CN109476728A - 脑部递送蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种脑部递送蛋白，所述脑部递送蛋白包含与哺乳动物脑中的靶结合的靶结合抗体；两个载体部分，所述两个载体部分中的每一个能够与在血脑屏障(BBB)内皮细胞上表达的蛋白进行单价相互作用，其中所述载体部分中的每一个连接至靶结合抗体的C末端。本发明还涉及这样的脑部递送蛋白在例如神经退行性紊乱和其他脑部疾病的治疗或诊断中的用途或用于研究例如神经退行性紊乱和其他脑部疾病的用途。

Description

脑部递送蛋白
技术领域
本发明涉及脑部递送蛋白，所述脑部递送蛋白使得与脑中的靶结合的蛋白诸如抗体能够转运跨越血脑屏障。
背景
血脑屏障(BBB)包含紧密连接的内皮细胞，并且通过将小的药物样分子和较大分子如蛋白保持在脑外来充当脑的保护者。虽然对于脑内稳态是必需的，但该屏障的存在是治疗和诊断脑中的疾病的障碍。例如，由于BBB的紧密连接的内皮细胞，仅约0.1％的未修饰的抗体进入脑(Bard F.等，Nat.Med.6:916-919(2000))。
然而，已经描述了一些蛋白从血液主动转运跨越BBB进入脑。一个这样的实例是经由位于BBB的转铁蛋白受体(TfR)将铁转运至脑的转铁蛋白。转铁蛋白-TfR复合物在BBB的腔侧(luminal side)形成，并且随后被内吞。铁在其中pH较低的核内体中与转铁蛋白解离。没有结合的铁的转铁蛋白(脱铁转铁蛋白)对TfR具有低亲和力并且在BBB的腔外侧(abluminal side)与铁一起释放。不仅是转铁蛋白，与TfR结合的其他蛋白也可从BBB的腔侧被内吞到腔外侧，并且该机制可以用于将分子主动转运到脑中(Boado RJ等，Biotechnol.Bioeng.102:1251-1258(2009)；Pardridge WM，Expert Opin.Drug Deliv.12:207-222(2015))。
为了避免在溶酶体中降解，与TfR结合的蛋白/抗体在核内体中与受体解离是必需的。已经提出，对于显示出pH依赖性亲和力的结合物，核内体中的低pH环境可促进与TfR的解离(Sade H.等，PLOS one 4：e96340(2014))。当对TfR的总体亲和力是中等或低时，解离也是更加可能的(Yu YJ.等，Sci.Transl.Med.3:84ra44(2011))。还发现与靶的二价结合是不利的(Niewoehner J.等，Neuron 81:49-60(2014))。抗体二价结合降低了与TfR解离的速率，因为抗体解离需要从两个表位(结合位点)同时解离，即亲合力效应。
先前已经公开了一种双特异性蛋白，该双特异性蛋白由与TfR抗体8D3化学缀合的抗淀粉样蛋白β原纤维抗体(被称为mAb158)组成(Sehlin D.等，Nat.Commun.7:10759(2016))。该蛋白在注射后3天显示出与mAb158相比20倍更高的脑部浓度与血液浓度的比率。发现增加的比率部分地由于脑部浓度增加，并且部分由于与mAb158相比血液中半衰期缩短。
对BBB受体具有低亲和力的抗体先前已在WO 2012/075037中公开。此外，该出版物公开了对于结合TfR和淀粉样蛋白前体蛋白(APP)裂解酶β分泌酶(BACE1)二者的双特异性抗体(抗TfRA/BACE1)，观察到在以示踪剂量施用和以治疗剂量施用之间的脑部摄取的差异。
在WO 2014/033074中公开了BBB抗体穿梭物的另一种变体。BBB穿梭物包含脑部效应物实体、接头和结合TfR的一个单价结合实体，其中接头将效应物实体偶联至结合TfR的单价结合实体。
为了提供脑部疾病的改进的治疗和诊断以及用于研究的目的，仍然需要具有改进的摄取的蛋白/抗体。
发明概述
本发明的一个目的是提供用于治疗和诊断脑部疾病以及用于研究目的的新型蛋白。
在本发明的第一方面中，提供了脑部递送蛋白，该脑部递送蛋白包含：
靶结合抗体或其片段，所述靶结合抗体或其片段与哺乳动物脑中的靶结合；
两个载体部分，所述两个载体部分中的每一个能够与在血脑屏障(BBB)内皮细胞上表达的蛋白进行单价相互作用，
其中所述载体部分中的每一个连接至靶结合抗体的C末端。
如本文所公开的脑部递送蛋白包含两种类型的部分；与脑中的靶结合的靶结合抗体和使得脑部递送蛋白能够转运跨越BBB进入脑中的两个载体部分。两个载体部分能够与在BBB内皮细胞上的蛋白进行单价相互作用或与在BBB内皮细胞上的蛋白单价结合。单价相互作用或结合表明在载体部分与在BBB内皮细胞上表达的蛋白之间的相互作用通过一个单一表位发生。由于脑部递送蛋白的结构，通常一次仅一个载体部分可与BBB上表达的蛋白结合。这可继而防止与BBB蛋白的二价、高亲合力结合并且引起更有效的BBB转移，并且还可防止BBB蛋白的任何二聚化/构象变化。
在一个实施方案中，一次所述两个载体部分中的一个与在BBB内皮细胞上表达的所述蛋白结合。因此，能够实现这样的脑部递送蛋白与在BBB内皮细胞上表达的蛋白的单价相互作用。
因此，尽管具有潜在地可以与所述BBB蛋白结合的两个载体部分，但通过维持单价结合，可增加跨越BBB的转运的效率。与仅包含一个载体部分的脑部递送蛋白相比，通过使两个载体部分与靶结合抗体连接，针对在BBB细胞上表达的蛋白的可用结合位点的数量将加倍。此外，在小鼠中进行的剂量实验证明，根据本发明的包含两个载体部分的脑部递送蛋白以治疗剂量和示踪剂量二者均改进了脑部摄取(实施例2)。与无载体部分的“裸”靶结合抗体(RmAb158)的脑部摄取相比，发现在实施例2中研究的特异性脑部递送蛋白RmAb158-scFv8D3(具有两个单链TfR结合抗体(scFv8D3))以示踪剂量在注射后2小时将脑部摄取提高了约80倍。对于RmAb48-scFv8D3，已经获得类似结果(实施例5)。发现治疗剂量的RmAb158-scFv8D3的脑部摄取比相应的裸靶结合抗体的脑部摄取高10倍。推测该差异可能至少部分地取决于具有两个TfR结合部分的脑部递送蛋白。相比之下，现有技术的脑部穿梭物已证明示踪剂量的抗TfR抗体的摄取增加约40倍，而治疗剂量的相同穿梭物的脑部摄取仅增加1.4倍(Yu等，同上，(2011))。这可能是由于TfR系统以治疗剂量达到饱和。然而，先前已经公开了作为BBB穿梭物的基于CD98的脑穿梭物的类似结果。发现示踪剂量的摄取比无CD98的抗体高80倍，但治疗剂量的摄取仅高3.2倍(Zuchero YJY.等，Neuron 89:70-82(2016))。
如本文所公开的脑部递送蛋白的载体部分在靶结合抗体的C末端连接至靶结合抗体。载体部分优选位于靶结合抗体的重链或轻链的C末端。优选地，载体部分连接至靶结合抗体的单独的链，优选地连接至单独的轻链或单独的重链。
根据一个实施方案，所述载体部分中的每一个通过接头连接至靶结合抗体。用于将载体部分连接至靶结合抗体的接头可以相同或不同，即它们可具有相同的长度和/或氨基酸序列，或者它们可具有不同的长度和/或氨基酸序列。具体地，就所述载体部分中的每一个而言，所述接头中的每一个单独地包含具有由1-30个氨基酸残基、优选1-25个氨基酸残基、优选1-19个氨基酸残基、优选3-19个氨基酸残基、优选3-15个氨基酸残基、优选5-15个氨基酸残基组成的氨基酸序列的肽。接头的一个实例是具有11个氨基酸的接头。这样的接头长度已在所附实施例中使用。因此，所述接头优选是相对短的肽。然而，接头的长度可取决于接头在靶结合抗体上的具体位置而不同。短的接头可以是有利的，因为载体部分与在内皮BBB细胞上表达的蛋白，例如二聚受体的二价结合可进一步在空间上受阻。与二价结合相比，与在BBB内皮细胞上表达的蛋白的单价结合可以提供跨越BBB的改进的转移。二价结合降低解离速率，这继而可增加结合的可能性并因此增加结合时间，即导致BBB转运减少的亲合力效应。
在一个实施方案中，两个载体部分中的每一个连接至靶结合抗体的轻链的C末端。特别地，包含通过短肽接头(例如每个接头包含具有1-30个氨基酸残基的肽)连接至所述靶结合抗体的两个载体部分的脑部递送蛋白可以仍然能够与在BBB内皮细胞上表达的蛋白进行单价相互作用。例如，每个接头可包含具有1-25个氨基酸、优选1-19个氨基酸、更优选5-19个氨基酸的肽。用于将载体部分的每一个连接至靶结合抗体的轻链的C末端的接头的非限制性实例是具有11个氨基酸残基长度的接头。这样的接头在所附实施例中公开。应当理解，用于连接载体部分与靶结合抗体的接头可以相同或不同，即它们可具有相同的长度和/或氨基酸序列，或者它们可具有不同的长度和/或氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述两个载体部分中的每一个连接至靶结合抗体的重链的C末端。特别地，包含通过短肽接头(例如每个接头包含具有1-19个氨基酸残基的肽)连接至所述靶结合抗体的两个载体部分的脑部递送蛋白可以仍然能够与在BBB内皮细胞上表达的蛋白进行单价相互作用。例如，每个接头可包含具有1-19个氨基酸、优选1-15个氨基酸、更优选1-10个氨基酸的肽。应当理解，连接载体部分与靶结合抗体的接头可以相同或不同，即它们可具有相同的长度和/或氨基酸序列，或者它们可具有不同的长度和/或氨基酸序列。
