取原液除杂步骤
取适量三七茎叶皂苷提取原液，稀释成质量浓度为适量值的提取液，在50℃下加入适当用量的所述壳聚糖溶液，充分搅拌一定时间后放入水浴锅中适量温度值保温一定时长，之后放置在室温下静置一定时间，离心、过滤、取滤液装瓶，置于4℃保存。
这里，所述壳聚糖溶液用量按所述壳聚糖溶液体积与生药质量之比来取。
皂苷对照品溶液的配制与标准曲线制备
将三七皂苷Rg1标准品在60℃下干燥至恒重，取2.51mg置容量瓶中，以甲醇溶液溶解，定容至25mL，摇匀，得对照品溶液，含量为0.1004mg/mL。
采用现有“香草醛-高氯酸”方法测定皂苷含量，并制备标准曲线。
皂苷保留率的测定
取除杂前后提取液按照上述方法进行定量测定，得皂苷保留率＝除杂后皂苷的量/除杂前皂苷的量。
固形物去除率的测定
精密移取除杂前和除杂后的提取液各15mL，放在已经干燥处理好的蒸发皿中，置于105℃电热恒温鼓风干燥箱中烘干3h，之后放于37℃恒温干燥箱中冷却30min，快速称量其重量，计算其固形物的去除率。
固形物去除率＝(除杂前固形物的量－除杂后固形物的量)/除杂前固形物的量×100％
综合评分(overall desirability，OD)
提取液中加入澄清剂进行除杂，不仅需要最大限度地减少皂苷有效成分的损失，还要保证良好的澄清效果，所以选择固形物去除率(E1)和皂苷保留率(E2)一起作为评价性指标进行综合性评分，将E1的权重设定为0.3，E2的权重设定为0.7，按下列公示进行计算：
OD＝(E1/E1max×0.3+E2/E2max×0.7)
除杂工艺单因素考察
分别以A、B、C、D代表药液质量浓度、壳聚糖用量、搅拌时间和作用温度，进行单因素除杂实验，具体步骤如下：
不同药液质量浓度的除杂实验
取适量三七茎叶皂苷提取液原液，分别稀释成质量浓度为1:5、1:6、1:8、1:10的提取液，每份20mL，在50℃下加入所述壳聚糖用量0.8mL/g，充分搅拌20min后放入水浴锅中50℃保温1h，之后放置在室温下静置12h，离心，过滤，定容至25mL，测定其固形物去除率以及皂苷保留率，结果如表1所示。
表1.药液质量浓度对三七茎叶皂苷提取液除杂效果的影响
不同壳聚糖用量的除杂实验
固定A为1:6，在50℃下分别加入壳聚糖用量为0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL/g，之后按照上述方法进行实验，测定其固形物去除率以及皂苷保留率，结果如表2所示。
表2.壳聚糖用量对三七茎叶皂苷提取液除杂效果的影响
不同搅拌时间的除杂实验
固定A为1:6，在50℃下加入壳聚糖用量0.8mL/g，分别充分搅拌10、20、30、40、60min，之后按照上述方式进行实验，测定其固形物去除率以及皂苷保留率，结果如表3所示。
表3.搅拌时间对三七茎叶皂苷提取液除杂效果的影响
不同作用温度的除杂实验
固定A为1:6，在50℃下加入壳聚糖用量0.8mL/g，充分搅拌20min后，分别选择放入水浴锅中40、50、60、70、80℃进行保温1h，之后按照上述方法进行实验，测定其固形物去除率及皂苷保留率，结果如表4所示。
表4.作用温度对三七茎叶皂苷提取液除杂效果的影响
单因素除杂实验结果分析
A、B、C对OD值的影响较大，随着A的降低，OD值呈现增大的趋势，随着B、C的增加，OD值均出现先增大后降低的趋势，D达到20min之后不同搅拌时间对OD值的影响不大。结合提取效率及工业生产的需要，拟将A设1:5、1:6、1:7三个水平，B、C取最佳值为中间水平进行模型建立研究。
响应面法优化方法的设计
