CN109463530A - 一种调控肠道微生物的促生长饲料添加剂及其制备方法 - Google Patents

一种调控肠道微生物的促生长饲料添加剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种调控肠道微生物的促生长饲料添加剂及其制备方法，包括重量比例为50‑80份的桑黄菌丝发酵粉和重量比例为50‑20份的五味子、吴茱萸混合原料粉，一种调控肠道微生物的促生长饲料添加剂的制备方法，包括如下步骤：利用深层液体发酵技术获得桑黄菌体发酵物，五味子和吴茱萸按1:5‑5:1的重量比例混合后提取获得五味子吴茱萸提取物，本发明以深层液体发酵技术发酵桑黄菌丝体，获得的菌丝体周期短，桑黄菌丝与五味子、吴茱萸提取并合理配比后，使其协同发挥作用，调控肠道微生物，促进动物健康和生长，具有可比拟抗生素的促生长效果。

Description

一种调控肠道微生物的促生长饲料添加剂及其制备方法
【技术领域】
本发明涉及饲料添加剂的技术领域，特别是一种调控肠道微生物的促生长饲料添加剂及其制备方法的技术领域。
【背景技术】
人和动物胃肠道中栖息着大量微生物，这些微生物与宿主之间进行物质、能量、信息的交流，并与宿主共同组成互为整体的微生态系统。保持肠道微生态平衡，在维持机体健康中起着重要作用(陈滔彬，严曾豪，苏薇薇.肠道微生态对疾病的影响及其与中药的相互作用研究进展，中南药学，2018(3)：358-388)。在仔猪等生产动物中，腹泻等肠道疾病发病率高，对动物健康产生很大影响，研究表明通过调节肠道微生物、降低有害菌比率，可以降低肠道疾病，维护动物健康并提高生产性能。
桑黄为一种药食两用的大型真菌，具有抑菌、抗炎等生理功效(张维博，王家国，李正阔，等.药用真菌桑黄的研究进展，中国中药杂志:2014,39(15):2838-2845)。报道显示，桑黄菌丝体甲醇、正丁醇提取物和发酵液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌均有一定的抑制作用(孟庆龙，潘景芝，陈丽，等.桑黄发酵产物的抑菌作用，食品科学，2011(3)：56.)。桑黄在液体发酵条件下菌丝体生长速度快、营养代谢产物和次级代谢产物的生物利用率高，而且桑黄本身具有菌菇类的香气，除了具有健康调节作用外，还能够增加饲料口感，为良好的饲料添加成分。
五味子和吴茱萸是常用的中药材，五味子其被报道在板蓝根、甘草等29种药材中抑菌效果最好(李斌，孟宪军，薛雪，等.北五味子乙素清除自由基及体外抑菌作用的研究，食品科学，2011，32(5):79-82)，吴茱萸也有很强的抑菌作用，对大肠杆菌、沙门氏菌和链球菌都具有抑制效果(孙雨晴.复合植物提取物的组方、安全性评价及其在小鼠上的应用研究，浙江师范大学，2012.)。二者在常用的药材对比中都显示了突出了抑菌作用，因此其对动物肠道健康及微生态可能具有调节作用。
本发明在建立桑黄菌丝体的深层发酵工艺的基础之上，获得桑黄菌丝发酵物，并将其与五味子和吴茱萸的共同提取物合理配比组成配方，所得产品添加于饲料当中在仔猪上获得了良好的促生长效果，对肠道微生物显示了明显的调控作用。
【发明内容】
本发明的目的就是解决现有技术中的问题，提出一种调控肠道微生物的促生长饲料添加剂及其制备方法，以深层液体发酵技术发酵桑黄菌丝体，获得的菌丝体周期短。桑黄菌丝与五味子、吴茱萸提取并合理配比后，使其协同发挥作用，调控肠道微生物，促进动物健康和生长，具有可比拟抗生素的促生长效果。