在一个实施方案中，第一载体部分连接至靶结合抗体的重链的C末端，并且第二载体部分连接至靶结合抗体的轻链的C末端。应当理解，连接载体部分与靶结合抗体的接头可以相同或不同，即它们可以具有相同的长度和/或氨基酸序列，或者它们可以具有不同的长度和/或氨基酸序列。接头的示例性长度在本文的相关实施方案中公开。
如所附实施例中所公开的，已发现将两个载体部分(scFv8D3)连接至靶结合抗体(RmAb158)的轻链的C末端的相对短的肽接头在空间上阻碍与在BBB上表达的蛋白(TfR二聚体)的二价结合。在所附实施例中使用的肽接头是柔性且亲水性的，并且含有11个氨基酸残基。因此，可以在根据本发明的脑部递送蛋白中使用的接头的一个非限制性实例是包含具有氨基酸序列APGSYTGSAPG(SEQ ID NO:1)的肽的接头。具有不同长度和氨基酸序列的肽接头也涵盖在本公开内容中。技术人员将理解如何设计可选的接头序列，即如何选择在例如亲水性和柔性方面具有/提供类似性质的可选的氨基酸残基。
在一个实施方案中，所述接头是柔性的。柔性接头可以包含具有小的侧链的氨基酸残基。柔性肽接头的非限制性实例是富含甘氨酸的接头。在一个实施方案中，所述接头是亲水性的。因此，亲水性接头通常包含亲水性氨基酸残基。在一个实施方案中，所述接头包含含有至少一个脯氨酸残基(诸如两个脯氨酸残基)的肽。这样的一个或更多个脯氨酸残基优选位于接头序列的C末端和/或N末端附近。
术语“抗体”在本文中以其最广泛的含义使用，包括单克隆和多克隆抗体二者，以及全长抗体诸如全长IgG和其他抗体同种型和亚型。全长抗体应理解为包含抗原结合可变区以及轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域CH1、CH2和CH3的抗体。术语“抗体”还包括抗体片段，诸如Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段。如本文所用的术语还涵盖其单链片段，诸如scFv、Fv、sFab、VHH或VNAR。因此，在一个实施方案中，靶结合抗体选自如以上所述及的抗体及其片段。本文提及的抗体优选是人源化抗体。
在一个实施方案中，所述载体部分中的每一个包含抗体或抗体片段。所述抗体片段可以选自scFv、Fv、scFab或VHH；转铁蛋白或其突变体或变体，或衍生自葡萄球菌蛋白A的结构域B的蛋白Z的变体。所述抗体或抗体片段优选是人源化的。
在一个实施方案中，所述载体部分中的每一个包含scFv。通过使用抗体的单链片段，脑部递送蛋白的制备可以例如被简化。
应当理解，在BBB内皮细胞上表达的几种不同蛋白可被用作用于靶结合抗体进入脑的转运途径。这样的转运途径可以利用受体介导的转胞吞作用，用于递送例如抗体跨越BBB。因此，在一个实施方案中，在BBB内皮细胞上表达的所述蛋白选自转铁蛋白受体(TfR)、胰岛素受体(InsR)、胰岛素样生长因子受体、低密度脂蛋白受体相关蛋白8(Lrp8)、低密度脂蛋白受体相关蛋白1(Lrp1)、CD98、跨膜蛋白50A(TMEM50A)、葡萄糖转运蛋白1(Glut1)、basigin(BSG)和肝素结合表皮生长因子样生长因子。优选地，在BBB内皮细胞上表达的所述蛋白选自TfR、InsR、Lrp1、CD98、Glut1和BSG。在一个实施方案中，在BBB内皮细胞上表达的所述蛋白是TfR。在一个实施方案中，在BBB内皮细胞上表达的所述蛋白是InsR。在一个实施方案中，在BBB内皮细胞上表达的所述蛋白是Lrp1。在一个实施方案中，在BBB内皮细胞上表达的所述蛋白是CD98。在一个实施方案中，在BBB内皮细胞上表达的所述蛋白是Glut1。在一个实施方案中，在BBB内皮细胞上表达的所述蛋白是BSG。
因此，应理解，所述两个载体部分各自能够与如以上所示例的在BBB内皮细胞上表达的蛋白进行单价相互作用。特别地，所述载体部分中的每一个可以是能够与例如TfR、InsR、Lrp1、CD98、Glut1或BSG相互作用的抗体或蛋白。在一个实施方案中，所述载体部分中的每一个是针对TfR的抗体片段。抗TfR结合抗体的实例是8D3。如在所附实施例中所证明的，可变结构域的单链片段(scFv8D3)在根据本发明的脑部递送蛋白的实施例中被证明是有利的。
在一个实施方案中，所述载体部分中的每一个是对TfR具有低至中等亲和力的抗TfR抗体。与高亲和力对应物相比，对TfR具有低至中等亲和力的抗TfR载体抗体可以改进脑部递送蛋白的脑部摄取和分布，因为TfR系统以治疗剂量首先表现出被饱和。尽管治疗剂量的抗TfR抗体的高亲和力变体可以使TfR系统饱和，但低或中等亲和力的抗TfR变体抗体以相同剂量可以避免这样的TfR饱和。此外，与高亲和力变体相比，低或中等亲和力变体可以在包封在核内体中之后更快地释放。高亲和力变体可能根本不释放，这因此可以导致蛋白的降解。此外，对TfR具有较低亲和力的抗体可以以高于其高亲和力对应物的浓度保持在循环中，因为它们不会像对TfR具有更高亲和力的那些抗体那样有效地从系统中清除。例如，抗TfR载体抗体的低或中等亲和力变体具有在1-10μM范围内的对TfR的结合亲和力。
在一个实施方案中，所述靶结合抗体是全长抗体、Fab、F(ab')2或Fv。在一个实施方案中，所述靶结合抗体是全长抗体。
包含如以上所公开的两个载体部分的脑部递送蛋白从制备角度也可以证明是有利的，因为与具有两个不同的轻链(即，一条具有连接的载体抗体，而另一条没有连接的载体抗体)的抗体的制备相比，包含两个相同轻链的基于抗体的脑部递送蛋白的生成可以以更高产率制备。
因此，根据本发明的脑部递送蛋白可以包含靶结合抗体，所述靶结合抗体对哺乳动物(诸如人或动物)脑中的任何感兴趣的靶具有结合亲和力。脑部的靶特别地可以是用于研究目的、治疗或诊断的感兴趣的靶，诸如参与脑部紊乱(特别是神经退行性紊乱)的靶。在一个实施方案中，脑中的所述靶选自淀粉样蛋白β(Aβ)肽、α突触核蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)、亨廷顿蛋白、转甲状腺素蛋白、P-分泌酶1、表皮生长因子、表皮生长因子受体2、Tau、磷酸化Tau、载脂蛋白E4、CD20、朊蛋白、富含亮氨酸重复序列激酶2、帕金蛋白(parkin)、早老素2、γ分泌酶、死亡受体6、淀粉样蛋白前体蛋白、p75神经营养蛋白受体、神经调节蛋白和胱天蛋白酶6。
阿尔茨海默病(AD)是最常见的神经退行性紊乱之一。已经通过靶向自聚集蛋白淀粉样蛋白-β(Aβ)的抗体进行许多试验。虽然由Aβ的纤维状沉积物组成的淀粉样蛋白斑是AD的标志，但是在死后的AD脑组织和CSF中测量的可溶性Aβ，特别是低聚物和原纤维，已被示出与疾病进展更好地相关，并且对突触和神经元有害。因此，可溶性Aβ组装体是使用Aβ特异性抗体的免疫疗法的合适的靶。因此，在一个实施方案中，所述脑部的靶是Aβ肽。在特定的实施方案中，所述Aβ肽是可溶性Aβ聚集体，优选选自低聚物和原纤维。结合原纤维的抗Aβ抗体的实例及其制备方法在WO 2002/03911、WO 2005/123775、WO 2007/108756、WO 2011/001366和WO 2016/005466中公开，它们的公开内容通过引用并入本文。与Aβ原纤维结合的充分研究的小鼠单克隆抗体(被称为mAb158)及该抗体的人源化形式(被称为BAN2401)在例如WO 2007/108756中公开。另外，它对Aβ蛋白前体没有亲和力。BAN2401的突变变体公开于WO2016/005466中。在所附实施例中用作靶结合抗体的RmAb158是具有相同Aβ结合特性的mAb158的重组形式。
还存在与Aβ蛋白聚集相关的其他紊乱，诸如创伤性脑损伤(TBI)、路易体痴呆(LBD)、唐氏综合征(DS)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、额颞叶痴呆、tau病变、系统性淀粉样变性、动脉粥样硬化和帕金森病痴呆(PDD)。包含对Aβ肽具有亲和力的靶结合抗体的脑部递送蛋白可以证明可用于例如这类紊乱的治疗或诊断。
在一个实施方案中，所述脑部递送蛋白包含Aβ结合抗体和两个载体部分。Aβ结合抗体可以是对Aβ原纤维具有结合特异性的抗体，诸如上文具体提及的现有技术公布物的任一个中所公开的mAb158/BAN2401或其突变体或变体。在特定的实施方案中，这样的脑部递送蛋白包含两个载体抗体，每一个载体抗体通过接头连接至Aβ结合抗体的(单独的)轻链的C末端。载体部分中的每一个可以是例如如本文定义的抗TfR抗体或其片段，诸如scFv8D3，任选地通过SEQ ID NO:1中列出的接头连接至靶结合部分。