在单因素除杂实验的基础上，根据Design-Expert设计原理，A、B、C 3个因素作为自变量，进行试验因素和水平设计，详见表5。
表5.响应面法分析因素和水平
模型的建立及方差分析
以A、B、C三个因素为考察因素，以OD作为评价指标，按照3因素3水平的响应面分析方法进行试验，每个因素按上述设置3个水平，试验按上述方法进行，响应面法方差分析结果见表6。将所得数据以Design-Expert 8.0.6软件进行分析，得响应值(Y)对编码自变量的二次多项回归方程：
Y＝81.32-1.77A-2.35B+17.69C+0.60AB+0.30AC-1.14BC-2.69A2+1.11B2-17.53C2。
对该模型进行方差分析和显著性检验，由表6可得，F值为8.96，概率P＝0.0043，P<0.01，说明模型显著；模型的确定系数R2 adj值为0.8175，说明方程的因变量与全体自变量间线性关系显著,响应值的变化有81.75％来源于所选自变量；同时，模型失拟项F值为0.28，概率P>0.05，可知失拟项不显著，表明该方程试验误差小，拟合情况较好。由此可得，拟合情况中的回归方程良好，故可用回归模型代替实验真实点对实验结果进行分析。对响应值作用显著的是因素C和C的平方项，AB、BC、BC无显著关系，说明温度对响应值得影响较大，各因素之间无较强的交互作用。
表6.响应面法方差分析
注：**为极显著(P<0.01)。
等高线图与响应面图结果与分析
由二次多项回归方程，分别固定因素C，取中间值50℃，固定因素B，取中间值1.0mL/g，固定因素A，取中间值1:6，可做出AB、AC、BC之间的等高线图和响应面图，见图2。
响应曲面的陡峭程度，反映了不同试验因素对结果的影响程度，曲面越陡峭，说明该因素对试验结果影响大，反之，则对试验结果影响小。从曲面图2(a1)知，AB之间作用平缓，从曲面图2(b1)和图2(c1)可知，固定AB其中任何一个因素，其OD值均随着因素C的增高而呈现先增高后降低的趋势，但是曲面变化也比较平缓，说明3个因素之间不存在交互作用，其中因素C对结果的影响较为显著。
最佳提取工艺条件的优化
由Design-Expert 8.0.6软件进行岭脊分析，以回归模型进行预测，得出最佳工艺条件为A:(1:6.25)，B:0.80mL/g，C:65.34℃，根据实际工艺条件操作的可行性和简易性，各工艺条件修正为A:(1:6)，B：0.80mL/g，C:65℃。为验证预测结果的真实性，在此工艺条件下进行三七茎叶除杂工艺的优化，具体方法如图1所示：
步骤1：制备40％浓度的三七茎叶皂苷提取原液；
这里，所述40％浓度的三七茎叶皂苷提取原液制备具体如下：称取三七茎叶200g，置烧杯中，以10倍量的蒸馏水加热回流提取3次，第1次1h，第2～3次各1.5h，每次以绸布趁热过滤掉残渣，合并提取液，浓缩，定容至500mL，即为三七茎叶皂苷提取原液，此时的皂苷提取原液浓度(所取得三七茎叶的重量与提取液体积之比)为1:2.5，也就是40％浓度的皂苷提取原液；
这里，多保留两份所述40％浓度的皂苷提取原液以供后续皂苷保留率和固形物去除率测定；
步骤2：制备1％浓度的壳聚糖溶液；
这里，所述1％浓度的壳聚糖溶液制备具体如下：称取壳聚糖10.0g，先以1％醋酸溶液搅拌为糊状，再定容至1000mL，溶胀24h以上，搅拌均匀，制备成1％浓度的壳聚糖溶液；
步骤3：将所述皂苷提取原液稀释成质量浓度为1:6的提取液，在50℃下加入0.8mL/g的所述壳聚糖溶液；
这里，加入所述壳聚糖溶液的用量0.8mL/g是指所述壳聚糖溶液体积与所取的三七茎叶的重量之比；
步骤4：搅拌20min后放入水浴锅中65℃保温1h；