为实现上述目的，本发明通过以下技术方案来实现：
一种调控肠道微生物的促生长饲料添加剂，包括重量比例为50-80份的桑黄菌丝发酵粉和重量比例为50-20份的五味子、吴茱萸混合原料粉。
作为优选，包括重量比例为50份的桑黄菌丝发酵粉和重量比例为50份的五味子、吴茱萸混合原料粉。
作为优选，包括重量比例为65份的桑黄菌丝发酵粉和重量比例为35份的五味子、吴茱萸混合原料粉。
作为优选，包括重量比例为80份的桑黄菌丝发酵粉和重量比例为20份的五味子、吴茱萸混合原料粉。
一种调控肠道微生物的促生长饲料添加剂的制备方法，包括如下步骤：
S1.制备桑黄菌丝发酵粉
①配制母种培养基并将桑黄母种在无菌条件下接种于母种培养基中进行活化；
②配制液体发酵培养基并将活化后的的桑黄母种接种到液体培养基上，在摇床内震荡培养7-14天获得桑黄原种，摇床的温度为20℃-30℃。
③将桑黄原种按照1:250-1:500的体积比接种至无菌发酵罐中，在温度为20℃-30℃的条件下培养7-14天以获得待用含菌丝体的发酵液；
④将发酵液用纱布过滤并分别收集菌丝体和发酵液；
⑤将菌丝体置于50℃-65℃的烘箱中烘干并用粉碎机磨成粉从而获得菌丝体粉，将发酵液浓缩至小体积后冷冻或喷雾干燥从而获得发酵产物粉；
⑥将菌丝体粉和发酵产物粉充分混合均匀从而获得桑黄菌丝发酵粉。
S2.制备五味子、吴茱萸混合原料粉
①将成熟的五味子和吴茱萸在温度低于65℃的条件下进行烘干和粉碎，将粉碎物过30目至80目的筛；
②将五味子粉和吴茱萸粉按照1:5-5:1的重量比例称取并混匀，接着在五味子和吴茱萸混合粉中加入自来水配制成质量浓度为1:30-1:50的溶液并在温度为80℃-100℃的条件下提取4-6小时；
③在提取完成后，过滤，收集滤液，在滤渣中加入自来水配制成质量浓度为1:30-1：50的溶液并在温度为80℃-100℃的条件下提取2-3小时，再次过滤后，合并两次的滤液；
④将合并后的滤液浓缩至小体积后喷雾干燥或冷冻干燥得到干燥固体并在研磨仪中磨成细粉从而获得五味子吴茱萸混合原料粉。
S3.混合原料粉
①将桑黄菌丝发酵粉和五味子、吴茱萸混合原料粉充分混合均匀。
作为优选，所述母种培养基为PDA培养基，所述的母种培养基包括重量比例为200份的马铃薯、20份的白砂糖、20份的琼脂、1.5份的MgSO4、1.5份的KH2PO4和1000份的水。
作为优选，所述液体发酵培养基包括重量比例为200份的马铃薯、20份的白砂糖、1.5份的MgSO4、1.5份的KH2PO4和1000份的水。
本发明的有益效果：本发明以深层液体发酵技术发酵桑黄菌丝体，获得的菌丝体周期短。桑黄菌丝与五味子、吴茱萸提取并合理配比后，使其协同发挥作用，调控肠道微生物，促进动物健康和生长，具有可比拟抗生素的促生长效果。
本发明的特征及优点将通过实施例结合附图进行详细说明。
【附图说明】
图1为本工艺生产的添加剂对仔猪日增重的影响；
图2为本工艺生产的添加剂对仔猪日采食量的影响；
图3为本工艺生产的添加剂对仔猪日料重比的影响；；
图4为本工艺生产的添加剂对仔猪粪便大肠杆菌活菌计数的影响。
图5为本工艺生产的添加剂对仔猪粪便葡萄球菌属占微生物总量百分比的影响。
图6为本工艺生产的添加剂对仔猪粪便乳杆菌属占微生物总量百分比的影响。
图7为本工艺生产的添加剂对仔猪粪便双歧杆菌属占微生物总量百分比的影响。