在一个实施方案中，所述Aβ结合抗体是mAb158/BAN2401或其突变体或变体，并且所述载体部分中的每一个是scFv8D3，其中所述scFv8D3中的每一个连接至所述mAb158/BAN2401或其突变体或变体的轻链的C末端，所述蛋白任选地还包含两个接头，每一个接头具有SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列，用于将所述scFv8D3连接至所述mAb158/BAN2401或其突变体或变体。
在一个实施方案中，所述脑部的靶是α突触核蛋白。帕金森病(PD)和路易体痴呆(LBD)是具有α突触核蛋白脑部病理的神经退行性紊乱中的两个最普遍的实例。其他实例包括阿尔茨海默病路易体变型、多系统萎缩、精神病、精神分裂症和克-雅氏病。在一个实施方案中，所述α突触核蛋白是可溶性α突触核蛋白，优选选自低聚物和原纤维。结合α突触核蛋白的靶结合抗体特别地可对人α突触核蛋白原纤维具有高亲和力并且对α突触核蛋白单体具有低结合性。抗α突触核蛋白抗体的具体实例公开于WO 2009/133521、WO 2011/104696中，它们通过引用并入本文。
在一个实施方案中，所述脑部递送蛋白包含α突触核蛋白结合抗体和两个载体部分。在一个实施方案中，所述α突触核蛋白结合抗体结合人α突触核蛋白原纤维，优选地，所述α突触核蛋白结合抗体不结合α突触核蛋白单体。α突触核蛋白结合抗体可以是如在上文提及的现有技术参考文献的任何一个中所公开的抗体或抗体变体。α突触核蛋白结合抗体的一个实例是mAb48或其突变体或变体。mAb48公开于WO 2011/104696中并且表示为“48B11/8”并且尤其在第31-32页的表1和表2中描述。在特定的实施方案中，这样的脑部递送蛋白包含两个载体抗体，每一个载体抗体通过接头连接至α-突触核蛋白结合抗体的轻链的C末端。两个载体部分中的每一个可以是例如抗TfR抗体，诸如scFv8D3，任选地通过SEQID NO:1中列出的接头与靶结合部分连接。
在一个实施方案中，所述α突触核蛋白结合抗体是mAb48或其突变体或变体，并且所述载体部分中的每一个是scFv8D3，其中所述scFv8D3中的每一个连接至所述mAb48或其突变体或变体的轻链的C末端，所述蛋白任选地还包含两个接头，每一个接头具有SEQ IDNO:1中列出的氨基酸序列，用于将所述scFv8D3连接至所述mAb48或其突变体或变体。
在一个实施方案中，所述脑部的靶是SOD。包含针对SOD的抗体的脑部递送蛋白可用于例如治疗和诊断ALS。
在一个实施方案中，所述脑部的靶是亨廷顿蛋白。包含针对亨廷顿蛋白的抗体的脑部递送蛋白可用于例如治疗和诊断亨廷顿病。
在一个实施方案中，所述脑部的靶是转甲状腺素蛋白。包含针对转甲状腺素蛋白的抗体的脑部递送蛋白可用于例如治疗和诊断家族性淀粉样蛋白神经病变。
在一个实施方案中，所述靶结合抗体是人源化抗体。
在一个实施方案中，所述脑部递送蛋白是重组的。
在一个实施方案中，所述蛋白是融合蛋白。特别地，所述蛋白可以被表达为融合蛋白。
在相关方面中，提供编码根据前述权利要求中任一项所述的蛋白的分离的核酸。包含这样的核酸的表达载体可以能够例如通过在宿主细胞中表达来制备脑部递送蛋白。
根据本发明的脑部递送蛋白可以用作治疗剂或诊断剂或用作研究工具，例如，作为PET或SPECT配体。在一个实施方案中，所述脑部递送蛋白用于在预防或治疗中使用。例如，所述脑部递送蛋白用于在脑部紊乱，诸如神经退行性紊乱的治疗和/或预防中使用。
在一个实施方案中，所述脑部递送蛋白用于在治疗和/或预防选自由以下组成的组的神经退行性紊乱中使用：阿尔茨海默病和与Aβ蛋白聚集相关的其他紊乱，诸如创伤性脑损伤(TBI)、路易体痴呆(LBD)、唐氏综合征(DS)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、额颞叶痴呆、tau病变、系统性淀粉样变性、动脉粥样硬化和帕金森病痴呆(PDD)；阿尔茨海默病路易体变型；多系统萎缩；精神病；精神分裂症；克-雅氏病；亨廷顿病和家族性淀粉样蛋白神经病变。
在一个实施方案中，所述脑部递送蛋白用于在治疗和/或预防阿尔茨海默病中使用。特别地，这样的脑部递送蛋白包含结合Aβ肽、优选可溶性形式的Aβ肽诸如低聚物和/或原纤维的靶结合蛋白。
在一个实施方案中，所述脑部递送蛋白用于在治疗和/或预防帕金森病中使用。特别地，这样的脑部递送蛋白包含结合α突触核蛋白、优选可溶性形式的α突触核蛋白诸如低聚物和/或原纤维的靶结合蛋白。
在一个实施方案中，所述脑部递送蛋白用于在体内诊断中使用。例如，所述脑部递送蛋白用于在脑部紊乱诸如神经退行性紊乱的体内诊断中使用。
在一个实施方案中，所述脑部递送蛋白用于在选自由以下组成的组的神经退行性紊乱的体内诊断中使用：阿尔茨海默病和与Aβ蛋白聚集相关的其他紊乱，诸如创伤性脑损伤(TBI)、路易体痴呆(LBD)、唐氏综合征(DS)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、额颞叶痴呆、tau病变、系统性淀粉样变性、动脉粥样硬化和帕金森病痴呆(PDD)；阿尔茨海默病路易体变型；多系统萎缩；精神病；精神分裂症；克-雅氏病；亨廷顿病和家族性淀粉样蛋白神经病变。
在一个实施方案中，所述脑部递送蛋白用于在阿尔茨海默病的体内诊断中使用。特别地，这样的脑部递送蛋白包含结合Aβ肽、优选可溶性形式的Aβ肽诸如低聚物和/或原纤维的靶结合蛋白。
在一个实施方案中，所述脑部递送蛋白用于在帕金森病的治疗中使用。特别地，这样的脑部递送蛋白包含结合α突触核蛋白、优选可溶性形式的α突触核蛋白诸如低聚物和/或原纤维的靶结合蛋白。
在一个实施方案中，所述脑部递送蛋白用于在使用PET的体内诊断中使用。
在一个实施方案中，所述脑部递送蛋白还包含使能够检测脑中的所述蛋白的标记物。在该上下文中，标记物应理解为偶联至脑部递送蛋白并且旨在用于在检测和/或成像(尤其用于医学、诊断或研究目的)中使用的标志物。标记物可以偶联至靶结合抗体或偶联至载体部分中的一个。这样的标记物的非限制性实例包括放射性标记物、荧光团、发色团或亲和标签。在一个实施方案中，标记物是用于医学或诊断成像的放射性标记物，例如Zr89、I124、I125、I131、C11、C14、H3、F18或镓68，其适于在SPECT(单光子发射计算机断层扫描)或PET(正电子发射断层扫描)成像中使用。
如本文所公开的脑部递送蛋白适合针对哺乳动物脑中的靶。因此，本发明的脑部递送蛋白适于哺乳动物中的治疗或诊断用途。如本文使用的哺乳动物包括但不限于家养动物(例如牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如人类和非人类灵长类动物，诸如猴)、兔和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，哺乳动物是人。
在相关方面中，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含根据本发明的脑部递送蛋白和药学上可接受的载体。在用于治疗用途的具体实施方案中，所述组合物是生理学上可接受的制剂，所述制剂包含在适于施用至人和/或动物的生理缓冲液中的治疗活性量的根据本发明的脑部递送蛋白。脑部递送蛋白可以被冷冻干燥以获得更好的稳定性。冷冻干燥的制剂可含有任何合适的常规赋形剂，包括稳定剂、冻干保护剂、缓冲剂等，诸如但不限于甘露醇，用于在冷冻干燥期间和/或之后和/或后续存储期间保护和/或稳定产品。
在相关方面中，提供了治疗和/或预防患有脑部紊乱或处于发展所述紊乱的风险的哺乳动物的脑部紊乱的方法，该方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的根据本发明的脑部递送蛋白。特别地，所述紊乱是选自由以下组成的组的神经退行性紊乱：阿尔茨海默病和与Aβ蛋白聚集相关的其他紊乱，诸如创伤性脑损伤(TBI)、路易体痴呆(LBD)、唐氏综合征(DS)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、额颞叶痴呆、tau病变、系统性淀粉样变性、动脉粥样硬化和帕金森病痴呆(PDD)；阿尔茨海默病路易体变型；多系统萎缩；精神病；精神分裂症；克-雅氏病；亨廷顿病和家族性淀粉样蛋白神经病变。如以上所公开的，特定的靶结合抗体由于它们对某些脑部的靶的结合亲和力，可以用于治疗某些神经退行性紊乱。因此，针对本发明的相关方面公开的实施方案对于本发明的治疗方面的方法也同样是相关的。
