CN109475584B - 治疗由阴道加德纳氏菌导致的细菌性阴道感染和可能存在的并发真菌感染的乳酸菌组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物组合物或医疗器械用组合物(简言之，本发明的组合物)，所述组合物基于属于发酵乳杆菌物种的乳酸菌，用于阴道和口服使用以同时治疗真菌和细菌起因的阴道感染、病症或疾病。具体而言，本发明涉及的所述组合物包含：药用级的赋形剂，和包含至少一种属于发酵乳杆菌物种的细菌菌株或者由其组成的混合物，其用于阴道和口服使用以同时治疗选自念珠菌病、阴道炎、外阴阴道炎或细菌性阴道病的阴道感染、病症或疾病。

Description

治疗由阴道加德纳氏菌导致的细菌性阴道感染和可能存在的 并发真菌感染的乳酸菌组合物
本发明涉及药物组合物或医疗器械用组合物(简言之，本发明的组合物)，所述组合物基于属于发酵乳杆菌物种的乳酸菌，用于阴道和口服使用以同时治疗真菌和细菌起因的阴道感染、病症或疾病。具体而言，本发明涉及的所述组合物包含：药用级的赋形剂、和包含至少一种属于发酵乳杆菌物种的细菌菌株或者由其组成的混合物，其用于阴道和口服使用以同时治疗选自念珠菌病、阴道炎、外阴阴道炎或细菌性阴道病的阴道感染、病症或疾病。
已知肠道和泌尿生殖道微生物群落的组成代表了妇女健康和幸福的关键点。阴道生态系统由衬阴道和子宫的上皮细胞、在器官腔内分泌的腺细胞和以不同微生物物种为代表的复杂细菌菌群组成。
这些微生物能够将由富营养性阴道粘膜的副基底细胞分解产生的糖原发酵，导致产生乳酸，其最终作用是建立和维持酸性阴道环境(在生理条件下pH值为约4-4.5)。
源自乳酸的氢离子(H+)有助于形成过氧化氢。这种过氧化物分子对于缺乏过氧化氢酶的大量细菌物种是有毒的。在阴道分泌物中，容易达到约0.75-5μg/ml的浓度，这对于发挥毒性作用是绰绰有余的。
过氧化氢、子宫过氧化物酶(由子宫颈和子宫内膜产生)和氯离子(Cl-)和碘离子(I-)的联合作用甚至通过直接激活多形核细胞来限制细菌生长，多细胞核细胞在上皮细胞间空间中发挥杀菌作用。
由于各种外源性和内源性因素，例如抗生素的使用、应激条件、与妊娠相关的激素调节、月经周期和/或采用高雌激素浓度，在女性中经常发生阴道生态系统的失衡。阴道生态系统平衡的改变导致诸如白色念珠菌和光滑念珠菌和/或阴道加德纳氏菌等微生物的蔓延，它们引起念珠菌病、阴道炎、外阴阴道炎和细菌性阴道病。
已知约75％的女性在其生命中的某些时刻遭受或将会遭受至少外阴阴道霉菌病发作，所述外阴阴道霉菌病在90％病例中由被称为白色念珠菌的真菌(酵母)引起(念珠菌阴道炎或外阴阴道炎)。此外，必须指出的是，在约40-50％的女性中发生复发，即进一步的感染事件。
此外，阴道感染的另一个重要方面涉及细菌性阴道病。已知细菌性阴道病是细菌起因的阴道炎症，并且是生育和更年期妇女中阴道紊乱的最常见原因。细菌性阴道病是由阴道微生物群落平衡的改变引起的，伴随着共生细菌的异常发展，共生细菌在阴道生态系统改变后由于许多原因而变成病原体。导致大多数细菌性阴道病发作(几乎80％的病例)的主要病原体是阴道加德纳氏菌。细菌性阴道病可以用抗生素治疗，例如甲硝唑或克林霉素。然而，细菌阴道病以及真菌性阴道病即使在治疗后也可能复发。因此，抗生素治疗绝不代表确定性治疗，无法避免一次或多次复发，也不是适用于所有类别患者的治疗。
目前，流行病学数据显示，全世界每年阴道感染影响超过10亿的妇女，造成严重的社会经济后果。此外，阴道病与早产和坏死性小肠结肠炎(NEC)的高发病率有关。已经提出了孤独症和围产期炎症之间的联系。
怀孕期间使用抗生素与哮喘的发病有关。
外阴阴道念珠菌病(VVC)通常由白色念珠菌引起，但也可能是由于其他物种的白色念珠菌或酵母菌引起。典型的VVC症状包括瘙痒、阴道刺激、性交困难、排尿疼痛和阴道分泌物异常。这些症状都不是VVC特有的。
光滑念珠菌(C.glabrata)是一种具有各种独特生物学特性的病原性酵母。它可以从皮肤和尿中分离出，并且代表了粘膜上发现的最常见的酵母之一。它被认为是引起表面和全身感染的机会致病病原体，特别是在免疫受损的患者中。在欧洲，光滑念珠菌菌株对氟康唑的总体耐药性百分比为16.5％。
近平滑念珠菌(C.parapsilosis)是外源性病原体。它可导致脓毒症、甲真菌病和皮肤真菌病，也见于黏膜，并具有不同于其他物种的生化特征。
热带念珠菌(C.tropicalis)是念珠菌属最常见的病原体。它在混合培养物中与白色念珠菌一起被发现并且对抗真菌疗法非常耐受。该病原体可以在粘膜上增殖，甚至在没有疾病特定体征的情况下也可以观察到。
克鲁斯念珠菌(C.krusei)是对氟康唑有天然抗性的真菌，并且可从啤酒、牛奶和衍生物以及动物的皮肤、唾液和粪便中分离出。它与某些形式的婴儿腹泻有关，偶尔与全身性疾病有关。这种真菌能够定殖粒细胞减少症患者的肠、呼吸道和尿道。
细菌性阴道病(BV)是临床多微生物性综合征，其归因于能够产生过氧化氢的正常乳杆菌被高浓度的厌氧菌(例如普雷沃氏菌属(Prevotella)和动弯杆菌(Mobiluncucus)的物种)、脲原体(ureaplasma)、支原体(mycoplasma)和几种烦人的厌氧生物体代替。在需要治疗的女性中，BV是阴道分泌物和臭味的主要原因。然而，在美国进行的一项研究中，大多数患有BV的女性被发现无症状。经历过至少一次BV发作的女性百分比在5％到70％之间。在80％的报道病例中，BV的特征是阴道加德纳氏菌感染。
在实验室真菌分析之后进行妇科诊断后，通常选择抗生素和/或杀真菌疗法，这通常在短期内导致良好结果，但由于病原体的抗性增加而不能预防复发性感染。此外，并非所有需要治疗的受试者都能够服用和耐受抗生素或杀真菌疗法。
咪康唑和氟康唑代表了治疗念珠菌病最常用的活性成分：咪康唑主要局部使用用于由白色念珠菌和白色念珠菌以外的物种导致感染。在三唑类中，氟康唑是治疗念珠菌病的首选分子，但其功效是可变的：事实上，29％至43％的全身感染患者使用这些分子没有获得令人满意的结果。此外，这些分子对不同的酵母物种具有高度可变的功效。
还已知使用能够恢复阴道微生物菌群的适当组成的微生物，例如乳酸菌。乳酸菌可用作阴道用组合物中的活性成分，其可以是诸如口服片剂、锭剂、颗粒或粉末等固体形式或诸如阴道片剂等固体形式；或者为诸如阴道灌洗剂、溶液或凝胶等液体形式。