【具体实施方式】
本发明一种调控肠道微生物的促生长饲料添加剂，包括重量比例为50-80份的桑黄菌丝发酵粉和重量比例为50-20份的五味子、吴茱萸混合原料粉。
一种调控肠道微生物的促生长饲料添加剂的制备方法包括如下步骤：
S1.制备桑黄菌丝发酵粉
①配制母种培养基并将桑黄母种在无菌条件下接种于母种培养基中进行活化；
②配制液体发酵培养基并将活化后的的桑黄母种接种到液体培养基上，在摇床内震荡培养7-14天获得桑黄原种，摇床的温度为20℃-30℃。
③将桑黄原种按照1:250-1:500的体积比接种至无菌发酵罐中，在温度为20℃-30℃的条件下培养7-14天以获得待用含菌丝体的发酵液；
④将发酵液用纱布过滤并分别收集菌丝体和发酵液；
⑤将菌丝体置于50℃-65℃的烘箱中烘干并用粉碎机磨成粉从而获得菌丝体粉，将发酵液浓缩至小体积后冷冻或喷雾干燥从而获得发酵产物粉；
⑥将菌丝体粉和发酵产物粉充分混合均匀从而获得桑黄菌丝发酵粉。
S2.制备五味子、吴茱萸混合原料粉
①将成熟的五味子和吴茱萸在温度低于65℃的条件下进行烘干和粉碎，将粉碎物过30目至80目的筛；
②将五味子粉和吴茱萸粉按照1:5-5:1的重量比例称取并混匀，接着在五味子和吴茱萸混合粉中加入自来水配制成质量浓度为1:30-1:50的溶液并在温度为80℃-100℃的条件下提取4-6小时；
③在提取完成后，过滤，收集滤液，在滤渣中加入自来水配制成质量浓度为1:30-1：50的溶液并在温度为80℃-100℃的条件下提取2-3小时，再次过滤后，合并两次的滤液；
④将合并后的滤液浓缩至小体积后喷雾干燥或冷冻干燥得到干燥固体并在研磨仪中磨成细粉从而获得五味子吴茱萸混合原料粉。
S3.混合原料粉
①将桑黄菌丝发酵粉和五味子、吴茱萸混合原料粉充分混合均匀。
所述母种培养基为PDA培养基，所述的母种培养基包括重量比例为200份的马铃薯、20份的白砂糖、20份的琼脂、1.5份的MgSO4、1.5份的KH2PO4和1000份的水，所述液体发酵培养基包括重量比例为200份的马铃薯、20份的白砂糖、1.5份的MgSO4、1.5份的KH2PO4和1000份的水。
实施例一：
取重量比例为50份的桑黄菌丝发酵粉和重量比例为50份的五味子、吴茱萸混合原料粉。桑黄菌丝发酵粉的制备步骤为，首先，配制母种培养基，母种培养基为PDA培养基，包括重量比例为200份的马铃薯、20份的白砂糖、20份的琼脂、1.5份的MgSO4、1.5份的KH2PO4和1000份的水，将桑黄母种在无菌条件下接种于母种培养基中进行活化。接着，配制液体发酵培养基，液体发酵培养基包括重量比例为200份的马铃薯、20份的白砂糖、1.5份的MgSO4、1.5份的KH2PO4和1000份的水，将活化后的的桑黄母种接种到液体培养基上，在摇床内震荡培养10天获得桑黄原种，摇床的温度为25℃。随后，将桑黄原种按照1:350的体积比接种至无菌发酵罐中，在温度为25℃的条件下培养10天以获得待用含菌丝体的发酵液。然后，将发酵液用纱布过滤并分别收集菌丝体和发酵液，将菌丝体置于60℃的烘箱中烘干并用粉碎机磨成粉从而获得菌丝体粉，将发酵液浓缩至小体积后喷雾干燥从而获得发酵产物粉，将菌丝体粉和发酵产物粉充分混合均匀从而获得桑黄菌丝发酵粉。五味子、吴茱萸混合原料粉的制备步骤为，首先，将成熟的五味子和吴茱萸在温度60℃的条件下进行烘干和粉碎，将粉碎物过60目的筛，接着将五味子粉和吴茱萸粉按照1:1的重量比例称取并混匀，随后，在五味子和吴茱萸混合粉中加入自来水配制成质量浓度为1:40的溶液并在温度为90℃的条件下提取5小时，在提取完成后，过滤，收集滤液，在滤渣中加入自来水配制成质量浓度为1:40的溶液并在温度为90℃的条件下提取2.5小时，再次过滤后，合并两次的滤液，将合并后的滤液浓缩至小体积后喷雾干燥得到干燥固体并在研磨仪中磨成细粉从而获得五味子吴茱萸混合原料粉。
