JP2022130646A - 脳送達タンパク質 - Google Patents

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Abstract

【課題】脳の病気の治療および診断のため、および研究目的のための新規なタンパク質を提供すること。【解決手段】本発明は、哺乳類の脳内の標的に結合する標的結合抗体、およびそれぞれ、血液脳関門（ＢＢＢ）内皮細胞表面に発現したタンパク質と一価の相互作用をすることができる２つの担体部位を含み、前記担体部位のそれぞれは、前記標的結合抗体のＣ末端側終端に結合している、脳送達タンパク質に関する。また、本発明は、例えば、神経変性障害、および他の脳の病気の治療または診断、あるいは研究目的でこのような脳送達タンパク質を用いることに関する。【選択図】図１

Description

技術分野
本発明は、抗体など、脳内の標的に結合するタンパク質を血液脳関門を越えて輸送することができる脳送達タンパク質に関する。
背景
血液脳関門（ＢＢＢ）は、緊密に結合した内皮細胞からなり、小さい薬物様分子と大きい分子様タンパク質の両方を脳の外側に保つことにより脳を保護する働きをする。血液脳関門は、脳の恒常性に重要であるが、その存在は脳の病気の治療および診断にとっては障害である。例えば、ＢＢＢの緊密に結合した内皮細胞により無修飾抗体の約０．１％のみが脳に侵入する(Bard F. et al, Nat. Med. 6: 916-919 (2000))。
しかしながら、タンパク質によっては血液からＢＢＢを越えて脳内への活性輸送が起こることが記載されている。そのような一例として、ＢＢＢに位置するトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）を介して鉄を脳に輸送するトランスフェリンがある。このトランスフェリン－ＴｆＲ複合体はＢＢＢの管腔側に形成されて、その後取り込まれる。鉄は、ｐＨが低いエンドソーム内でトランスフェリンから解離する。鉄が結合していないトランスフェリン、すなわちアポトランスフェリンはＴｆＲとの親和性が低く、ＢＢＢの反管腔側で鉄と共に放出される。トランスフェリンだけでなく、ＴｆＲに結合する他のタンパク質もまた、ＢＢＢの管腔側から反管腔側に取り込まれることがあり、この反応機構を利用して脳内に分子を能動的に輸送することができる(Boado RJ. et al, Biotechnol. Bioeng. 102: 1251-1258 (2009); Pardridge WM, Expert Opin. Drug Deliv. 12: 207-222 (2015))。
リソソーム内での分解を回避するため、ＴｆＲに結合したタンパク質／抗体は、エンドソーム内で受容体から解離する必要がある。ｐＨに依存した親和性を示す結合体の場合、ＴｆＲからの解離はエンドソーム内の低ｐＨ環境により促進され得ることが示唆されている(Sade H. et al, PLOS one 4: e96340 (2014))。ＴｆＲとの総親和性が中程度あるいは低い場合もまた解離が起こる傾向にある(Yu YJ. et al, Sci. Transl. Med. 3: 84ra44 (2011))。標的への二価結合もまた、不利益であることが分かっている(Niewoehner J. et al, Neuron 81: 49-60 (2014))。抗体の二価結合はＴｆＲからの解離速度を低下させる。というのは、抗体の解離には２つのエピトープ（結合部位）、すなわち結合活性効果から同時に解離することが必要であるためである。
ｍＡｂ１５８という抗アミロイドβプロトフィブリル抗体からなり、ＴｆＲ抗体８Ｄ３に化学的に結合している二重特異性タンパク質がこれまでに開示されている(Sehlin D. et al, Nat. Commun. 7: 10759 (2016))。このタンパク質は、注入後３日目にｍＡｂ１５８に比べて脳対血液濃度が２０倍も高くなっていた。この増加比率は、ｍＡｂ１５８との比較で、一部は脳内濃度の上昇、一部は血液中の半減期の低下によるものであることが分かった。
ＷＯ２０１２／０７５０３７にはＢＢＢ受容体との親和性が低い抗体が開示されている。また、この公報には、ＴｆＲとアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）切断酵素βセクレターゼ（ＢＡＣＥ１）との両方に結合する二重特異性抗体（抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１）の脳への取り込みで観察された微量投与量と治療投与量とでの違いが開示されている。
ＷＯ２０１４／０３３０７４には、ＢＢＢ抗体シャトルの他の多様体が開示されている。このＢＢＢシャトルは、脳エフェクター実体、リンカー、およびＴｆＲに結合する１つの一価の結合実体を含み、上記リンカーは上記ＴｆＲに結合する一価の結合実体に上記エフェクター実体を結合する。
脳の病気の治療および診断を向上させるため、また研究目的として、タンパク質／抗体の取り込みの向上が未だ必要とされている。
発明の概要
本発明の目的は、脳の病気の治療および診断のため、および研究目的のための新規なタンパク質を提供することである。
本発明の第一の側面では脳送達タンパク質が提供される。この脳送達タンパク質は、
哺乳類の脳内の標的に結合する標的結合抗体またはその断片、および
それぞれ、血液脳関門（ＢＢＢ）内皮細胞表面に発現したタンパク質と一価の相互作用をすることができる２つの担体部位を含み、
前記担体部位のそれぞれは、前記標的結合抗体のＣ末端側終端に結合している。
本明細書で開示される脳送達タンパク質は、２種類の部位、すなわち、脳内の標的に結合する標的結合抗体と、前記脳送達タンパク質をＢＢＢを越えて脳に輸送することができる２つの担体部位を含む。前記担体部位はいずれも、ＢＢＢ内皮細胞表面のタンパク質と一価の相互作用または一価の結合をすることができる。一価の相互作用または結合とは、前記担体部位と、ＢＢＢ内皮細胞表面に発現したタンパク質との相互作用が単一のエピトープを介して生じることを指す。脳送達タンパク質の構造により、典型的には、担体部位の一方のみがＢＢＢ表面に発現したタンパク質と一度に結合してもよい。従って、これによりＢＢＢタンパク質に対する二価の高い親和性結合を防ぎ、より効率的なＢＢＢ輸送に繋がることがある。また、ＢＢＢタンパク質が何らかの二量化／高次構造変化することを防ぐことがある。
一態様では、前記２つの担体部位の一方が前記ＢＢＢ内皮細胞表面に発現したタンパク質に一度に結合する。これにより、前記脳送達タンパク質が前記ＢＢＢ内皮細胞表面に発現したタンパク質などと一価の相互作用をすることができる。
従って、電気的に前記ＢＢＢタンパク質と結合し得る２つの担体部位を持っているにも関わらず一価の結合を維持することで、ＢＢＢを通過する輸送効率を上げてもよい。前記標的結合抗体に結合した２つの担体部位を持つことで、ＢＢＢ内皮細胞表面に発現したタンパク質との利用可能な結合部位の数は、１つのみの担体部位を含む脳送達タンパク質に比べて倍になっている。また、マウスで行った投薬実験では、本発明による２つの担体部位を含む脳送達タンパク質が、治療投薬量および微量投与量での脳への取り込みを向上させることが示された（実施例２）。実施例２で調べた特定の脳送達タンパク質ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３は、２つの一本鎖ＴｆＲ結合抗体（ｓｃＦｖ８Ｄ３）を持っているが、微量投与量を注入して２時間後に担体部位のない「裸の」標的結合抗体（ＲｍＡｂ１５８）の脳への取り込みに比べて約８０倍も脳への取り込みを増加させることが分かった。ＲｍＡｂ４８－ｓｃＦｖ８Ｄ３でも同様の結果が得られた（実施例５）。治療投与では、ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３の脳への取り込みは、対応する裸の標的結合抗体の脳への取り込みの１０倍多いことが分かった。この違いは、少なくとも一部には２つのＴｆＲ結合部位を持つ脳送達タンパク質に依存すると仮定する。比較により、従来技術の脳シャトルは、微量投与では抗ＴｆＲ抗体の取り込みを約４０倍増加させたが、治療投与量では同じシャトルの脳への取り込みはわずか１．４倍の増加に過ぎないことが示された(Yu et al, supra, (2011))。これは、治療投与量でＴｆＲ系が飽和したためであると思われる。しかしながら、ＢＢＢシャトルとしてＣＤ９８に基づく脳シャトルについて同様の結果が公開されている。微量投与での取り込みは、ＣＤ９８のない抗体よりも８０倍多いことが分かったが、治療投与ではわずか３．２倍多かっただけである(Zuchero YJY. et al, Neuron 89: 70-82 (2016))。
本明細書で開示される脳送達タンパク質の担体部位は、標的結合抗体のＣ末端側終端で標的結合抗体に結合している。これら担体部位は、重鎖のＣ末端側終端あるいは標的結合抗体の軽鎖に位置することが好ましい。これら担体部位は、標的結合抗体の分離した鎖、好ましくは分離した軽鎖または分離した重鎖に結合していることが好ましい。
一態様によれば、前記担体部位のそれぞれは、リンカーにより前記標的結合抗体に結合している。前記担体部位を前記標的結合抗体に結合するためのリンカーは同じでも異なっていてもよい。すなわち、これらリンカーは同じ長さおよび／またはアミノ酸配列を持っていてもよく、異なる長さおよび／またはアミノ酸配列を持っていてもよい。特に、前記担体部位のそれぞれについて、前記リンカーのそれぞれは、個別に、１～３０個のアミノ酸残基、好ましくは１～２５個のアミノ酸残基、好ましくは１～１９個のアミノ酸残基、好ましくは３～１９個のアミノ酸残基、好ましくは３～１５個のアミノ酸残基、好ましくは５～１５個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を持つペプチドを含む。リンカーの一例は、１１個のアミノ酸を含むリンカーである。このようなリンカー長は、添付の実施例で用いられた。従って、前記リンカーは、比較的短いペプチドであることが好ましい。しかしながら、リンカー長は、標的結合抗体表面のリンカーの特定の位置に依存して異なっていてもよい。短いリンカーは、担体部位がタンパク質（例えば、内皮ＢＢＢ細胞表面に発現した二量体受容体）と二価結合をするのにさらに立体障害となり得るという点で利点がある場合がある。二価結合に比べて、ＢＢＢ内皮細胞表面に発現したタンパク質との一価結合は、ＢＢＢを越える輸送を向上されることがある。二価結合は解離速度を低下させ、その結果、結合の確率と、従って、結合時間、すなわち親和性効果を高め、ＢＢＢ輸送を低下させる。
一態様では、前記２つの担体部位のそれぞれは、標的結合抗体の軽鎖のＣ末端側終端に結合している。特に、例えば、それぞれ１～３０個のアミノ酸残基を持つペプチドを含む短いペプチドリンカーにより前記標的結合抗体に結合している２つの担体部位を含む脳送達タンパク質は、ＢＢＢ内皮細胞表面で発現したタンパク質と一価の相互作用をすることができる。例えば、各リンカーは、１～２５個のアミノ酸、好ましくは１～１９個のアミノ酸、より好ましくは５～１９個のアミノ酸を持つペプチドを含んでいてもよい。担体部位のそれぞれを前記標的結合抗体の軽鎖のＣ末端側終端に結合するためのリンカーの非限定的な例は、１１個のアミノ酸残基の長さを持つリンカーである。このようなリンカーは、添付の実施例で開示されている。自明であるが、担体部位を標的結合抗体に結合するためのリンカーは、同じであっても異なっていてもよい。すなわち、これらのリンカーは同じ長さおよび／またはアミノ酸配列を持っていても、異なる長さおよび／またはアミノ酸配列を持っていてもよい。
一態様では、前記２つの担体部位のそれぞれは、標的結合抗体の重鎖のＣ末端側終端に結合している。特に、短いペプチドリンカー（例えば、それぞれ、１～１９個のアミノ酸残基を持つペプチドを含むリンカー）により前記標的結合抗体に結合している２つの担体部位を含む脳送達タンパク質は、ＢＢＢ内皮細胞表面に発現したタンパク質と一価の相互作用をすることができる。例えば、各リンカーは、１～１９個のアミノ酸、好ましくは１～１５個のアミノ酸、より好ましくは１～１０個のアミノ酸を持つペプチドを含んでいてもよい。自明であるが、担体部位を標的結合抗体に結合するためのリンカーは、同じであっても異なっていてもよい。すなわち、これらのリンカーは同じ長さおよび／またはアミノ酸配列を持っていても、異なる長さおよび／またはアミノ酸配列を持っていてもよい。