然而，到目前为止，仍然需要具有独立于妇科诊断和微生物分析的针对阴道感染、病症或疾病的快速有效治疗，以便从细菌性阴道病和/或念珠菌性阴道炎的治疗中获得快速和有益的结果。基本上，非常有用的是提供这样一种治疗：对于其应用而言不需要诊断(这对于患者而言意味着进行医学检查和取样)，没有常用抗生素/抗真菌药物的典型副作用，避免发展出对抗生素的交叉耐药性，并且是高度耐受和有效的。
具体而言，仍然需要具有一种用于阴道和口服使用的组合物，其同时治疗真菌和细菌起因的阴道感染、病症或疾病，其(i)是有效的和/或(ii)容易制备和/或(iii)能够决定性地对阴道生态系统的平衡起作用和/或(iv)有效地避免一种或多种复发并且适用于所有类别的患者，所述组合物具有针对病原性微生物的广谱活性，其中有但不限于念珠菌属的酵母，其导致真菌性念珠菌病、阴道炎和外阴阴道炎；以及阴道加德纳氏菌，其占细菌性阴道病病例的80％。
此外，仍然需要一种具有用于阴道和口服使用的组合物，其同时治疗真菌(即，由真菌和/或酵母导致)和细菌起因的阴道感染、病症或疾病，其代表了抗生素和/或杀真菌治疗的有效替代方案，同时代表了与针对念珠菌属和阴道加德纳氏菌感染的已知施用形式相比有效的治疗。
申请人在经过深入严谨的研究和开发活动后，开发了一种基于乳酸菌的用于阴道或口服使用的组合物，其能够有效地解决已知技术的常见问题。
本发明的一个目的是用于阴道或口服使用的组合物，如所附独立权利要求中所述那样。
本发明的其它优选实施方式在所附从属权利要求中提出。
图形1涉及在MRS中乳杆菌和白色念珠菌共生长的影响的说明性直方图。
图形2涉及表示与LF5共生长的念珠菌属的不同物种的死亡率的直方图。
图形3涉及表示与LF5共生长的念珠菌属的不同物种的死亡率的直方图。
图形4涉及表示与LF5共生长的念珠菌属的不同物种的死亡率的直方图。
图1涉及在两种微生物共生长期间LF5对白色念珠菌ATCC 90028施加的作用。
图2涉及由菌株LF5肉汤培养物诱导的在琼脂培养基上白色念珠菌ATCC 90028的抑制晕圈：盘技术(disc technique)。
图3涉及由来自盘和斑点技术的上清液的冷冻干燥浓缩物诱导的琼脂培养基上白色念珠菌ATCC 90028生长的抑制晕圈。
图4、5和6涉及菌株LF5对白色念珠菌的作用机制。
图形5涉及在实验1和实验2的白色念珠菌ATCC 90028的抑制：总体数据图形。
表11涉及关于在24和48小时显示出MIC的发酵乳杆菌细菌菌株的实验。
图7显示在具有白色念珠菌的患者中，与安慰剂相比LF5的功效和耐受性的临床研究结果。
图8a显示在用LF5或咪康唑治疗期间和之后与真菌阴道定殖相关的症状和体征的总体平均数(+ESM)的趋势。
图8b显示在用LF5或咪康唑治疗期间和之后与真菌阴道定殖相关的症状和体征的总体平均强度(+ESM)的趋势。
图9显示发酵乳杆菌的不同菌株对念珠菌属的几个物种的活性。
图10显示发酵乳杆菌LF5对念珠菌属的几个物种的活性。
申请人进行了长期密集的实验研究活动，期间测试了属于以下物种的第一组细菌菌株：
-植物乳杆菌(L.plantarum)，例如细菌菌株植物乳杆菌(LP 01)LMG P-21021；
-戊糖乳杆菌(L.pentosus)，例如细菌菌株戊糖乳杆菌(LPS 01)DSM 21980；
-德氏乳杆菌德式亚种(L.delbrueckii ssp.delbrueckii)，例如细菌菌株德氏乳杆菌德式亚种(DSMZ 20074LDD01)DSM 22106；
-鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)，例如细菌菌株鼠李糖乳杆菌(LR 06)DSM 21981；
-短双歧杆菌(B.breve)，例如菌株短双歧杆菌(BR 03)DSM 16604。
测试所述细菌菌株以评估对阴道加德纳氏菌(导致女性中80％的细菌性阴道病病例)的抑制数据以及其对白色念珠菌的活性和功效。所述抑制试验的结果对于病原体阴道加德纳氏菌是阴性的。测试结果返回阴性，因为所测试的菌株都不能够抑制病原体阴道加德纳氏菌。
在本发明的试验中使用的病原体阴道加德纳氏菌的菌株是如下报道的阴道加德纳氏菌ATCC 14018类型，也称为阴道嗜血杆菌(Haemophilus vaginalis)：阴道加德纳氏菌
Figure GDA0003374206320000051
编号：14018TM，
Figure GDA0003374206320000052
Culture.Organism：阴道加德纳氏菌(Gardner andDukes)Greenwood and Pickett，保藏为阴道嗜血杆菌Gardner and Dukes.ATCC培养基：814GC培养基。
然后申请人测试了属于以下物种的第二组阴道细菌菌株：
(i)卷曲乳杆菌(L.crispatus)，例如细菌菌株卷曲乳杆菌CRL 1266 ID1626 DSM24439；
(ii)卷曲乳杆菌，例如细菌菌株卷曲乳杆菌CRL 1251 ID1606 DSM 24438；
(iii)副干酪乳杆菌(L.paracasei)，例如细菌菌株副干酪乳杆菌LPC 08 ID1696DSM 21718；
(iv)副干酪乳杆菌，例如细菌菌株副干酪乳杆菌CRL 1289 ID1608 DSM 24440；
(v)发酵乳杆菌，例如细菌菌株发酵乳杆菌LF 11 ID1639 DSM 19188。
表1
Figure GDA0003374206320000062
表1报道了上述(i)至(v)阴道细菌菌株对阴道加德纳氏菌菌株的抑制试验(以下分析方法)的结果。
表1中的结果是指光密度，其在微需氧生长24小时后在波长OD600处检测出。用来自TH肉汤中的新鲜肉汤培养物的起始接种物以2％进行测试。还观察到添加MRS培养基增加了病原体的生长能力。
然后，申请人测试了属于发酵乳杆菌物种的第三组细菌菌株，以评估阴道加德纳氏菌的抑制数据(导致女性中80％的细菌性阴道病病例)以及其对白色念珠菌和念珠菌属的其他酵母的活性和功效。
申请人仅选择属于发酵乳杆菌物种的细菌菌株，其显示出对白色念珠菌和阴道加德纳氏菌病原体具有活性和功效。
在24小时和48小时的吸光度OD600的结果分别报告在表2和表3中。
表2：抑制试验(以下分析方法)
Figure GDA0003374206320000072
Figure GDA0003374206320000081
表3：抑制试验(以下分析方法)
Figure GDA0003374206320000083
Figure GDA0003374206320000091
