ES2864049T3 - Anticuerpos selectivos para protofibrillas/oligómeros de amiloide-P truncado en el extremo N - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo, en donde el anticuerpo se obtiene contra la protofibrilla estabilizada que comprende el amiloide β (Aβ) Aβ3(pE)-42 truncado en el extremo N, y se selecciona de modo que (i) se une a la protofibrilla soluble que comprende Aβ3(pE)-42, (ii) se une al monómero de Aβ3(pE)-42, y (iii) no presenta unión o sustancialmente no se une al monómero de Aβ truncado en el extremo N, en donde: (a) el monómero de Aβ no truncado en el extremo N puede tener o no un truncamiento carboxiterminal; y (b) la protofibrilla estabilizada se estabiliza con una sustancia orgánica hidrófoba que comprende un detergente no iónico, un detergente dipolar, 4-hidroxi-2-nonenal (HNE) o 4-oxo-2-nonenal (ONE), y en donde la protofibrilla estabilizada tiene una velocidad de formación inferior para una forma agregada no soluble que una forma no estabilizada de la protofibrilla.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos selectivos para protofibrillas/oligómeros de amiloide-P truncado en el extremo N

Campo de la invención

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas y cualquier materia objeto que no esté dentro del alcance de las reivindicaciones es solo para información. La presente invención proporciona anticuerpos selectivos para protofibrillas/oligómeros de proteína amiloide p (Ap) truncada en el extremo N, que también se unen al monómero de Ap truncado en el extremo N pero que no presentan unión o no se unen sustancialmente a los monómeros de Ap no truncados en el extremo N. En una realización, los anticuerpos son de clase IgG, en particular, de la subclase IgGl o IgG4 o combinaciones de las mismas o mutaciones de las mismas y conservan una elevada unión al receptor de Fc y una unión disminuida a C1 (C1q). Los anticuerpos pueden ser eficaces en la eliminación de protofibrillas de Ap y tienen riesgo reducido de inflamación.

Antecedentes de la invención

La enfermedad de Alzheimer (EA) es un trastorno neurodegenerativo progresivo e irreversible que causa alteración cognitiva, de la memoria y del comportamiento. Es la causa más común de demencia en la población anciana que afecta aproximadamente al 5 % de la población mayor de 65 años y al 20 % mayor de 80 años. La EA se caracteriza por un inicio gradual y un deterioro progresivo de múltiples funciones cognitivas. La neuropatología implica depósitos proteínicos argirófilos tanto extracelulares como intracelulares. Los depósitos extracelulares, denominados placas neuríticas, consisten principalmente en proteína amiloide p (Ap) rodeada de axones distróficos (procesos neuronales distorsionados e hinchados). El Ap dentro de estos depósitos extracelulares es de carácter fibrilar con una estructura de hoja plegada en p. El Ap en estos depósitos se puede teñir con determinados tintes, por ejemplo, rojo Congo, y muestra una ultraestructura fibrilar. Estas características, adoptadas por el Ap en su estructura fibrilar en placas neuríticas, son la definición del término genérico amiloide. La lesión patológica intracelular clásica de la EA es el ovillo neurofibrilar (ONF), que consta de estructuras filamentosas llamadas filamentos helicoidales emparejados (FHE), compuesto por cadenas retorcidas de proteína T hiperfosforilada asociada a microtúbulos. Las placas neuríticas frecuentes y los depósitos de ovillos neurofibrilares en el cerebro son criterios de diagnóstico de la EA, como se cumple en la autopsia. Los cerebros con EA también muestran atrofia cerebral macroscópica, pérdida de células nerviosas, inflamación local (microgliosis y astrocitosis) y, a menudo, angiopatía amiloide cerebral (AAC) en las paredes de los vasos cerebrales.

La patología cerebral indicativa de la EA, por ejemplo, placas amiloides y ovillos neurofibrilares, se ve en varios otros trastornos. Después de los 30 años, casi todos los sujetos con síndrome de Down han desarrollado las características neuropatológicas representativas de la EA con deposiciones y ONF (Zigman 1996). Aproximadamente un 50 % de los casos de demencia con cuerpos de Lewy tienen una neuropatología coexistente indicativa de la EA. No está claro si la existencia de patologías paralelas implica dos enfermedades diferentes o simplemente representa una variante de cada trastorno respectivo. A veces, los casos con patologías conjuntas se describen como una variante de la EA con cuerpos de Lewy. (Hansen et al., 1990). La demencia mixta se refiere a una combinación de EA y encefalopatía vascular, pero la distinción entre ambos trastornos es controvertida. Para el diagnóstico de la demencia mixta se utilizan los criterios clínicos/de neuroimagen de la posible EA más la enfermedad cerebrovascular como entidades separadas, pero las relaciones causales entre las lesiones vasculares cerebrales y la demencia no están claras. En una serie de autopsias consecutivas de 1500 ancianos con demencia, 830 de los cuales con EA clínicamente probable, en Viena, Austria, del 41,5 al 52,0 % mostró EA "pura", el 7 % EA atípica, el 16-20 % EA más lesiones cerebrovasculares y el 9 % EA más patología con cuerpos de Lewy. Esto indica la existencia conjunta frecuente de EA con múltiples lesiones cerebrovasculares en pacientes con alteración cognitiva. (Jellinger 2007). El documento US7122374 divulga un anticuerpo que reacciona con ApN3pE-42.

El glaucoma y la degeneración macular relacionada con la edad son las principales causas de ceguera en todo el mundo. Cada vez hay más pruebas que apoyan mecanismos patológicos similares que implican al Ap y que conducen a la pérdida de la visión implicada en el cerebro con EA. En la degeneración macular relacionada con la edad, drusas numerosas y/o confluentes se asocian de manera clínica con la atrofia geográfica del epitelio pigmentado de la retina. El Ap se deposita en estas drusas en los ojos de donantes humanos. (Johnson 2002). Se ha demostrado que un anticuerpo monoclonal dirigido a un epítopo lineal en el extremo C tiene un potencial terapéutico en un modelo de ratón de degeneración macular relacionada con la edad. (Ding 2008). Se ha informado que el Ap está implicado en la apoptosis de las células ganglionares de la retina en el glaucoma experimental. (Guo 2007). En este modelo animal, la apoptosis inducida de las células ganglionares de la retina se puede rescatar mediante el tratamiento con anticuerpos con epítopos lineales disponibles comercialmente.

La miositis por cuerpos de inclusión es la enfermedad muscular adquirida más común en ancianos. Normalmente, las características distintivas de la EA se encuentran en biopsias musculares de pacientes con esta enfermedad: la presencia de depósitos de Ap, inclusiones congofílicas y patología T (Needham 2008). En conclusión, los depósitos de Ap se pueden encontrar en trastornos neurodegenerativos y otros trastornos que afectan el ojo y los músculos y están implicados como un factor causante de enfermedades.

Dos formas de péptidos Ap, Ap40 y Ap42, son las especies dominantes en las placas neuríticas de la EA, mientras que Ap40 es la especie prominente en el amiloide cerebrovascular asociado con la EA. Las actividades enzimáticas permiten que el Ap se forme continuamente a partir de una proteína más grande denominada proteína precursora amiloide (PPA) tanto en sujetos sanos como afectados por la EA en todas las células del cuerpo. Dos eventos principales de procesamiento de la PPA a través de actividades de la secretasa p y y permiten la producción del Ap, mientras que una tercera enzima denominada secretasa a evita la generación del Ap mediante escisión dentro de la secuencia del Ap (Selkoe, 1994; Ester 2001; US5604102). El Ap42 es un péptido de cuarenta y dos aminoácidos de longitud, es decir, dos aminoácidos más largos en el extremo C, en comparación con Ap40. Ap42 es más hidrófobo y se agrega más fácilmente en estructuras más grandes de péptidos Ap (Jarret 1993) tales como dímeros de Ap, trímeros de Ap, tetrámeros de Ap, oligómeros de Ap superiores tales como protofibrillas de Ap o fibrillas de Ap. Las fibrillas de Ap son hidrófobas e insolubles, mientras que las otras estructuras son todas menos hidrófobas y solubles. Todas estas estructuras moleculares superiores de péptidos Ap se definen individualmente en función de su aspecto biofísico y estructural, por ejemplo, en microscopía electrónica, y sus características bioquímicas, por ejemplo, mediante análisis con cromatografía de exclusión por tamaño/transferencia Western. Estos péptidos Ap, particularmente los Ap42, se ensamblarán gradualmente en varias estructuras moleculares superiores de Ap durante la vida. La EA, que es un trastorno fuertemente dependiente de la edad, ocurrirá antes en la vida si este proceso de ensamblaje ocurre más rápidamente. Este es la esencia de la "hipótesis de la cascada amiloide" de la EA, que afirma que el procesamiento de la PPA, los niveles de Ap42 y su ensamblaje en estructuras moleculares superiores es la causa principal de la EA. Todas las demás neuropatologías del cerebro con EA y los síntomas de la eA, tal como la demencia, son causados de alguna manera por el Ap o formas ensambladas del mismo.