一態様では、第一の担体部位は前記標的結合抗体の重鎖のＣ末端に結合しており、第二の担体部位は前記標的結合抗体の軽鎖のＣ末端側終端に結合している。自明であるが、担体部位を標的結合抗体に結合するためのリンカーは、同じであっても異なっていてもよい。すなわち、これらのリンカーは同じ長さおよび／またはアミノ酸配列を持っていても、異なる長さおよび／またはアミノ酸配列を持っていてもよい。リンカーの例示的な長さは、本明細書の関連する実施形態で開示される。
添付の実施例で開示されるように、２つの担体部位（ｓｃＦｖ８Ｄ３）を標的結合抗体（ＲｍＡｂ１５８）の軽鎖のＣ末端側終端に結合している比較的短いペプチドリンカーは、ＢＢＢ表面で発現したタンパク質（ＴｆＲ二量体）との二価の結合の立体障害となることが分かった。添付の実施例で用いられるペプチドリンカーは、柔軟性と親水性があり、１１個のアミノ酸残基を含んでいた。従って、本発明による脳送達タンパク質で用いてもよいリンカーの一非限定的な例は、アミノ酸配列ＡＰＧＳＹＴＧＳＡＰＧ（配列番号１）を持つペプチドを含むリンカーである。異なる長さおよびアミノ酸配列を持つペプチドリンカーもまた、本開示に包含される。代替リンカー配列の設計、すなわち、例えば、親水性および柔軟性の点で同様の特性を持つ／提供する代替アミノ酸残基の選択は当業者には自明である。
一態様では、前記リンカーは柔軟性を持つ。柔軟性のあるリンカーは、小さな側鎖を持つアミノ酸残基を含んでいてもよい。柔軟性のあるペプチドリンカーの非限定的な例は、グリシンに富んだリンカーである。一態様では、前記リンカーは親水性である。従って、親水性リンカーは、典型的には親水性アミノ酸残基を含む。一態様では、前記リンカーは、少なくとも１つのプロリン残基、例えば、２つのプロリン残基を含むペプチドを含む。そのようなプロリン残基はリンカー配列のＣ末端側終端および／またはＮ末端側終端付近に位置することが好ましい。
用語「抗体」はその最も広い意味で用いられ、モノクローナル抗体とポリクロナール抗体の両方、および完全な長さの抗体（例えば、完全な長さのＩｇＧ）、およびその他の抗体のアイソタイプおよびサブタイプ（亜型）を含む。完全な長さの抗体は、抗原結合可変領域、軽鎖定常領域（ＣＬ）、および重鎖定常領域ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む抗体のことである。また、用語「抗体」にはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片などの抗体断片も含まれる。ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｓＦａｂ、ＶＨＨ、またはＶＮＡＲなどの一本鎖断片もまた、本明細書で用いられる用語に包含される。従って、一態様では、前記標的結合抗体は、上記の抗体およびその断片より選択される。本明細書で言う抗体は、ヒト化抗体であることが好ましい。
一態様では、前記担体部位のそれぞれは抗体または抗体断片を含む。前記抗体断片は、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｓｃＦａｂ、またはＶＨＨ；トランスフェリンまたはその変異体あるいは多様体、またはブドウ球菌タンパク質ＡのドメインＢに由来するタンパク質Ｚの多様体より選択されてもよい。前記抗体または抗体断片はヒト化されていることが好ましい。
一態様では、前記担体部位のそれぞれはｓｃＦｖを含む。抗体の一本鎖断片を用いることで、例えば、脳送達タンパク質の製造を簡便にすることができる。
自明であるが、ＢＢＢ内皮細胞表面に発現したいくつかの異なるタンパク質を標的結合抗体のための脳内への輸送経路として利用してもよい。このような輸送経路は、例えば、ＢＢＢを越えて抗体を送達するための受容体媒介トランスサイトーシスを利用してもよい。従って、一態様では、前記ＢＢＢ内皮細胞表面に発現したタンパク質は、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体（ＩｎｓＲ）、インスリン様成長因子受容体、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（Ｌｒｐ８）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（Ｌｒｐ１）、ＣＤ９８、膜貫通タンパク質５０Ａ（ＴＭＥＭ５０Ａ）、グルコース輸送体１（Ｇｌｕｔ１）、ベイシジン（ＢＳＧ）、およびヘパリン結合上皮成長因子様成長因子より選択される。前記ＢＢＢ内皮細胞表面に発現したタンパク質はＴｆＲ、ＩｎｓＲ、Ｌｒｐ１、ＣＤ９８、Ｇｌｕｔ１、およびＢＳＧより選択されるのが好ましい。一態様では、前記ＢＢＢ内皮細胞表面に発現したタンパク質ＴｆＲである。一態様では、前記ＢＢＢ内皮細胞表面に発現したタンパク質はＩｎｓＲである、一態様では、前記ＢＢＢ内皮細胞表面に発現したタンパク質はＬｒｐ１である。一態様では、前記ＢＢＢ内皮細胞表面に発現したタンパク質はＣＤ９８である。一態様では、前記ＢＢＢ内皮細胞表面に発現したタンパク質はＧｌｕｔ１である。一態様では、前記ＢＢＢ内皮細胞表面に発現したタンパク質はＢＳＧである。
従って、自明であるが、前記２つの担体部位はそれぞれ、上記で例示したＢＢＢ内皮細胞表面に発現したタンパク質と一価の相互作用をすることができる。特に、前記担体部位のそれぞれは、例えば、ＴｆＲ、ＩｎｓＲ、Ｌｒｐ１、ＣＤ９８、Ｇｌｕｔ１、またはＢＳＧと相互作用することができる抗体またはタンパク質であってもよい。一態様では、前記担体部位のそれぞれはＴｆＲに向けられた抗体断片である。抗ＴｆＲ結合抗体の一例は８Ｄ３である。添付の実施例で示されるように、可変領域（ｓｃＦｖ８Ｄ３）の一本鎖断片は、本発明による脳送達タンパク質の一例として利点があることが証明された。
一態様では、前記担体部位のそれぞれ、ＴｆＲに対して低から中程度の親和性を持つ抗ＴｆＲ抗体である。ＴｆＲに対して低から中程度の親和性を持つ抗ＴｆＲ担体抗体は、親和性が高いものに比べて、脳送達タンパク質の脳への取り込みおよび分布を向上させる場合がある。というのも、第一にＴｆＲ系は治療投与量で飽和しているように思われるからである。抗ＴｆＲ抗体の高い親和性を持つ多様体は治療投与でＴｆＲ系を飽和させる場合があるが、低から中程度の親和性を持つ抗ＴｆＲ多様体抗体は治療投与でそのようなＴｆＲの飽和を回避することがある。また、低から中程度の親和性を持つ多様体は、高い親和性を持つ多様体に比べて、エンドソーム内に封入後、より迅速に放出されることがある。高い親和性を持つ多様体は全く放出されず、従って、タンパク質が分解されることがある。また、ＴｆＲに対する親和性が低い抗体は、親和性が高いものに比べて高濃度で循環したままであることがある。というのは、これらの抗体は、ＴｆＲに対する親和性が高いもののようには効率的に系から除去されないからである。例えば、抗ＴｆＲ担体抗体の低から中程度の親和性を持つ多様体は、１～１０μＭの範囲でＴｆＲに対する結合親和性を持つ。
一態様では、前記標的結合抗体は完全な長さの抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦｖである。一態様では、前記標的結合抗体は完全な長さの抗体である。
また、上で開示された２つの担体部位を含む脳送達タンパク質は製造という観点から利点がある場合がある。というのも、２つの同じ軽鎖を含む抗体に基づいた脳送達タンパク質は、２つの異なる（すなわち、一方は結合担体抗体を持ち、他方は結合担体抗体を持たない）軽鎖を持つ抗体に比べてより高い収率で生成される傾向があるためである。
従って、本発明による脳送達タンパク質は、ヒトまたは動物など哺乳類の脳内で任意の標的に対して結合親和性を持つ標的結合抗体を含んでいてもよい。脳の標的は、特に、研究目的、治療、または診断のための標的（例えば、脳障害、特に神経変性障害に関与する標的）であってもよい。一態様では、脳内の前記標的は、アミロイドβ（Ａβ）ペプチド、αシヌクレイン、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、ハンチンチン、トランスサイレチン、Ｐ－セクレターゼ１、上皮成長因子、上皮成長因子受容体２、タウ、リン酸化タウ、アポリポタンパク質Ｅ４、ＣＤ２０、プリオンタンパク質、ロイシン富化反復キナーゼ２、パーキン、プレセニリン２、γセクレターゼ、細胞死受容体６、アミロイド前駆体タンパク質、ｐ７５ニューロトロフィン受容体、ニューレグリン、およびカスパーゼ６より選択される。
図１は、本発明による脳送達タンパク質の一態様を示す概略図である。図１ＡはｓｃＦｖによって表される２つの担体部位を含む脳送達タンパク質を示し、これらの担体部位は抗体により表される標的結合抗体の２つの軽鎖のＣ末端にリンカーにより結合されている。図１Ｂは、脳送達タンパク質がＢＢＢ内皮細胞表面に発現した受容体に一価結合をしていることを想定した図である。 図２Ａ～図２Ｃは、阻害ＥＬＩＳＡの結果を示す。本発明による脳送達タンパク質の一例であるＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３は、ＲｍＡｂ１５８（２Ｂ）に比べて単量体（Ｍ）よりもＡβプロトフィブリル（ＰＦ）に対する高い結合選択性を保持している（２Ａ）が、対照抗体６Ｅ１０はＡβ種両方に同程度に結合している（２Ｃ）ことを示している。図２ＤはＴｆＲ競合ＥＬＩＳＡの結果を示す。抗ＴｆＲ抗体８Ｄ３および化学的に結合した融合タンパク質８Ｄ３－Ｆ（ａｂ’）２－ｈ１５８(Sehlin et al, 2016, 上記参照)（いずれもＴｆＲに二価結合することができる）は、本発明による脳送達タンパク質の一具体例であるＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３と比べてＴｆＲに対してほぼ１０倍強い結合力を示すことが示されている。８Ｄ３のｓｃＦｖ断片は、結合部位が１つしかないので、ＴｆＲ結合力はさらに弱い。 図３Ａ、図３Ｂは生体外実験の結果を示す図である。図３Ａの図は、野生型マウスに微量投与量を注入した２時間後に［１２５Ｉ］ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３の脳内濃度が［１２５Ｉ］ＲｍＡｂ１５８の脳内濃度の８０倍高くなったことを示している。［１２５Ｉ］ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３は本発明による脳送達タンパク質の標識多様体であり、この実験では微量投与量で投与された。図３Ｂの図は、同じ実験での同じタンパク質の脳対血中濃度比を示す。 図４Ａ～図４Ｃは生体外実験の結果を示す図である。図４Ａは、本明細書で開示される脳送達タンパク質の一具体例である［１２４Ｉ］ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３を成熟（１８～２４月齢）および若い（８～９月齢）野生型マウスおよびｔｇ－ＡｒｃＳｗｅマウスに注入して３日後に生体外が定量された脳内濃度を示す。図４Ｂは、１８月齢のｔｇ－ＡｒｃＳｗｅマウスに注入して３日後の化学的に融合した８Ｄ３－Ｆ（ａｂ’）２－ｍＡｂ１５８とＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３の生体外脳内濃度の比較を示している。図４Ｃは、成熟（１８～２４月齢）ｔｇ－ＡｒｃＳｗｅマウスに投与して３日後、６日後、および１０日後に生体外で定量した［１２４Ｉ］ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３の脳内濃度を同じ期間の血中濃度と比較したものを示している。脳からの排出は血液からの排出に比べて非常にゆっくりであった。 図５は、本明細書で開示される脳送達タンパク質の一具体例である［１２４／１２５Ｉ］ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３の生体内分布を示す図である。この脳送達タンパク質は投与の３日後、６日後、および１０日後に異なる周辺器官の臓器重量に対する注入された投与量の百分率として定量されている。比較のために図４Ｃの脳内濃度が含まれている。 図６は、導入遺伝子ＡｒｃＳｗｅマウス（Ａ－Ｄ）および野生型マウス（Ｅ－Ｇ）を６０分間ＰＥＴ走査して得たＰＥＴ画像を示している。（Ａ）を除くすべての画像は、同じ色目盛を用いて表示されている。６Ａは、［１２４Ｉ］ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３の投与後０～６０分で得られた成熟ｔｇ－ＡｒｃＳｗｅマウスのＰＥＴ画像を示している。