实施例二：
取重量比例为65份的桑黄菌丝发酵粉和重量比例为35份的五味子、吴茱萸混合原料粉。其他条件同实施例一。
实施例三：
取重量比例为80份的桑黄菌丝发酵粉和重量比例为20份的五味子、吴茱萸混合原料粉。其他条件同实施例一。
本发明的实验效果：
1.试验动物及试验设计
取96头体重为6±2kg的去势杜洛克×长白×大约克仔猪根据体重均匀分为3个组，每个组4个重复，每重复8头仔猪饲养于一栏中。3个组分别为无抗组、抗生素组和受试产品组。其中，无抗组采用基础日粮，不添加饲用抗生素，抗生素组在基础日粮中添加金霉素75g/t，吉他霉素20g/t，受试产品组在基础日粮添加本发明产品5kg/t。
试验期28天，称量试验中期和末期体重，记录采食量。第28天，每组随意选取10头仔猪取直肠内粪便。
本发明所使用的桑黄菌来自浙江省农业科学院蚕桑所，其在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC No.11407。
2.平板法大肠杆菌活菌计数
取粪便1.0g溶解于9ml无菌生理盐水中，充分混匀，吸取1ml混悬液，加入另外9ml无菌生理盐水中，作为10-1浓度，照此10倍稀释至10-8，每个浓度取100μl至麦康凯平板培养基上，涂布棒涂匀，37℃培养箱培养24h，计数红色的菌落为大肠杆菌菌落数。
3.粪便16sRNA宏基因组分析
取粪便1.0g溶解于9ml无菌生理盐水中，充分混匀，吸取1ml混悬液，加入另外9ml无菌生理盐水中，作为10-1浓度，照此10倍稀释至10-8，每个浓度取100μl至麦康凯平板培养基上，涂布棒涂匀，37℃培养箱培养24h，计数红色的菌落为大肠杆菌菌落数。
4.粪便16sRNA宏基因组分析
CTAB法提取粪便基因组DNA。以稀释后的基因组DNA为模板，使用特异引物，KAPAHiFi HotStart Ready Mix试剂盒进行PCR扩增。16S V3+4区引物(515F和806R)鉴定细菌多样性。等量混样不同浓度PCR产物，使用2％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，使用QIAquickGel Extraction Kit胶回收试剂盒回收产物。
使用TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过Qubit和Q-PCR定量，检测合格的文库使用Illumina MiSeq进行测序。对测序得到的有效数据进行分类单元(operational taxonomic units，OTUs)聚类和物种分类分析。
5.试验结果
5.1本工艺生产的添加剂对仔猪生产性能的影响
由图1结果可见，与无抗组相比，添加本受试产品显著提高了仔猪的日增重(P<0.05)，与抗生素组之间无显著差异(P>0.05)，且本受试产品有提高采食量和降低料重比的趋势(P>0.05)。
5.2本工艺生产的添加剂对肠道微生物的影响