在一个相关方面中，提供用于诊断和/或检测怀疑患有脑部紊乱或处于发展所述紊乱的风险的哺乳动物的脑部紊乱的方法，该方法包括以足以能够进行诊断和/或检测的量向所述哺乳动物施用根据本发明的脑部递送蛋白。在特定的实施方案中，所述紊乱是神经退行性紊乱，诸如选自由以下组成的组的神经退行性紊乱：阿尔茨海默病和与Aβ蛋白聚集相关的其他紊乱，诸如创伤性脑损伤(TBI)、路易体痴呆(LBD)、唐氏综合征(DS)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、额颞叶痴呆、tau病变、系统性淀粉样变性、动脉粥样硬化和帕金森病痴呆(PDD)；阿尔茨海默病路易体变型；多系统萎缩；精神病；精神分裂症；克-雅氏病；亨廷顿病和家族性淀粉样蛋白神经病变。如以上所公开的，特定的靶结合抗体由于它们对某些脑部的靶的结合亲和力，可以用于诊断或检测某些紊乱。应当理解，用于诊断和/或检测的方法的具体实施方案可以为体内或体外方法，诸如哺乳动物脑中的体内诊断或诸如细胞样品的体外诊断。因此，针对本发明的相关方面公开的实施方案对于如以上所公开的诊断/检测方面也同样是相关的。
本发明将通过以下非限制性实施例进一步说明。
附图简述
图1是根据本发明的脑部递送蛋白的实施方案的示意图。图1A示出了包含两个由scFv表示的载体部分的脑部递送蛋白，该载体部分通过接头附接至由抗体表示的靶结合抗体的两个轻链的C末端。图1B描绘了脑部递送蛋白与在BBB内皮细胞上表达的受体的假定的单价结合。
图2A-2C示出来自抑制ELISA的结果，显示根据本发明的脑部递送蛋白的一个实例RmAb158-scFv8D3相对于单体(M)保持与Aβ原纤维(PF)的高选择性结合(2A)，其与RmAb158相当(2B)，而对照抗体6E10与两种Aβ种类同样良好地结合(2C)。
图2D示出了来自TfR竞争ELISA的结果，展示了与根据本发明的脑部递送蛋白的一个具体实例RmAb158-scFv8D3相比，可以二价结合TfR的抗TfR抗体8D3以及化学缀合的融合蛋白8D3-F(ab')2-h158(Sehlin等，2016，同上)显示几乎10倍更强的与TfR的结合。8D3的scFv片段具有甚至更弱的TfR结合，因为它仅具有一个结合位点。
图3A-3B是显示来自离体实验的结果的图。图3A的图显示在注射示踪剂量后2小时，wt小鼠中[125I]RmAb158-scFv8D3的脑部浓度比[125I]RmAb158的脑部浓度高80倍。[125I]RmAb158-scFv8D3是根据本发明的脑部递送蛋白的标记的变体，在该实验中其以示踪剂量施用。图3B的图示出了在相同实验中相同蛋白的脑部浓度与血液浓度的比率。
图4A-4C是显示来自离体实验的结果的图。图4A示出了在注射后3天在年老(18-24个月)和年轻(8-9个月)wt和tg-ArcSwe小鼠中，如本文所公开的脑部递送蛋白的一个具体实例[124I]RmAb158-scFv8D3的离体定量的脑部浓度。图4B示出了在注射后3天在18个月龄的tg-ArcSwe小鼠中化学融合的8D3-F(ab')2-mAb158和RmAb158-scFv8D3的离体脑部浓度的比较。图4C示出了在施用后3天、6天和10天，在年老(18-24个月)tg-ArcSwe小鼠中[124I]RmAb158-scFv8D3的离体定量的脑部浓度与相同时间段内的血液浓度的比较。从脑中清除比从血液中清除要慢得多。
图5是示出了如本文所公开的脑部递送蛋白的一个具体实例[124/125I]RmAb158-scFv8D3的生物分布的图，该生物分布被定量为注射剂量/在施用后3天、6天和10天不同外周器官中的器官重量的百分数。包括来自图4C的脑部浓度用于比较。
图6示出了对转基因-ArcSwe小鼠(A-D)和野生型小鼠(E-G)进行60分钟PET扫描期间获得的PET图像。除了(A)之外，所有图像都使用相同颜色标度显示。6A显示在施用[124I]RmAb158-scFv8D3后0-60分钟获得的年老tg-ArcSwe小鼠的PET图像。放射性浓度在所有脑部区域中是相似的。不能使用与其他图中相同的标度，因为在该早期时间点的放射性高得多。PET图像在注射[124I]RmAb158-scFv8D3后3天(6B)、6天(6C)和10天(6D)在年老tg-ArcSwe小鼠中获得。PET图像在注射[124I]RmAb158-scFv8D3后3天(6E)、6天(6F)和10天(6G)在年老野生型小鼠中获得。(％ID/g_脑组织＝一克脑组织中测量的注射剂量的百分数，即[124I]RmAb158-scFv8D3的脑部浓度的量度)。
图7A-7F是示出了海马体(A)、丘脑(B)、纹状体(C)、皮质(D)和全脑(E)中基于PET的脑部区域的浓度与小脑浓度的比率的图。与化学缀合的融合蛋白的比较示出在(F)中。在图中标记为n.a.的一些动物类型在所有时间点都没有进行调查。
图8A-8B是显示来自离体实验的结果的图。图8A的图显示了注射后2小时wt小鼠中[125I]RmAb158-scFv8D3的脑部浓度。[125I]RmAb158-scFv8D3是根据本发明的脑部递送蛋白的标记的变体，在该实验中其以治疗剂量施用。图8B的图示出了以示踪剂量施用的相同蛋白的脑部浓度与血液浓度的比率。
图9A-9D是示出了在注射后6天注射[125I]RmAb158-scFv8D3(A)和[125I]RmAb158(B)的18个月龄的tg-ArcSwe小鼠的脑中的抗体的总体分布的图像，用离体自动放射显影术(左)与Aβ40免疫染色(右)可视化的比较。[125I]RmAb158-scFv8D3分布在整个脑中，而[125I]RmAb158集中在脑的中央部位。为了比较，wt动物也注射了[125I]RmAb158-scFv8D3，其未产生信号(C)；和[125I]RmAb158，其中在脑的中央检测到微弱信号(D)。
图10A-10D是显示以下的图：A.在72小时期间两种不同剂量的RmAb158-scFv8D3和RmAb158的血浆药代动力学，表示为注射剂量/g血浆的百分数。B.根据(A)中血浆曲线下面积计算的药物暴露量。C.注射后72小时的抗体的脑部保留，表示为注射剂量/克脑组织的百分数。D.注射后72小时抗体的脑部保留量与药物暴露量的比率，以显示它们进入并被保留在脑中的相对效率。
实施例
实施例1：重组双特异性Aβ-TfR抗体的生成和表征
RmAb158-scFv8D3的克隆
将表达的抗体的重链和轻链二者克隆到载体pcDNA3.4(ThermoFischer)中，其中在N末端具有信号肽。将8D3序列(Boado等，同上)制成scFv，其中重链可变片段为N末端部分并且轻链可变片段在C末端。重链和轻链由先前公开于Wu AM等，Protein Eng.14:1025-1033(2001)中的18aa长的富含GlySer的氨基酸接头(GSTSGGGSGGGSGGGGSS)分开。然后将scFv8D3用具有氨基酸序列APGSYTGSAPG(SEQ ID NO:1)的内部设计的肽接头连接至RmAb158(例如在EP 2004688中公开)的轻链的C末端。在接头的开始和结束处添加脯氨酸以确保α螺旋不延伸，因为它们不能够贡献α螺旋中所需的酰胺氢键。添加极性氨基酸如丝氨酸和苏氨酸以确保接头是亲水性的，并且添加较小的氨基酸甘氨酸以确保柔性。
RmAb158-scFv8D3的表达和纯化
使用“Protein Expression in Mammalian Cells:Methods and Protocols”(Baldi L.等，Methods in Molecular Biology，81:13-26(2012))中描述的方案表达重组融合蛋白，例外是细胞、用于细胞培养的培养基和载体用以下提及的那些替换：Expi293细胞(ThermoFisher)在Expi293培养基(ThermoFisher)中生长，并使用聚乙烯亚胺(PEI)作为转染试剂和丙戊酸(VPA)作为细胞周期抑制剂用重链和轻链pcDNA3.4载体瞬时转染。RmAb158-scFv8D3在HiTrap蛋白G柱(GE Healthcare)上纯化，并用至0.7％HAc的梯度洗脱。
RmAb158-scFv8D3的体外分析
为了证实RmAb158-scFv8D3的尺寸和完整性，用SDS-PAGE分析融合蛋白。将RmAb158和RmAb158-scFv8D3与无还原剂的 LDS样品缓冲液混合，并且直接加载到10％Bolt Bis-Tris Plus凝胶(Thermo Fisher)上，并且在200V运行22分钟，在dH2O中洗涤并用页蓝(Page blue)(Fermentas)染色。Chameleon预染色的蛋白标志物(Li-Cor)用作分子量标准品。