因此，本发明的目的是药物组合物或医疗器械用组合物(简言之，本发明的组合物)，所述组合物包含：药用级的赋形剂、和包含至少一种属于发酵乳杆菌物种的细菌菌株或者由其组成的混合物，所述组合物用于阴道和口服使用以治疗选自念珠菌病、阴道炎、外阴阴道炎和/或细菌性阴道病的阴道感染、病症或疾病。
本发明的一个实施方式涉及药物组合物或医疗器械用组合物(简言之，本发明的组合物)，所述组合物包含：药用级的赋形剂、和包含至少一种属于发酵乳杆菌物种的细菌菌株或者由其组成的混合物，所述细菌菌株选自包含细菌菌株1至14(列于表4中)或由其组成的组；所述组合物用于阴道和口服使用以治疗选自念珠菌病、阴道炎、外阴阴道炎和/或细菌性阴道病的阴道感染、病症或疾病。
表4
Figure GDA0003374206320000101
本发明的一个实施方式涉及药物组合物或医疗器械用组合物(简言之，本发明的组合物)，所述组合物包含：药用级的赋形剂、和包含至少一种属于发酵乳杆菌物种的细菌菌株或者由其组成的混合物；所述组合物用于阴道和口服使用以治疗由选自包含下述菌的组中的至少一种病原体引起的选自念珠菌病、阴道炎、外阴阴道炎和/或细菌性阴道病的阴道感染、病症或疾病：光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克鲁斯念珠菌、热带念珠菌、阴道加德纳氏菌、阴道毛滴虫、淋病奈瑟菌、大肠杆菌、单纯疱疹和杜克雷嗜血杆菌，其中所述细菌属于发酵乳杆菌(LF05)菌株，保藏号为DSM 32277或CNCM I-789(保藏人波比奥泰克股份公司)。
本发明的优选实施方式涉及药物组合物或医疗器械用组合物(简言之，本发明的组合物)，如上所定义的，所述组合物包含药用级的赋形剂和混合物，所述混合物在属于保藏号为DSM 32277或CNCM I-789(保藏人波比奥泰克股份公司)的发酵乳杆菌(LF05)菌株的细菌之外，还包含选自以下组的至少一种属于发酵乳杆菌物种的细菌菌株或者由其组成，所述组包含细菌菌株编号7、8、11、12、13和14(列于表4中)或由其组成的组；所述组合物用于阴道和口服使用以治疗选自念珠菌病、阴道炎、外阴阴道炎和/或细菌性阴道病的阴道感染、病症或疾病。有利的是，至少一种属于发酵乳杆菌物种的所述细菌菌株选自包含细菌菌株编号8、11、13和14(列于表4中)或由其组成的组。
优选的是，在用于上述用途的组合物中，所述阴道感染选自由包含光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克鲁斯念珠菌、热带念珠菌和阴道加德纳氏菌组成的组中的至少一种病原体导致的念珠菌病、阴道炎、外阴阴道炎和/或细菌性阴道病。
有利的是，本申请发明人发现，保藏号为DSM 32277或CNCM I-789(保藏人波比奥泰克股份公司)的细菌菌株发酵乳杆菌(LF05)针对不同物种的念珠菌属的酵母，以及针对诸如阴道加德纳氏菌(其是细菌性阴道炎的主要起因)等细菌起作用。在这方面，保藏号为DSM 32277或CNCM I-789的细菌菌株发酵乳杆菌(LF05)可用于治疗由念珠菌属的酵母(其中尤其是白色念珠菌)和细菌(其中有但不限于阴道加德纳氏菌)同时存在引起的疾病。
有利的是，本发明的组合物用于阴道或口服使用以治疗由病原体白色念珠菌和阴道加德纳氏菌联合导致的阴道感染、病症或疾病，因为发现发酵乳杆菌(LF05)对诸如白色念珠菌等酵母具有活性，并且令人惊讶的是，还对除白色念珠菌以外的念珠菌属物种和细菌阴道加德纳氏菌具有活性。
有利的是，本发明的组合物用于阴道或口服使用以治疗选自念珠菌病(特别是真菌性念珠菌病)、阴道炎和细菌性阴道病的阴道感染、病症或疾病。
本发明的一个实施方式涉及药物组合物或医疗器械用组合物，所述组合物包含：药用级的赋形剂、和包含至少一种属于发酵乳杆菌物种的细菌菌株或者由其组成的混合物；所述组合物用于阴道和口服使用以治疗至少一种阴道感染，其中所述至少一种阴道感染包含由病原性细菌阴道加德纳氏菌引起的细菌性阴道病或由其组成，并且其中所述细菌属于发酵乳杆菌(LF05)菌株，保藏号为DSM 32277或CNCM I-789(保藏人波比奥泰克股份公司)。
优选的是，在本发明的组合物中，所述混合物还包含至少一种属于发酵乳杆菌物种的细菌菌株或由其组成，所述细菌菌株选自包含以下细菌菌株3至14或由其组成的组：
Figure GDA0003374206320000121
在优选实施方式中，所述混合物还包含至少一种属于发酵乳杆菌物种的细菌菌株或者由其组成，所述细菌菌株选自包含细菌菌株编号7、8、11、12、13和14或由其组成的组。
在优选实施方式中，所述混合物还包含至少一种属于发酵乳杆菌物种的细菌菌株或者由其组成，所述细菌菌株选自包含细菌菌株编号8、11、13和14或由其组成的组。
在优选实施方式中，根据本发明的组合物用于治疗至少一种阴道感染，所述阴道感染在由病原性细菌阴道加德纳氏菌引起的细菌感染之外，还包含由至少一种选自包含下述病原体的组的病原体导致的阴道感染、阴道炎、外阴阴道炎或细菌性阴道病：白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克鲁斯念珠菌、热带念珠菌、阴道毛滴虫、淋病奈瑟菌、大肠杆菌、单纯疱疹和杜克雷嗜血杆菌。
在优选实施方式中，根据本发明的组合物用于治疗至少一种阴道感染，所述阴道感染在由病原性细菌阴道加德纳氏菌引起的细菌感染之外，还包含由病原体白色念珠菌导致的阴道感染。
本发明的组合物可以是固体形式或液体形式。作为固体形式，其可以是粉末、颗粒、片剂或锭剂的形式，而作为液体形式，其可以是溶液、阴道灌洗液、分散液或凝胶形式。
优选的是，所述混合物含有浓度为1x108至1x1012CFU/g，优选1x109至1x1011CFU/g的所述细菌菌株。
优选的是，所述组合物含有浓度为1x106至1x1010CFU/g，优选1x107至1x109CFU/g的所述细菌菌株。
优选的是，所述细菌混合物以1：2至1:10的重量比，优选1：3至1：5的重量比存在于在所述组合物中。
本发明的组合物用于阴道使用和口服使用，并有效地应用于治疗阴道感染、病症或疾病，因为其对病原性微生物具有广谱活性，所述病原性微生物例如为微生物白色念珠菌，导致念珠菌病、阴道炎、外阴阴道炎的酵母，和引起细菌性阴道病的细菌阴道加德纳氏菌。所述组合物还可用于阴道应用以治疗诸如淋病、疱疹和软下疳等阴道感染、病症或疾病。
表4中列出的细菌菌株可以在所述细菌混合物中作为活细菌或死细菌，或以经超声处理、经间歇灭菌或经冷冻干燥的细菌的形式存在。
