CN103948659A

CN103948659A - 三七叶总皂苷的制备方法

Info

Publication number: CN103948659A
Application number: CN201410221017.XA
Authority: CN
Inventors: 郑立雄; 陈金东; 任杨帆; 邵艳红
Original assignee: YUNNAN WEIHE PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: YUNNAN WEIHE PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2014-05-23
Filing date: 2014-05-23
Publication date: 2014-07-30

Abstract

本发明涉及一种三七叶总皂苷的制备方法，属于天然药物提取技术领域。三七叶加溶剂超声波逆流连续提取，过滤，收集滤液，浓缩成清膏，加天然澄清剂澄清，离心后澄清溶液加入乙醇使其的含乙醇量为30-50%，进行醇沉；醇沉澄清液经脱糖树脂柱纯化，用不同浓度乙醇洗脱，脱糖后再经阴离子交换树脂脱色，最后经浓缩，微波干燥制备得到三七叶总皂苷。本发明优点在于所得总皂苷产品颜色为类白色，粉末质地疏松，总苷收率为8%以上，含量不低于90%（UV）以上，主要含Rb₃、Rc、Fc、Fa等成分，其中Rb₃含量≥40%（HPLC）；工艺简单，利于实现产业化，产品质量得到较大幅度的提高。

Description

三七叶总皂苷的制备方法

技术领域

本发明属于天然药物提取技术领域，具体涉及三七叶总皂苷的制备方法。

背景技术

三七(Panax notoginseng (Burk.) F.H.Chen) 为著名中药，通常以根入药。三七叶性温，味辛，民间常为茶饮。新鲜的嫩叶可作蔬菜食用。《本草纲目》称三七叶“治折伤跌扑出血，敷之即止，青肿经夜即散，余功同根”。现代研究表明三七叶有止血、消肿、定痛等作用。

上世纪80年代以来，对三七叶的化学成分进行了系统的研究，发现三七叶富含达玛烷型原人参二醇型(protopanxadiol type)（简称二醇组）皂苷，并含有微量的达玛烷型原人参三醇型(protopanxatriol type)（简称三醇组）皂苷和黄酮类化合物。从中先后分离得到20余个化合物，包括：人参皂苷(ginsenoside) Rb₃, Rb₁,Rc,Rd, Rh₁,Rh₂,Rg₃,Rg₁,Re,F₂, C-K,MC，三七皂苷(notoginsenoside) R₁, Fa, Fb,Fc,七叶胆苷(gypenoside) XIII,IX,XVII,以及甘草素和芹糖甘草苷等（李海舟，张颖君，杨崇仁．三七叶化学成分的进一步研究[J]．天然产物研究与开发，2006（18）：549-554）。

三七叶皂苷具有抑制血小板聚集、改善微循环、降低血脂、抗心律失常、抗心绞痛、抗脑缺血、抗炎、镇静安神和抗衰老作等作用。其中主要的活性物质是Rb₃，具有镇静催眠作用。目前叶苷在临床上被用于改善神经功能，治疗失眠以及缓和焦虑等，早在上世纪80年代就以三七叶皂苷为原料开发了天然药物“七叶神安片”，用于神经衰弱、安神镇静和偏头痛等病症，有显著的临床疗效，已收载于《中华人民共和国药典》（2010）并列为国家中药保护品种。近年来，三七叶的药理活性在传统应用的基础上开展了深入的研究，又证明了三七叶总皂苷有抗忧郁的作用（Hui Xiang, Yingxue Liu, Baibing Zhang，et al.The antidepressant effects and mechanism of action of total saponins from the caudexes and leaves of Panax notoginseng in animal models of depression[J]. Phytomedicine,2011:731-738）。三七叶显著的药理活性提示我们要进行深入研究，在原有技术层次较低的加工品基础上进一步开发对其产业开发和临床应用，将会具有很大的意义。