步骤5：之后放置在室温下静置12h，离心、过滤、取滤液装瓶，置于4℃保存。
这样就得到了经过除杂后的三七茎叶皂苷提取液。
皂苷保留率的测定：
将三七皂苷Rg1标准品在60℃下干燥至恒重，取2.51mg置容量瓶中，以甲醇溶液溶解，定容至25mL，摇匀，得对照品溶液，采用现有“香草醛-高氯酸”方法测定皂苷含量，并制备标准曲线。
取除杂前后的皂苷提取液按照上述方法进行定量测定，得皂苷保留率＝除杂后皂苷的量/除杂前皂苷的量。
固形物去除率的测定：
精密移取除杂前后的皂苷提取液各15mL，放在已经干燥处理好的蒸发皿中，置于105℃电热恒温鼓风干燥箱中烘干3h，之后放于37℃恒温干燥箱中冷却30min，快速称量其重量，计算其固形物的去除率。
固形物去除率＝(除杂前固形物的量－除杂后固形物的量)/除杂前固形物的量×100％
经过上述步骤方法，重复3次实验，最终得到除杂后的三七茎叶皂苷提取液中皂苷保留率为96.10％，固形物去除率为24.42％，验证了该模型的有效性。表明该方程能够客观地表示各因素对三七茎叶皂苷提取液除杂效果的影响。
本发明采用的响应面法是由Box等提出的试验设计方法，将试验设计和数学建模进行优化，回归拟合整体因素与结果的函数关系，取得各因素最优水平值。该方法具有试验周期短、试验次数少、精密度等优点，已经广泛应用于农业、制药、化工等领域。而正交试验不能在获得因素和响应值之间的函数表达式，无法获得最优方案和最优值，而且水平数较多时，试验次数多，实施比较困难。
通过上述实施例得到除杂后的三七茎叶皂苷提取液中皂苷保留率可以达到96.10％，同时固形物去除率达到24.42％，比较适合工业化大生产，而通过现有醇沉法除杂会造成30％左右的皂苷有效成分损失，远高于本发明对皂苷有效成分损失的控制。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非用于限定本发明的保护范围，故凡依照本发明专利范围所做的等效变化或修饰，均属于本发明专利权利要求范围内。
Claims (4)
1.一种响应面法优化三七茎叶皂苷提取液的除杂方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)1:2.5浓度的三七茎叶皂苷提取原液制备；
b)1％浓度的壳聚糖溶液制备；
c)将所述皂苷提取原液稀释成质量浓度为1:6的提取液，在50℃下加入0.8mL/g的所述壳聚糖溶液；
d)搅拌20min后放入水浴锅中65℃保温1h；
e)之后放置在室温下静置12h，离心、过滤、取滤液装瓶，置于4℃保存。
2.根据权利要求1所述的一种响应面法优化三七茎叶皂苷提取液的除杂方法，其特征在于，所述40％浓度的三七茎叶皂苷提取原液制备包括：取三七茎叶200g置烧杯中，以10倍量的蒸馏水加热回流提取3次，第1次2h，第2～3次各1.5h，每次以绸布趁热过滤掉残渣，合并提取液、浓缩、定容至500mL。
3.根据权利要求1所述的一种响应面法优化三七茎叶皂苷提取液的除杂方法，其特征在于，所述1％浓度的壳聚糖溶液制备包括：取壳聚糖10.0g，先以1％醋酸溶液搅拌为糊状，再定容至1000mL，溶胀24h以上，搅拌均匀，制备成1％浓度的壳聚糖溶液。
4.根据权利要求1所述的一种响应面法优化三七茎叶皂苷提取液的除杂方法，其特征在于，所述响应面法包括二次多项回归方程：Y＝81.32-1.77A-2.35B+17.69C+0.60AB+0.30AC-1.14BC-2.69A2+1.11B2-17.53C2。
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