放射性活性濃度は、すべての脳領域で同様である。この初期の時点では放射性活性が非常に高かったため、他の図と同じ目盛を用いることができなかった。［１２４Ｉ］ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３を成熟ｔｇ－ＡｒｃＳｗｅマウスに注入して３日後（６Ｂ）、６日後（６Ｃ）、および１０日後（６Ｄ）に得られたＰＥＴ画像。［１２４Ｉ］ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３を成熟した野生型マウスに注入して３日後（６Ｅ）、６日後（６Ｆ）、および１０日後（６Ｇ）に得られたＰＥＴ画像（脳組織１ｇ当たりの％ＩＤ=脳組織１グラムで測定された注入した投与量のパーセント、すなわち［１２４Ｉ］ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３の脳内濃度の測定値）。 図７Ａ～図７Ｆは、海馬（Ａ）、視床（Ｂ）、線条体（Ｃ）、皮質（Ｄ）、および 全脳（Ｅ）におけるＰＥＴに基づいた脳領域対小脳濃度比を示す図である。化学的に結合した融合タンパク質との比較が（Ｆ）に示されている。動物の種類によっては、どの時点でも調べられなかったものがあり、図中では「該当なし」として示されている。 図８Ａ、図８Ｂは生体外実験の結果を示す図である。図８Ａの図は、野生型マウスに注入して２時間後の［１２５Ｉ］ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３の脳内濃度を示す。［１２５Ｉ］ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３は、本発明による脳送達タンパク質の標識多様体であり、この実験では治療投与量で投与された。図３Ｂの図は、微量投与量で投与された同じタンパク質の血中濃度に対する脳内濃度の比を示す。 図９Ａ～図９Ｄは、［１２５Ｉ］ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３（Ａ）および［１２５Ｉ］ＲｍＡｂ１５８（Ｂ）を注入された１８月齢のｔｇ－ＡｒｃＳｗｅマウスの注入後６日後の脳内での抗体の全体分布を示す画像である。この図では生体外オートラジオグラフィー（左）で視覚化したものをＡβ４０免疫染色（右）で視覚化したものと比較している。［１２５Ｉ］ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３は全脳に亘って分布していたが、［１２５Ｉ］ＲｍＡｂ１５８は脳の中央部に集中していた。比較のため、野生型動物にも［１２５Ｉ］ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３と［１２５Ｉ］ＲｍＡｂ１５８を注入した。［１２５Ｉ］ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３では信号が得られなかった（Ｃ）。［１２５Ｉ］ＲｍＡｂ１５８では脳の中央で信号がかすかに検出された（Ｄ）。 図１０Ａ～図１０Ｄは以下のものを示している。Ａ．７２時間２つの異なる投与量でＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３およびＲｍＡｂ１５８を投与した場合の血漿薬物動態であり、血漿１グラム当たりの注入投与量を％で表している。Ｂ．（Ａ）の血漿曲線下の面積から算出された薬物暴露量である。Ｃ．注入して７２時間後の抗体の脳内保持量であり、注入投与量／１グラムの脳組織の％として表されている。Ｄ．注入して７２時間後の薬物暴露量に対する抗体の脳内保持量の比であり、抗体が脳に侵入して保持される相対的な効率を示している。
アルツハイマー病（ＡＤ）は最も一般的な神経変性障害の１つである。自己凝集したタンパク質アミロイド－β（Ａβ）を標的する抗体による試験が多数行われている。アミロイドプラークはＡβの繊維状堆積物からなり、ＡＤの特徴であるが、死後にＡＤの脳組織および脳脊髄液（ＣＳＦ）で測定した可溶性Ａβ、特にオリゴマーおよびプロトフィブリルは、病気の進行とよく相関していること、また、シナプスとニューロンに有害であることが示されている。従って、可溶性Ａβ集合体は、Ａβに特異的な抗体による免疫治療法の好適な標的である。従って、一態様では前記脳の標的はＡβペプチドである。ある特定の態様では、前記Ａβペプチドは可溶性Ａβ凝集体であり、オリゴマーおよびプロトフィブリルより選択されることが好ましい。プロトフィブリルに結合する抗Ａβ抗体およびその製法の例は、ＷＯ２００２／０３９１１、ＷＯ２００５／１２３７７５、ＷＯ２００７／１０８７５６、ＷＯ２０１１／００１３６６、およびＷＯ２０１６／００５４６６で開示されており、引用により本開示に組み込まれる。Ａβプロトフィブリルに結合するよく研究されたマウスモノクローナル抗体ｍＡｂ１５８、およびそのヒト化形態ＢＡＮ２４０１は、例えば、ＷＯ２００７／１０８７５６に開示されている。また、この抗体はＡβタンパク質前駆体に親和性がない。ＢＡＮ２４０１の変異多様体は、ＷＯ２０１６／００５４６６で開示されている。添付の実施例で標的結合抗体として用いられたＲｍＡｂ１５８は同じＡβ結合特性を持つｍＡｂ１５８の組換えバージョンである。
Ａβタンパク質凝集に関連付けられた他の障害がある。例えば、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、レビー小体認知症（ＬＢＤ）、ダウン症候群（ＤＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症、タウオパシー、全身性アミロイド症、アテローム性動脈硬化、およびパーキンソン病認知症（ＰＤＤ）などである。Ａβペプチドに対する親和性を持つ標的結合抗体を含む脳送達タンパク質は、例えば、このような障害の治療または診断に有用な場合がある。
一態様では、前記脳送達タンパク質は、Ａβ結合抗体、および２つの担体部位を含む。このＡβ結合抗体は、Ａβプロトフィブリルに結合特異性を持つ抗体、例えば、従来技術の公報のいずれか、具体的には上記で開示されているｍＡｂ１５８／ＢＡＮ２４０１またはその変異体あるいは多様体であってもよい。特定の態様では、そのような脳送達タンパク質は２つの担体抗体を含み、それぞれ、リンカーによりＡβ結合抗体の（分離した）軽鎖のＣ末端側終端に結合されている。これら担体部位のそれぞれは、例えば、本明細書で規定した抗ＴｆＲ抗体またはその断片（例えば、ｓｃＦｖ８Ｄ３）であってもよく、配列番号１のリンカーにより標的結合部位に結合されていてもよい。
一態様では、前記Ａβ結合抗体はｍＡｂ１５８／ＢＡＮ２４０１またはその変異体あるいは多様体であり、前記担体部位のそれぞれはｓｃＦｖ８Ｄ３である。前記ｓｃＦｖ８Ｄ３のそれぞれは、前記ｍＡｂ１５８／ＢＡＮ２４０１またはその変異体あるいは多様体の軽鎖のＣ末端側終端に結合している。前記タンパク質は、さらに２つのリンカーを含んでいてもよく、各リンカーは、前記ｍＡｂ１５８／ＢＡＮ２４０１またはその変異体あるいは多様体に前記ｓｃＦｖ８Ｄ３を結合するための配列番号１のアミノ酸配列を持つ。
一態様では、前記脳の標的はαシヌクレインである。パーキンソン病（ＰＤ）およびレビー小体認知症（ＬＢＤ）の２つは、αシヌクレイン脳病理学で扱う最も一般的な神経変性障害である。他の例としては、アルツハイマー病のレビー小体多様体、多系統萎縮症、精神病、統合失調症、およびクロイツフェルト・ヤコブ病が挙げられる。一態様では、前記αシヌクレインは可溶性αシヌクレインであり、オリゴマーおよびプロトフィブリルより選択されることが好ましい。αシヌクレインに結合する標的結合抗体は、特に、ヒトαシヌクレインプロトフィブリルに対して高い親和性を持ち、αシヌクレイン単量体に対する低い結合力を持っていてもよい。抗αシヌクレイン抗体の具体的な例は、ＷＯ２００９／１３３５２１、ＷＯ２０１１／１０４６９６に開示されており、引用により本明細書に組み込まれる。
一態様では、前記脳送達タンパク質は、αシヌクレイン結合抗体、および２つの担体部位を含む。一態様では、前記αシヌクレイン結合抗体はヒトαシヌクレインプロトフィブリルに結合し、前記αシヌクレイン結合抗体はαシヌクレイン単量体に結合しないことが好ましい。前記αシヌクレイン結合抗体は、上記の従来技術文献の何れかで開示されている抗体または抗体多様体であってもよい。αシヌクレイン結合抗体の一例は、ｍＡｂ４８またはその変異体あるいは多様体である。ｍＡｂ４８はＷＯ２０１１／１０４６９６では「４８Ｂ１１／８」として開示されており、特に３１～３２ページの表１および表２に記載されている。特定の態様では、そのような脳送達タンパク質は２つの担体抗体を含み、それぞれ、αシヌクレイン結合抗体の軽鎖のＣ末端側終端にリンカーによって結合されている。前記２つの担体部位のそれぞれは、例えば、ｓｃＦｖ８Ｄ３などの抗ＴｆＲ抗体であってもよく、配列番号１のリンカーにより標的結合部位に結合されていてもよい。
一態様では、前記αシヌクレイン結合抗体はｍＡｂ４８またはその変異体あるいは多様体であり、前記担体部位のそれぞれはｓｃＦｖ８Ｄ３である。前記ｓｃＦｖ８Ｄ３のそれぞれは、前記ｍＡｂ４８またはその変異体あるいは多様体の軽鎖のＣ末端側終端に結合している。前記タンパク質はさらに２つのリンカーを含み、各リンカーは前記ｓｃＦｖ８Ｄ３を前記ｍＡｂ４８またはその変異体あるいは多様体に結合するための配列番号１のアミノ酸配列を持っていてもよい。
一態様では、前記脳の標的はＳＯＤである。ＳＯＤに向けられた抗体を含む脳送達タンパク質は、例えば、ＡＬＳの治療および診断に有用な場合がある。
一態様では、前記脳の標的はハンチンチンである。ハンチンチンに向けられた抗体を含む脳送達タンパク質は、例えば、ハンチントン病の治療および診断に有用な場合がある。
一態様では、前記脳の標的はトランスサイレチンである。トランスサイレチンに向けられた抗体を含む脳送達タンパク質は、例えば、家族性アミロイドニューロパシーの治療および診断に有用な場合がある。
一態様では、前記標的結合抗体はヒト化抗体である。
一態様では、前記脳送達タンパク質は組換え体である。
一態様では、前記タンパク質は融合タンパク質である。特に、前記タンパク質は融合タンパク質として発現していてもよい。
関連する一側面では、上記態様の何れか一項に記載のタンパク質をコードする単離された核酸が提供される。そのような核酸を含む発現ベクターにより、例えば、宿主細胞内で発現することで脳送達タンパク質を生成することが可能になる場合がある。
本発明の脳送達タンパク質は、治療薬または診断薬として、あるいは研究ツール（例えば、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴリガンド）として有用な場合がある。一態様では、前記脳送達タンパク質は予防または治療に使用される。例えば、前記脳送達タンパク質は神経変性障害など脳障害の治療および／または予防に使用される。
一態様では、前記脳送達タンパク質は、アルツハイマー病、およびＡβタンパク質凝集に関連づけられた他の障害、例えば、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、レビー小体認知症（ＬＢＤ）、ダウン症候群（ＤＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症、タウオパシー、全身性アミロイド症、アテローム性動脈硬化およびパーキンソン病認知症（ＰＤＤ）；アルツハイマー病のレビー小体多様体；多系統萎縮症；精神病；統合失調症；クロイツフェルト・ヤコブ病；ハンチントン病、および家族性アミロイドニューロパシーからなる群より選択される神経変性障害の治療および／または予防に使用される。
一態様では、前記脳送達タンパク質はアルツハイマー病の治療および／または予防に使用される。特に、このような脳送達タンパク質は、Ａβペプチド、好ましくは、Ａβペプチドの可溶な形態（例えば、オリゴマー）および／またはプロトフィブリルに結合する標的結合タンパク質を含む。
一態様では、前記脳送達タンパク質はパーキンソン病の治療および／または予防に使用される。特に、このような脳送達タンパク質は、αシヌクレイン、好ましくはαシヌクレインの可溶な形態（例えば、オリゴマー）および／またはプロトフィブリルに結合する標的結合タンパク質を含む。
一態様では、前記脳送達タンパク質は生体内での診断に使用される。例えば、前記脳送達タンパク質は、神経変性障害などの脳障害の生体内での診断に使用される。