目前三七叶总皂苷的提取工艺有：水提取法和醇提取法，其精制方法采用大孔树脂纯化，或者使用有机溶剂正丁醇萃取。 2010版药典规定三七叶总皂苷的含量以Rb₃计不得低于10%。而已有报道的三七叶皂苷提取工艺所得产品没有强调叶苷中的指标性成分Rb₃的含量，没有针对性地富集Rb₃，多以总皂苷的总含量做为质量好坏的依据，不能保证产品的稳定性与质量的可靠性。同时在使用树脂纯化时，样品对树脂的污染较为严重，树脂使用寿命较短。因此如何克服现有技术的不足是目前天然药物提取技术领域亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种三七叶总皂苷的制备方法。

本发明采用的技术方案如下：

一种三七叶总皂苷的制备方法，包括如下步骤：

步骤（1）：将三七叶粉碎，加入溶剂进行提取，得到提取液；

步骤（2）：用澄清剂将步骤（1）得到的提取液澄清后，醇沉，然后用大孔吸附树脂柱层析脱糖，得到的洗脱液再用阴离子交换树脂柱层析脱色，最后经浓缩、干燥，即得三七叶总皂苷；

步骤（1）中所述的溶剂为乙醇；

所述的脱糖洗脱时，先用水冲洗至流出液为无色，再用2-3倍柱体积的20-30%乙醇冲洗，弃去冲洗液，最后用体积分数不小于于80%的乙醇洗脱，得到洗脱液。

所述的三七的叶茎质量比不低于3/7。

所述的步骤（1）中的溶剂为体积分数为70~80%的乙醇溶液。

所述的步骤（1）中提取的方式为超声波逆流连续提取。

所述的步骤（2）中的澄清剂为天然澄清剂。

进一步，优选的是所述的步骤（2）中的澄清剂为ZTC 1+1、明胶或壳聚糖。

所述的醇沉加入乙醇的量为使澄清液的含乙醇量为30~50%。

所述的大孔吸附树脂为聚苯乙烯型大孔吸附树脂。

步骤（2）中所述的采用微波干燥。

所述的三七叶总皂苷的制备方法，包括如下步骤：

步骤（1）：将三七叶粉碎，加入70~80%乙醇，超声波逆流连续提取60min，收集提取液，过滤，浓缩至清膏；

步骤（2）：向步骤（1）得到的清膏中加入水使其密度为1.08（60℃），加热至75-78℃，按m_三七叶：v_{天然澄清剂B}=1000g：24~26ml加入天然澄清剂B，搅拌至混合均匀，再升温至82-85℃时，加入天然澄清剂A，天然澄清剂A加入量为天然澄清剂B的一半，搅拌至混合均匀，降至室温静止过夜，离心，得到澄清溶液；将澄清溶液浓缩至密度为1.08（60℃），加入乙醇使其含乙醇量为30~50%，搅拌至混合均匀，室温静止过夜，离心，得到醇沉澄清液；醇沉澄清液经浓缩至无醇味，按m_三七叶：v_纯化水=1000g：6.5~7.5L加入纯化水稀释，得到稀释液，将稀释液上D-101、DA-201、D1400、CAD-40、ADS-5、HPD-500、DM130、XAD-2、XAD-4、Diaion或AB-8型大孔吸附树脂柱，其中大孔吸附树脂与稀释液的重量比为1:10-20，柱径与柱高比为1:8-10，先用水洗至流出液为无色，再用2-3倍柱体积的20-30%乙醇冲洗，弃去冲洗液，最后用体积分数不小于80%的乙醇洗脱，收集洗脱液；将洗脱液上D941、D280、D296、D900、D396、D390、D311或D314型阴离子交换树脂柱脱色，收集流出的脱色药液，浓缩，微波干燥，即得三七叶总皂苷。