在优选实施方式中，存在于本发明的所述组合物所包含的所述细菌混合物中的属于发酵乳杆菌物种的细菌菌株为涂层形式，具有一种(单涂层)或多种(例如双涂层)脂质涂布用植物材料，所述脂质涂布用植物材料的熔点为30℃至80℃，优选40℃至60℃。
本发明的组合物包含至少一种属于发酵乳杆菌物种的益生菌菌株，所述益生菌菌株能够减少和/或消除选自包含以下病原体的组的病原体的存在：白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克鲁斯念珠菌、热带念珠菌、阴道加德纳氏菌、阴道毛滴虫、淋病奈瑟菌、大肠杆菌、单纯疱疹和杜克雷嗜血杆菌。
举例而言，在根据本发明的片剂中，细菌菌株(优选以活体计数通常为100亿至2000亿个集落形成单位(CFU)/克的冷冻干燥培养物形式使用)，相对于片剂的总重量，优选的量为0.5至20％w/w，优选1至15％w/w，甚至更优选3至10％w/w。
在一个优选实施方式中，为了增强根据本发明的制剂的功效，将特定的益生元组分加入到粉末混合物中，从而获得共生组合物(symbiotic composition)。益生元组分通常是不可消化的糖类物质，其至少部分可溶于水或水溶液，其刺激如上所述的一种或多种益生菌菌株的生长和/或活性。在这些益生元试剂中，优选食物纤维(food fiber)。
优选的是，所述益生元纤维选自：低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、反式低聚半乳糖(TOS)、低聚木糖(XOS)、壳聚糖寡糖(COS)、α-半乳糖苷(如棉子糖和水苏糖)、果胶、树胶、部分水解的树胶、菊粉、欧车前(psyllium)、阿拉伯树胶、角豆树、燕麦、竹纤维、柑橘纤维，以及通常含有具有彼此可变比例的可溶性和不溶性部分的纤维。
有利的是，所述益生元纤维选自低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)和低聚木糖(XOS)。这些纤维不被念珠菌属的酵母利用，因此为本发明组合物的细菌菌株提供竞争优势。
优选的是，相对于组合物的总重量，益生元组分在组合物中的存在量为至多70％w/w，优选为5至50％w/w，甚至更优选为10至30％w/w。
在优选实施方式中，根据本发明的组合物可以含有另外的活性组分，例如维生素、矿物盐、植物提取物或与根据本发明制剂的微生物群体具有协同或互补效应的其他化合物。
优选的是，相对于组合物的总重量，所述另外的活性组分的量为至多70w/w,，优选为0.5至40％w/w,，甚至更优选为1至20％w/w。
在实施方式(E1)中，本发明涉及药物组合物或医疗器械用组合物，所述组合物包含：药用级的赋形剂、和包含至少一种属于发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)物种的细菌菌株或者由其组成的混合物；所述组合物用于阴道或口服使用以治疗阴道感染。
在实施方式(E2)中，本发明涉及根据实施方式E1所述用途的组合物，其中所述阴道感染选自念珠菌病、阴道炎、外阴阴道炎或细菌性阴道病。
在实施方式(E3)中，本发明涉及根据实施方式E1或E2所述用途的组合物，其中所述混合物包含至少一种属于发酵乳杆菌物种的细菌菌株或者由其组成，所述细菌菌株选自包含以下细菌菌株1至14或由其组成的组：
Figure GDA0003374206320000151
在优选实施方式(E4)中，本发明涉及根据实施方式E3所述用途的组合物，其中所述混合物包含至少一种属于发酵乳杆菌物种的细菌菌株或者由其组成，所述细菌菌株选自包含细菌菌株编号1、2、7、8、11、12、13和14或由其组成的组。
在优选实施方式(E5)中，本发明涉及根据实施方式E4所述用途的组合物，其中所述混合物包含至少一种属于发酵乳杆菌物种的细菌菌株或者由其组成，所述细菌菌株选自包含细菌菌株编号1、2、8、11、13和14或由其组成的组。
在优选实施方式(E6)中，本发明涉及根据实施方式E1-E5中任一项所述用途的组合物，其中所述组合物用于治疗由病原体白色念珠菌和阴道加德纳氏菌导致的阴道感染、病症或疾病。
在优选实施方式(E7)中，本发明涉及根据实施方式E1-E6中任一项所述用途的组合物，其中所述组合物为固体形式或液体形式，优选为粉末、颗粒、片剂、锭剂、溶液、阴道灌洗剂、分散液或凝胶形式。
在优选实施方式(E8)中，本发明涉及根据实施方式E1-E7中任一项所述用途的组合物，其中所述混合物含有浓度为1×108CFU/g至1×1012CFU/g，优选1×109CFU/g至1×1011CFU/g的所述细菌菌株。
在优选实施方式(E9)中，本发明涉及根据实施方式E1-E8中任一项所述用途的组合物，其中所述组合物含有浓度为1×106CFU/g至1×1010CFU/g，优选1×107CFU/g至1×109CFU/g的所述细菌菌株。
在优选实施方式(E10)中，本发明涉及根据实施方式E1-E9中任一项所述用途的组合物，其中所述细菌混合物以1：2至1:10的重量比，优选1：3至1：5的重量比存在于在所述组合物中。
实验部分
发酵乳杆菌株LF5特有的生物抗念珠菌属活性-“体外”研究。
1.最佳液体和琼脂基质的选择
对于微生物：白色念珠菌和发酵乳杆菌的生长而言。
在不同条件下在几种液体和琼脂基质上以长或短的温育时间进行白色念珠菌ATCC 90028和菌株发酵乳杆菌LF5(表5)的生长试验。通过读取培养物自身在560nm处的吸光度，基于培养基的浊度评估生长，参见表5。
Figure GDA0003374206320000161
Figure GDA0003374206320000171
表5在不同温育条件下白色念珠菌ATCC 90028和发酵乳杆菌LF5在几种基质上的生长
因此，对作为使发酵乳杆菌菌株和白色念珠菌ATCC 90028共生长的完美折衷的以下条件进行检测：
a)液体或琼脂MRS作为生长基质；
b)37℃作为温育温度(偏向于乳杆菌)；
c)在有氧(对于酵母良好生长所观察到的条件)下。
2.评估与白色念珠菌共生长的菌株发酵乳杆菌LF5的生物活性
2.1评估针对白色念珠菌的生物活性
建立其中在用发酵乳杆菌菌株(103细胞/ml)接种的液体培养基中接种白色念珠菌ATCC 90028(104细胞/ml)的生长试验。在共生长24和48小时后在琼脂培养基中通过直接计数来评估细菌诱导的酵母抑制。
(a)考虑到计数平均值，可确认菌株LF5(表4)：确定对白色念珠菌ATCC 90028的抑制在24小时后等于99.9％并且在48小时后等于99.999％。因此，当白色念珠菌和发酵乳杆菌的接种细胞的数量比分别为10比1时，获得温育24小时后的MCB99.9和接触48小时后的MCB99.999。