El Ap puede existir en diferentes longitudes, por ejemplo, 1-38, 1-39, 1-40, 1-41, 1-42 y 1-43 y fragmentos de los mismos en varios tamaños, por ejemplo, 1-28 y 25-35. También pueden producirse truncamientos en el extremo N del péptido. El Ap monomérico truncado en el extremo N se ha caracterizado a partir del Ap insoluble extraído en ácido fórmico puro de tejido cerebral con EA (Sargento 2003) y el LCR. Pueden existir en diferentes longitudes. Algunas formas también se pueden oxidar en Met35. Algunos de estos fragmentos se pueden metilar en el extremo N o formar un resto de piroglutamilo en el extremo N mediante glutaminil ciclasa (QC). La enzima QC actúa sobre la glutamina y el glutamato aminoterminal provocando una modificación del piroglutamato (pE) en el extremo N. Uno de dichos fragmentos de Ap modificado con piroglutamato es el Ap3(pE)-42 que también se ha demostrado que tiene una localización intracelular. También se ha demostrado que la forma Ap3(pE)-42 tiene una elevada estabilidad y propensión a la agregación. Todos estos péptidos pueden agregarse y formar intermedios solubles y fibrillas insolubles, teniendo cada forma molecular una conformación estructural y una propiedad biofísica únicas. El Ap1-42 monomérico, por ejemplo, es un péptido soluble y no tóxico de 42 aminoácidos de longitud, que se sugiere que está implicado en las funciones normales de sinapsis. En determinadas condiciones, el Ap1-42 puede agregarse en dímeros, trímeros, tetrámeros, pentámeros y formas oligoméricas superiores, todas con distintas propiedades fisicoquímicas tales como el tamaño molecular, la estructura de ME y la forma molecular de MFA (microscopía de fuerza atómica). Un ejemplo de una forma de Ap oligomérica soluble de mayor peso molecular es la protofibrilla (Walsh 1997) , que generalmente tiene un peso molecular aparente >100 kDa y una estructura lineal de curva de 4-11 nm de diámetro y <200 nm de longitud. Se ha demostrado que el Ap oligomérico soluble, tal como las protofibrillas de Ap, afecta a la potenciación a largo plazo (PLP), una medida de plasticidad sináptica que se cree que refleja la formación de la memoria en el hipocampo (Walsh 2002). Asimismo, los péptidos Ap oligoméricos árticos, que son formas mutadas que (véase más abajo) muestran un efecto inhibidor mucho más profundo que el Ap de tipo silvestre (Apts <9 en PLP en el cerebro, probablemente debido a su fuerte propensión a formar protofibrillas de Ap (Klyubin 2003)).

También hay otras formas oligoméricas solubles descritas en la bibliografía que son claramente diferentes de las protofibrillas. Una de dichas formas oligoméricas es el ADDL (ligando difusible procedente de amiloide) (Lambert 1998) . El análisis de MFA del ADDL reveló especies globulares predominantemente pequeñas de 4,7-6,2 nm a lo largo del eje z con pesos moleculares de 17-42 kDa (Stine 1996). Otra forma se denomina ASPD (amiloides esferoides) (Hoshi 2003). Los ASPD son oligómeros esféricos de Ap1-40. Los estudios de toxicidad mostraron que los ASPD esféricos >10 nm eran más tóxicos que las formas moleculares inferiores (Hoshi 2003). Esta idea se ha ganado el apoyo del descubrimiento de la mutación ártica de la PPA (E693), que causa la EA de inicio temprano (Documento US 2002/0162129 A1; Nilsberth et al., 2001). La mutación se ubica dentro de la secuencia del péptido Ap. Los portadores de mutaciones generarán así variantes de péptidos Ap, por ejemplo, Ap40 ártico y Ap42 ártico. T anto Ap40 ártico como Ap42 ártico se ensamblarán mucho más fácilmente en estructuras moleculares superiores, es decir, protofibrillas.

En el cerebro con la enfermedad de Alzheimer (EA), las placas amiloides extracelulares se encuentran normalmente en el parénquima y las paredes de los vasos. Las placas se componen de péptidos de amiloide Ap de 38-43 aminoácidos de longitud, hidrófobos y autoagregantes, que se polimerizan gradualmente antes de la deposición de la placa. Se ha propuesto que las especies de Ap oligoméricas solubles se correlacionan mejor con la enfermedad que las propias placas amiloides. (McLean y col., 1999; Naslund et al., 2000). Entre estas especies de Ap intermedias prefibrilares, se ha demostrado que las formas oligoméricas provocan efectos biológicos adversos tanto in vitro como in vivo (Walsh et al., 2002) y, por lo tanto, pueden desempeñar un papel principal en la patogenia de la enfermedad. Se conocen varias especies de Ap oligoméricas de varios tamaños moleculares. De manera importante, la conformación de las formas monomérica, oligomérica y fibrilar del Ap son diferentes y pueden ser dirigidas mediante anticuerpos selectivos conformacionales. La identidad del principal patógeno del Ap no está clara, aunque alguna evidencia sugiere que los oligómeros de Ap de elevado peso molecular son especialmente neurotóxicos (Hoshi et al., 2003).

Se han descrito mutaciones patógenas en el gen proteína precursora amiloide (PPA), que causan la aparición temprana de la EA. Una de ellas, la mutación PPA sueca (Mullan et al., 1992), provoca un aumento de los niveles de Ap. La mutación PPA ártica (E693G) ubicada dentro del dominio Ap, se encontró que mejora la formación de protofibrillas, grandes oligómeros de Ap, sugiriendo que estos intermedios de Ap son particularmente patógenos (Documento US 2002/0162129 A1; Nilsberth et al., 2001). La identificación de la mutación PPA ártica y la aclaración de los efectos tóxicos de las protofibrillas de Ap han aumentado el enfoque en los oligómeros de Ap en la patogenia de la EA.

La inmunización activa como estrategia terapéutica para la enfermedad de Alzheimer fue informada por primera vez por Schenk y col. (1999). La diana de la estrategia de inmunización fue la forma fibrilar de Ap que se encuentra en las placas de Alzheimer. Un ensayo clínico de fase I/II de vacunación activa contra Ap utilizando Ap fibrilado como vacuna (AN-1792) tuvo que interrumpirse debido al desarrollo de meningoencefalitis en un pequeño número de pacientes (Bayer et al., 2005). Los efectos secundarios observados en este estudio probablemente se produjeron por anticuerpos anti-Ap que reaccionan contra el amiloide fibrilar en las paredes de los vasos. El amiloide fibrilar en una AAC está muy cerca de la barrera hematoencefálica (BHE) y, por lo tanto, la reacción antígeno-anticuerpo podría generar daño a la BHE que lleva a la infiltración de linfocitos T en el SNC. (Pfeifer et al., 2002; Racke et al., 2005). Por otra parte, solo una minoría de los pacientes participantes mostró una respuesta inmunitaria a la vacuna contra el Ap. Aunque el estudio terminó de manera prematura, parece implicar que la inmunización activa contra Ap puede ser beneficiosa sólo para un subconjunto de pacientes con EA.

Se han descrito anticuerpos monoclonales selectivos para protofibrillas de Ap humanas (Documento WO2005/123775). El método para generar protofibrillas de Ap humanas altamente puras y estables implica la utilización de péptidos Ap42 sintéticos con la mutación ártica (Glu22Gly). La mutación facilita la inmunización y la detección de hibridomas, para anticuerpos selectivos de protofibrillas de Ap. De manera importante, estos anticuerpos se unen tanto a las protofibrillas de Ap de tipo silvestre como a las protofibrillas de Ap-Ar.

Se ha descrito anticuerpos que son selectivos hacia otras conformaciones de Ap tales como las fibrillas de Ap (O 'Nuallain 2002), Ap micelar (Kayed 2003), ADDL (Lambert 2001). Sin embargo, ninguno de ellos es selectivo para las protofibrillas de Ap.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un anticuerpo, en donde el anticuerpo se produce a partir de protofibrillas estabilizadas que comprenden el amiloide p (Ap) Ap3(pE)-42 truncado en el extremo N, y se selecciona de modo que (i) se une a protofibrillas solubles que comprenden Ap3(pE)-42 truncado en el extremo N, (ii) se une al monómero de Ap3(pE)-42 truncado en el extremo N, y (iii) no presenta unión o sustancialmente ninguna unión con el monómero de Ap no truncado en el extremo N, en donde:

(a) el monómero de Ap no truncado en el extremo N puede tener o no un truncamiento carboxiterminal; y (b) la protofibrilla estabilizada se estabiliza con una sustancia orgánica hidrófoba que comprende un detergente no iónico, un detergente dipolar, 4-hidroxi-2-nonenal (HNE) o 4-oxo-2-nonenal (ONE), y en donde la protofibrilla estabilizada tiene una velocidad de formación inferior para una forma agregada no soluble que una forma no estabilizada de la protofibrilla.

La invención también proporciona un método para detectar protofibrillas que comprenden Ap3(pE)-42 truncado en el extremo N y para detectar el monómero de Ap3(pE)-42 truncado en el extremo N, que comprende añadir un anticuerpo de la invención a una muestra biológica que comprende o se sospecha que comprende la protofibrilla y/o el monómero, y medir una concentración de un complejo formado entre el anticuerpo y la protofibrilla y un complejo formado entre el anticuerpo y el monómero.

En el presente documento también se divulga una vacuna que comprende protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N para tratar y/o diagnosticar la enfermedad de Alzheimer y trastornos relacionados con el Alzheimer.