一態様では、前記脳送達タンパク質は、アルツハイマー病およびＡβタンパク質凝集に関連付けられた他の障害からなる群より選択される神経変性障害の生体内での診断に使用される。他の障害としては、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、レビー小体認知症（ＬＢＤ）、ダウン症候群（ＤＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症、タウオパシー、全身性アミロイド症、アテローム性動脈硬化およびパーキンソン病認知症（ＰＤＤ）；アルツハイマー病のレビー小体多様体；多系統萎縮症；精神病；統合失調症；クロイツフェルト・ヤコブ病；ハンチントン病、および家族性アミロイドニューロパシーが挙げられる。
一態様では、前記脳送達タンパク質はアルツハイマー病の生体内での診断に使用される。特に、このような脳送達タンパク質は、Ａβペプチド、好ましくはＡβペプチドの可溶な形態（例えば、オリゴマー）および／またはプロトフィブリルに結合する標的結合タンパク質を含む。
一態様では、前記脳送達タンパク質はパーキンソン病の治療に使用される。特に、このような脳送達タンパク質は、αシヌクレイン、好ましくはαシヌクレインの可溶な形態（例えば、オリゴマー）および／またはプロトフィブリルに結合する標的結合タンパク質を含む。
一態様では、前記脳送達タンパク質はＰＥＴを用いて生体内での診断に使用される。
一態様では、前記脳送達タンパク質は、脳内で前記タンパク質を検出することができる標識をさらに含む。この文脈では、この標識は、前記脳送達タンパク質に結合させた、特に医療、診断、または研究目的のために検出および／または画像処理で用いることを意図したマーカーであると理解すべきである。この標識は、前記標的結合抗体または前記２つの担体部位の一方のいずれかと結合していてもよい。このような標識の非限定的な例としては、放射性標識、蛍光色素分子、発色団、または親和性タグが挙げられる。一態様では、この標識は、例えば、Ｚｒ８９、Ｉ１２４、Ｉ１２５、Ｉ１３１、Ｃ１１、Ｃ１４、Ｈ３、Ｆ１８、またはガリウム６８など医療または診断用の画像処理に用いられる放射性標識であり、ＳＰＥＣＴ（単一光子放射断層撮影）またはＰＥＴ（ポジトロン断層法）画像処理で用いるのに好適なものである。
本明細書で開示される脳送達タンパク質は、哺乳類の脳内の標的に好適に向けられる。従って、本発明の脳送達タンパク質は、哺乳類の治療または診断に用いるのに好適なものである。本明細書で用いられる哺乳類は、これらに限定されないが、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、および齧歯類（例えば、マウスおよびラット）が挙げられる。特定の態様では、前記哺乳類はヒトである。
関連した一側面では、本発明による脳送達タンパク質および医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物が提供される。治療に使用するための特定の一態様では、前記組成物は、ヒトおよび／または動物に投与するのに好適な生理学的緩衝剤中に治療活性量の本発明による脳送達タンパク質を含む生理学的に許容される製剤である。この脳送達タンパク質は、安定性を高めるために冷凍乾燥してもよい。この冷凍乾燥製剤は、任意の好適な従来の賦形剤を含んでいてもよい。そのような賦形剤としては、冷凍乾燥時および／または冷凍乾燥後、および／またはその後の保存時に製品を保護および／または安定化させる安定化剤、冷凍乾燥保護剤、緩衝剤、例えばマンニトールが挙げられるが、これらに限定されない。
関連する一側面では、脳障害を発症する危険がある哺乳類で前記脳障害を治療および／または予防する方法が提供される。この方法は、前記哺乳類に治療有効量の本発明による脳送達タンパク質を投与することを含む。特に、前記障害は、アルツハイマー病、および外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、レビー小体認知症（ＬＢＤ）、ダウン症候群（ＤＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症、タウオパシー、全身性アミロイド症、アテローム性動脈硬化およびパーキンソン病認知症（ＰＤＤ）；アルツハイマー病のレビー小体多様体；多系統萎縮症；精神病；統合失調症；クロイツフェルト・ヤコブ病；ハンチントン病、および家族性アミロイドニューロパシーなどのＡβタンパク質凝集に関連付けられた他の障害からなる群より選択される神経変性障害である。上で開示されたように、特定の標的結合抗体は、特定の脳の標的に対する結合親和性により、特定の神経変性障害の治療に有用な場合がある。従って、本発明の関連した側面で開示される態様は、本発明の治療側面の方法にも同様に関連している。
関連した一側面では、脳障害を発症する危険性が疑われる哺乳類で前記脳障害を診断および／または検出する方法が提供される。この方法は、前記哺乳類に診断および／または検出が可能な十分な量で本発明による脳送達タンパク質を投与することを含む。特定の一態様では、前記障害は、アルツハイマー病および外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、レビー小体認知症（ＬＢＤ）、ダウン症候群（ＤＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症、タウオパシー、全身性アミロイド症、アテローム性動脈硬化およびパーキンソン病認知症（ＰＤＤ）；アルツハイマー病のレビー小体多様体；多系統萎縮症；精神病；統合失調症；クロイツフェルト・ヤコブ病；ハンチントン病、および家族性アミロイドニューロパシーなどのＡβタンパク質凝集に関連付けられた他の障害からなる群より選択される神経変性障害などの神経変性障害である。上で開示されたように、特定の標的結合抗体は、特定の脳の標的に対する結合親和性により特定の障害の診断または検出に有用な場合がある。自明であるが、診断および／または検出する方法の特定の態様は、生体内または試験管内での方法であってもよく、例えば、哺乳類の脳内での生体内診断、あるいは細胞試料の試験管内診断であってもよい。従って、本発明の関連した側面で開示される態様は、上で開示された診断／検出の側面にも同様に関連している。
以下の非限定的な実施例により本発明をさらに説明する。
実施例１：組換え二重特異性Ａβ－ＴｆＲ抗体の生成および評価
ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３のクローニング
発現させた抗体の重鎖と軽鎖の両方をベクターｐｃＤＮＡ３．４(ThermoFischer)のＮ末端にシグナルペプチドと共にクローニングした。８Ｄ３配列(Boado et al,上記参照)を、Ｎ末端部分として重鎖可変領域断片を持ち、Ｃ末端に軽鎖可変領域断片を持つｓｃＦｖとした。この重鎖および軽鎖を、Wu AM. et al, Protein Eng. 14: 1025-1033 (2001)で既に開示されている１８個の長さのＧｌｙＳｅｒに富んだアミノ酸リンカー（ＧＳＴＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳ）で分離した。次いで、ｓｃＦｖ８Ｄ３を、アミノ酸配列ＡＰＧＳＹＴＧＳＡＰＧ（配列番号１）を持つ内製設計したペプチドリンカーと共にＲｍＡｂ１５８（例えばＥＰ２００４６８８で開示されている）の軽鎖のＣ末端に結合した。このリンカーの最初と終わりにプロリンを付加して、確実にαヘリックスが伸長しないようにした。というのも、プロリンはαヘリックスに必要なアミド水素結合を供与することができないからである。極性アミノ酸様セリンおよびトレオニンを付加して、確実にリンカーが親水性であるようにした。また、より小さいアミノ酸グリシンを付加して柔軟性を確保した。
ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３の発現および精製
“Protein Expression in Mammalian Cells: Methods and Protocols” (Baldi L. et al, Methods in Molecular Biology, 81:13-26 (2012))に記載された試験規約を用いて、この組換え融合タンパク質を発現させた。この時、細胞、細胞培養培地、およびベクターは、以下に記載するものと置き換えた。Ｅｘｐｉ２９３細胞(ThermoFisher)をＥｘｐｉ２９３培地(ThermoFisher)で成長させ、トランスフェクション試薬としてポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、細胞周期阻害剤としてバルプロ酸（ＶＰＡ）を用いて重鎖および軽鎖ｐｃＤＮＡ３．４ベクターで一過性のトランスフェクションを行った。ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３をHiTrapタンパク質Ｇカラム(GE Healthcare)で精製し、０．７％のＨＡｃに対して勾配溶出した。
ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３の生体外分析
ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３の大きさと完全性を確認するため、この融合タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。ＲｍＡｂ１５８およびＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３を還元剤なしでＢｏｌｔ（登録商標）ＬＤＳ試料緩衝剤と混合して、１０％のBolt Bis-Tris Plusゲル(Thermo Fisher)に直接充填した。２００Ｖで２２分間運転し、ｄＨ２Ｏで洗浄して、Page blue (Fermentas)で染色した。Chameleon予備染色タンパク質マーカー(Li-Cor)を分子量基準として用いた。
上述のように(Englund H. et al, J. Neurochem. 103: 334-345 (2007))、溶液中のＡβ単量体とプロトフィブリルとの特異的結合を評価するため、ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３を阻害ＥＬＩＳＡで分析して Ａβ抗体６Ｅ１０(Covance)と比較した。９６ウェルプレートを４５ｎｇ／ウェルのＡβプロトフィブリルで＋４℃で２時間被覆し、次いで、ＢＳＡで１時間ブロックした。連続希釈したＡβ単量体またはプロトフィブリルを非結合性の９６ウェルプレート内で一定の濃度の抗体（ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３：５０ｎｇ／ｍｌ；６Ｅ１０：４００ｎｇ／ｍｌ）と共に１時間プレインキュベートした。次いで、Ａβ－抗体溶液をＡβで被覆したプレートに移して、１５分間インキュベートし、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗マウス－ＩｇＧ－Ｆ（ａｂ’）２(Jackson ImmunoResearch Laboratories, 米国ペンシルベニア州ウエストグローブ)およびK blue aqueous TMB基質(Neogen Corp., 米国ケンタッキー州レキシントン)で検出し、４５０ｎｍの分光光度計で読み取った。すべてのＡβおよび抗体希釈液をＥＬＩＳＡインキュベーション緩衝剤（０．１％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ、および０．１５％のＫａｔｈｏｎを含むＰＢＳ）で作製した。Ａβ単量体およびプロトフィブリルは上記のように調製した(Magnusson K. et al, J. Alzheimers Dis. 37: 29-40 (2013))。