b)由发酵乳杆菌LF5诱导的对白色念珠菌的特异性抑制在酵母与其他乳酸菌菌株的共生长中未同样地发现。在这些样品中计数的念珠菌集落的数量在任何情况下都小于在MRS中使酵母单独生长时获得的数量。这种现象可归因于在乳杆菌生长期间发生的培养基的自发酸化，以及确切地说，归因于对营养物的竞争和来自乳酸菌的各种分解代谢产物的存在。在所观察到的发酵乳杆菌LF5对白色念珠菌的实质抑制和如上总体定量的情况下，产生了菌株LF5的比活性，这使其与其他酸化乳杆菌区别开来(图形1)。
c)进一步证明，发酵乳杆菌LF5即使在从MCB(Master Cell Bank)开始直至第八次亚培养的培养物中传代数次后仍保持在液体培养基中抑制白色念珠菌生长的能力，因此，可以在中试工厂开始生产菌株LF5，然后在工业水平上实现规模扩大。然后证明即使在最终的冷冻干燥产品中也能维持对酵母的比活性。
2.2评估属于念珠菌属的其他菌株的生物活性
根据与上述相同的操作模式，进行菌株发酵乳杆菌LF5与念珠菌属下述其他菌株的共生长试验：光滑念珠菌ATCC 90030、克鲁斯念珠菌ATCC 6258、近平滑念珠菌ATCC22019。
菌株发酵乳杆菌LF5能够诱导念珠菌属的上述不同菌株的显著程度的死亡(图形2、3、4)，程度根据物种以及进行评估的条件而略有不同。平均而言，在温育的最初24小时期间观察到约99.9％的抑制，在48小时期间死亡率取决于给定菌株达到99.99-100％。考虑到近平滑念珠菌和光滑念珠菌物种是机会致病病原体的事实(它们能够以皮肤表面水平和全身性疾病方式导致感染)，可以认为应用菌株LF5作为未来药物制剂的活性成分，不仅仅全身使用且具有泌尿生殖器和肠道功效，还用于皮肤表面水平的局部使用。
2.3发酵乳杆菌LF5对白色念珠菌ATCC 90028的可能作用机制的假设
通过显微镜观察LF5和白色念珠菌液体培养基中的共生长和数字图像捕获，可以评价乳杆菌的作用，乳酸杆菌似乎执行一种酵母“调理作用”，可能随后通过与膜结合并可能分泌的特定的推测蛋白因子而将膜裂解(图1)。
3.评估发酵上清液的生物活性
进行接种到从LF5(上清液)发酵的肉汤中的白色念珠菌ATCC 90028的生长试验。上清液代表这样的培养基：其中在乳杆菌的最佳条件下使发酵乳杆菌LF5发育(106细胞/ml)，然后通过过滤除去细胞(表6)。
Figure GDA0003374206320000191
Figure GDA0003374206320000192
表6在LF5上清液中生长24小时和48小时后的白色念珠菌ATCC 90028群体，阳性对照由24小时后接种到10ml MRS中的念珠菌计数表示(5.7x106细胞/ml)
a)在共生长实验(第2.1项)中观察到的导致念珠菌抑制的“活性”保持在上清液中，可能通过从甚至在培养肉汤中的LF5释放的特定“因子”起作用。
b)这种对酵母的抑制活性与接种其的上清液浓度成正比，因此可能与在培养肉汤中乳杆菌释放的“因子”浓度成正比(即只有上清液和1：2稀释，表6)。
c)该浓度在发酵乳杆菌生长48小时期间增加(即，在24小时和48小时上清液中,在接种24小时后计数的酵母集落的数量)。
d)如果浓度相同，则随着接触时间增加，抑制活性增加(即在温育24和48小时后在24小时上清液中计数的集落的数量)。
e)特别是，在温育24小时和通过过滤除去细胞后，由LF5发酵的发酵液诱导的对白色念珠菌ATCC 90028的抑制作用在24小时为99.99％，在48小时为99.999％。这种抑制归因于LF5的特异性活性以及明确而言归因于接种有酵母的生长基质(上清液)的酸性，并且归因于某些营养缺乏。在任何情况下，通过调节pH并预先加入葡萄糖和蛋白胨，针对接种到LF5上清液中的念珠菌的另外抑制试验显示其中存在特异性活性，其自身决定酵母抑制在24小时和48小时分别为约96％和99％。
f)LF5上清液的抑制效率在高于37℃的温度下在MRS中进行亚培养时增加；特别是42℃，结果是产生更高浓度的特异性抗念珠菌“因子”的最佳条件。相反，LF5在5或5.5的受控pH下的生长似乎不会影响这种浓度/生产率。
通过涂布铺板(104个细胞)接种使白色念珠菌ATCC 90028在琼脂培养基中生长，与通过点或浸渍盘技术沉积在琼脂上的肉汤培养物和LF5上清液接触，对所述生长进行评估。
a)在具有与用LF5 TQ的肉汤培养物浸渍的盘(图2)对应的盘的平板中，发生对盘周围的念珠菌生长的抑制，其中距离盘边缘约5mm出现孔可检测晕圈。
b)与斑点技术：在具有斑点的板中相比，放在之前用酵母涂布铺板的琼脂培养基上的浸渍盘的技术通常产生由发酵乳杆菌导致的更加肉眼可检测的抑制晕圈和/或裂解，但是，在LF5 TQ的微滴(drop)中，可以在显微镜下观察具有界限不清楚的分布的酵母单细胞，好像存在细胞碎片并且细胞之间的区域是黑暗和不均匀的。微滴外的情况是不同的，其中酵母细胞具有界限清楚的轮廓并且琼脂底部更清晰且几乎均匀。在微滴内所能检测的可以归因于酵母生长的抑制，由于裂解存在可能的碎片，以及无论如何生长的乳杆菌细胞。
c)用从LF5培养肉汤中收获的上清液的盘和/或斑点进行的琼脂试验确定没有形成可检测的晕圈，可能是因为具有特异性活性的“因子”难以扩散到琼脂中。为了将这样的因子浓缩甚至高达20倍，冷冻干燥和重构的上清液导致使用盘和斑点技术都出现明显的抑制晕圈(图3)，并且通过直接使用非重构粉末(图4-5-6)也是如此。
4.在具有白色念珠菌的患者中LF5阴道胶囊与安慰剂相比的功效和耐受性的临床研究
将平均年龄32.7岁(范围18-64岁)的100例因白色念珠菌而患有阴道炎或外阴阴道炎的患者随机分为均匀的两组，治疗各自50名患者，他们根据实验双盲设计用安慰剂治疗或在阴道胶囊制剂中给予≤109的LF5，剂量为连续三天在夜间1个阴道胶囊。
在治疗期间或在治疗后两周观察期间没有发生中断，因此提供了两组50个功效和耐受性观察。
在三天治疗结束时LF5治疗以显著高于安慰剂的患者比例产生微生物根除，并且在接下来的两周内复发风险非常低。此外，LF5与安慰剂相比，甚至症状缓解也明显更大。
关于LF5与安慰剂的比较的功效数据以下报道于表7a和图7中。
表7a与安慰剂相比LF5功效的研究结果
Figure GDA0003374206320000211
**P<0.01；***0.001
1Fisher
2Mann-Whitney
表7b:关于功效的患者选项