La vacuna divulgada en el presente documento, para retrasar la aparición de la enfermedad de Alzheimer o para su tratamiento o de un trastorno relacionado con el Alzheimer, comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una protofibrilla/oligómero fisiológicamente aceptable que comprende el Ap truncado en el extremo N. La protofibrilla/oligómero puede comprender una combinación de péptido(s) Ap de longitud completa y péptido(s) Ap truncado en el extremo N en diversas proporciones. En particular, la vacuna puede comprender una cantidad terapéuticamente eficaz de una protofibrilla/oligómero truncado en el extremo N estabilizado fisiológicamente aceptable que tiene una velocidad de formación inferior para una forma agregada no soluble que una forma no estabilizada de la protofibrilla/oligómero truncado en el extremo N.

Otro aspecto de la divulgación es un método para retrasar la aparición de la enfermedad de Alzheimer o para su tratamiento o de un trastorno relacionado con el Alzheimer en un individuo, que comprende administrar al individuo una vacuna según se describe en el presente documento. La vacuna descrita en el presente documento se puede utilizar para producir anticuerpos contra protofibrillas/oligómeros que comprenden Ap truncado en el extremo N, es decir, anticuerpos mejorados con unión más eficaz a las protofibrillas/oligómeros formados in vivo.

El anticuerpo de la invención puede administrarse a un individuo con el fin de retrasar el inicio o para tratar la enfermedad de Alzheimer o un trastorno relacionado con el Alzheimer en un individuo.

En el presente documento también se divulga un método para producir un anticuerpo para retrasar la aparición de la enfermedad de Alzheimer o para su tratamiento o de un trastorno relacionado con el Alzheimer en un individuo, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo se une a una o más protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N, pero no presenta o sustancialmente no presenta ninguna reactividad cruzada con los monómeros de Ap de longitud completa. El método comprende administrar un antígeno a un animal no humano y recoger los anticuerpos formados contra el antígeno, comprendiendo el antígeno protofibrillas/oligómeros truncados en el extremo N estabilizados o protofibrillas/oligómeros truncados en el extremo N estabilizados que tienen una velocidad de formación inferior para una forma agregada no soluble que las protofibrillas/oligómeros truncados en el extremo N, que son especies de Ap solubles.

En el presente documento también se divulgan composiciones de anticuerpos y composiciones de vacunas, que comprenden un anticuerpo o una vacuna, respectivamente, como se describe anteriormente y uno o más excipientes, por ejemplo, seleccionados del grupo que consiste en sustancias antibacterianas, adyuvantes, tampones, sales, reguladores de pH, detergentes y cualquier combinación de los mismos, que sean farmacéuticamente aceptables para uso humano y/o veterinario.

En el presente documento también se divulga un método para detectar Ap3(pE)-42 truncado en el extremo N in vivo. El método comprende administrar a un individuo sospechoso de portar protofibrillas/oligómeros truncados en el extremo N, un anticuerpo de acuerdo con la invención, estando marcados los anticuerpos con un marcador detectable; y detectar la presencia de cualquier complejo formado entre el anticuerpo y el compuesto Ap3(pE)-42 truncado en el extremo N soluble mediante la detección del anticuerpo marcado.

Las vacunas, los anticuerpos y los métodos divulgados en el presente documento son ventajosos para las técnicas de diagnóstico y terapéuticas dirigidas a la enfermedad de Alzheimer y los trastornos relacionados con el Alzheimer. En la descripción detallada se exponen realizaciones y aspectos adicionales de la invención, y las ventajas adicionales de la invención serán evidentes a partir de la misma.

Breve descripción del dibujo

La presente invención se ilustra adicionalmente con referencia a la figura 1 que muestra la separación de los monómeros de Ap3(pE)-42 de las protofibrillas de Ap3(pE)-42 mediante SEC-HPLC.

Descripción detallada

La presente invención proporciona anticuerpos producidos a partir de protofibrillas estabilizadas que comprenden Ap3(pE)-42 truncado en el extremo N, que se seleccionan de modo que (i) se unen a protofibrillas solubles que comprenden Ap3(pE)-42 truncado en el extremo N, (ii) se unen al monómero de Ap3(pE)-42 truncado en el extremo N, y (iii) no presentan o sustancialmente no presentan ninguna unión con el monómero de Ap no truncado en el extremo N, en donde:

(a) el monómero de Ap no truncado en el extremo N puede tener o no un truncamiento carboxiterminal; y (b) la protofibrilla estabilizada se estabiliza con una sustancia orgánica hidrófoba que comprende un detergente no iónico, un detergente dipolar, 4-hidroxi-2-nonenal (HNE) o 4-oxo-2-nonenal (ONE), y en donde la protofibrilla estabilizada tiene una velocidad de formación inferior para una forma agregada no soluble que una forma no estabilizada de la protofibrilla.

Los anticuerpos de acuerdo con la invención se pueden utilizar en varios métodos para diagnosticar y combatir, incluyendo retrasar la aparición de, el tratamiento y/o la prevención de, la enfermedad de Alzheimer y trastornos relacionados con el Alzheimer.

Los anticuerpos se pueden utilizar para retrasar la aparición de, el tratamiento y/o la prevención de la enfermedad de Alzheimer y los trastornos relacionados con la enfermedad de Alzheimer (trastornos relacionados con el Alzheimer), que incluyen, sin limitación, síndrome de Down, amiloidosis cerebrovascular, demencia mixta, glaucoma, degeneración macular relacionada con la edad y/o miositis por cuerpos de inclusión. Estos trastornos también pueden aparecer en combinación con otros trastornos neurodegenerativos, por ejemplo, enfermedades relacionadas con la sinucleína a.

Los anticuerpos también se pueden utilizar en métodos de detección con, entre otros, fines de diagnóstico, seguimiento o terapia.

La patología principal de la enfermedad de Alzheimer son las formas tóxicas extracelulares de las formas oligoméricas solubles del péptido Ap, en particular, las formas de mayor peso molecular de las formas oligoméricas de Ap, denominadas protofibrillas. Dentro de la presente divulgación, los términos "oligómero/protofibrilla" y "protofibrilla/oligómero" se utilizan indistintamente para referirse a oligómeros de mayor peso molecular, incluyendo protofibrillas. La invención está dirigida a un anticuerpo que se une a protofibrillas/oligómeros que comprenden Ap3(pE)-42 truncados en el extremo N. En el presente documento también se divulga una vacuna que comprende protofibrillas/oligómeros que comprenden Ap truncados en el extremo N.

Ejemplos de péptidos Ap truncados en el extremo N son los de fórmula Apx-y, en donde x es 2, 3, 3(pE), 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 11(pE) o 12 e y es 38, 39, 40, 41, 42 o 43, en cualquier combinación. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, Ap2-40, Ap3-40, Ap3(pE)-40, Ap 4-40, Ap5-40, Ap6-40, Ap7-40, Ap8-40, Ap9-40, Ap10P-40, Ap11-40, Ap11(pE)-40, Ap 12-40, Ap2-42, Ap3-42, Ap3(pE)-42, Ap 4-42, Ap5-42, Ap6-42, Ap 7-42, Ap 8-42, Ap9-42, Ap10-42, Ap 11-42, Ap11(pE)-42 y Ap12-42.

En Ap3(pE)-40/42 y. Ap11(pE)-40/42, el péptido ha perdido dos o 10 aminoácidos, respectivamente, en su extremo N y el aminoácido aminoterminal glutamato se ha ciclado a un derivado piroglutamílico del glutamato.

En la actualidad, Ap2-42, Ap3(pE)-42, Ap4-42 y/o Ap11 (pE)-42 parecen ser de especial importancia y se cree que los anticuerpos que se unen a protofibrillas/oligómeros que comprenden uno o más de estos en diversas combinaciones cumplen un papel terapéutico importante.

En una realización, el anticuerpo de la invención se une a protofibrillas/oligómeros que comprenden péptidos Ap3(pE)-42 truncados en el extremo N pero sin péptidos Ap de longitud completa, es decir, péptidos Ap no truncados en el extremo N. Dentro de la presente memoria descriptiva, las expresiones "péptidos Ap de longitud completa" y "péptidos Ap no truncados en el extremo N" se usan indistintamente y se refieren a péptidos Ap que no tienen truncamiento en el extremo N pero pueden tener o no truncamiento en el extremo C.

El anticuerpo de la invención también puede unirse a protofibrillas/oligómeros de Ap que contienen tanto Ap3(pE)-42 truncados en el extremo N como formas de Ap no truncadas en el extremo N. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, en la actualidad se cree que dichas protofibrillas/oligómeros de Ap proporcionan una buena estimación de una situación clínica.

La protofibrilla/oligómero descrito en el presente documento puede comprender >50 % de péptido(s) Ap truncado(s) en el extremo N, tal como >60 %, >70 %, >80 %, >90 %, o >95 % o 100 % de cualquiera de los péptidos truncados en el extremo N divulgados anteriormente, solos, o como una combinación de dos o más formas truncadas en el extremo N. Los péptidos de longitud completa en dicha construcción de protofibrillas pueden ser Ap1-38, Ap1-39, Ap1-40, Ap1-41, Ap1-42 o Ap1-43 o cualquier combinación de estos. En la actualidad, se cree que Ap1-40 y, en particular, Ap1-42 son los componentes más importantes de dicha construcción.