三七叶原料经适当粉碎，用一定浓度的乙醇作溶剂提取，提取液经澄清，醇沉，脱糖，脱色、干燥等工艺制备而成。所制备的总皂苷收率为8%以上，总苷含量≥90%以上（UV），主要含Rb₃、Rc、Fc、Fa等成分，其中Rb₃含量≥40%(HPLC)。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：（1）本发明经过工艺研究，优化出了一条三七叶总皂苷最优工艺路线，该路线下三七叶总皂苷收率高，主要的药理活性成分Rb₃富集程度和含量也较高。；所制备得到的总皂苷产品类白色，，粉末质地疏松。总苷收率为8%以上，含量不低于90%（UV），主要含Rb₃、Rc、Fc、Fa等成分，其中Rb₃含量≥40%（HPLC）；（2）和已有制备方法相比，本发明工艺采用超声波逆流连续提取，有别于传统的热回流提取，提取温度低、效率高、耗时少，利于产业化低成本、高效率、高质量生产；（3）和已有制备方法相比，该工艺中采用前处理加澄清剂澄清、醇沉除杂，之后进树脂柱用乙醇梯度洗脱，结合离子交换树脂脱色的方法；工艺过程中因在上树脂柱前进行了相应的澄清、醇沉除杂处理，极大程度地减少了含大量杂质、颜色较深的药液对树脂柱的污染，延长了树脂的使用寿命；（4）该工艺所制备得到的总皂苷制成制剂可用于改善神经功能，治疗失眠以及缓和焦虑等，用于神经衰弱、安神镇静和偏头痛等病症。

附图说明

图1为本发明实施例1所制备的三七叶总皂苷HPLC图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

实施例1

三七叶总皂苷的制备方法，包括如下步骤：

步骤（1）：将30kg三七叶粉碎，加质量为三七叶4倍的70%乙醇，超声波逆流连续提取60min，收集提取液，过滤，浓缩至清膏，清膏相对密度为1.2（60℃）；其中，所述的三七的叶茎质量比为3/7；

步骤（2）：向步骤（1）得到的清膏中加入水使其密度为1.08（60℃），加热至75℃，加入750 ml明胶，搅拌至混合均匀，再升温至82℃时，加入375 ml壳聚糖，搅拌至混合均匀，降至室温静止过夜，离心，得到澄清溶液；

将澄清溶液浓缩至密度为1.08（60℃），加入乙醇使其的含乙醇量为30%，搅拌至混合均匀，室温静止过夜，离心，得到醇沉澄清液；

醇沉澄清液经浓缩至无醇味，密度为1.08（60℃），按m_三七叶：v_纯化水=1000g：6.5L加入纯化水稀释，得到稀释液，将稀释液上DM130型大孔吸附树脂柱，其中大孔吸附树脂与稀释液的重量比为1:10，柱径与柱高比为1:8，先用水洗至流出液为无色，再用2倍柱体积的30%乙醇冲洗，弃去冲洗液，最后用体积分数为80%的乙醇全部洗脱，收集洗脱液；将洗脱液上D941型阴离子交换树脂柱脱色，调整流速至280ml/min，收集流出的脱色药液，浓缩至密度为1.08（60℃），微波干燥，即得三七叶总皂苷2.60kg，总苷含量95.2%（UV），Rb₃含量为42.3%（HPLC）。

实施例2

三七叶总皂苷的制备方法，包括如下步骤：

步骤（1）：将15kg三七叶粉碎，加质量为三七叶5倍的70%乙醇，超声波逆流连续提取60min，收集提取液，过滤，浓缩至清膏，清膏相对密度为1.2（60℃）；其中，所述的三七的叶茎质量比为1/2；

步骤（2）：向步骤（1）得到的清膏中加入水使其密度为1.10（60℃），加热至78℃，加入375 ml ZTC 1+1，搅拌至混合均匀，再升温至85℃时，加入187.5 ml明胶，搅拌至混合均匀，降至室温静止过夜，离心，得到澄清溶液；

将澄清溶液浓缩至密度为1.08（60℃），加入乙醇使其的含乙醇量为40%，搅拌至混合均匀，室温静止过夜，离心，得到醇沉澄清液；

醇沉澄清液经浓缩至无醇味，密度为1.08（60℃），按m_三七叶：v_纯化水=1000g：7.5L加入纯化水稀释，得到稀释液，将稀释液上D-101型大孔吸附树脂柱，其中大孔吸附树脂与稀释液的重量比为1:20，柱径与柱高比为1:10，先用水洗至流出液为无色，再用3倍柱体积的30%乙醇冲洗，弃去冲洗液，最后用体积分数为80%的乙醇全部洗脱，收集洗脱液；将洗脱液上D941型阴离子交换树脂柱脱色，调整流速至250ml/min，收集流出的脱色药液，浓缩至密度为1.08（60℃），微波干燥，即得三七叶总皂苷1.25kg，总苷含量92.6%（UV），Rb₃含量为43.2%（HPLC）。