Figure GDA0003374206320000212
***0.001
1卡方逼近(Chi-square approximation)
4.1耐受性研究
两种制剂的临床耐受性均良好，其中3例LF5(6％)局部反应差，1例安慰剂(2％)局部反应差，两组间无统计学相关差异。没有观察到外周血流动力学或常规血液学的临床相关变化。
关于LF5与安慰剂比较的耐受性数据以下报道于表7b和图7中。
表7c与安慰剂相比LF5耐受性的研究结果
Figure GDA0003374206320000221
1卡方逼近
2费希尔精确检验(Fisher's exact test)
菌株LF5在治疗白色念珠菌阴道定殖方面具有功效和耐受性，这无疑是有利的，并且在任何情况下，与安慰剂相比显著更有利，这是因为具有统计学上更高的微生物学和临床功效，并且不良风险相同，没有临床相关的局部反应。因此，认为阴道胶囊中的LF5是用于治疗阴道念珠菌病的合成抗真菌药物的有效替代物。
测试组合物的实例
LF5专有医药产品的组成
各阴道胶囊含有：
活性成分：
冷冻干燥的发酵乳杆菌编号1和2(表4) 不小于109CFU
赋形剂：
中链甘油三酯 1.964mg
二氧化硅(Aerosil 300) 36mg
壳组成：
Figure GDA0003374206320000222
Figure GDA0003374206320000231
每个皮肤病油性悬浮液胶囊含有：活性成分：
冷冻干燥的发酵乳杆菌编号1和2(表4) 不小于109CFU
赋形剂：
中链甘油三酯 1.964mg
二氧化硅(Aerosil 300) 36mg
壳组成：
Figure GDA0003374206320000232
5在具有白色念珠菌的患者中LF5阴道胶囊与咪康唑相比的疗效和耐受性的临床研究
将平均年龄38.0岁(范围19-61岁)的100例阴道念珠菌病患者随机分为均匀的两组，治疗各自50名患者，他们根据实验双盲设计用咪康唑治疗或在阴道胶囊制剂中给予≤109的LF5，剂量为连续三天在夜间1个阴道胶囊。
在治疗期间或在治疗后两周观察期间没有发生中断，因此提供了两组50个功效和耐受性观察。
在三天治疗结束时两种治疗在几乎所有的患者中(96％v.s.94％)都产生念珠菌根除。对于两种治疗在治疗后两周内复发的风险也非常低。然而，咪康唑(8/47患者；17％)的复发风险相对于LF5(5/48例；10％)明显较高。两种治疗的症状缓解都非常有利。
两种制剂的临床耐受性都很好。然而，与LF5(2例；4％)相比，咪康唑(6例；12％)的局部不良事件频率为3倍。没有观察到外周血流动力学或常规血液学的临床相关变化。
关于LF5与咪康唑的比较的功效数据以下报道于表8a和图8a和8b中。
表8a与安慰剂相比LF5功效的研究结果
Figure GDA0003374206320000241
***0.001
1Fisher
2Mann-Whitney
表8b:关于功效的患者选项
Figure GDA0003374206320000242
***0.001
1卡方逼近
关于LF5与咪康唑的比较的耐受性数据以下报道于表8c中。
表8c与咪康唑相比LF5耐受性的研究结果
Figure GDA0003374206320000243
1卡方逼近
2费希尔精确检验
总之，LF5在阴道念珠菌病的治疗中呈现出有效性和耐受性特征，其无疑是有利的，并且就微生物学和临床功效的特征而言，与诸如咪康唑等沿用已久的药物是实质性相等的。然而，即使没有达到统计学意义，LF5耐受性与参考药物的耐受性相比也高得多。因此，LF5阴道胶囊产生用于治疗阴道念珠菌病的合成抗真菌药物的有效替代品。
6LF5：在具有白色念珠菌的患者中局部耐受性和活性的研究
治疗平均年龄34.0岁(范围17-65岁)的100例阴道炎、外阴阴道炎或更深入的白色念珠菌定殖患者，根据开放试验设计，在阴道胶囊制剂中给予≤109的LAB，剂量为1个阴道胶囊，在夜间连续14天。
没有发生治疗中断，因此提供了100个功效和耐受性观察。
在前三天治疗结束时LF5治疗在92％的患者中产生微生物根除，并且在随后的治疗期间在又有5％中产生微生物根除。总体而言，只有3％的患者未成功治疗。
在相同的观察期内，特别是在治疗的前三天期间检测到症状的显著缓解，并且在剩余的观察期间显著缓解也在统计学上显著。
临床耐受性良好，总共有5例报告局部反应不良。没有观察到常规血液学的临床相关变化。
总之，LF5在治疗白色念珠菌阴道定殖方面具有功效和耐受性特性，这无疑是有利的，因为它在应用的前三天已经具有统计学上显著的微生物学和临床功效，在治疗继续进行时具有进一步的改善，没有局部相关风险，具有总是轻微的、临床无关的和自发可逆的不良反应，实验室参数也没有可检测的改变风险。
因此，认为LF5阴道胶囊是用于治疗阴道念珠菌病的合成抗真菌药物的有效替代品，即使它扩散到近端结构和在具有诸如妊娠等特定状况的患者中也是如此。
方法
该方法的目的是验证给定的细菌是否能够通过产生具有抑菌/杀菌作用的物质抑制阴道加德纳氏菌的肉汤生长。
材料和试剂：
-MRS肉汤(Difco)
-盐酸半胱氨酸(Cysteine chlorohydrate)溶胶5％水溶液，在无菌纯水中。通过0.22μm直径的注射器过滤器除菌
-THB(Todd Hewitt Broth Sigma–Aldrich)
-蛋白胨盐水溶液(MET_INT 119-版本，有效)
-NaOH 30％
-阴道加德纳氏菌ATCC 14018(Biogenetics)
样品的取样和制备
抑制性菌株的制备
将益生菌两次连续接种到15ml的0.1％MRS肉汤(5.1)中，并在37±1℃进行温育过夜。当细菌属于双歧杆菌属时，培养肉汤补充有1％半胱氨酸HCl(5.2)。
除了肉汤量为100ml外，以同样的模式进行第三次接种。
继续温育至多30±3小时。
将肉汤培养物如此离心，并通过加入浓NaOH使与细胞分离的上清液达到pH 6.6±0.2。
然后将上清液通过0.2μm过滤器过滤并储存在4-5℃的温度下。
阴道加德纳氏菌的制备
将阴道加德纳氏菌ATCC 14018球团接种到补充有1％半胱氨酸HCl(5.2)的10mlTHB培养基中，并在37±1℃温育过夜。
在37±1℃下以1％进行连续接种过夜。
将如此制备的新鲜肉汤培养物用于抑制实验
步骤：
制备的无菌管含有：
Figure GDA0003374206320000261
如此制备的所有管均加入1％半胱氨酸HCl(5.2)。
然后用阴道加德纳氏菌的新鲜肉汤培养物以1％接种它们，并在37±1℃温育24+24小时。