Un anticuerpo de la invención se caracteriza por que presenta elevada afinidad y unión a protofibrillas/oligómeros que comprenden Ap3(pE)-42 truncados en el extremo N. Esta funcionalidad proporciona importantes ventajas en comparación con los anticuerpos conocidos producidos contra varias especies en el sistema Ap. Por consiguiente, un anticuerpo de acuerdo con un aspecto de la invención tiene un valor de CI50 <25 nM, tal como <15 nM, <10 nM o incluso <5 nM para una protofibrilla/oligómero que comprende al menos un 80 % de Ap3(pE)-42. Un método para la determinación de los valores de CI50 se describe en Englund H. et al. en J. of Neurochemistry, 2007, 103, 334-345. La concentración de antígeno (protofibrillas/oligómeros o monómero de Ap) requerida para inhibir la mitad de la señal máxima en el ELISA de inhibición se define como el valor CI50 y se puede utilizar como una estimación de la afinidad del anticuerpo por el antígeno. La concentración de protofibrillas/oligómeros se expresa como molaridad de la subunidad monomérica (~ 4kD).

De acuerdo con una realización de la invención, el anticuerpo se une a protofibrillas/oligómeros que comprenden el 80 % de Ap3(pE)-42 y el 20 % de Ap1-42.

En una realización de la invención, el anticuerpo presenta un valor de CI50 <50 nM para una protofibrilla/oligómero que comprende el 90 % de Ap3(pE)-42 y, en particular, un valor de CI50 <100 nM, tal como <50 nM, <25 nM, <10 nM, o incluso <5 nM para una protofibrilla/oligómero que comprende el 100 % de Ap3(pE)-42.

El anticuerpo de la invención también se une a monómeros de Ap3(pE)-42 truncados en el extremo N. Una característica adicional de un anticuerpo de acuerdo con la invención es que no presenta o sustancialmente no presenta unión a monómeros de Ap no truncados en el extremo N, lo que significa que no hay unión detectable a concentraciones inferiores a 1 nM según lo medido por ELISA estándar.

Incluso en otra realización de la invención, el anticuerpo se une a protofibriNas/oligómeros de Ap3(pE)-42 truncados en el extremo N que comprenden la mutación ártica (E22G).

Incluso en otra realización de la invención, el anticuerpo se une a protofibrillas/oligómeros de Ap3(pE)-42 truncados en el extremo N que comprenden la mutación holandesa (E22Q) o la mutación italiana (E22K) o la mutación de lowa (D23N) o la mutación flamenca (A21G), o combinaciones de dos o más de estas mutaciones.

Incluso en otra realización de la invención, el anticuerpo se une a protofibrillas/oligómeros de Ap3(pE)-42 truncados en el extremo N que comprenden cualquier combinación de dos o más de las mutaciones ártica, holandesa, italiana, de lowa y flamenca.

Reducir los niveles de estas protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N representa un desafío para el enfoque inmunoterápico. Sin embargo, es probable que una fracción de los anticuerpos inducidos activamente o administrados pasivamente puedan unirse a su diana y reducirla mediante un proceso fagocitósico microglial en el cerebro.

En el presente documento también se divulgan métodos para la producción de protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N estabilizados que facilitan de manera considerable el diseño y desarrollo de anticuerpos de acuerdo con la invención. El peso molecular de los monómeros de Ap humanos es de aproximadamente 4 kDa. Dos o más monómeros de Ap pueden agregarse y formar protofibrillas/oligómeros truncados en el extremo N solubles con una amplia gama de pesos moleculares. Un oligómero dominante se denomina generalmente protofibrilla. Sin embargo, estas protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N son inestables y polimerizan de manera espontánea a fibrillas insolubles. En el presente documento se divulgan métodos para estabilizar protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N y aislar las protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N estabilizados, preferentemente en forma altamente purificada, para el desarrollo de anticuerpos y vacunas. Las protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N estabilizados producidos de acuerdo con los métodos divulgados en el presente documento presentan una velocidad de formación inferior a una forma agregada no soluble, es decir, fibrillas, que las protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N no estabilizados. Estas formas son de particular interés ya que presentan una elevada toxicidad.

Además, las formas de Ap truncadas en el extremo N se pueden preparar mediante tecnología recombinante o síntesis de péptidos en fase sólida. Asimismo, las protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N pueden proceder directamente de extractos de cerebro de tejido cerebral humano autopsiado post-mortem de casos con enfermedad de Alzheimer. Las preparaciones de protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N producidas a partir de péptidos truncados en el extremo N se purifican en diferentes tampones fisiológicos. Estas preparaciones de muestra se inyectan como tales en ratones o se fraccionan mediante métodos cromatográficos antes de inyectarse en ratones para el desarrollo de anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos generados pueden utilizarse después de la humanización para tratar pacientes en un programa de vacunación pasivo o en inmunoensayos de diagnóstico como se describe con más detalle en el presente documento.

Asimismo, las protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N, para ser utilizados para la inmunización de ratones y el desarrollo de anticuerpos monoclonales, también pueden aislarse de tejidos o líquidos biológicos tales como sangre, líquido cefalorraquídeo, orina o saliva de individuos sanos o pacientes con enfermedad de Alzheimer y/o un trastorno relacionado con el Alzheimer. La estabilización de protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N, puede lograrse de varias maneras, tal como, por ejemplo, modificación estructural. La modificación estructural se puede lograr mediante la unión a un estabilizante. La unión puede estar en forma de reticulación. El estabilizante puede ser en particular una sustancia orgánica hidrófoba. La sustancia orgánica hidrófoba puede comprender un ácido graso saturado, insaturado o polinsaturado, o un derivado del mismo, o cualquier combinación de los mismos, por ejemplo, una combinación de dos cualquiera o más de los mismos. La sustancia orgánica hidrófoba puede comprender de manera alternativa un aldehído reactivo. El aldehído puede, por ejemplo, ser un alkenal, tal como un aldehído a,p-insaturado. Los aldehídos reactivos adecuados incluyen, pero sin limitación, 4-hidroxi-2-nonenal (HNE), 4-oxo-2-nonenal (ONE), malondialdehído y acroleína. El aldehído también puede ser un dialdehído que tiene una cadena de carbono mono o polinsaturada de 2 a 25 átomos de carbono que conecta los grupos aldehído. La sustancia orgánica hidrófoba estabiliza la conformación de protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N, de manera que se evite una mayor agregación a la conformación de fibrillas no solubles.

Las protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N se pueden modificar de manera alternativa mediante detergentes hidrófobos tales como, pero sin limitación, detergentes no iónicos y dipolares. Ejemplos de dichos detergentes incluyen, pero sin limitación, detergentes no iónicos tales como Triton X-100 (polietilenglicol p-(1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenileter), Tween-20 (monolaurato de polioxietilen(20)sorbitano), Tween-80 (monooleato de polioxietileno(20)sorbitán) y detergentes Brij (éteres de polioxietileno de alcoholes grasos) y detergentes dipolares tales como CHAPS (3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato).

Otros estabilizantes adecuados incluyen derivados de ácidos biliares, ejemplos de los cuales incluyen, pero sin limitación, colato, desoxicolato y taurocolato, y cualquier combinación de los mismos.

El estabilizador también se puede seleccionar del grupo de moléculas biológicas naturales, ejemplos de las cuales incluyen, pero sin limitación, triglicéridos, fosfolípidos, esfingolípidos, gangliósidos, colesterol, ésteres de colesterol, alcoholes de cadena larga (por ejemplo, que contienen aproximadamente de 6 a 30 átomos de carbono) y cualquier combinación de las moléculas anteriores.

La estabilización también se puede lograr utilizando reticulantes de proteínas tales como, pero sin limitación, tartrato de disuccinimidilo, suberimidato de bis-sulfosuccinimidilo, propionato de 3,3-ditiobis-sulfosuccinimidilo y cualquier combinación de los mismos.

Las protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N estabilizados pueden comprender de manera alternativa 1-alfa-hidroxi-secosterol como estabilizante.

El anticuerpo de acuerdo con la invención se produce a partir de protofibrillas estabilizadas con una sustancia orgánica hidrófoba que comprende un detergente no iónico, un detergente dipolar, 4-hidroxi-2-nonenal (HNE) o 4-oxo-2-nonenal (ONE).

Los estabilizantes pueden estar unidos a, incluyendo mediante reticulación, monómeros y/o protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N, o una combinación de los mismos, para formar las protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N estabilizados. Por ejemplo, el aldehido reactivo a base de ácidos grasos no saturados, tales como HNE y ONE, puede unirse a los oligómeros por medio del grupo aldehido o un doble enlace, o ambos. Esto último da lugar a la reticulación de los oligómeros. HNE, por ejemplo, puede unirse de manera covalente a histidinas y lisinas de los oligómeros. De manera similar, ONE puede unirse de manera covalente a histidinas y lisinas. Los aldehidos pueden unirse a lisina a través de una base de Shiff, o una histidina puede unirse a través de un ataque nucleófilo en el átomo de carbono de un doble enlace en una cadena de carbono insaturado. La estequiometría entre el estabilizante, por ejemplo, un aldehído reactivo, tal como HNE y ONE, y el péptido Ap truncado en el extremo N se puede variar dentro de un amplio intervalo de 2:1 a 50:1 o más. Valores de modificación de HNE por encima de 20:1, por ejemplo, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1 e incluso más, puede proporcionar un producto con una formación de protofibrillas deseablemente elevada. Además, con ONE, se puede usar una proporción aún inferior, por ejemplo, de 5:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1,40:1, 45:1, 50:1 e incluso superior.