競合ＥＬＩＳＡを用いて、上で生成した化学的に融合した８Ｄ３－Ｆ（ａｂ’）２－ｈ１５８(Sehlin D. et al,上記参照(2016))、８Ｄ３、および８Ｄ３のｓｃＦｖ断片と比較してＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３のＴｆＲに対する結合能を評価した。９６ウェルプレートを５０ｎｇ／ウェルの組換えトランスフェリン受容体タンパク質(Sinobiological, 中国北京)で＋４℃で一晩被覆し、ＢＳＡでブロッキングした。連続希釈した抗体をシェーカー上のプレートで２時間インキュベートして、２．５ｎＭのビオチン化ｓｃＦｖ８Ｄ３と競合させ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合ストレプトアビジン(Mabtech AB, スウェーデン国ナッカストランド)およびK blue aqueous TMB基質(Neogen Corp.,米国ケンタッキー州レキシントン)で検出して、４５０ｎｍの分光光度計で読み取った。すべての抗体希釈液はＥＬＩＳＡインキュベーション緩衝剤（０．１％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ、および０．１５％のＫａｔｈｏｎを含むＰＢＳ）で作製された。すべてのＡβおよび抗体希釈液は、ＥＬＩＳＡインキュベーション緩衝剤で作製された。GraphPad Prism 5.0(GraphPad Software, Inc, 米国カリフォルニア州ラホヤ)を用いてＩＣ５０およびＫｄ値を非直線回帰分析で推定した。
結果
一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）は、リンカーにより互いに結合した８Ｄ３の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むものであり、短いペプチドリンカーを介してＲｍＡｂ１５８の軽鎖のそれぞれのＣ終端に結合されていた（図１Ａ）。このリンカーは、αヘリックスの形成を回避するように設計されていた。また、親水性アミノ酸の数は、疎水性コアの形成を回避するように選択されていた。小さい側鎖を持つアミノ酸は、柔軟性を確保するようにリンカーに組み込まれていた。リンカーの長さを短くした目的は、ｓｃＦｖをＲｍＡｂ１５８に密接に結合させて、ＴｆＲとの二価結合を立体的に困難にするためであった（図１Ｂ）。
Ｅｘｐｉ２９３細胞でのタンパク質発現は、抗体の収率がトランスフェクションした細胞培養物１リットル当たり約１５～３０ｍｇであった。精製したタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析し、単一バンドが観察された（結果（図示せず））。すなわち、ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３は純粋であり、同じバッチを以下で記載する試験管内および生体内での研究すべてに用いた。
生成された融合タンパク質の機能を評価するため、試験管内結合分析を行った。異なるＡβ種に対する融合タンパク質の選択性を阻害ＥＬＩＳＡにより調べた。これは、間接Ａβ ＥＬＩＳＡでのＡβ単量体およびプロトフィブリルの信号阻害能を試験抗原との親和性として近似するものである。ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３は、単量体よりもプロトフィブリルに対して５００倍近い強い結合能を示した。また、中央値阻害濃度（ＩＣ５０）はそれぞれ０．８５ｎＭおよび４００ｎＭとＲｍＡｂ１５８と同様であった（図２Ａ）。ＲｍＡｂ１５８のＩＣ５０は、単量体で１．２ｎＭ、プロトフィブリルに対して１．２μＭであった（図２Ｂ）。広く用いられているＡβ抗体６Ｅ１０は対照であるが、異なるＡβ調製物に対する結合について何ら違いは見られなかった（図２Ｃ）。
ＴｆＲ結合を競合ＴｆＲ ＥＬＩＳＡで評価した（図２Ｄ）。プレートを高濃度の組換えＴｆＲタンパク質で被覆して、その読み出しとして高い親和性を持つ二価結合を達成する可能性を模倣した。８Ｄ３のビオチン化ｓｃＦｖを連続希釈したｓｃＦｖ８Ｄ３、ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３、８Ｄ３、および化学的に融合した８Ｄ３－Ｆ（ａｂ’）２－ｈ１５８により競合させた。予測されたように、ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３は、８Ｄ３全抗体および８Ｄ３－Ｆ（ａｂ’）２－ｈ１５８に比べて、親和性が１０分の１になっており、推定Ｋｄ値は、それぞれ８．０、０．８０、および０．６９ｎＭであった。ＳｃＦｖ８Ｄ３は、定義により一価であり、１５ｎＭのＫｄ値を示した。すなわち、ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３の約２倍大きい数値であった。この組換え融合タンパク質は１分子当たり２つの可能な結合部位を持っているので、ｓｃＦｖ８Ｄ３とＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３とで結合において実際に差がなく、ＴｆＲとの一価の相互作用を強く示唆するものである。
実施例２：放射性標識化ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３を用いた脳内分布および周辺生体内分布の生体内研究
動物
Tg-ArcSweモデルは、北極圏突然変異(AβPP E693G)およびスウェーデン突然変異(AβPP KM670/671NL)を宿しかつC57BL/6背景(Lord, A. et al, Neurobiol Aging 27, 67-77 (2006); Philipson, O. et al, Neurobiol Aging 30, 1393-1405 (2009))に維持されており、非常に若年ですでに可溶性Ａβプロトフィブリル量の上昇を示し、約６月齢でプラーク病態を多く急速に発病する。オス、メスの両方を用いた。また、同腹の子を対照動物（野生型）として用いた。これらの動物を、ウプサラ大学の動物施設にある温度および湿度を調節した室内で食べ物と水を自由に得られるようにして飼育した。本明細書で記載するすべての手順はウプサラ郡動物倫理委員会(#C17/14)で承認され、Swedish Animal Welfare Agencyの規則および規定に従い、２０１０年９月２２日のEuropean Communities Council Directiveを遵守するものである(2010/63/欧州)。
放射化学
二重特異性ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３を、生体外実験用にヨウ素１２５（１２５Ｉ）で標識し、直接放射性ヨウ素化(Greenwood, F. C. et al, Biochem. J. 89,114-123 (1963))を用いてＰＥＴ実験用にヨウ素１２４（１２４Ｉ）で標識した。この方法は、その場で酸化したヨウ素によるチロシン残基のフェノール環の求電子性攻撃に基づくものである。手短に言うと、１２５Ｉ標識では、１２０ｐｍｏｌの抗体または融合タンパク質（推定Ｍｗ：２１０ｋＤａ）、１２５Ｉ保存溶液(Perkin-Elmer Inc., 米国マサチューセッツ州ウォルサム, USA)、および５μｇのChloramine-T(Sigma Aldrich, スウェーデン国ストックホルム)を最終体積が１１０μｌになるようにＰＢＳに混合した。この反応を９０秒間進めて、次いで２倍モル過剰のメタ重亜硫酸ナトリウム(Sigma Aldrich)を加えて反応を停止し、ＰＢＳで５００μｌに希釈した。１２４Ｉ標識では、６０μｌの１２４Ｉ保存溶液(Perkin-Elmer Inc.)を１２μｌの５０μＭ ＮａＩと共に１５分間予備インキュベートして、その後、２４０ｐｍｏｌの融合タンパク質と４０μｇのChloramine-TをＰＢＳに混合したものを加えて最終体積４２０μｌとした。この反応を１２０秒間進めて、次いでメタ重亜硫酸ナトリウムのＰＢＳ溶液８０μｇを加えて反応を停止した。製造者の指示に従って使い捨てのＮＡＰ－５サイズ排除カラム（Ｍｗカットオフ：５ｋＤａ）(GE Healthcare AB, スウェーデン国ウプサラ)によりこの放射性標識タンパク質から遊離ヨウ素と低分子量成分を除去し、１ｍｌのＰＢＳで希釈した。収率を加えた放射性活性および精製した放射性リガンド溶液の放射性活性に基づいて算出した。標識化はいずれの実験でもその２時間前までに行った。
生体外研究
０．４４±０．０３ＭＢｑの［１２５Ｉ］ＲｍＡｂ１５８（ｎ＝３）または０．８９±０．２６ＭＢｑの［１２５Ｉ］ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３（ｎ＝１０）をマウスに静脈内投与した。投与量は同じで０．０５ｍｇ／ｋｇであった。注射の０．５時間後、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、６時間後、８時間後、２４時間後、および４８時間後に尾の静脈から血液試料（８μｌ）を採取した。注射の２時間後に動物の下位集合（各リガンドに対してｎ＝３）を安楽死させ、残りを注射の３日後に安楽死させた。野生型マウスの別の群に検出用の１．５％の放射性標識タンパク質を含む１０ｍｇ／ｋｇのＲｍＡｂ１５８（ｎ＝５）および１３．３ｍｇ／ｋｇのＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３（ｎ＝５）を注射して、注射の２時間後に安楽死させた。灌流後、脳を単離して、小脳を脳の残りの部分と分け、脳組織試料をドライアイスで冷凍した。肝臓、肺、心臓、脾臓、腎臓、膵臓、筋肉、および大腿骨もまた単離した。血液、脳、小脳、および単離した器官の放射性活性をγカウンター(1480 Wizard（登録商標）, Wallac Oy, フィンランド、トゥルク)で測定した。脳中濃度、小脳中濃度、および血中濃度を組織１グラム当たりの注入投与量％（％ＩＤ／ｇ）として定量し、以下のようにして算出した。
％ＩＤ／ｇ=組織（または血液）１グラム当たりの測定放射性活性／注入した放射性活性
また、組織対血液（Ｋｐ）濃度比を以下のように算出した。
Ｋｐ=組織１グラム当たりの測定放射性活性／１グラムの血液の測定放射性活性
ＰＥＴ研究
［１２４Ｉ］ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３を注射する前日、動物に０．２％のＮａＩを補った水を与えて、１２４Ｉの甲状腺への取り込みを低減させた。マウス（ｎ＝１２）に７．２±３．４ＭＢｑの［１２４Ｉ］ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３（０．５ｍｇ／ｋｇの投与量に相当）を静脈内投与した。注射の１時間後、３時間後、６時間後、２４時間後、および４８時間後に尾の静脈から血液試料（８μｌ）を採取した。注射の３日後に、動物を動物用ＰＥＴ／ＣＴスキャナ(Triumph Trimodality System, TriFoil Imaging, Inc., 米国カリフォルニア州ノースリッジ)のガントリーに載せてリストモードで６０分間走査し、３分間ＣＴ検査を行った（視野（ＦＯＶ）＝８．０ｃｍ）。ＰＥＴ走査後に、心臓からの末端血試料を含む生体外研究に関して記載したのと同じ手順に従って動物を安楽死させた。血液、脳、小脳および単離した器官の放射性活性をウェルカウンター(GE Healthcare, スウェーデン国ウプサラ)で測定した。２匹の動物を注射の６日後に走査して、１匹の動物を注射の１０日後に走査した。
サブセット化による期待値最大化法(ordered subsets expectation-maximization, OSEM)の３Ｄアルゴリズム（２０反復）を用いてＰＥＴデータを再構築した。フィルタ補正逆投影法（Filter Back Projection、FBP）を用いて、ＣＴの生ファイルを再構築した。ＰＥＴおよびＣＴ画像のすべての後続の処理は、画像形成ソフトウェアAmide 1.0.4 (Loening AM. et al, Mol. Imaging 2: 131-137 (2003))で行った。海馬、線条体、視床、皮質、および小脳の関心のある輪郭付きの領域を含む、Ｔ２で重み付けしたＭＲＩに基づくマウスの脳地図(Ma Y, et al, Neuroscience 135: 1203-1215 (2005))とＣＴ走査を手動で並べた。次いで、ＰＥＴ画像をＣＴと並べて、ＭＲＩ地図もＰＥＴデータと並べた。
結果
ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３は、マウスの生体内研究のため、収率が約７０％で１２５Ｉおよび１２４Ｉで放射性標識された。特異的な活性は、［１２５Ｉ］ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３で０．４±０．１ＭＢｑ／μｇ（７９±１９ＭＢｑ／ｎｍｏｌ）であり、［１２４Ｉ］ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３で１．２±０．７ＭＢｑ／μｇ（２６１±１４５ＭＢｑ／ｎｍｏｌ）であった。