在24和48小时，通过对每组使用与两种培养物具有相同百分比组成的空白进行分光光度读数(波长λ600)。
7.与唑类疗法相比的功效的比较研究
鉴于上述情况，基于其对抗念珠菌属不同物种的能力，在体外选择发酵乳杆菌菌株的组合，然后在抑制功效方面与咪康唑和氟康唑进行比较。具体而言，研究了乳杆菌菌株作为微生物用于预防和/或辅助治疗急性外阴阴道念珠菌病(VVC)和由念珠菌属酵母引起的其它阴道感染的可能用途。
材料和方法
菌株和细菌生长的条件
在本研究中使用的念珠菌属菌株购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。具体而言，使用以下生物型：白色念珠菌ATCC 10231、近平滑念珠菌ATCC 22019、克鲁斯念珠菌ATCC 6258、光滑念珠菌ATCC 2001和热带念珠菌ATCC 750(14)。
将本研究中的乳杆菌菌株(均分离自健康女性受试者的阴道拭子或直接刷过健康人的肠粘膜)，根据其表型和基因型特征进行分类：发酵乳杆菌LF5(DSM 32277)、发酵乳杆菌LF09(DSM 18298)、发酵乳杆菌LF10(DSM 19187)和发酵乳杆菌LF11(DSM 19188)。
将益生菌菌株在De Man,Rogosa and Sharpe(MRS)培养基(Difco,BD,Maryland)中培养过夜。在所有实验中，使用用于所有念珠菌属菌株的新鲜培养基。在实验之前，将单一的念珠菌属菌株在沙保氏葡萄糖肉汤(Difco,BD,Maryland)(酵母的最佳培养基)中培养，在有氧条件下培养48小时。
然后将每种益生菌在相同的肉汤(MRS)中与任何一种所述念珠菌属微生物共培养。益生菌和酵母的接种物之比为1：100，有利于后者。温育在有氧下于37℃进行24小时。在温育24小时后对每种培养物(1mL)取样，在酵母提取物葡萄糖氯霉素(YGC)琼脂(Sigma-Aldrich,Milan,意大利)上进行酵母的选择性计数。将YGC琼脂板在有氧条件下于37℃温育4天，以使任何存在的酵母生长。然后对集落计数，结果表示为每mL菌落形成单位(CFU)的数量。
评估杀真菌活性。氟康唑的最小抑制浓度(MIC)通过E-test(bioMérieux Italy,Florence)利用MHE琼脂确定。将板在有氧条件下于30℃温育并在24小时后读数。此外，由于没有针对咪康唑的特异性E-测试，因此通过使用肉汤大量稀释法确定MIC。我们评估了针对念珠菌菌株的连续稀释的氟康唑和咪康唑(Sigma-Aldrich,Missouri,USA)(从1mg/ml至1mg/ml)的活性。在存在念珠菌菌株的情况下在沙保氏葡萄糖肉汤中制备唑类的连续稀释液，并且在30℃的有氧条件下温育肉汤，然后在560nm的光密度(DO)下读数。MIC被定义为完全抑制可见生长的抗生素最低浓度。
结果
唑类对念珠菌属菌株的抑制活性。从表8-9中可以推断，除了近平滑念珠菌ATCC22019外，检测到对所有念珠菌属物种的显著抗性。关于这种生物型，获得了1mg/ml的MIC，从而证实了对氟康唑和咪康唑有轻微的敏感性。
表9通过使用培养基的大量稀释试验(光密度，OD)评估咪康唑的抑制活性
Figure GDA0003374206320000281
表10
来自E_检验的氟康唑的MIC(最小抑制浓度)(范围0.016-256μg/ml)。*P≤0.05
念珠菌属物种 MIC(μg/ml)
近平滑念珠菌ATCC 22019 1*
白色念珠菌ATCC 10231 >256
热带念珠菌ATCC 750 >256
克鲁斯念珠菌ATCC 6258 >256
光滑念珠菌ATCC 2001 >256
发酵乳杆菌对念珠菌的拮抗作用。
一旦检测到大多数念珠菌属物种对两种参考药物的抗性，就评估发酵乳杆菌抑制酵母生长的能力。
如图9所示，所有测试的乳杆菌菌株，即LF5、LF09、LF10和LF11，显示出将念珠菌的5个物种的生长显著抑制至少4个对数的能力。此外，使用咪康唑对近平滑念珠菌获得的最佳结果甚至低两个对数。LF5的结果报告在图10中。
有趣的是，人体内抗生素的剂量通常提供最大400mg/餐的管理：这样的口服浓度峰值平均血浆浓度为30-40pg/ml，这个值远低于在抗性菌株的情况下的功效截止值。
讨论
在体外测试了与咪康唑和氟康唑相比发酵乳杆菌对不同念珠菌物种的可能作用。
具体而言，通过两个不同的测试，即用于咪康唑的肉汤大量稀释测试和用于氟康唑的E-测试，将在增加浓度的咪康唑和氟康唑存在下的念珠菌物种的生长能力量化。
本发明的结果非常令人惊讶，并且给出了广泛用于抵抗念珠菌物种的生长的唑类体外功效相对不良的第一个证据，并且证明了属于发酵乳杆菌物种的乳酸菌的高功效。使用近平滑念珠菌ATCC 22019检测到唯一的抑制试验，尽管总体结果几乎没有相关性。唑类功效不良可能是念珠菌属感染频繁复发的原因。
实际上，可能难以获得酵母从阴道环境中的完全根除，因此保持了不利症状随后重新发展和临床表现的条件。
另一方面，根据本发明的所选择的发酵乳杆菌菌株证实了不仅可以有效和直接抵抗生长，而且还证实了几种念珠菌属菌株的活力。发酵乳杆菌的这些菌株中的一种，即菌株LF5(鉴定为保藏号CNCM I-789)用于具有急性VVC的女性，而与特定的念珠菌物种无任何关系，并且与因阴道加德纳氏菌导致的细菌感染的同时存在无关，因此证实了其解决症状和迅速根除感染的能力(Vicariotto F.等“Effectiveness of the association of2probiotic strains formulated in a slow release vaginal product,in womenaffected by vulvovaginal candidiasis:a pilot study”.J ClinGastroenterol.2012；46Suppl:S73-80)。
8.发酵乳杆菌LF5对阴道加德纳氏菌的抑制
该研究旨在评估发酵乳杆菌LF5在体外直接抑制阴道加德纳氏菌的能力，以便评估即使在混合阴道感染或BV的情况下其潜在功效。
材料和方法
细菌菌株和生长条件。
所用的阴道加德纳氏菌菌株购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。在实验之前，将阴道加德纳氏菌ATCC 14018在由2％明胶(重量/重量)、0.5％酵母提取物、0.1％淀粉和0.1％葡萄糖(7)组成的心脑输注(BHI)肉汤(Oxoid,Milan,意大利)中培养。