为了评价溶液中与Aβ单体和原纤维的特异性结合，用抑制ELISA分析RmAb158-scFv8D3，并与Aβ抗体6E10(Covance)进行比较，如先前所描述的(Englund H.等，J.Neurochem.103:334-345(2007))。将96孔板在+4℃用45ng/孔的Aβ原纤维包被2小时，然后用BSA封闭1小时。将连续稀释的Aβ单体或原纤维与固定浓度的抗体(RmAb158-scFv8D3-50ng/ml；6E10-400ng/ml)在未结合的96孔板中预孵育1小时。然后将Aβ-抗体溶液转移到Aβ包被的板上并孵育15分钟，然后用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗小鼠IgG-F(ab')2(Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA,USA)和K蓝水性TMB底物(Neogen Corp.,Lexington,KY,USA)检测，并且用分光光度计在450nm进行读取。所有Aβ和抗体稀释液都在ELISA孵育缓冲液(含有0.1％BSA、0.05％Tween和0.15％Kathon的PBS)中制备。如先前所描述的产生Aβ单体和原纤维配制物(Magnusson K.等，J.AlzheimersDis.37:29-40(2013))。
竞争ELISA用于评价RmAb158-scFv8D3与TfR结合的能力，并与先前生成的化学融合的8D3-F(ab')2-h158(Sehlin D.等，同上(2016))、8D3和8D3的scFv片段进行比较。将96孔板在+4℃用50ng/孔的重组转铁蛋白受体蛋白(Sinobiological,Beijing,China)包被过夜，并且用BSA封闭。在振荡器上将连续稀释的抗体在板上与2.5nM生物素化的scFv8D3竞争孵育2小时，然后用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的链霉亲和素(Mabtech AB,Nacka Strand,Sweden)和K蓝水性TMB底物(Neogen Corp.,Lexington,KY,USA)检测，并且用分光光度计在450nm进行读取。所有抗体稀释液在ELISA孵育缓冲液(含有0.1％BSA、0.05％Tween和0.15％Kathon的PBS)中制备。所有Aβ和抗体稀释液在ELISA孵育缓冲液中制备。使用GraphPad Prism 5.0(GraphPad Software,Inc,La Jolla,CA,USA)通过非线性回归分析来估计IC50和Kd值。
结果
包含通过接头彼此连接的8D3的重链和轻链可变区的单链可变片段(scFv)经由短肽接头附接至RmAb158轻链中的每一个的C末端(图1A)。该接头被设计为避免形成α螺旋，并且亲水性氨基酸的数量被选择以避免形成疏水性核心。将具有小的侧链的氨基酸掺入接头中以确保柔性。接头的短的长度的目的是将scFv与RmAb158紧密连结，使得与TfR的二价结合在空间上是困难的(图1B)。
Expi293细胞中的蛋白表达导致每升转染的细胞培养物产生约15-30mg抗体。纯化的蛋白用SDS-PAGE分析，在SDS-PAGE上观察到单一条带(结果未示出)，即RmAb158-scFv8D3是纯的并且同一批次被用于在下文描述的所有体外和体内研究。
为了评价所生成的融合蛋白的功能性，执行体外结合分析。用抑制ELISA研究融合蛋白对不同Aβ种类的选择性，其中Aβ单体和原纤维在间接AβELISA中抑制信号的能力近似于对测试抗原的亲和力。RmAb158-scFv8D3示出比与单体的结合强接近500倍的与原纤维的结合，其中中位抑制浓度(IC50)分别为0.85nM和400nM(图2A)，与RmAb158相似，其中单体的IC50为1.2nM，并且原纤维的IC50为1.2μM(图2B)。广泛使用的Aβ抗体6E10用作对照，显示在与不同Aβ配制物的结合方面没有差异(图2C)。
通过竞争TfRELISA评价TfR结合(图2D)，其中将板用高浓度的重组TfR蛋白包被以模拟实现二价结合的可能性，其中更高的亲合力作为该情况的读数。通过连续稀释的scFv8D3、RmAb158-scFv8D3、8D3和化学融合的8D3-F(ab')2-h158使8D3的生物素化scFv经受竞争。如预期的，与整个8D3抗体和8D3-F(ab')2-h158相比，RmAb158-scFv8D3显示出1/10更低的亲合力，其中估计的Kd值分别为8.0nM、0.80nM和0.69nM。根据定义为单价的ScFv8D3显示出15nM的Kd值，即比RmAb158-scFv8D3高约2倍。因为重组融合蛋白每分子具有两个可能结合位点，所以scFv8D3和RmAb158-scFv8D3之间在结合方面没有实际差异，强烈暗示与TfR的单价相互作用。
实施例2：用放射性标记的RmAb158-scFv8D3进行的脑部分布和外周生物分布的体 内研究
动物
具有Arctic突变(AβPP E693G)和Swedish突变(AβPP KM670/671NL)并且维持在C57BL/6背景的Tg-ArcSwe模型(Lord，A.等，Neurobiol Aging 27,67-77(2006)；Philipson,O.等人，Neurobiol Aging 30,1393-1405(2009))示出在很小的年龄已经具有升高水平的可溶性Aβ原纤维，并且在6个月龄左右开始出现大量且快速发展的斑块病理。雄性和雌性均被使用并且同窝小鼠被用作对照动物(wt)。动物容纳在乌普萨拉大学的动物设施中具有受控的温度和湿度的房间内，自由获取食物和水。本文所述的所有程序均经乌普萨拉县动物伦理委员会批准(#C17/14)，遵守瑞典动物福利局的规则和条例，并且符合2010年9月22日的欧洲共同体理事会指令(2010/63/EU)。
放射化学
将双特异性RmAb158-scFv8D3用碘-125(125I)标记用于离体实验，并且用碘-124(124I)标记用于使用直接放射性碘化的PET实验(Greenwood，F.C.等，Biochem.J.89,114-123(1963))。该方法基于原位氧化碘对酪氨酸残基的酚环的亲电攻击。简而言之，对于125I-标记，将120皮摩尔的抗体或融合蛋白(假定Mw 210kDa)、125I储备溶液(Perkin-ElmerInc.,Waltham,MA,USA)和5μg氯胺-T(Sigma Aldrich,Stockholm,Sweden)在PBS中混合至最终体积为110μl。允许反应进行90秒，并且随后通过加入两倍摩尔过量的偏亚硫酸氢钠(Sigma Aldrich)淬灭，并在PBS中稀释至500μl。对于124I-标记，将60μl 124I储备溶液(Perkin-Elmer Inc.)与12μl 50μM NaI预孵育15分钟，然后加入240皮摩尔融合蛋白和40μg氯胺-T，在PBS中混合至最终体积为420μl。允许反应进行120秒，并且然后通过在PBS中加入80μg偏亚硫酸氢钠进行淬灭。根据制造商的说明，放射性标记的蛋白用Mw截止值5kDa的一次性NAP-5尺寸排阻柱(GE Healthcare AB,Uppsala,Sweden)从游离碘和低分子量组分中纯化并在1ml PBS中洗脱。基于增加的放射性和在纯化的放射性配体溶液中的放射性计算产率。在每次研究之前的2小时内执行标记。
离体研究
将小鼠静脉内(i.v.)注射0.44±0.03MBq[125I]RmAb158(n＝3)或0.89±0.26MBq[125I]RmAb158-scFv8D3(n＝10)，其等于0.05mg/kg的剂量。在注射后0.5、1、2、3、4、6、8、24和48小时从尾静脉获得血液样品(8μl)。在注射后2小时对动物的子集(每个配体n＝3)实施安乐死，剩余动物在注射后3天实施安乐死。将一个单独的wt小鼠的组注射10mg/kgRmAb158(n＝5)和13.3mg/kg RmAb158-scFv8D3(n＝5)(含有1.5％的放射性标记的蛋白用于检测)，并在注射后2小时实施安乐死。在灌注后，分离脑，并且将小脑与脑的其余部分分离，然后将脑组织样品在干冰上冷冻。肝、肺、心脏、脾、肾、胰腺、肌肉和股骨也被分离。用γ-计数器(1480 Wizard TM Wallac Oy,Turku，Finland)测量血液、脑、小脑和分离器官中的放射性。脑、小脑和血液浓度(定量为每克组织的注射剂量的百分比(％ID/g))如下计算：
％ID/g＝每克组织(或血液)测量的放射性/注射的放射性
此外，组织与血液(Kp)浓度的比率如下计算：
Kp＝每克组织测量的放射性/每克血液测量的放射性
PET研究
在注射[124I]RmAb158-scFv8D3前一天，向动物给予补充有0.2％NaI的水以减少甲状腺摄取124I。小鼠(n＝12)静脉内(i.v.)注射7.2±3.4MBq[124I]RmAb158-scFv8D3，相当于0.5mg/kg的剂量。在注射后1、3、6、24和48小时从尾静脉获得血液样品(8μl)。在注射后3天，将动物置于动物PET/CT扫描仪(Triumpo Trimodality System，TriFoil Imaging,Inc.,Northridge,CA,USA)的台架中，并在列表模式下扫描60分钟，然后进行CT检查3分钟(视场(FOV)＝8.0cm)。在PET扫描后根据与以上针对离体研究的相同程序(包括来自心脏的末端血液样品)使动物安乐死。用井式计数器(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)测量血液、脑、小脑和分离器官中的放射性。在注射后6天扫描两只动物，并且在注射后10天扫描一只动物。