实施例3

三七叶总皂苷的制备方法，包括如下步骤：

步骤（1）：将20kg三七叶粉碎，加质量为三七叶4.5倍的80%乙醇，超声波逆流连续提取60min，收集提取液，过滤，浓缩至清膏，清膏相对密度为1.2（60℃）；其中，所述的三七的叶茎质量比为2/3；

步骤（2）：向步骤（1）得到的清膏中加入水使其密度为1.08（60℃），加热至78℃，加入500 ml ZTC 1+1，搅拌至混合均匀，再升温至85℃时，加入250ml壳聚糖，搅拌至混合均匀，降至室温静止过夜，离心，得到澄清溶液；

将澄清溶液浓缩至密度为1.08（60℃），加入乙醇使其的含乙醇量为50%，搅拌至混合均匀，室温静止过夜，离心，得到醇沉澄清液；

醇沉澄清液经浓缩至无醇味，密度为1.08（60℃），按m_三七叶：v_纯化水=1000g：7L加入纯化水稀释，得到稀释液，将稀释液上DM130型大孔吸附树脂柱，其中大孔吸附树脂与稀释液的重量比为1:15，柱径与柱高比为1:9，先用水洗至流出液为无色，再用2.5倍柱体积的30%乙醇冲洗，弃去冲洗液，最后用体积分数为85%的乙醇全部洗脱，收集洗脱液；将洗脱液上D941型阴离子交换树脂柱脱色，调整流速至200ml/min，收集流出的脱色药液，浓缩至密度为1.08（60℃），微波干燥，即得三七叶总皂苷1.70kg，总苷含量96.6%（UV），Rb₃含量为44.2%（HPLC）。

实施例4

三七叶总皂苷的制备方法，包括如下步骤：

步骤（1）：将20kg三七叶粉碎，加质量为三七叶4倍的75%乙醇，超声波逆流连续提取60min，收集提取液，过滤，浓缩至清膏，清膏相对密度为1.2（60℃）；其中，所述的三七的叶茎质量比为4/7；

步骤（2）：向步骤（1）得到的清膏中加入水使其密度为1.08（60℃），加热至76℃，加入480 ml ZTC 1+1，搅拌至混合均匀，再升温至83℃时，加入240 ml ZTC 1+1，搅拌至混合均匀，降至室温静止过夜，离心，得到澄清溶液；

将澄清溶液浓缩至密度为1.08（60℃），加入乙醇使其的含乙醇量为45%，搅拌至混合均匀，室温静止过夜，离心，得到醇沉澄清液；

醇沉澄清液经浓缩至无醇味，密度为1.08（60℃），按m_三七叶：v_纯化水=1000g：7L加入纯化水稀释，得到稀释液，将稀释液上DA-201型大孔吸附树脂柱，其中大孔吸附树脂与稀释液的重量比为1:13，柱径与柱高比为1:9，先用水洗至流出液为无色，再用2.5倍柱体积的,20%乙醇冲洗，弃去冲洗液，最后用体积分数为90%的乙醇全部洗脱，收集洗脱液；将洗脱液上D280型阴离子交换树脂柱脱色，调整流速至240ml/min，收集流出的脱色药液，浓缩至密度为1.08（60℃），微波干燥，即得三七叶总皂苷1.72kg，总苷含量96.2%（UV），Rb₃含量为44.3%（HPLC）。

实施例5

三七叶总皂苷的制备方法，包括如下步骤：

步骤（1）：将20kg三七叶粉碎，加质量为三七叶4.5倍的70%乙醇，超声波逆流连续提取60min，收集提取液，过滤，浓缩至清膏，清膏相对密度为1.2（60℃）；其中，所述的三七的叶茎质量比为5/7；

步骤（2）：向步骤（1）得到的清膏中加入水使其密度为1.08（60℃），加热至77℃，加入520 ml明胶，搅拌至混合均匀，再升温至84℃时，加入260 ml明胶，搅拌至混合均匀，降至室温静止过夜，离心，得到澄清溶液；