Si no se indica de otra manera, todos los estabilizantes mencionados anteriormente imparten su efecto estabilizador mediante la unión al Ap truncado en el extremo N y la reacción estabilizadora puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante incubación, como se ilustra en los ejemplos. Los estabilizantes también se pueden utilizar en combinaciones de dos o más según se desee.

Las protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N estabilizados pueden incluir una o más de las siguientes proteínas: a-sinucleína, proteína T o fosfo-T, en cualquier combinación. Estas mezclas son ventajosas porque los componentes adicionales se encuentran en pacientes con demencia, por ejemplo, pero sin limitación, enfermedad de Alzheimer, pero también la variante de la enfermedad de Alzheimer con cuerpos de Lewy y, por lo tanto, proporcionará neoepítopos terapéuticamente importantes para el tratamiento con anticuerpos o vacunas de estos trastornos (Tsigelny et al. 2008). Otra ventaja es que los componentes adicionales aumentarán la estabilidad de las protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N.

En el presente documento se divulga una vacuna para retrasar la aparición de la enfermedad de Alzheimer o para su tratamiento y/o de trastornos relacionados con el Alzheimer. En la presente divulgación, el término vacuna se utiliza para referirse a una composición que está en una forma fisiológicamente aceptable para la administración humana o animal para inmunización activa. La vacuna comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N, por ejemplo, protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N aislados. El término aislado se refiere a las protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N que se han separado del medio de preparación, reactivos y similares, incluyendo péptidos Ap truncados en el extremo N solubles. Las protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N pueden ser protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N estabilizados como se explica anteriormente, habiendo sido separados de los medios de preparación, reactivos y similares, incluyendo péptidos Ap truncados en el extremo N solubles. La vacuna puede comprender de aproximadamente 10-500 microgramos/dosis de las protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N o protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N estabilizados. En particular, la vacuna puede comprender aproximadamente 50-250 microgramos/dosis de las protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N o protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N estabilizados.

La vacuna para la inmunización activa puede comprender uno o más excipientes como se emplean convencionalmente en la materia de las vacunas, ejemplos de los cuales incluyen, pero sin limitación, uno o más antibacterianos, adyuvantes, tampones, sales, reguladores de pH, detergentes, o una combinación de los mismos, siempre que los excipientes sean farmacéuticamente aceptables para uso humano y veterinario. La vacuna también puede liofilizarse, por ejemplo, junto con uno o más excipientes para aumentar la estabilidad de la vacuna durante y/o después de la liofilización. Ejemplos específicos de excipientes apropiados incluyen, pero sin limitación, manitol y/o trehalosa.

La invención está dirigida a anticuerpos que se unen a protofibrillas/oligómeros solubles que comprenden Ap3(pE)-42 truncados en el extremo N y monómeros de Ap3(pE)-42 truncados en el extremo N, pero que no presentan unión o sustancialmente no presentan ninguna unión con el monómero de Ap no truncado en el extremo N. Las protofibrillas/oligómeros de Ap3(pE)-42 truncados en el extremo N estabilizados con una sustancia orgánica hidrófoba que comprende un detergente no iónico, un detergente dipolar, 4-hidroxi-2-nonenal (HNE) o 4-oxo-2-nonenal (ONE), y que tienen una velocidad de formación inferior de una forma agregada no soluble que una forma no estabilizada de la protofibrilla, se utilizan como un antígeno para producir dichos anticuerpos, y se pueden utilizar para optimizar el desarrollo de anticuerpos específicos contra protofibrillas de Ap3(pE)-42 truncados en el extremo N tóxicas. En dichos métodos, el antígeno se administra a un animal no humano y se recogen los anticuerpos producidos contra dicho antígeno. Para maximizar el efecto terapéutico, los anticuerpos de acuerdo con la presente invención, obtenidos contra el antígeno de protofibrillas/oligómeros de Ap(pE)-42 truncados en el extremo N estabilizado, también presentan de manera ventajosa una elevada unión a formas naturales de protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N, y preferentemente, también a monómeros truncados en el extremo N presentes en el cuerpo, en particular, las formas de Ap solubles agregadas. Los anticuerpos no presentan o sustancialmente no presentan ninguna unión a monómeros de longitud completa, en particular, monómeros de Ap1-42 y/o la proteína precursora amiloide (PPA) y/u otros amiloides. Una forma de seleccionar dichos anticuerpos es hacerlo en etapas con un primer cribado de anticuerpos que se unen a la protofibrilla/oligómero de Ap3(pE)-42 truncado en el extremo N y entre estos seleccionar especies que cumplan las otras características requeridas, incluyendo no tener sustancialmente unión a monómeros de Ap de longitud completa, en particular, monómeros de Ap1-42, PPA y otros amiloides, y posteriormente, cribar entre estos anticuerpos en busca de anticuerpos que se unan bien a protofibrillas de Ap truncados en el extremo N humanas de tipo silvestre o una mezcla de protofibrillas que refleje una situación in vivo.

Una protofibrilla/oligómero, como se define en el presente documento, se puede utilizar para la fabricación de una composición farmacéutica para retrasar el inicio de la enfermedad de Alzheimer o para su tratamiento o de un trastorno relacionado con el Alzheimer.

Un anticuerpo, como se define en el presente documento, también se puede utilizar para la fabricación de una composición farmacéutica para retrasar el inicio de la enfermedad de Alzheimer o para su tratamiento o de un trastorno relacionado con el Alzheimer.

En el presente documento también se divulgan anticuerpos que se unen tanto a protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N como a protofibrillas/oligómeros de Ap que comprenden principalmente péptidos Ap no truncados en el extremo N. Dichos anticuerpos son ventajosos para reducir ambas formas de esas protofibrillas/oligómeros de Ap, así como protofibrillas que comprenden una mezcla de Ap de longitud completa y Ap truncado en el extremo N en el cerebro, mediante la utilización de un anticuerpo. Por consiguiente, la divulgación incluye un anticuerpo bifuncional que reconoce dos epítopos en el sistema Ap. Dicho anticuerpo bifuncional se puede utilizar para retrasar el inicio de la enfermedad de Alzheimer y/o para su tratamiento o de un trastorno relacionado con el Alzheimer.

Como alternativa, un anticuerpo específico para protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N y, opcionalmente, también para monómeros truncados en el extremo N, se puede utilizar en terapia en combinación con un anticuerpo que se une a protofibrillas/oligómeros de Ap no truncados en el extremo N (no truncados), logrando así una importante reducción terapéutica tanto de las protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N como de las protofibrillas/oligómeros de Ap (no truncados). En el presente documento se divulga un método para retrasar la aparición de la enfermedad de Alzheimer y/o su tratamiento o de enfermedades relacionadas con el Alzheimer mediante la administración de dicha combinación de anticuerpos. Dicha administración se puede realizar de manera simultánea utilizando una única preparación farmacéutica que contenga ambos anticuerpos o como dos composiciones, o con dos composiciones también mediante administración secuencial.

Los anticuerpos resultantes pueden ser anticuerpos monoclonales o policlonales, o fragmentos activos de los mismos que se unen a protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N antes de que el Ap se haya agregado a fibrillas de Ap y potencialmente también podría reducir la cantidad de fibrillas ya formadas. El antígeno de protofibrilllas de Ap truncados en el extremo N se puede utilizar en métodos tales como tecnología de hibridomas, presentación en fagos, presentación en ribosomas, presentación en células de mamífero y presentación en bacterias, para producir y/o desarrollar anticuerpos monoclonales o policlonales, o fragmentos activos de los mismos. Más específicamente, para la generación de anticuerpos monoclonales, se puede emplear una técnica convencional, tal como la técnica del hibridoma y/o la presentación en fagos, presentación en ribosomas, presentación en células de mamífero o presentación en bacterias. Dichos anticuerpos pueden producirse en roedores tales como ratón, hámster o rata. Una vez generados, los clones se aíslan y se seleccionan para determinar su respectiva especificidad de antígeno. Para la selección, se utilizan dos principios. En primer lugar, los anticuerpos se prueban contra monómeros de Ap truncados en el extremo N purificados, fibrillas y protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N. Estas diferentes formas conformacionales de Ap truncado en el extremo N se pueden preparar mediante la incubación del péptido Ap truncado en el extremo N o de las protofibrillas de Ap truncados en el extremo N estabilizadas, por ejemplo, modificadas con HNE y/o modificadas con ONE, y posteriormente fraccionadas mediante HPLC o utilizando un dispositivo de filtrado centrífugo. Las fibrillas de Ap truncados en el extremo N pueden aislarse mediante centrifugación de la mezcla de incubación (Ejemplo 1). La selección puede realizarse mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA, por sus siglas en inglés) o mediante métodos similares. En segundo lugar, los anticuerpos se evalúan en cortes de tejido de animales transgénicos y/o cortes de tejido de cerebro humano con Alzheimer patológico.

El anticuerpo de la invención reacciona con protofibrillas/oligómeros de Ap3(pE)-42 truncados en el extremo N humanos tanto estabilizados como no estabilizados, en forma mutada o de tipo silvestre pero sin unión o sustancialmente sin unión a formas monoméricas de Ap de longitud completa, en particular, Ap1-42, PPA o cualquier otro amiloide.