使用有序子集最大期望值法(OSEM)3D算法(20次迭代)重建PET数据。使用滤波反投影(FBP)重建CT原始文件。PET和CT图像的所有后续处理在成像软件Amide 1.0.4中进行(Loening AM.等，Mol.Imaging 2:131-137(2003))。将CT扫描与T2加权的基于MRI的小鼠脑图谱手动对齐(Ma Y等，Neuroscience 135:1203-1215(2005))，该脑图谱含有海马体、纹状体、丘脑、皮质和小脑的标轮廓的感兴趣区域。然后将PET图像与CT对齐，并且因此，MRI-图谱也与PET数据对齐。
结果
对于小鼠体内研究，将RmAb158-scFv8D3用125I和124I放射性标记，产率约70％。对于[125I]RmAb158-scFv8D3，比活性为0.4±0.1MBq/μg(79±19MBq/nmol)，且对于[124I]RmAb158-scFv8D3，比活性为1.2±0.7MBq/μg(261±145MBq/nmol)。
为了测试scFv8D3部分在体内实现TfR介导的转胞吞作用的能力，向wt小鼠施用[125I]RmAb158或[125I]RmAb158-scFv8D3，并在注射后2小时分离脑。对于[125I]RmAb158和[125I]RmAb158-scFv8D3，脑部浓度(表示为每克脑组织的注射剂量的百分比(％ID/g，等式1))分别为0.03±0.01和2.20±0.92(图3A)。因此，scFv8D3修饰在该时间点引起脑部浓度的80倍增加。针对两种配体的脑部浓度与血液浓度的比率(Kp，参见以上等式)分别为0.0010±0.00013和0.15±0.10(图3B)。因此，考虑到血液中可用配体，Kp通过RmAb158的scFv8D3修饰增加了140倍。
为了进一步研究药代动力学和脑部分布，将放射标记的RmAb158-scFv8D3施用至年轻(8-9个月)和年老(18-24个月)的wt和tg-ArcSwe小鼠。大多数(n＝14)小鼠在注射后3天被实施安乐死，而两只年老tg-ArcSwe小鼠被保持研究直到注射后10天并且一只年老tg-ArcSwe在注射后第14天时被实施安乐死。
施用RmAb158-scFv8D3后3天，发现与年老wt小鼠(％ID/g＝0.08±0.01)相比，年老tg-ArcSwe小鼠中融合蛋白的脑部浓度(％ID/g＝0.69±0.17)为9倍更高(图4A)。这相当于与化学生成的融合蛋白8D3-F(ab')2-h158相比的5倍差异(图4B)。在施用后的接下来7天期间，RmAb158-scFv8D3的脑部浓度仅略微降低(图4C)。基于在3小时和3天之间获得的样品，血液中半衰期为18.6±1.5小时。从1天到3天，即在消除阶段期间，半衰期为24.4±3.3小时(图4C)。转基因和wt小鼠之间的血液浓度或半衰期没有差异。
[125/124I]RmAb158-scFv8D3在外周器官中的分布如图5所示。大多数器官中的组织浓度比血液中的浓度降低得略微更快。脾脏显示出最高摄取，并且尽管脾脏中的浓度降低，但该降低比[125/124I]RmAb158-scFv8D3从其他器官的消除慢(但仍然比从血液的消除快)。
在注射时、注射后3、6或10天对研究的动物的子集进行PET扫描。来自这些扫描的PET图像显示在图6中，证明[124I]RmAb158-scFv8D3保持在tg-ArcSwe小鼠脑中，而它则从野生型小鼠的脑中被洗出。在假定3％的脑容量是血液的情况下，将在注射后的最初0-60分钟期间获得的PET数据相对于在扫描后直接获得的血液样品来定量。该实验示出，在该时间点的72％的PET信号来源于与脑组织相关的[124I]RmAb158-scFv8D3，表明在注射后几乎立即获得脑中的高浓度(图6A)。这表明主动转运到脑中，这不同于在注射后3天具有脑部浓度的峰值的未修饰的mAb158(Magnusson K.等，同上)。注射后3天，tg-ArcSwe和wt小鼠脑中的重组融合蛋白浓度分别降至注射时在扫描中观察到浓度的约25％和10％(图6B和6E)。在较晚的时间点，通过PET测量的脑部浓度脑部浓度在年老tg-ArcSwe动物中仅略微降低(图6C-6D)，而在wt小鼠的脑中几乎没有剩余[124I]RmAb158-scFv8D3(图6F-6G)。由于脑的血液含量相对较高，脑中的PET信号受重组融合蛋白的血液浓度影响，重组融合蛋白的血液浓度在注射后的最初三天期间显著下降，从而解释第一次和第二次扫描之间PET信号的大幅下降。这表明未与脑中Aβ结合的[124I]RmAb158-scFv8D3与血液处于平衡状态并且被主动转运出脑。
用例如[11C]PIB评价的脑中Aβ水平的PET数据通常被量化为脑部浓度与小脑浓度的比率，因为小脑很大程度上不受Aβ病理的影响并且可以用作参考区域。图7示出通过PET量化的使用小脑作为参考的全脑、丘脑、纹状体、海马体和皮质的浓度比率。注射后3天已经有明显区别，在年老tg-ArcSwe和其他组之间的比率没有重叠。在注射后6天，年轻和年老tg-ArcSwe小鼠均可与wt小鼠区分开，脑中无原纤维积累。这表明脑中的[124I]RmAb158-scFv8D3结合确实是Aβ病理特异性的，如先前针对化学融合蛋白已经证实的(Sehlin D.等，同上(2016))。
以上描述的所有2小时脑部摄取实验均使用示踪剂量，即约0.05mg/kg的RmAb158或RmAb158-scFv8D3进行。使用与先前实验中相同量的放射性进行第二组实验，但是以10mg/kg的剂量添加未标记的RmAb158或RmAb158-scFv8D3。治疗剂量后RmAb158的脑部浓度(表示为％ID/g脑部浓度和脑部浓度与血液浓度的比率(图8))与示踪剂量后获得的脑部浓度相同(图3)。因此，跨越BBB的转运与剂量成线性关系。然而，对于RmAb158-scFv8D3，TfR介导的BBB表现出是饱和的，产生相对于剂量浓度和全身浓度的较低的脑部浓度。
实施例3：用RmAb158-scFv8D3治疗AβPP-转基因小鼠
动物
同样在此研究中，使用具有Arctic突变(AβPP E693G)和Swedish突变(AβPPKM670/671NL)并且维持在C57BL/6背景的AβPP转基因小鼠模型tg-ArcSwe。使用雄性和雌性二者，并且使用同窝小鼠作为对照动物(wt)。动物容纳在乌普萨拉大学的动物设施中具有受控的温度和湿度的房间内，自由获取食物和水。此论文中描述的所有程序均经乌普萨拉县动物伦理委员会批准(#C17/14)，遵守瑞典动物福利局的规则和条例，并且符合2010年9月22日的欧洲共同体理事会指令(2010/63/EU)。所有努力都是为了尽量减少动物的痛苦并且减少使用的动物数量。
抗体和放射性标记
在此研究中，如以上所描述的产生的RmAb158-scFv8D3和RmAb158(BioArctic AB,Stockholm,Sweden)在未经修饰或用碘-125(125I)放射性标记的情况下使用。
基本上如实施例2中所述，使用直接放射性碘化用125I标记抗体。
离体放射自显影
为了用离体放射自显影使脑中的抗体分布可视化，向18个月龄的tg-ArcSwe和wt小鼠注射3.5MBq[125I]RmAb158-scFv8D3或2.9MBq[125I]RmAb158，相当于0.20mg IgG/kg体重的剂量。注射后六天，向小鼠灌注盐水，并且将脑立即在干冰上冷冻。获得50μm厚的冠状冷冻切片(coronal cryosection)并将其与已知放射性的125I标准品一起置于X射线盒中。将正电子敏感荧光屏(MS,MultiSensitive,PerkinElmer,Downers Grove,IL,USA)置于样品上曝光5天，并且然后在Cyclone Plus Imager系统(Perkin Elmer)中以600点/英寸的分辨率扫描。得到的数字图像用ImageJ相对于标准品归一化。
抗体治疗和离体分析