醇沉澄清液经浓缩至无醇味，密度为1.08（60℃），按m_三七叶：v_纯化水=1000g：7.2L加入纯化水稀释，得到稀释液，将稀释液上D1400型大孔吸附树脂柱，其中大孔吸附树脂与稀释液的重量比为1:18，柱径与柱高比为1:9.5，先用水洗至流出液为无色，再用2.4倍柱体积的25%乙醇冲洗，弃去冲洗液，最后用体积分数为88%的乙醇全部洗脱，收集洗脱液；将洗脱液上D296型阴离子交换树脂柱脱色，调整流速至260ml/min，收集流出的脱色药液，浓缩至密度为1.08（60℃），微波干燥，即得三七叶总皂苷1.68kg，总苷含量95.7%（UV），Rb₃含量为43.5%（HPLC）。

实施例6

三七叶总皂苷的制备方法，包括如下步骤：

步骤（1）：将20kg三七叶粉碎，加质量为三七叶4倍的80%乙醇，超声波逆流连续提取60min，收集提取液，过滤，浓缩至清膏，清膏相对密度为1.2（60℃）；其中，所述的三七的叶茎质量比为4/7；

步骤（2）：向步骤（1）得到的清膏中加入水使其密度为1.08（60℃），加热至77℃，加入500 ml明胶，搅拌至混合均匀，再升温至84℃时，加入250 ml ZTC 1+1，搅拌至混合均匀，降至室温静止过夜，离心，得到澄清溶液；

将澄清溶液浓缩至密度为1.08（60℃），加入乙醇使其的含乙醇量为35%，搅拌至混合均匀，室温静止过夜，离心，得到醇沉澄清液；

醇沉澄清液经浓缩至无醇味，密度为1.08（60℃），按m_三七叶：v_纯化水=1000g：6.8L加入纯化水稀释，得到稀释液，将稀释液上CAD-40型大孔吸附树脂柱，其中大孔吸附树脂与稀释液的重量比为1:17，柱径与柱高比为1:9，先用水洗至流出液为无色，再用2.7倍柱体积的26%乙醇冲洗，弃去冲洗液，最后用体积分数为92%的乙醇全部洗脱，收集洗脱液；将洗脱液上D900型阴离子交换树脂柱脱色，调整流速至270ml/min，收集流出的脱色药液，浓缩至密度为1.08（60℃），微波干燥，即得三七叶总皂苷1.73kg，总苷含量94.8%（UV），Rb₃含量为43.2%（HPLC）。

实施例7

本实施例的三七叶总皂苷的制备方法与实施例6的区别在于步骤（2）中天然澄清剂A为壳聚糖，天然澄清剂B为壳聚糖，脱糖采用ADS-5型大孔吸附树脂柱，脱色采用D396型阴离子交换树脂柱；

得三七叶总皂苷1.66kg，总苷含量94.3%（UV），Rb₃含量为44.2%（HPLC）。

实施例8

本实施例的三七叶总皂苷的制备方法与实施例6的区别在于步骤（2）中天然澄清剂A为壳聚糖，天然澄清剂B为明胶，脱糖采用HPD-500型大孔吸附树脂柱，脱色采用D390型阴离子交换树脂柱；

得三七叶总皂苷1.71kg，总苷含量95.4%（UV），Rb₃含量为43.8%（HPLC）。

实施例9

本实施例的三七叶总皂苷的制备方法与实施例6的区别在于步骤（2）中天然澄清剂A为壳聚糖，天然澄清剂B为ZTC 1+1，脱糖采用ADS-5型大孔吸附树脂柱，脱色采用D396型阴离子交换树脂柱；