El anticuerpo de la invención puede ser humano, humanizado o modificado para reducir la antigenicidad en seres humanos de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la materia. La reducción de la antigenicidad puede realizarse, por ejemplo, mediante la modificación o eliminación de los epítopos de linfocitos T del anticuerpo. En una realización, el anticuerpo se selecciona de la clase IgG, o más preferentemente de la subclase IgG1 o IgG4 (anticuerpo humano).

En realizaciones adicionales, el anticuerpo también puede tener una actividad del complemento reducida y/o propiedades de unión al receptor de Fc alteradas. Esto puede, por ejemplo, lograrse mediante la mutación de la parte Fc del anticuerpo en la posición 297, 322 o 331 de la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada (humana), o los aminoácidos correspondientes en, por ejemplo, IgG de ratón. (Duncan y Winter, Nature 1988, 332: 738-470 y Idusogie et al., Journal of Immunology, 2000, 164: 4178-84). La actividad del complemento reducida también se puede lograr mediante la desglucosilación del anticuerpo de manera enzimática o mediante otros medios, de acuerdo con técnicas conocidas en la materia. Las propiedades de unión al receptor de Fc alteradas del anticuerpo se pueden lograr mediante la alteración de las estructuras de oligosacáridos unidas a la glucoproteína (Jeffries, Nature, 2009, 8: 226­ 234). El anticuerpo puede ser un fragmento Fab, por ejemplo seleccionado de F(ab), F(ab)2 y DiFacuerpo, o un anticuerpo monocatenario, por ejemplo seleccionado de scFv-Fc y scFab, por ejemplo, para mejorar la penetrancia de la barrera hematoencefálica y la captación de células neuronales. Por lo tanto, es evidente que el anticuerpo, como se utiliza en el presente documento, se refiere a una proteína de longitud completa producida por el antígeno o un fragmento activo de la misma.

El antígeno de protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N puede fraccionarse y aislarse mediante SEC-HPLC. Las fracciones se evalúan por su respectiva toxicidad en modelos de cultivo celular y las fracciones de antígeno con la toxicidad más fuerte se seleccionan como antígenos para la producción de anticuerpos o como antígenos para la inmunización activa. Las preparaciones de muestra también se pueden utilizar directamente para evaluar la toxicidad y las muestras que muestran la toxicidad más pronunciada se pueden utilizar de manera ventajosa como antígeno para la selección y/o producción de anticuerpos o como antígenos para inmunización activa.

Los anticuerpos de protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N se forman como respuesta a la administración de las protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N descritos en el presente documento, ya sea directamente al paciente (inmunización activa) o mediante inmunización a un roedor, por ejemplo un ratón o un conejo, para obtener anticuerpos monoclonales o policlonales contra el antígeno, que se aplican en un protocolo de inmunización pasiva para tratar trastornos neurodegenerativos tales como la enfermedad de Alzheimer y los trastornos relacionados con el Alzheimer. En el caso de la inmunización pasiva, los anticuerpos pueden humanizarse antes de administrarse al paciente.

Siguiendo un protocolo de inmunización activa, el antígeno de protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N seleccionado se administra para producir anticuerpos específicos de conformación dirigidos hacia especies de protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N con toxicidad pronunciada, en particular especies protofibrilares/oligoméricas. Siguiendo un protocolo de inmunización pasiva, los anticuerpos monoclonales o policlonales contra dichas especies de protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N ejercen su efecto tras inyecciones repetidas de los anticuerpos.

El anticuerpo que se une a protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N puede ser un anticuerpo humano procedente de glóbulos blancos de sujetos humanos de control o pacientes con enfermedad de Alzheimer. Los hibridomas se preparan a partir de los glóbulos blancos de acuerdo con técnicas establecidas y se seleccionan para aglutinantes de protofibrillas/monómeros de Ap truncados en el extremo N y protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N estabilizados. También se pueden obtener anticuerpos monoclonales humanos contra protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N mediante la selección de una biblioteca de anticuerpos humanos para la unión a protofibrillas/monómeros de Ap truncados en el extremo N. También se pueden aislar para su uso autoanticuerpos contra protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N presentes en sangre de sujetos humanos de control o pacientes con Alzheimer o una enfermedad relacionada con el Alzheimer. Dichos autoanticuerpos se pueden secuenciar y preparar mediante tecnología de ADN recombinante en, por ejemplo, células CHO para mejorar el rendimiento y la economía.

El anticuerpo, como se describe, se puede proporcionar en una composición, por ejemplo, adecuada para la administración. Dichas composiciones pueden comprender un anticuerpo como se describe en el presente documento y uno o más excipientes empleados de manera convencional en composiciones farmacéuticas. El anticuerpo se incluirá en una cantidad terapéuticamente eficaz. Las composiciones pueden comprender el anticuerpo en una cantidad de aproximadamente 0,1-5 mg/kg, o más específicamente, aproximadamente 0,5-2 mg/kg, del peso corporal del destinatario previsto.

Excipientes adecuados incluyen, pero sin limitación, uno o más antibacterianos, adyuvantes, tampones, sales, reguladores de pH, detergentes, o cualquier combinación de los mismos, siempre que dichos excipientes sean farmacéuticamente aceptables para uso humano y/o veterinario. La composición puede estar liofilizada, por ejemplo, junto con un excipiente para aumentar la estabilidad del anticuerpo durante y/o después de la liofilización. El manitol y/o la trehalosa son ejemplos no limitantes de excipientes adecuados para la liofilización.

Las vacunas y anticuerpos, como se describen en el presente documento, se pueden utilizar en uno o más métodos para prevenir, retrasar la aparición o tratar la enfermedad de Alzheimer o un trastorno relacionado con el Alzheimer en un individuo. Dichos métodos comprenden la administración de un anticuerpo o vacuna como se describe en el presente documento al individuo. El individuo es, por ejemplo, un sujeto sospechoso de haber adquirido o tener un mayor riesgo de adquirir la enfermedad de Alzheimer.

Se podría sospechar que un sujeto tiene dicho trastorno si muestra cualquiera de las siguientes características: síntomas tempranos de la enfermedad, resultados positivos de imágenes cerebrales y aumento de los niveles de proteína T o fosfo-T. Ejemplos de métodos de imágenes cerebrales incluyen, pero sin limitación, DaTscan (123I-loflupano) o tomografía por emisión de positrones (TEP) mediante la utilización de un anticuerpo monoclonal como se describe en el presente documento.

Mediante la identificación de los sujetos en riesgo o sospechosos de tener la enfermedad de Alzheimer o un trastorno relacionado con el Alzheimer, se previene el desarrollo adicional del trastorno o se retrasa el inicio o la progresión mediante los tratamientos inventivos descritos en el presente documento, por ejemplo, mediante la utilización de la inmunización activa o pasiva con las vacunas/antígenos o anticuerpos.

Los anticuerpos de la invención, como se describen en el presente documento, también se pueden utilizar en métodos de detección, un ejemplo específico de los cuales incluye inmunoensayos de diagnóstico en los que los anticuerpos se utilizan para detectar niveles alterados de protofibrillas/oligómeros de Ap3(pE)-42 truncados en el extremo N y/o especies de monómeros de Ap3(pE)-42 truncados en el extremo N in vitro e in vivo. Las formas dirigidas de protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N pueden servir como marcadores bioquímicos tempranos para la enfermedad de Alzheimer y trastornos relacionados con el Alzheimer, en particular los mencionados anteriormente.

Más específicamente, un método para detectar protofibrillas/oligómeros de Ap3(pE)-42 truncados en el extremo N solubles in vitro comprende añadir el anticuerpo de acuerdo con la invención a una muestra biológica que comprende o se sospecha que comprende protofibrillas/oligómeros de Ap3(pE)-42 truncados en el extremo N, y detectar y medir una concentración de cualquier complejo formado entre el anticuerpo y las protofibrillas/oligómeros de Ap3(pE)-42 truncados en el extremo N. La muestra biológica puede ser, por ejemplo, plasma, líquido cefalorraquídeo (LCR) o una biopsia de cerebro. En el presente documento también se divulga un método para detectar protofibrillas/oligómeros de Ap3(pE)-42 truncados en el extremo N in vivo, que comprende administrar un anticuerpo de acuerdo con la presente invención, estando dicho anticuerpo marcado con un marcador detectable, a un individuo sospechoso de portar protofibrillas/oligómeros de Ap3(pE)-42 truncados en el extremo N perjudiciales para la salud en el cerebro, y detectar la presencia de cualquier complejo formado entre el anticuerpo y las protofibrillas/oligómeros de Ap3(pE)-42 truncados en el extremo N mediante detección del marcador.

Para el marcaje de los anticuerpos contra especies de Ap truncados en el extremo N, un experto en la materia tiene acceso a varias alternativas, dependiendo de la elección del método de detección, por ejemplo, ligandos radiactivos tales como 131I, 14C, 3H o 58Ga, por mencionar sólo algunos. En particular, se cree que la TEP con un anticuerpo específico de oligómero radiomarcado es de gran importancia para el diagnóstico, seguimiento de la terapia y/o similares. Por consiguiente, la invención proporciona anticuerpos que se pueden marcar fácilmente por un experto en la materia, para usar en varios métodos de diagnóstico y seguimiento de la terapia.

De acuerdo con los métodos y técnicas descritos, los antígenos y anticuerpos descritos en el presente documento pueden evaluarse por su potencial terapéutico en modelos de cultivo celular y/o modelos animales transgénicos para la patología de Alzheimer.