14个月龄的Tg-ArcSwe小鼠用单次注射安慰剂(PBS)、RmAb158-scFv8D3(6.6mg/kg体重；在PBS溶液中1.32mg/ml)或RmAb158(5.0或50mg/kg体重；在PBS溶液中1或10mg/ml)治疗。将用于治疗并且相当于0.05mg/kg IgG的相同类型放射性标记的蛋白混合到抗体溶液中。[125I]RmAb158-scFv8D3的比活性为71.2±7.6MBq/nmol，并且[125I]RmAb158的比活性为71.9±3.6MBq/nmol。将小鼠用异氟烷(Isoflurane Baxter Medical AB,Kista,Sweden)轻度镇静，置于塑料支架中并静脉内(i.v.)施用5μl抗体溶液/g体重。在1、24、48小时从尾部采集血液样品，并在注射后72小时从心脏采集最终血液样品，然后进行盐水灌注并分离脑。用γ-计数器(1480 WizardTM,Wallac Oy,Turku,Finland)测量脑和血浆中的放射性，并且将血浆和脑中的抗体浓度定量为每g组织的注射剂量(ID)的％，如在实施例2中所列出的进行计算。
Aβ病理的ELISA分析
如Syvanen，S.等先前所述(Neuroimage 148:55-63(2017))，测量可溶性Aβ和总Aβ的脑浓度。简而言之，将脑组织在TBS中以1:5的重量:体积比与完全蛋白酶抑制剂(Roche；Sigma Aldrich,Stockholm,Sweden)均质化，然后与TBS以1：1混合并且在100 000x g离心1小时。对于总Aβ，将原始TBS提取物与浓甲酸混合至70％的浓度，然后如上所述进行均质化并在16 000×g离心。Aβ低聚物和原纤维使用82E1(IBL International/Tecan TradingAG,Switzerland)作为捕获和检测抗体二者用均相ELISA测量。82E1特异于β-分泌酶裂解AβPP后生成的N末端Aβ新表位。将96孔半区域板(half area plate)用12.5ng/孔的82E1包被过夜，然后用PBS中的1％BSA封闭。将TBS提取物1:10稀释并且在+4℃孵育过夜，然后用生物素化的82E1(0.25μg/ml)、SA-HRP(1:2000，Mabtech AB)和K蓝水性TMB底物(Neogen Corp.,Lexington,KY,USA)检测。对于Aβ1-40和Aβ1-42，将96孔板用100ng/孔的多克隆兔抗Aβ40或抗Aβ42(Agrisera,Sweden)包被过夜，并且用PBS中的1％BSA封闭。将甲酸提取物用2M Tris中和并且稀释10 000x(Aβ1-40)或2 000x(Aβ1-42)并在+4℃孵育过夜。与生物素化82E1(0.25μg/ml)一起孵育后，如上地显示信号并读取。所有稀释液均在ELISA孵育缓冲液中制备。
免疫组织化学
如先前所描述的(Magnusson K.等人，同上)，Aβ病理在与用于离体放射自显影的切片相邻的50μm厚的冷冻切片上用Aβ40免疫染色可视化。将切片在PBS中的4％PFA中在室温固定20分钟，在PBS中洗涤，并且然后在预热的柠檬酸盐缓冲液(25mM，pH 7.3，在程序开始时100℃)中孵育40分钟，用于抗原修复(retrieval)。然后将切片转移至在室温的70％甲酸中5分钟，并在恒定流量的新鲜MQ-H2O下洗涤另外5分钟。内源性过氧化物酶活性用DAKO过氧化物酶(Agilent Technologies，Kista，Sweden)在15分钟期间阻断，并且在PBS中的0.4％triton中透化5分钟。在DAKO-阻断(PBS中的0.25％酪蛋白)10分钟以抑制非特异性结合后，将切片与0.5μg/ml多克隆抗Aβ40抗体(Agrisera,Sweden)孵育过夜，然后与5μg/ml生物素化山羊抗大鼠(Vector Laboratories Inc.，Burlingame，CA)孵育30分钟，并且与链霉亲和素-HRP(Mabtech AB)孵育30分钟。染色用NOVARED发色团(VectorLaboratories Inc.)在振荡器上显色10分钟，并然后在MQ-H2O中洗涤1分钟，并且首先快速浸入95％EtOH，然后浸入99.9％EtOH中。将切片风干，用DPX封固剂(Sigma Aldrich,Sweden)固定，并且用Nikon显微镜(DXM1200F，Nikon Instruments Inc.，Melville NY，USA)分析。
统计学分析
结果表示为平均值±标准偏差。数据用单因素方差分析(ANOVA)分析，然后进行Bonferroni事后检验。统计学分析以及血浆曲线拟合(单项衰变)和曲线下面积用GraphPadPrism 5.0(GraphPad Software,Inc,La Jolla,CA,USA)计算。
结果
为了评价脑组织内的抗体分布，向具有丰富Aβ病理的野生型(wt)以及18个月龄的tg-ArcSwe小鼠注射用碘-125(125I)标记的RmAb158-scFv8D3和RmAb158。注射后6天对小鼠进行盐水灌注，并且对它们的脑进行冠状切片用于离体放射自显影和Aβ40免疫染色。如图9所示，脑实质中抗体的总体分布从根本上不同。双特异性[125I]RmAb158-scFv8D3分布在整个脑中并且保留在具有丰富Aβ病理的脑区域中，如通过相邻切片的Aβ40免疫染色可视化的。相反，[125I]RmAb158几乎完全集中在脑的中央部位。两种抗体的保留对Aβ病理是特异性的，因为在wt小鼠中几乎没有检测到信号。
接下来，为了研究改进的脑部分布对抗体降低可溶性Aβ原纤维的脑部水平的能力的影响，在14个月龄的tg-ArcSwe小鼠中进行短期免疫疗法研究。分为10-11个体的4个组，向小鼠给予以下的单次静脉内注射：PBS(安慰剂)；低剂量的RmAb158-scFv8D3(6.6mg/kg体重，等于5mg/kg IgG)；低剂量的RmAb158(5mg/kg体重)或高剂量RmAb158(50mg/kg体重)。所有抗体剂量补充有示踪量的125I标记的相同类型的抗体以追踪血液和脑中的浓度。与未修饰的RmAb158相比，双特异性抗体在血液中显示出更短的半衰期(图10A)，引起几乎1/4更低的药物暴露，如图10B中所示的曲线下面积所示。较低的暴露量也解释了为什么与先前观察到的注射后2小时的10倍差异相比，观察到在三天(图10C)的抗体的脑保留的较小差异。然而，当针对减少的暴露量进行调整时，我们仍然发现10倍更有效的向脑中的转运(图10D)。
在盐水灌注后，分离经抗体治疗的小鼠的脑。将右半球固定并用石蜡包埋用于免疫组织化学分析，而将左半球在TBS和甲酸(FA)中均质化以分别获得可溶性Aβ和总Aβ的提取物。使用用AβN末端特异性82E1作为捕获抗体和检测抗体二者的同源ELISA(Xia，W.等，Arch Neurol 66(2):190-199(2009))，发现与安慰剂相比，可溶性Aβ低聚物和原纤维的脑部水平在用双特异性RmAb158-scFv8D3治疗的小鼠组中减少超过40％(图10E)。相比之下，等摩尔剂量的RmAb158对可溶性Aβ聚集体的水平无影响，而10倍更高的剂量显示与双特异性抗体相似的降低。如从单一注射治疗范例所预期的，治疗组都没有显示出对总Aβ水平的任何显著影响，如在FA可溶性脑提取物中用Aβ1-40和Aβ1-42ELISA测量的(数据未示出)。
实施例4：重组双特异性α-突触核蛋白-TfR抗体的生成和表征
RmAb48-scFv8D3的克隆、表达和纯化
重组双特异性α突触核蛋白-TfR抗体RmAb48-scFv8D3的克隆、表达和纯化基本上如实施例1中所阐述地进行。MAb48公开于WO 2011/104696中并且表示为“48B11/8”，并且尤其在第31-32页的表1和表2中描述。结果
重组双特异性α突触核蛋白-TfR抗体根据实施例1被成功制备和表征。将包含通过接头彼此连接的8D3的重链和轻链可变区的单链可变片段(scFv)经由短肽接头附接至RmAb48轻链中的每一个的C末端。所得蛋白因此具有与图1A中所示蛋白构象一致的构象。
实施例5：使用放射性标记的RmAb48-scFv8D3的脑分布和外周生物分布的体内研 究
该研究中使用的方法和材料与实施例2中阐述的方法和材料基本相同。
动物
雄性和雌性野生型C57b16动物(wt)都用于研究RmAb48-scFv8D3的脑分布。如实施例2所述地容纳和喂养动物。
放射化学
使用直接放射性碘化，用碘-125(125I)标记α-突触核蛋白结合抗体RmAb48和双特异性RmAb48-scFv8D3(Greenwood，F.C.等，Biochem.J.89,114-123(1963))。基本上如实施例2中所阐述地标记。
离体研究
向小鼠静脉内(i.v.)注射0.89±0.06MBq[125I]RmAb48(n＝3)或0.92±0.02MBq[125I]RmAb48-scFv8D3(n＝3)，其等于0.05mg/kg的剂量。在灌注后，分离脑，并且将小脑与脑的其余部分分离，然后将脑组织样品在干冰上冷冻。用γ-计数器(1480 WizardTM,WallacOy,Turku,Finland)测量血液、脑和小脑中的放射性。如实施例2中所述地计算脑、小脑和血液浓度，以及组织与血液(Kp)浓度比。
结果
以约70％产率将RmAb48-scFv8D3和RmAb48用I125进行放射性标记，用于小鼠体内研究。