得三七叶总皂苷1.69kg，总苷含量95.0%（UV），Rb₃含量为43.6%（HPLC）。

实施例10

本实施例的三七叶总皂苷的制备方法与实施例9的区别在于步骤（2）中脱糖采用XAD-2型大孔吸附树脂柱，脱色采用D311型阴离子交换树脂柱；

得三七叶总皂苷1.67kg，总苷含量94.5%（UV），Rb₃含量为45.1%（HPLC）。

实施例11

本实施例的三七叶总皂苷的制备方法与实施例9的区别在于步骤（2）中脱糖采用XAD-4型大孔吸附树脂柱，脱色采用D314型阴离子交换树脂柱；

得三七叶总皂苷1.74kg，总苷含量95.5%（UV），Rb₃含量为45.4%（HPLC）。

实施例12

本实施例的三七叶总皂苷的制备方法与实施例9的区别在于步骤（2）中脱糖采用Diaion型大孔吸附树脂柱，脱色采用D314型阴离子交换树脂柱；

得三七叶总皂苷1.65kg，总苷含量94.4%（UV），Rb₃含量为44.9%（HPLC）。

实施例13

本实施例的三七叶总皂苷的制备方法与实施例9的区别在于步骤（2）中脱糖采用AB-8型大孔吸附树脂柱，脱色采用D314型阴离子交换树脂柱；

得三七叶总皂苷1.72kg，总苷含量93.7%（UV），Rb₃含量为43.9%（HPLC）。

Claims

1.一种三七叶总皂苷的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤（1）中所述的溶剂为乙醇；

所述的脱糖洗脱时，先用水冲洗至流出液为无色，再用2-3倍柱体积的20-30%乙醇冲洗，弃去冲洗液，最后用体积分数不小于80%的乙醇洗脱，得到洗脱液。

2.根据权利要求1所述的三七叶总皂苷的制备方法，其特征在于所述的三七的叶茎质量比不低于3/7。

3.根据权利要求1所述的三七叶总皂苷的制备方法，其特征在于所述的步骤（1）中的溶剂为体积分数为70~80%的乙醇溶液。

4.根据权利要求1所述的三七叶总皂苷的制备方法，其特征在于所述的步骤（1）中提取的方式为超声波逆流连续提取。

5.根据权利要求1所述的三七叶总皂苷的制备方法，其特征在于所述的步骤（2）中的澄清剂为天然澄清剂。

6.根据权利要求1所述的三七叶总皂苷的制备方法，其特征在于所述的步骤（2）中的澄清剂为ZTC 1+1、明胶或壳聚糖。

7.根据权利要求1所述的三七叶总皂苷的制备方法，其特征在于所述的醇沉加入乙醇的量为使澄清液的含乙醇量为30~50%。

8.根据权利要求1所述的三七叶总皂苷的制备方法，其特征在于所述的大孔吸附树脂为聚苯乙烯型大孔吸附树脂。

9.根据权利要求1所述的三七叶总皂苷的制备方法，其特征在于步骤（2）中所述的采用微波干燥。

10.根据权利要求1所述的三七叶总皂苷的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤（2）：向步骤（1）得到的清膏中加入水使其密度为1.08（60℃），加热至75-78℃，按m_三七叶：v_{天然澄清剂B}=1000g：24~26ml加入天然澄清剂B，搅拌至混合均匀，再升温至82-85℃时，加入天然澄清剂A，天然澄清剂A加入量为天然澄清剂B的一半，搅拌至混合均匀，降至室温静止过夜，离心，得到澄清溶液；将澄清溶液浓缩至密度为1.08（60℃），加入乙醇使其含乙醇量为30~50%，搅拌至混合均匀，室温静止过夜，离心，得到醇沉澄清液；醇沉澄清液经浓缩至无醇味，按m_三七叶：v_纯化水=1000g：6.5~7.5L加入纯化水稀释，得到稀释液，将稀释液上D-101、DA-201、D1400、CAD-40、ADS-5、HPD-500、DM130、XAD-2、XAD-4、Diaion或AB-8型大孔吸附树脂柱，其中大孔吸附树脂与稀释液的重量比为1:10-20，柱径与柱高比为1:8-10，先用水洗至流出液为无色，再用2-3倍柱体积的20-30%乙醇冲洗，弃去冲洗液，最后用体积分数不小于80%的乙醇洗脱，收集洗脱液；将洗脱液上D941、D280、D296、D900、D396、D390、D311或D314型阴离子交换树脂柱脱色，收集流出的脱色药液，浓缩，微波干燥，即得三七叶总皂苷；

所述的天然澄清剂A为ZTC 1+1、明胶或壳聚糖；

所述的天然澄清剂B为ZTC 1+1、明胶或壳聚糖。