Los anticuerpos contra Ap3(pE)-42 truncado en el extremo N de acuerdo con la invención también se utilizan en ensayos inmunobasados para la medición de niveles de Ap3(pE)-42 truncado en el extremo N en muestras de pacientes para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer. Los métodos de detección aplicados en el ensayo de diagnóstico se basan principalmente en inmunoensayos, tales como ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y/o transferencia Western. Se investiga una amplia gama de tejidos de pacientes con signos tempranos de la enfermedad de Alzheimer o individuos con un elevado riesgo de desarrollar estos trastornos para determinar sus niveles de protofibrilla/oligómero/monómero de Ap3(pE)-42 truncado en el extremo N, dichos tejidos incluyen, pero sin limitación, plasma, líquido cefalorraquídeo (LCR) y biopsias de cerebro.

Ejemplos

En los siguientes ejemplos se ilustran varios aspectos de la divulgación.

Ejemplo 1. Preparación de protofibrillas/oligómeros de Ap3(pE)-42 truncados.

Se disuelve Ap3(pE)-42 liofilizado en NaOH 10 mM hasta una concentración final de 100 pM. Se añade solución salina tamponada con fosfato pH 7,4 a una concentración final de péptido de 50 pM. La solución de péptido se incuba a temperatura ambiente o 37 °C durante 5-15 min. El tiempo de incubación para un rendimiento óptimo de protofibrillas se determina en un experimento cinético piloto a pequeña escala, antes de la configuración de un volumen de reacción mayor, ya que el proceso de agregación es muy diferente de un lote a otro y también de un vial a otro. Después de la incubación, la muestra se centrifuga a 16000 xg durante 5 minutos a 4 °C para eliminar el material fibrilar que luego se sedimenta. El sobrenadante contiene protofibrillas/oligómeros y diversas cantidades de monómeros de Ap3(pE)-42. Se inyectan cien pl del sobrenadante en una columna Superdex 75 equilibrada con PBS que contiene Tween-20 al 0,1-0,6 %. La separación de protofibrillas de monómeros se realiza a un caudal de 80 pl/min. La absorbencia de UV se controla mediante la longitud de onda de 214 y 280 nm. El máximo de vacío eluyendo a los 12-13 minutos, contiene protofibrilla/oligómero de Ap3(pE)-42 (véase la figura 1). Se aíslan protofibrillas/oligómeros de Ap3(pE)-42 altamente puros para el desarrollo de vacunas y/o monoclonales mediante la recogida de fracciones que eluyen a los 12­ 13 minutos.

Ejemplo 2. Preparación de protofibrillas/oligómeros de AP3-42 truncados.

Se disuelve Ap3-42 liofilizado en NaOH 10 mM hasta una concentración final de 100 pM. Se añade solución salina tamponada con fosfato pH 7,4 a una concentración final de péptido de 50 pM. La solución de péptido se incuba a temperatura ambiente o 37 °C durante 5-15 min. El tiempo de incubación para un rendimiento óptimo de protofibrillas se determina en un experimento cinético piloto a pequeña escala, antes de la configuración de un volumen de reacción mayor, ya que el proceso de agregación es muy diferente de un lote a otro y también de un vial a otro. Después de la incubación a 37 °C, la muestra se centrifuga a 16000 xg durante 5 minutos a 4 °C para eliminar el material fibrilar que luego se sedimenta. El sobrenadante contiene protofibrillas/oligómeros y diversas cantidades de monómeros Ap3-42. Se inyectan cien pl del sobrenadante en una columna Superdex 75 equilibrada con PBS que contiene Tween-20 al 0,1-0,6 %. La separación de protofibrillas/oligómeros de monómeros se realiza a un caudal de 80 pl/min. La absorbencia de UV se controla mediante la longitud de onda de 214 y 280 nm. El máximo de vacío eluyendo a los 12­ 13 minutos, contiene protofibrillas/oligómeros de Ap3-42. Se aíslan protofibrillas/oligómeros de Ap3-42 altamente puros para el desarrollo de vacunas y/o monoclonales mediante la recogida de fracciones que eluyen a los 12­ 13 minutos.

Eiemplo 3. Síntesis de protofibrillas/oligómeros de AB3(pE)-42 truncados estabilizados.

Para producir antígeno de protofibrillas de Ap truncados en el extremo N (es decir, antígeno que contiene protofibrillas y otros oligómeros), el Ap3(pE)-42 truncado en el extremo N de tipo silvestre humano, como se ha descrito anteriormente, se utiliza a una concentración de 35-750 pM. En muestras en las que Ap3(pE)-42 se ha conjugado con HNE y/u ONE (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, EE.UU.), estos compuestos se utilizan a una concentración de 0,01­ 65 mM. En un experimento típico, la relación molar entre HNE y/u ONE y Ap3(pE)-42 varía entre 1:1 y 100:1, pero la proporción de los compuestos respectivos no se limita a esta estequiometría. En determinados experimentos, se utiliza borohidruro de sodio (NaBH4) a una concentración de 0,1-100 mM para reducir las muestras modificadas con HNE y/o modificadas con ONE. En algunos casos, el aminoácido de Ap3(pE)-42 puede contener aminoácidos (tales como lisina) que durante dicha modificación con HNE forman una base de Shift inestable y reversible que se une con HNE. En otro caso, el aminoácido de Ap3(pE)-42 puede contener aminoácidos (tales como lisina) que durante dicha modificación con UNO forman una base de Shiff inestable y reversible que se une con UNO. La reducción de borohidruro de sodio estabiliza dicha unión a la base de Shiff. Las muestras se incuban a 37 °C con o sin agitación durante 30 minutos a 30 días. Para verificar la composición molecular de las muestras, se utilizan varios métodos. Ap3(pE)-42 sin modificar o Ap3(pE)-42 modificado con HNE y/o modificado con ONE o Ap3(pE)-42 modificado con otros aldehídos reactivos, se centrifugan a 16900 xg durante cinco min. a 21 °C para eliminar las fibrillas insolubles. El sobrenadante se fracciona posteriormente utilizando un sistema SEC-HPLC con detección UV entre 214 nm y 280 nm (descrito en detalle a continuación) para aislar protofibrillas/oligómeros y monómeros de Ap3(pE)-42. En otro experimento, las protofibrillas/oligómeros y los monómeros de Ap3(pE)-42 se separan utilizando un dispositivo de filtro centrífugo con un límite molecular entre 5-1000 kDa. En un experimento típico, las muestras de 500 pl de App3-42 modificado con HNE y/u ONE, se centrifugan utilizando un dispositivo de filtro centrífugo Microcon (Millipore, Billerica, MA) o un dispositivo centrífugo Vivaspin500 (Sartorius, Goettingen, Alemania) con un límite de 100 kDa. Las muestras se centrifugan a una velocidad que varía entre 1000-15000 xg durante 5-30 min y el retenido se recoge y contiene la mayoría de las protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N.

-Protofibrillas/oligómeros de Ap truncados en el extremo N modificados con HNE

En un experimento típico, se incuba Ap3(pE)-42 truncado en el extremo N de tipo silvestre humano 140 pM con HNE 5,6 mM (por ejemplo, con una razón de 40:1 entre HNE y Ap3(pE)-42 durante 20 horas a 37 °C después de lo cual el exceso de HNE no unido se elimina utilizando columnas de centrifugación y desalinización Zeba (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, Estados Unidos), el dispositivo centrífugo Vivaspin 500 (Sartorius, Goettingen, Alemania) o un dispositivo de filtro centrífugo Microcon (Millipore, Billerica, MA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de esta etapa inicial de modificación con HNE, las muestras se analizan directamente. Antes del análisis de SEC-HPLC, todas las muestras se someten a centrifugación a 16900 xg durante 5 min a 22 °C y solo la fracción soluble se analiza mediante SEC-HPLC utilizando una columna Superose 6 PC3.2/30. Las protofibrillas/oligómeros de Ap3(pE)-42 estabilizados con HNE eluyen en un máximo en aproximadamente 10-15 min.

- Ap3(pE)-42 modificado con ONE

En un experimento típico, Ap3(pE)-42 de tipo silvestre humano (140 j M) se incuba con ONE 4,2 mM (por ejemplo, con una proporción de 40:1 entre ONE y Ap3(pE)-42) durante 20 horas a 37 °C y el exceso de ONE no unido se elimina utilizando columnas de centrifugación y desalinización Zeba (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, Estados Unidos), el dispositivo centrífugo Vivaspin 500 (Sartorius, Goettingen, Alemania) o un dispositivo de filtro centrífugo Microcon (Millipore, Billerica, MA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Antes del análisis de SEC-HPLC, todas las muestras se someten a centrifugación a 16900 xg durante 5 min a 22 °C y solo la fracción soluble se analiza mediante SEC-HPLC utilizando una columna Superose 6 PC3.2/30. Las protofibrillas/oligómeros de Ap3(pE)-42 estabilizadas con ONE eluyen como el máximo principal en aproximadamente 10-15 min.