生体内でＴｆＲ媒介トランスサイトーシスを可能にするｓｃＦｖ８Ｄ３部位の能力を調べるため、野生型マウスに［１２５Ｉ］ＲｍＡｂ１５８または［１２５Ｉ］ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３を投与して、注射の２時間後に脳を単離した。脳内濃度は１グラムの脳組織の注入投与量の百分率（％ＩＤ／ｇ、数式１）で表されるが、［１２５Ｉ］ＲｍＡｂ１５８で０．０３±０．０１であり、［１２５Ｉ］ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３で２．２０±０．９２であった（図３Ａ）。従って、ｓｃＦｖ８Ｄ３の修飾は、この時点で脳内濃度は８０倍の増加となった。脳対血中濃度比（Ｋｐ、上記数式を参照のこと）は、２つのリガンドでそれぞれ０．００１０±０．０００１３と０．１５±０．１０であった）図３Ｂ）。従って、血中で利用可能なリガンドを考慮にいれたＫｐは、ＲｍＡｂ１５８のｓｃＦｖ８Ｄ３修飾により１４０倍に増加した。
薬物動態および脳内分布をさらに調べるため、放射性標識ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３を若い（８～９月齢）野生型およびｔｇ－ＡｒｃＳｗｅマウスおよび成熟（１８～２４月齢）野生型およびｔｇ－ＡｒｃＳｗｅマウスに投与した。注射の３日後にマウスの大部分（ｎ＝１４）を安楽死させた。２匹の成熟ｔｇ－ＡｒｃＳｗｅマウスを注射の１０日後まで調べて、注射の１４日後に１匹の成熟ｔｇ－ＡｒｃＳｗｅを安楽死させた。
ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３の投与後３日目に、成熟野生型マウス（％ＩＤ／ｇ＝０．０８±０．０１）に比べて成熟ｔｇ－ＡｒｃＳｗｅマウス（％ＩＤ／ｇ＝０．６９±０．１７）で融合タンパク質の脳内濃度が９倍高くなっていたことが分かった（図４Ａ）。これは、化学的に生成した融合タンパク質８Ｄ３－Ｆ（ａｂ’）２－ｈ１５８に比べて５倍の差に相当する（図４Ｂ）。ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３の脳内濃度は、投与後に続く７日間でわずかに低下しただけであった（図４Ｃ）。３時間から３日間の間で得た試料に基づく血液中の半減期は１８．６±１．５時間であった。１日から３日、すなわち排出相では、半減期は２４．４±３．３時間であった（図４Ｃ）。遺伝子導入マウスと野生型マウスとで血中濃度または半減期に違いは見られなかった。
周辺器官の［１２５／１２４Ｉ］ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３の分布を図５に示す。ほとんどの器官の組織濃度は、血中濃度よりも幾分速く低下した。脾臓は最も取り込みが多かったが、脾臓内の濃度は低下していた。この低下は、他の器官からの［１２５／１２４Ｉ］ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３の排出よりもゆっくりであった（しかし、血液からの排出よりは速かった）。
調べた動物の下位集合を注入時、注入後３日目、６日目、または１０日目にＰＥＴ走査した。これらの走査から得たＰＥＴ画像を図６に示す。これらの画像は、［１２４Ｉ］ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３はｔｇ－ＡｒｃＳｗｅマウスの脳内に保持されているが、野生型マウスの脳からは排出されていることを示している。脳体積の３％は血液であると仮定して、注入後最初の０～６０分間で得たＰＥＴデータを走査後直接得た血液試料との関係で定量した。この実験から、この時点のＰＥＴ信号の７２％は、脳組織に関連した［１２４Ｉ］ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３に由来することが示された。これは、脳内の高濃度は注入のほとんど直後に得られたことを示唆している（図６Ａ）。これは、無修飾ｍＡｂ１５８（注入後３日目に脳内濃度がピークとなっている）とは異なり、脳内への活性輸送を示している(Magnusson K. et al,上記参照)。注入後３日目に、組換え融合タンパク質濃度は、それぞれ、ｔｇ－ＡｒｃＳｗｅマウスおよび野生型マウスの脳で注入時に走査により得た濃度の約２５％から１０％まで低下した（図６Ｂおよび図６Ｅ）。その後の時点で、ＰＥＴにより測定された脳内濃度は、成熟ｔｇ－ＡｒｃＳｗｅ動物（図６Ｃ～図６Ｄ）で幾分低下した一方で、野生型マウスの脳では［１２４Ｉ］ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３はほとんど残っていなかった（図６Ｆ～図６Ｇ）。脳の血液含有量が比較的高いため、脳内のＰＥＴ信号は組換え融合タンパク質の血中濃度によって影響される。この組換え融合タンパク質は注入後最初の３日間で大きく減少するため、第一の走査と第二の走査でＰＥＴ信号が大きく低下したことが説明される。これは、脳内のＡβに結合していない［１２４Ｉ］ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３は血液と平衡状態にあり、脳から活性輸送されることを示唆している。
例えば［１１Ｃ］ＰＩＢで評価される脳内のＡβ濃度のＰＥＴデータは、脳対小脳濃度比として定量される。これは、小脳はほとんどＡβ病変を免れており、基準領域として作用することができるためである。小脳を基準として用いて、ＰＥＴにより定量した全脳、視床、線条体、海馬、および皮質の濃度比を図７に示す。注入後３日目には既にはっきりとした違いが見られ、成熟ｔｇ－ＡｒｃＳｗｅ群と他の群とでは比に重なるところがない。注入後６日目には、若年および成熟ｔｇ－ＡｒｃＳｗｅマウスいずれも、脳内でのプロトフィブリルの蓄積がない野生型マウスと区別することができた。これは、化学融合タンパク質について(Sehlin D. et al,上記参照(2016))で既に証明されているように、脳内での［１２４Ｉ］ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３結合が実際にＡβ病変部に特異的であることを示唆している。
上記の２時間の脳への取り込み実験はすべて、微量投与量、すなわち約０．０５ｍｇ／ｋｇのＲｍＡｂ１５８またはＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３を用いて行われた。前の実験と同量の放射性活性を用いて第二の実験を行った。これらの実験では、投与量１０ｍｇ／ｋｇで非標識のＲｍＡｂ１５８またはＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３を加えた。治療投与後のＲｍＡｂ１５８の脳内濃度（％ＩＤ／１ｇの脳および脳対血中濃度比（図８））を微量投与後に得られたものと同じであった（図３）。従って、ＢＢＢを越える輸送は、投与量に対して線状であった。しかしながら、ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３ではＴｆＲ媒介ＢＢＢは飽和しているようで、投与量および全身性濃度に関して脳内濃度が低下した。
実施例３：ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３によるＡβＰＰ遺伝子導入マウスの治療
動物
この研究でもまた、北極圏突然変異（ＡβＰＰ Ｅ６９３Ｇ）およびスウェーデン突然変異（ＡβＰＰ ＫＭ６７０／６７１ＮＬ）を宿しかつＣ５７ＢＬ／６背景に維持されたＡβＰＰ遺伝子導入マウスモデルを用いた。オス、メスの両方を用いた。また、同腹の子を対照動物（野生型）として用いた。これらの動物を、ウプサラ大学の動物施設にある温度および湿度を調節した室内で食べ物と水を自由に得られるようにして飼育した。本明細書で記載するすべての手順はウプサラ郡動物倫理委員会（＃Ｃ１７／１４）で承認され、Swedish Animal Welfare Agencyの規則および規定に従い、２０１０年９月２２日のEuropean Communities Council Directiveを遵守するものである（２０１０／６３／欧州）。動物の苦痛を最小限にし、用いる動物の数を減らすためにあらゆる努力をした。
抗体および放射性標識
この研究では、上述のように作製したＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３とＲｍＡｂ１５８(BioArctic AB, スウェーデン国ストックホルム)は、無修飾であるか、ヨウ素１２５（１２５Ｉ）で放射性標識してあるかのいずれかであった。
本質的には実施例２で記載したように直接放射性ヨウ素化により抗体を１２５Ｉで標識した。
生体外オートラジオグラフィー
抗体の脳内分布を生体外のオートラジオグラフィーで視覚化するため、１８月齢のｔｇ－ＡｒｃＳｗｅマウスおよび野生型マウスに３．５ＭＢｑの［１２５Ｉ］ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３または２．９ＭＢｑの［１２５Ｉ］ＲｍＡｂ１５８を注射した。これは、０．２０ｍｇのＩｇＧ／体重１ｋｇの投与量に相当する。注射後の６日目に、マウスを生理食塩水で灌流して、すぐに脳をドライアイスで冷凍した。厚さが５０μｍの冠状冷凍切片を得て、周知の放射性活性の１２５Ｉ規格に沿ってＸ線カセットに置いた。ポジトロン感受性リンスクリーン(MS, MultiSensitive, PerkinElmer, 米国イリノイ州ダウナーズグローブ)を試料の上に載せて５日間露出し、その後Cyclone Plus Imagerシステム (Perkin Elmer)で１インチ当たり６００ドットの解像度で走査した。得られたデジタル画像をImageJで基準に対して正規化した。
抗体治療および生体外分析
１４月齢のＴｇ－ＡｒｃＳｗｅマウスにプラセボ（ＰＢＳ）、ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３（６．６ｍｇ／体重１ｋｇ；ＰＢＳ中１．３２ｍｇ／ｍｌ）、またはＲｍＡｂ１５８（５．０または５０ｍｇ／体重１ｋｇ；ＰＢＳ中１または１０ｍｇ／ｍｌ）を１回注射して治療した。治療に用いたのと同じ種類の放射性標識タンパク質（０．０５ｍｇ／ｋｇのＩｇＧに相当）を抗体溶液に混合した。特異的活性は、［１２５Ｉ］ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３が７１．２±７．６ＭＢｑ／ｎｍｏｌ［１２５Ｉ］ＲｍＡｂ１５８が７１．９±３．６ＭＢｑ／ｎｍｏｌであった。マウスをイソフルレン(Isoflurane Baxter（登録商標）, Baxter Medical AB, スウェーデン国キスタ)で軽く鎮静させて、プラスチックホルダーに入れ、５μｌの抗体溶液／体重１ｇを静脈内投与した。１時、２４時、４８時に尾から血液試料を採取して、注射の７２時間後に最終血液試料を心臓から採取した。その後、生理食塩水で灌流して、脳を単離した。脳と血漿の放射性活性γカウンター (1480 Wizard（登録商標）, Wallac Oy, フィンランド、トゥルク)で測定し、血漿と脳の抗体濃度（組織１ｇ当たりの注入投与量（ＩＤ）の％として定量）を実施例２に記載したように算出した。
Ａβ病変のＥＬＩＳＡ分析
可溶性Ａβおよび総Ａβの脳内濃度をSyvanen, S., et al. (Neuroimage 148: 55-63 (2017))で記載されているように測定した。手短に言うと、完全プロテアーゼ阻害剤(Roche; Sigma Aldrich, スウェーデン国ストックホルム)と共に脳組織を１：５の重量：体積比でＴＢＳにて均一にし、次いでＴＢＳと１：１で混合して、１０００００Ｇで１時間時間遠心分離した。総Ａβについて、元のＴＢＳ抽出物を濃縮ギ酸と混合して濃度７０％まで濃縮し、上記のように均質にして、１６０００Ｇで遠心分離を行った。８２Ｅ１(IBL International/Tecan Trading AG, スイス)を回収体および検出抗体として用いてＡβオリゴマーおよびプロトフィブリルを均一ＥＬＩＳＡで測定した。８２Ｅ１は、ＡβＰＰのβセクレターゼ切断後に生成されたＮ末端Ａβネオエピトープに特異的である。９６ウェルのハーフエリアプレートを１ウェル当たり１２．５ｎｇの８２Ｅ１で被覆し、１％のＢＳＡのＰＢＳ溶液でブロックした。ＴＢＳ抽出物を１：１０に希釈して、＋４℃で一晩インキュベートし、ビオチン化８２Ｅ１(０．２５μｇ／ｍｌ）、SA-HRP (1:2000, Mabtech AB)、およびK blue aqueous TMB基質(Neogen Corp.,米国ケンタッキー州レキシントン)で検出した。Ａβ１－４０およびＡβ１－４２では、９６ウェルプレートを１ウェル当たり１００ｎｇのポリクロナールウサギ抗Ａβ４０または抗Ａβ４２(Agrisera,スウェーデン国ウメオ)で一晩被覆して、１％のＢＳＡのＰＢＳ溶液でブロックした。ギ酸抽出物を２ＭのＴｒｉｓで中和し、１００００ｘ（Ａβ１－４０）または２０００ｘ（Ａβ１－４２）に希釈し、＋４℃で一晩インキュベートした。ビオチン化８２Ｅ１（０．２５μｇ／ｍｌ）と共にインキュベーション後、信号を生じさせて上記のように読み取った。すべての希釈液は、ＥＬＩＳＡインキュベーション緩衝剤で作製された。