为了测试scFv8D3部分在体内实现TfR介导的转胞吞作用的能力，向wt小鼠施用[125I]RmAb48或[125I]RmAb48-scFv8D3，并在注射后2小时分离脑。对于[125I]RmAb48和[125I]RmAb48-scFv8D3，脑部浓度(表示为每克脑组织的注射剂量的百分数(％ID/g，等式1))分别为0.04±0.01和1.04±0.26。因此，scFv8D3修饰在该时间点引起脑部浓度的25倍增加。两种配体的脑部浓度与血液浓度的比率(Kp，参见以上等式)分别为0.0020±0.0004和0.089±0.015。因此，考虑到血液中可用配体，Kp通过RmAb48的scFv8D3修饰增加了54倍。

Claims (30)

1.脑部递送蛋白，所述脑部递送蛋白包含
靶结合抗体，所述靶结合抗体与哺乳动物脑中的靶结合；
两个载体部分，所述两个载体部分中的每一个能够与在血脑屏障(BBB)内皮细胞上表达的蛋白进行单价相互作用，
其中所述载体部分中的每一个连接至所述靶结合抗体的C末端。
2.根据权利要求1所述的蛋白，其中一次所述两个载体部分中的一个与在BBB内皮细胞上表达的所述蛋白结合。
3.根据权利要求1或2所述的蛋白，其中所述载体部分中的每一个通过接头连接至所述靶结合抗体。
4.根据权利要求3所述的蛋白，其中所述接头中的每一个单独地包含具有由1-30个氨基酸残基、优选1-25个氨基酸残基、优选1-19个氨基酸残基、优选3-19个氨基酸残基、优选3-15个氨基酸残基、优选5-15个氨基酸残基组成的氨基酸序列的肽。
5.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中所述载体部分中的每一个连接至所述靶结合抗体的轻链的C末端。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的蛋白，其中所述载体部分中的每一个连接至所述靶结合抗体的重链的C末端。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的蛋白，其中第一载体部分连接至所述靶结合抗体的重链的C末端，并且第二载体部分连接至所述靶结合抗体的轻链的C末端。
8.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中所述载体部分中的每一个通过接头连接至所述靶结合抗体，所述接头包含具有SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列的肽。
9.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中所述载体部分中的每一个包含选自scFv、Fv、scFab或VHH的抗体片段；转铁蛋白或其突变体或变体，或衍生自葡萄球菌蛋白A的结构域B的蛋白Z的变体。
10.根据权利要求9所述的蛋白，其中所述载体部分中的每一个包含scFv。
11.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中在BBB内皮细胞上表达的所述蛋白选自转铁蛋白受体(TfR)、胰岛素受体(InsR)、胰岛素样生长因子受体、低密度脂蛋白受体相关蛋白8(Lrp8)、低密度脂蛋白受体相关蛋白1(Lrp1)、CD98、跨膜蛋白50A(TMEM50A)、葡萄糖转运蛋白1(Glut1)、basigin(BSG)和肝素结合表皮生长因子样生长因子。
12.根据权利要求11所述的蛋白，其中在BBB内皮细胞上表达的所述蛋白是TfR。
13.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中所述靶结合抗体是全长抗体、Fab、F(ab')2或Fv。
14.根据权利要求13所述的蛋白，其中所述靶结合抗体是全长抗体。
15.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中所述脑中的靶选自淀粉样蛋白β(Aβ)肽、α突触核蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)、亨廷顿蛋白、转甲状腺素蛋白、P-分泌酶1、表皮生长因子、表皮生长因子受体2、Tau、磷酸化Tau、载脂蛋白E4、CD20、朊蛋白、富含亮氨酸重复序列激酶2、帕金蛋白、早老素2、γ分泌酶、死亡受体6、淀粉样蛋白前体蛋白、p75神经营养蛋白受体、神经调节蛋白和胱天蛋白酶6。
16.根据权利要求15所述的蛋白，其中所述脑中的靶是Aβ肽，优选可溶性Aβ聚集体，诸如选自低聚物和原纤维的可溶性Aβ聚集体。
17.根据权利要求16所述的蛋白，所述蛋白包含Aβ结合抗体，并且两个载体部分是抗TfR抗体的片段。
18.根据权利要求17所述的蛋白，其中所述Aβ结合抗体是mAb158/BAN2401或其突变体或变体，并且所述载体部分中的每一个是scFv8D3，其中所述scFv8D3中的每一个连接至所述mAb158/BAN2401或其突变体或变体的轻链的C末端，所述蛋白任选地还包含两个接头，每个接头具有SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列，用于将所述scFv8D3连接至所述mAb158/BAN2401或其突变体或变体。
19.根据权利要求15所述的蛋白，其中所述脑中的靶是α突触核蛋白，优选可溶性α突触核蛋白，诸如选自低聚物和原纤维的可溶性α突触核蛋白。
20.根据权利要求19所述的蛋白，所述蛋白包含α突触核蛋白结合抗体，并且两个载体部分是抗TfR抗体的片段。
21.根据权利要求20所述的蛋白，其中所述α突触核蛋白结合抗体结合人α突触核蛋白原纤维，优选地所述α突触核蛋白结合抗体不结合α突触核蛋白单体。
22.根据权利要求20或21所述的蛋白，其中所述α突触核蛋白结合抗体是mAb48或其突变体或变体，并且所述载体部分中的每一个是scFv8D3，其中所述scFv8D3中的每一个连接至所述mAb48或其突变体或变体的轻链的C末端，所述蛋白任选地还包含两个接头，每个接头具有SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列，用于将所述scFv8D3连接至所述mAb48或其突变体或变体。
23.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白，所述蛋白是融合蛋白。
24.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白，用于在预防和/或治疗中使用。
25.根据权利要求24所述的蛋白，用于在神经退行性紊乱、优选地选自由以下组成的组的神经退行性紊乱的治疗和/或预防和/或体内诊断中使用：阿尔茨海默病和与Aβ蛋白聚集相关的其他紊乱，诸如创伤性脑损伤(TBI)、路易体痴呆(LBD)、唐氏综合征(DS)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、额颞叶痴呆、tau病变、系统性淀粉样变性、动脉粥样硬化和帕金森病痴呆(PDD)；阿尔茨海默病路易体变型；多系统萎缩；精神病；精神分裂症；克-雅氏病；亨廷顿病和家族性淀粉样蛋白神经病变。
26.根据权利要求25所述的蛋白，用于在阿尔茨海默病的治疗和/或预防和/或体内诊断中使用。
27.根据权利要求26所述的蛋白，用于在帕金森病的治疗和/或预防和/或体内诊断中使用。
28.用于治疗和/或预防患有脑部紊乱或处于发展所述紊乱的风险的哺乳动物的脑部紊乱的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的根据权利要求1-23中任一项所述的脑部递送蛋白。
29.用于诊断和/或检测怀疑患有脑部紊乱或处于发展所述紊乱的风险的哺乳动物的脑部紊乱的方法，所述方法包括以足以能够进行诊断和/或检测的量向所述哺乳动物施用根据权利要求1-23中任一项所述的脑部递送蛋白。
30.根据权利要求28所述的用于治疗和/或预防的方法，或根据权利要求29所述的用于诊断和/或检测的方法，其中所述紊乱是神经退行性紊乱，诸如选自由以下组成的组的神经退行性紊乱：阿尔茨海默病和与Aβ蛋白聚集相关的其他紊乱，诸如创伤性脑损伤(TBI)、路易体痴呆(LBD)、唐氏综合征(DS)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、额颞叶痴呆、tau病变、系统性淀粉样变性、动脉粥样硬化和帕金森病痴呆(PDD)；阿尔茨海默病路易体变型；多系统萎缩；精神病；精神分裂症；克-雅氏病；亨廷顿病和家族性淀粉样蛋白神经病变。
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