从健康女性受试者的阴道拭子中分离本研究中的发酵乳杆菌LF5菌株，并根据其表型和基因型特征进行分类。
将其在De Man,Rogosa and Sharpe(MRS)肉汤(Difco,BD,Maryland)中培养过夜。
评估LF5对阴道加德纳氏菌的拮抗活性。
如下制备LF5上清液：将MRS肉汤中的过夜培养物以5,000x g离心。将得到的上清液在pH6.5用NaOH 1N中和，通过注射器过滤器(Ministart孔径0.22mm)过滤灭菌，并分析肉汤中任何抑制分子的存在。然后向经中和的LF5上清液中加入不同百分比的如上制备的接种有阴道加德纳氏菌的新鲜BHI肉汤。在37℃于微需氧条件下温育24和48小时后，阴道加德纳氏菌单独(阳性对照)和在不同浓度的中和上清液(5％至20％)的存在下的生长通过600nm处的光密度定量(OD600)。在添加至量为5％至20％的新鲜MRS肉汤的BHI肉汤中评估阳性对照(单独的阴道加德纳氏菌)的生长。因此，阳性对照与接种有LF5的管尽可能相似。该试验重复三次以确保可靠性和再现性。
结果
表11中报道了LF5对阴道加德纳氏菌ATCC 10231的体外抑制结果。发酵乳杆菌LF5在24小时和48小时后都显示出显著活性(利用20％经中和的上清液，分别为46％和82％)。用经中和的上清液检测到剂量依赖性生长的显著抑制，特别是在温育48小时后，直至甚至80％的阴道加德纳氏菌的生长抑制(表9)。
表11
发酵乳杆菌LF5对阴道加德纳氏菌的生物活性。
LF5上清液(0.5、1和2mL)即使在24小时后也能够抑制阴道加德纳氏菌的生长，但最好的抑制是在48小时后。阳性对照＝阴道加德纳氏菌-在最佳培养基加上等体积的MRS(5％，10％和20％)中生长(n＝3)。
Figure GDA0003374206320000311
该研究表明，发酵乳杆菌LF5能够对阴道加德纳氏菌发挥根本性的抑制活性，从而揭示了多用途的应用。上述数据表明，菌株LF5也可用于治疗因不同菌株(其中尤其是白色念珠菌)导致的外阴阴道念珠菌病(VVC)；因此它甚至可以用于混合性阴道炎的临床管理。

Claims (14)

1.药物组合物或医疗器械用组合物，所述组合物包含：药用级的赋形剂、和包含至少一种属于发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)物种的细菌菌株或者由该细菌菌株组成的混合物；所述组合物用于阴道或口服使用以治疗至少一种阴道感染，其中所述至少一种阴道感染包括由病原性细菌阴道加德纳氏菌(Gardnerella vaginalis)引起的细菌性阴道病或由该细菌性阴道病组成，其中所述发酵乳杆菌物种的细菌属于保藏号为DSM 32277或CNCM I-789的菌株，保藏人为波比奥泰克股份公司。
2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述混合物还包含选自以下组的至少一种属于发酵乳杆菌物种的细菌菌株或者由其组成，所述组包含以下细菌菌株3至14或由它们组成：
Figure FDA0003374206310000011
3.如权利要求2所述的组合物，其中，所述混合物包含选自以下组的至少一种属于发酵乳杆菌的细菌菌株或由其组成，所述组包含细菌菌株编号7、8、11、12、13和14或由它们组成。
4.如权利要求3所述的组合物，其中，所述混合物包含选自以下组的至少一种属于发酵乳杆菌的细菌菌株或由其组成，所述组包含细菌菌株编号8、11、13和14或由它们组成。
5.如权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中，所述阴道感染还包括由选自以下组的至少一种病原体导致的阴道感染、阴道炎、外阴阴道炎或细菌性阴道病，所述组包括：白色念珠菌(Candida albicans)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、近平滑念珠菌(Candidaparapsilosis)、克鲁斯念珠菌(Candida krusei)、热带念珠菌(Candida tropicalis)、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、单纯疱疹(Herpes simplex)和杜克雷嗜血杆菌(HemophilusDucreyi)。
6.如权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中，所述组合物用于治疗由病原体白色念珠菌和阴道加德纳氏菌引起的阴道感染、病症或疾病。
7.如权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中，所述组合物为固体形式或液体形式。
8.如权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中，所述组合物为粉末、颗粒、片剂、锭剂、溶液、阴道灌洗剂、分散液或凝胶形式。
9.如权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中，所述混合物含有浓度为1×108CFU/g至1×1012CFU/g的所述细菌菌株。
10.如权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中，所述混合物含有浓度为1×109CFU/g至1×1011CFU/g的所述细菌菌株。
11.如权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中，所述组合物含有浓度为1×106CFU/g至1×1010CFU/g的所述细菌菌株。
12.如权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中，所述组合物含有浓度为1×107CFU/g至1×109CFU/g的所述细菌菌株。
13.如权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中，所述细菌混合物以1：2至1:10的重量比存在于所述组合物中。
14.如权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中，所述细菌混合物以1：3至1：5的重量比存在于所述组合物中。
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