免疫組織化学
上述のように、生体外オートラジオグラフィーに用いた切片に隣接する厚さ５０μｍの冷凍切片のＡβ病変部をＡβ４０免疫染色で視覚化した(Magnusson K. et al,上記参照)。室温で２０分間、切片を４％のＰＦＡのＰＢＳ溶液内で固定し、ＰＢＳで洗浄し、次いで抗原回復のために予備加熱したクエン酸塩緩衝剤（２５ｍＭ、ｐＨ：７．３、手順の開始時に１００℃）中で４０分間インキュベートした。次いで、切片を室温で５分間、７０％ギ酸に移し、さらに５分間新鮮なＭＱ－Ｈ２Ｏを一定量流しながら洗浄した。内因性ペルオキシダーゼ活性を１５分間ＤＡＫＯペルオキシダーゼブロック剤(Agilent Technologies, スウェーデン国キスタ)でブロックして、０．４％トリトンのＰＢＳ溶液で５分間透過処理した。１０分後にＤＡＫＯブロック（０．２５％カゼインのＰＢＳ溶液）して非特異的な結合を阻害し、０．５μｇ／ｍｌのポリクロナール抗Ａβ４０抗体(Agrisera, スウェーデン国ウメオ)と共に切片を一晩インキュベートした。次いで、５μｇ／ｍｌのビオチン化ヤギ抗ラット(Vector Laboratories Inc., カリフォルニア州バーリンゲーム)で３０分間インキュベートし、さらに３０分間ストレプトアビジンＨＲＰ(Mabtech AB)でインキュベートした。シェーカーにて、NOVA RED色原体(Vector Laboratories Inc.)で１０分間染色して、次いでＭＱ－Ｈ２Ｏで１分間洗浄し、まず９５％のＥｔＯＨ、次いで９９．９％のＥｔＯＨにさっと浸した。切片を空気乾燥して、ＤＰＸを搭載した培地(Sigma Aldrich, スウェーデン国)に載せ、ニコン顕微鏡(DXＭ1200F, Nikon Instruments Inc., 米国ニューヨーク州メルヴィル)で分析した。
統計分析
結果を平均±標準偏差として表示している。データを一元配置分散分析（分散分析）で分析し、その後、ボンフェローニの事後検定で分析した。統計分析に加えて、血漿曲線適合（１フェーズ減衰）と曲線下面積をGraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc, 米国カリフォルニア州ラホヤ)を用いて算出した。
結果
抗体の脳組織内分布を評価するため、野生型（ｗｔ）と多くのＡβ病変部を持つ１８月齢のｔｇ－ＡｒｃＳｗｅマウスにＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３およびヨウ素１２５（１２５Ｉ）で標識したＲｍＡｂ１５８を注入した。注入後６日目にマウスを生理食塩水で灌流し、生体外オートラジオグラフィーおよびＡβ４０免疫染色のためにその脳を冠状に切り出した。図９に示すように、脳実質内の抗体の全体分布は基本的に異なっていた。隣接する切片のＡβ４０免疫染色によって視覚化されたように、二重特異性［１２５Ｉ］ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３は全脳に亘って分布し、Ａβ病変部を多く持つ脳領域内で保持されていた。これに対して［１２５Ｉ］ＲｍＡｂ１５８は、ほとんど完全に脳の中央部に集中していた。いずれの抗体の保持もＡβ病変部に特異的であった。というのは、野生型マウスではほとんど信号が検出されなかったからである。
次いで、可溶性Ａβプロトフィブリルの脳内濃度を低下させる抗体の能力に及ぼす向上した脳分布の影響を調べるため、１４月齢ｔｇ－ＡｒｃＳｗｅマウスを使って短期間の免疫治療法検査を行った。マウスを１０～１１個体からなる４つの群に分けて、ＰＢＳ（プラセボ）、低投与量のＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３（６．６ｍｇ／体重１ｋｇ、５ｍｇ／１ｋｇのＩｇＧに相当）、低投与量のＲｍＡｂ１５８（５ｍｇ／体重１ｋｇ）、または高投与量のＲｍＡｂ１５８（５０ｍｇ／体重１ｋｇ）を１回静脈内投与した。すべての抗体投与量には、血液および脳で濃度を追跡したのと同じ種類の微量の１２５Ｉ標識抗体を補った。この二重特異性抗体は、無修飾ＲｍＡｂ１５８に比べて血中での半減期が短く（図１０Ａ）、曲線下面積に示されているように薬物暴露量がほとんど１／４となった（図１０Ｂ）。なぜ注入後２時間で１０倍の差が観察されたのに比べて３日目に抗体の脳での保持において差が小さいのかは、暴露量が少ないことで説明される（図１０Ｃ）。しかしながら、暴露量の低下を調節すると、脳内への輸送効率は１０倍になることが分かった（図１０Ｄ）。
生理食塩水で灌流後に、抗体で治療したマウスの脳を単離した。免疫組織化学分析のため、右脳を固定してパラフィンに埋めた。左脳をＴＢＳとギ酸（ＦＡ）で均一にして、可溶性Ａβおよび総Ａβの抽出物をそれぞれ得た。回収体および検出抗体としてのＡβのＮ末端に特異的な８２Ｅ１と共に均一ＥＬＩＳＡを用いて(Xia, W., et al., Arch Neurol 66(2):190-199 (2009))、プラセボと比べて二重特異性ＲｍＡｂ１５８－ｓｃＦｖ８Ｄ３で治療したマウス群では可溶性Ａβオリゴマーおよびプロトフィブリルの脳内濃度が４０％超低下したことが分かった（図１０Ｅ）。これに対して、当量の投与量のＲｍＡｂ１５８は、可溶性Ａβ凝集体の濃度に何ら効果を及ぼさなかったが、１０倍多い投与量では二重特異性抗体と同程度の低下が見られた。１回の注射による治療の枠組みから想定されたように、ＦＡに可溶な脳抽出物でＡβ１－４０およびＡβ１－４２ ＥＬＩＳＡにより測定されたように（データ（図示せず））、これらの治療群はいずれも総Ａβの濃度に何らかの大きな効果を示さなかった。
実施例４：組換え二重特異性αシヌクレイン－ＴｆＲ抗体の生成および評価
ＲｍＡｂ４８－ｓｃＦｖ８Ｄ３のクローニング、発現、および精製
組換え二重特異性αシヌクレイン－ＴｆＲ抗体ＲｍＡｂ４８－ｓｃＦｖ８Ｄ３のクローニング、発現、精製を本質的に実施例１に記載のように行った。ＭＡｂ４８は、ＷＯ２０１１／１０４６９６に「４８Ｂ１１／８」として開示されており、特に３１～３２ページの表１および表２に記載されている。
結果
組換え二重特異性αシヌクレイン－ＴｆＲ抗体を、実施例１に従って作製・評価した。一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）は、リンカーにより互いに結合した８Ｄ３の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、短いペプチドリンカーを介してＲｍＡｂ４８軽鎖のＣ終端に結合していた。従って、得られたタンパク質は図１Ａに示すタンパク質高次構造に従う高次構造を持っていた。
実施例５：放射性標識ＲｍＡｂ４８－ｓｃＦｖ８Ｄ３を用いた脳内分布および周辺生体内分布の生体内研究
この研究で用いた方法および材料は、実施例２に記載の方法および材料と本質的に同じであった。
動物
ＲｍＡｂ４８－ｓｃＦｖ８Ｄ３の脳内分布の研究では野生型Ｃ５７ｂｌ６動物（ｗｔ）のオスとメスを用いた。これらの動物を実施例２に記載のように飼育・給餌した。
放射性化学
直接放射性ヨウ素化 (Greenwood, F. C. et al, Biochem. J. 89,114-123 (1963))を用いて、αシヌクレイン結合抗体ＲｍＡｂ４８および二重特異性ＲｍＡｂ４８－ｓｃＦｖ８Ｄ３をヨウ素１２５（１２５Ｉ）で標識した。標識付けは本質的に実施例２の記載に従った。
生体外研究
マウスに０．８９±０．０６ＭＢｑの［１２５Ｉ］ＲｍＡｂ４８（ｎ＝３）または０．９２±０．０２ＭＢｑの［１２５Ｉ］ＲｍＡｂ４８－ｓｃＦｖ８Ｄ３（ｎ＝３）を静脈内投与した。これは０．０５ｍｇ／ｋｇの投与量に相当するものである。灌流後、脳を単離して、小脳を脳の残りの部分から分離し、脳組織試料をドライアイスで冷凍した。血液、脳、および小脳の放射性活性をγカウンター(1480 Wizard（登録商標）, Wallac Oy, フィンランド、トゥルク)で測定した。脳内濃度、小脳内濃度、血中濃度、および組織体血液（Ｋｐ）濃度比を実施例２の記載に従って算出した。
結果
マウスの生体内研究のため、ＲｍＡｂ４８－ｓｃＦｖ８Ｄ３およびＲｍＡｂ４８をＩ１２５で放射性標識したところ、収率は７０％であった。
生体内でＴｆＲ媒介トランスサイトーシスを可能にするｓｃＦｖ８Ｄ３部位の能力を調べるため、野生型マウスに［１２５Ｉ］ＲｍＡｂ４８または［１２５Ｉ］ＲｍＡｂ４８－ｓｃＦｖ８Ｄ３を投与して、その脳を注入の２時間後に単離した。脳内濃度は、脳組織１ｇ当たりの注入投与量の百分率（％ＩＤ／ｇ、数式１）で表され、［１２５Ｉ］ＲｍＡｂ４８で０．０４±０．０１、［１２５Ｉ］ＲｍＡｂ４８－ｓｃＦｖ８Ｄ３で１．０４±０．２６であった。従って、ｓｃＦｖ８Ｄ３修飾により、この時点での脳内濃度は２５倍増加した。これら２つのリガンドの脳対血中濃度比（Ｋｐ、上記数式を参照のこと）はそれぞれ、０．００２０±０．０００４および０．０８９±０．０１５であった。従って、血中で利用可能なリガンドを考慮して、ＫｐはＲｍＡｂ４８のｓｃＦｖ８Ｄ３修飾により５４倍増加した。

Claims (30)

  1. 哺乳類の脳内の標的に結合する標的結合抗体、および
    それぞれが血液脳関門（ＢＢＢ）内皮細胞表面に発現したタンパク質と一価の相互作用をすることができる２つの担体部位を含み、
    前記担体部位のそれぞれは前記標的結合抗体のＣ末端側終端に結合している、脳送達タンパク質。
  2. 前記２つの担体部位の一方が前記ＢＢＢ内皮細胞表面に発現したタンパク質に一度に結合する、請求項１に記載のタンパク質。
  3. 前記担体部位のそれぞれはリンカーにより前記標的結合抗体に結合している、請求項１または２に記載のタンパク質。
  4. 前記リンカーのそれぞれは、個別に、１～３０個のアミノ酸残基、好ましくは１～２５個のアミノ酸残基、好ましくは１～１９個のアミノ酸残基、好ましくは３～１９個のアミノ酸残基、好ましくは３～１５個のアミノ酸残基、好ましくは５～１５個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を持つペプチドを含む、請求項３に記載のタンパク質。
  5. 前記担体部位のそれぞれは前記標的結合抗体の軽鎖のＣ末端側終端に結合している、上記請求項の何れか一項に記載のタンパク質。
  6. 前記担体部位のそれぞれは前記標的結合抗体の重鎖のＣ末端側終端に結合している、請求項１～４の何れか一項に記載のタンパク質。
  7. 第一の担体部位は前記標的結合抗体の重鎖のＣ末端に結合しており、第二の担体部位は前記標的結合抗体の軽鎖のＣ末端側終端に結合している、請求項１～４の何れか一項に記載のタンパク質。
  8. 前記担体部位のそれぞれはリンカーにより前記標的結合抗体に結合しており、前記リンカーは配列番号１として表されるアミノ酸配列を持つペプチドを含む、上記請求項の何れか一項に記載のタンパク質。
  9. 前記担体部位のそれぞれは、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｓｃＦａｂ、またはＶＨＨ；トランスフェリンまたはその変異体あるいは多様体、またはブドウ球菌タンパク質ＡのドメインＢに由来するタンパク質Ｚの多様体より選択される抗体断片を含む、上記請求項の何れか一項に記載のタンパク質。
  10. 前記担体部位のそれぞれはｓｃＦｖを含む、請求項９に記載のタンパク質。