-Ap3(pE)-42 modificado con HNE- y ONE

En un experimento típico, Ap3(pE)-42 de tipo silvestre humano (140 j M) se incuba con HNE 4,2 mM y ONE 4,2 mM durante 20 horas a 37 °C y se elimina el exceso de HNE y ONE no unidos utilizando columnas de centrifugación y desalinización Zeba (Pierce Biotecnología, Rockford, IL, Estados Unidos), el dispositivo centrífugo Vivaspin 500 (Sartorius, Goettingen, Alemania) o un dispositivo de filtro centrífugo Microcon (Millipore, Billerica, MA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todas las muestras se someten a centrifugación a 16900 xg durante 5 min a 22 °C y solo la fracción soluble se analiza mediante SEC-HPLC utilizando una columna Superose 6 PC3.2/30. Las protofibrillas/oligómeros de Ap3(pE)-42 estabilizados con HNE y ONE eluyen como el máximo principal en aproximadamente 10-15 min.

Ejemplo 4. Anticuerpos contra Ap3(pE)-42 en ratones inmunizados con protofibrillas/oligómeros truncados en el extremo N

-Inmunización/Anticuerpos policlonales

En el esquema de inmunización se utilizan ratones BALB/c. Para las inmunizaciones iniciales (por ejemplo, 3-6 veces), se inyectan a los ratones 30-50 jg de preparaciones de protofibrillas/oligómeros de Ap3(pE)-42 diluidas en solución salina tamponada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés) Tween 20 al 0,1 % junto con 5 j l de ISCOM. Para la inmunización final, se inyectan a los ratones 30-50 jg de preparaciones de protofibrillas/oligómeros de Ap3(pE)-42 sin ISCOM. Se analiza la reactividad del plasma de los ratones inmunizados frente a las protofibrillas/oligómeros de Ap3(pE)-42. La especificidad de la respuesta de anticuerpos policlonales se analiza mediante ELISA. En un experimento típico, una placa de microvaloración de poliestireno de 96 pocillos de fondo plano de alta unión se recubre con un anticuerpo reactivo contra Ap, los pocillos se bloquean con PBS Tween-20 al 0,05 % y, posteriormente, se diluyen los monómeros de Ap3(pE)-42 o las protofibrillas/oligómeros de Ap3(pE)-42 en PBS/BSA al 0,1 %/Tween-20 al 0,05 % y se añaden a una concentración final de 1 ng/pocillo. Las muestras de plasma de ratones inmunizados (tomadas en diferentes momentos durante el programa de inmunización) se diluyen en PBS/BSA al 0,1 %/Tween-20 al 0,05 % y se añaden a los pocillos. El anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP, por sus siglas en inglés) (Southern Biotech) se utiliza como anticuerpo secundario a una dilución de 1/10000. La inmunorreactividad se visualiza usando TMB (Neogen Corp.).

En el suero, se detectan anticuerpos que reconocen específicamente protofibrillas/oligómeros de Ap3(pE)-42. Se realizan pruebas de ELISA similares a las descritas anteriormente con otras formas de Ap42 truncadas o no truncadas, tanto como monómeros y protofibrillas/oligómeros, para evaluar la especificidad de la respuesta policlonal.

- Hibridoma/anticuerpos monoclonales

Se aíslan células del bazo y se muelen en solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril y se centrifugan a 1200 xg durante 10 min para recoger un sedimento rico en células. Las células se lavan adicionalmente con PBS y se centrifugan a 1200 xg durante 10 min. El sedimento celular se vuelve a suspender en el medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM, Invitrogen, La Jolla, CA, EE.UU.) complementado con antibióticos al 1 %. Las células del bazo se mezclan en una proporción de 1:2 con células Sp2/0 (línea celular de mieloma de ratón) en DMEM. Para facilitar la fusión celular, se añade a la mezcla de células 1 ml de polietilenglicol (Sigma-Aldrich, San Luis, MO, EE.UU.) y la reacción se detiene con la adición de DMEM. Las células se recogen y el sedimento se vuelve a suspender en DMEM complementado con suero bovino fetal al 10 % (v/v) (Cambrex, Charles City, IA, EE.UU.) y que también contiene el complemento de medios HAT Hybri-Max™ (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Ee .UU.), medio de acondicionamiento de BM al 10 % (v/v) (Roche Diagnostics Scandinavia, Bromma, Suecia), piruvato de sodio al 1 % (v/v) (Cambrex, Charles City, IA, EE. UU.), antibióticos al 1 % (v/v) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) y L-glutamina al 1 % (v/v) (Cambrex, Charles City, IA, EE.UU.) y las células se siembran en placas de cultivo celular de 96 pocillos.

Para detectar anticuerpos reactivos protofibrilares/oligómeros de Ap3(pE)-42 producidos por los hibridomas generados, se utiliza un protocolo ELISA. En un experimento típico, una placa de microvaloración de poliestireno de 96 pocillos de fondo plano de alta unión se recubre con un anticuerpo reactivo contra Ap, los pocillos se bloquean con PBS Tween-20 al 0,05 % y, posteriormente, se diluyen los monómeros de Ap3(pE)-42 o las protofibrillas/oligómeros de Ap3(pE)-42 en PBS/BSA al 0,1 %/Tween-20 al 0,05 % y se añaden a una concentración final de 1 ng/pocillo. Se añaden a los pocillos sobrenadantes de cultivo celular de los hibridomas. El anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Southern Biotech) se utiliza como anticuerpo secundario a una dilución de 1/10000. La inmunorreactividad se visualiza utilizando un sustrato K-Blue® mejorado (TMB). Se seleccionan clones de hibridoma reactivos con Ap3(pE)-42 y se subclonan adicionalmente utilizando el ensayo de dilución limitada (EDL).

Se realizan ELISA similares a los descritos anteriormente con otras formas de Ap42 truncadas o no truncadas, tanto como monómeros y protofibrillas/oligómeros, para evaluar la especificidad de los anticuerpos monoclonales producidos mediante los hibridomas.

Los hibridomas se generan mediante la inyección de preparaciones de protofibrillas/oligómeros de Ap3(pE)-42 como se describió anteriormente. Otras formas de protofibrillas/oligómeros de Ap42 truncados, así como preparaciones de protofibrillas/oligómeros de Ap42 truncados modificadas con HNE y/u ONE, u otros aldehidos también se utilizan como antígenos para desarrollar anticuerpos monoclonales que se unen a otras formas de protofibrillas/oligómeros de Ap42 truncados y se prueban utilizando la prueba de ELISA como se describe anteriormente.

Los datos de unión de las pruebas con anticuerpos de acuerdo con la invención demuestran una elevada afinidad por los monómeros de Ap3(pE)-42 así como por las protofibrillas/oligómeros que comprenden 100 % de Ap3(pE)-42, y sustancialmente sin unión a los monómeros de Ap1-42 de longitud completa. Esto contrasta claramente con los anticuerpos de la técnica anterior que pueden presentar una elevada afinidad por todas estas especies o pueden unirse a protofibrillas que comprenden solo Ap de longitud completa de manera eficaz, pero sustancialmente sin afinidad por las formas de Ap truncado en el extremo N.

Los ejemplos y realizaciones específicas descritas en el presente documento son únicamente de naturaleza ilustrativa y no se pretende que sean limitantes de la invención definida por las reivindicaciones.

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Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo, en donde el anticuerpo se obtiene contra la protofibrilla estabilizada que comprende el amiloide p (Ap) Ap3(pE)-42 truncado en el extremo N, y se selecciona de modo que (i) se une a la protofibrilla soluble que comprende Ap3(pE)-42, (ii) se une al monómero de Ap3(pE)-42, y (iii) no presenta unión o sustancialmente no se une al monómero de Ap truncado en el extremo N, en donde:

(a) el monómero de Ap no truncado en el extremo N puede tener o no un truncamiento carboxiterminal; y (b) la protofibrilla estabilizada se estabiliza con una sustancia orgánica hidrófoba que comprende un detergente no iónico, un detergente dipolar, 4-hidroxi-2-nonenal (HNE) o 4-oxo-2-nonenal (ONE), y en donde la protofibrilla estabilizada tiene una velocidad de formación inferior para una forma agregada no soluble que una forma no estabilizada de la protofibrilla.

2. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la protofibrilla soluble a la que se une el anticuerpo comprende Ap que comprende la mutación ártica (E22G), la mutación holandesa (E22Q), la mutación italiana (E22K), la mutación de lowa (D23N) o la mutación flamenca (A21G), o combinaciones de dos o más de las mismas.

3. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que se une a una protofibrilla que comprende al menos un 80 % de Ap3(pE)-42 con un valor de CI50 menor o igual a 25 nM.

4. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 3, que se une a una protofibrilla que comprende el 80 % de Ap3(pE)-42 y el 20 % de Ap1-42 con un valor de CI50 menor o igual a 25 nM.

5. El anticuerpo de la reivindicación 1, que se une a una protofibrilla que comprende el 100 % de Ap3(pE)-42 con un valor de CI50 menor o igual a 100 nM.

6. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el anticuerpo es humano, humanizado o modificado para reducir la antigenicidad en seres humanos y/o en donde el anticuerpo tiene una actividad del complemento reducida y/o en donde el anticuerpo es un fragmento Fab, por ejemplo, F(ab), F(ab)2 o DiFacuerpo.

7. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el anticuerpo es monoclonal.

8. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el anticuerpo también se une a la protofibrilla estabilizada.

9. Un método para detectar protofibrillas que comprenden Ap3(pE)-42 truncado en el extremo N y para detectar monómero de Ap3(pE)-42 truncado en el extremo N, que comprende añadir un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 a una muestra biológica que comprende o se sospecha que comprende la protofibrilla y/o monómero, y medir una concentración de un complejo formado entre el anticuerpo y la protofibrilla y un complejo formado entre el anticuerpo y el monómero.