  11. 前記ＢＢＢ内皮細胞表面に発現したタンパク質は、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体（ＩｎｓＲ）、インスリン様成長因子受容体、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（Ｌｒｐ８）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（Ｌｒｐ１）、ＣＤ９８、膜貫通タンパク質５０Ａ（ＴＭＥＭ５０Ａ）、グルコース輸送体１（Ｇｌｕｔ１）、ベイシジン（ＢＳＧ）、およびヘパリン結合上皮成長因子様成長因子より選択される、上記請求項の何れか一項に記載のタンパク質。
  12. 前記ＢＢＢ内皮細胞表面に発現したタンパク質はＴｆＲである、請求項１１に記載のタンパク質。
  13. 前記前記標的結合抗体は完全な長さの抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦｖである、上記請求項の何れか一項に記載のタンパク質。
  14. 前記標的結合抗体は完全な長さの抗体である、請求項１３に記載のタンパク質。
  15. 前記脳内の標的は、アミロイドβ（Ａβ）ペプチド、αシヌクレイン、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、ハンチンチン、トランスサイレチン、Ｐ－セクレターゼ１、上皮成長因子、上皮成長因子受容体２、タウ、リン酸化タウ、アポリポタンパク質Ｅ４、ＣＤ２０、プリオンタンパク質、ロイシン富化反復キナーゼ２、パーキン、プレセニリン２、γセクレターゼ、細胞死受容体６、アミロイド前駆体タンパク質、ｐ７５ニューロトロフィン受容体、ニューレグリン、およびカスパーゼ６より選択される、上記請求項の何れか一項に記載のタンパク質。
  16. 前記脳の標的は、Ａβペプチド、好ましくは可溶性Ａβ凝集体、例えば、オリゴマーおよびプロトフィブリルから選択される可溶性Ａβ凝集体である、請求項１５に記載のタンパク質。
  17. 前記タンパク質は、Ａβ結合抗体、および抗ＴｆＲ抗体の断片である２つの担体部位を含む、請求項１６に記載のタンパク質。
  18. 前記Ａβ結合抗体はｍＡｂ１５８／ＢＡＮ２４０１またはその変異体あるいは多様体であり、前記担体部位のそれぞれはｓｃＦｖ８Ｄ３であり、前記ｓｃＦｖ８Ｄ３のそれぞれは、前記ｍＡｂ１５８／ＢＡＮ２４０１またはその変異体あるいは多様体の軽鎖のＣ末端側終端に結合しており、前記タンパクは、さらに２つのリンカーを含んでいてもよく、各リンカーは、前記ｍＡｂ１５８／ＢＡＮ２４０１またはその変異体あるいは多様体に前記ｓｃＦｖ８Ｄ３を結合するための配列番号１で表されるアミノ酸配列を持つ、請求項１７に記載のタンパク質。
  19. 前記脳の標的は、αシヌクレイン、好ましくは可溶性αシヌクレイン、例えば、オリゴマーおよびプロトフィブリルより選択される可溶性αシヌクレインである、請求項１５に記載のタンパク質。
  20. αシヌクレイン結合抗体、および抗ＴｆＲ抗体の断片である２つの担体部位を含む、請求項１９に記載のタンパク質。
  21. 前記αシヌクレイン結合抗体はヒトαシヌクレインプロトフィブリルに結合し、前記αシヌクレイン結合抗体はαシヌクレイン単量体に結合しないことが好ましい、請求項２０に記載のタンパク質。
  22. 前記αシヌクレイン結合抗体はｍＡｂ４８またはその変異体あるいは多様体であり、前記担体部位のそれぞれはｓｃＦｖ８Ｄ３であり、前記ｓｃＦｖ８Ｄ３のそれぞれは、前記ｍＡｂ４８またはその変異体あるいは多様体の軽鎖のＣ末端側終端に結合しており、前記タンパク質はさらに２つのリンカーを含み、各リンカーは前記ｓｃＦｖ８Ｄ３を前記ｍＡｂ４８またはその変異体あるいは多様体に結合するための配列番号１で表されるアミノ酸配列を持っていてもよい、請求項２０または２１に記載のタンパク質。
  23. 前記タンパク質は融合タンパク質である、上記請求項の何れか一項に記載のタンパク質。
  24. 予防および／または治療に用いられる、上記請求項の何れか一項に記載のタンパク質。
  25. 神経変性障害、好ましくはアルツハイマー病、およびＡβタンパク質凝集に関連付けられた他の障害、例えば、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、レビー小体認知症（ＬＢＤ）、ダウン症候群（ＤＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症、タウオパシー、全身性アミロイド症、アテローム性動脈硬化およびパーキンソン病認知症（ＰＤＤ）；アルツハイマー病のレビー小体多様体；多系統萎縮症；精神病；統合失調症；クロイツフェルト・ヤコブ病；ハンチントン病、および家族性アミロイドニューロパシーからなる群より選択される神経変性障害の治療および／または予防および／または生体内診断に用いられる、請求項２４に記載のタンパク質。
  26. アルツハイマー病の治療および／または予防および／または生体内診断に用いられる、請求項２５に記載のタンパク質。
  27. パーキンソン病の治療および／または予防および／または生体内診断に用いられる、請求項２６に記載のタンパク質。
  28. 脳障害を患っているか、または発症する危険がある哺乳類で前記脳障害を治療および／または予防する方法であって、前記哺乳類に治療有効量の請求項１～２３の何れか一項に記載の脳送達タンパク質を投与することを含む、方法。
  29. 脳障害を患っているか、または発症する危険性があると疑われる哺乳類で前記脳障害を診断および／または検出する方法であって、前記哺乳類に診断および／または検出が可能な十分な量で請求項１～２３の何れか一項に記載の脳送達タンパク質を投与することを含む、方法。
  30. 前記障害は、アルツハイマー病、および外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、レビー小体認知症（ＬＢＤ）、ダウン症候群（ＤＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症、タウオパシー、全身性アミロイド症、アテローム性動脈硬化およびパーキンソン病認知症（ＰＤＤ）；アルツハイマー病のレビー小体多様体；多系統萎縮症；精神病；統合失調症；クロイツフェルト・ヤコブ病；ハンチントン病、および家族性アミロイドニューロパシーなどのＡβタンパク質凝集に関連付けられた他の障害からなる群より選択される神経変性障害などの神経変性障害である、請求項２８に記載の治療および／または予防する、または請求項２９に記載の診断および／または検出をする方法。
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SI3583120T1 (sl) 2017-02-17 2023-02-28 Denali Therapeutics Inc. Inženirani polipeptidi, ki vezujejo transferinske receptorje
WO2018151821A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to alpha-synuclein and uses thereof
CA3118692A1 (en) * 2018-11-06 2020-05-14 Alsatech, Inc. Cell-based gene therapy for neurodegenerative diseases
IL308394A (en) 2021-06-11 2024-01-01 Bioarctic Ab The bispecific binding molecule
WO2023215697A1 (en) * 2022-05-05 2023-11-09 Eli Lilly And Company Multispecific binding molecules and methods of use thereof
WO2024080843A1 (ko) * 2022-10-14 2024-04-18 주식회사 아임뉴런 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 및 이의 용도

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002003911A2 (en) 2000-07-07 2002-01-17 Lars Lannfelt Prevention and treatment of alzheimer's disease
SE0401601D0 (sv) 2004-06-21 2004-06-21 Bioarctic Neuroscience Ab Protofibril specific antibodies and uses thereof
NZ567888A (en) 2006-03-23 2010-08-27 Bioarctic Neuroscience Ab Improved protofibril selective antibodies and the use thereof
US8759297B2 (en) * 2006-08-18 2014-06-24 Armagen Technologies, Inc. Genetically encoded multifunctional compositions bidirectionally transported between peripheral blood and the cns
MX2010011209A (es) 2008-04-24 2010-11-12 Squibb Bristol Myers Co Uso de epotilona d en el tratamiento de enfermedades asociadas a tau incluyendo enfermedad de alzheimer.
WO2009133521A2 (en) 2008-04-29 2009-11-05 Bioartic Neuroscience Ab Antibodies and vaccines for use in therapeutic and diagnostic methods for alpha-synuclein-related disorders
CN104800147A (zh) 2008-07-10 2015-07-29 德勒尼克斯治疗股份公司 用于大分子的增强的递送的方法和组合物
DK2448968T3 (da) 2009-06-29 2021-04-12 Bioarctic Ab ANTISTOFFER SOM ER SELEKTIVE FOR N-TERMINAL-TRUNKEREDE AMYLOID-ß PROTOFIBRILLER/OLIGOMERER
JP5894939B2 (ja) 2010-02-26 2016-03-30 バイオアークティック ニューロサイエンス アーベー プロトフィブリル結合抗体ならびにパーキンソン病、レビー小体型認知症および他のα−シヌクレイノパチーの治療および診断方法におけるこれらの使用
KR101849738B1 (ko) * 2010-06-17 2018-04-17 트렐리스 바이오싸이언스 인코포레이티드 수동 인플루엔자 면역에 유용한 항체
EA034333B1 (ru) 2010-11-30 2020-01-29 Дженентек, Инк. Варианты антитела для переноса соединения через гематоэнцефалический барьер
WO2014033074A1 (en) * 2012-08-29 2014-03-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Blood brain barrier shuttle
DK3041507T3 (da) * 2013-08-26 2021-07-26 Biontech Res And Development Inc Nukleinsyrer, der koder for humane antistoffer mod sialyl-lewis a
US10562973B2 (en) * 2014-04-08 2020-02-18 Prothena Bioscience Limited Blood-brain barrier shuttles containing antibodies recognizing alpha-synuclein
KR102564384B1 (ko) * 2014-07-10 2023-08-07 바이오악틱 에이비 개선된 Aβ 프로토피브릴 결합 항체

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