从图4、图5、图6、图7可以看出，本发明产品对有害菌大肠杆菌、葡萄球菌有显著的抑制作用(P>0.05)，作用强于抗生素；与抗生素相比，本发明产品对益生菌双歧杆菌、乳杆菌没有抑制作用(P>0.05)。
本发明以深层液体发酵技术发酵桑黄菌丝体，获得的菌丝体周期短。桑黄菌丝与五味子、吴茱萸提取并合理配比后，使其协同发挥作用，调控肠道微生物，促进动物健康和生长，具有可比拟抗生素的促生长效果。
上述实施例是对本发明的说明，不是对本发明的限定，任何对本发明简单变换后的方案均属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种调控肠道微生物的促生长饲料添加剂，其特征在于：包括重量比例为50-80份的桑黄菌丝发酵粉和重量比例为50-20份的五味子、吴茱萸混合原料粉。
2.如权利要求1所述的一种调控肠道微生物的促生长饲料添加剂，其特征在于：包括重量比例为50份的桑黄菌丝发酵粉和重量比例为50份的五味子、吴茱萸混合原料粉。
3.如权利要求1所述的一种调控肠道微生物的促生长饲料添加剂，其特征在于：包括重量比例为65份的桑黄菌丝发酵粉和重量比例为35份的五味子、吴茱萸混合原料粉。
4.如权利要求1所述的一种调控肠道微生物的促生长饲料添加剂，其特征在于：包括重量比例为80份的桑黄菌丝发酵粉和重量比例为20份的五味子、吴茱萸混合原料粉。
5.一种调控肠道微生物的促生长饲料添加剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
S1.制备桑黄菌丝发酵粉
①配制母种培养基并将桑黄母种在无菌条件下接种于母种培养基中进行活化；
②配制液体发酵培养基并将活化后的的桑黄母种接种到液体培养基上，在摇床内震荡培养7-14天获得桑黄原种，摇床的温度为20℃-30℃。
③将桑黄原种按照1:250-1:500的体积比接种至无菌发酵罐中，在温度为20℃-30℃的条件下培养7-14天以获得待用含菌丝体的发酵液；
④将发酵液用纱布过滤并分别收集菌丝体和发酵液；
⑤将菌丝体置于50℃-65℃的烘箱中烘干并用粉碎机磨成粉从而获得菌丝体粉，将发酵液浓缩至小体积后冷冻或喷雾干燥从而获得发酵产物粉；
⑥将菌丝体粉和发酵产物粉充分混合均匀从而获得桑黄菌丝发酵粉。
S2.制备五味子、吴茱萸混合原料粉
①将成熟的五味子和吴茱萸在温度低于65℃的条件下进行烘干和粉碎，将粉碎物过30目至80目的筛；
②将五味子粉和吴茱萸粉按照1:5-5:1的重量比例称取并混匀，接着在五味子和吴茱萸混合粉中加入自来水配制成质量浓度为1:30-1:50的溶液并在温度为80℃-100℃的条件下提取4-6小时；
③在提取完成后，过滤，收集滤液，在滤渣中加入自来水配制成质量浓度为1:30-1：50的溶液并在温度为80℃-100℃的条件下提取2-3小时，再次过滤后，合并两次的滤液；
④将合并后的滤液浓缩至小体积后喷雾干燥或冷冻干燥得到干燥固体并在研磨仪中磨成细粉从而获得五味子吴茱萸混合原料粉。
S3.混合原料粉
①将桑黄菌丝发酵粉和五味子、吴茱萸混合原料粉充分混合均匀。
6.如权利要求5所述的一种调控肠道微生物的促生长饲料添加剂的制备方法，其特征在于：所述母种培养基为PDA培养基，所述的母种培养基包括重量比例为200份的马铃薯、20份的白砂糖、20份的琼脂、1.5份的MgSO4、1.5份的KH2PO4和1000份的水。
7.如权利要求5所述的一种调控肠道微生物的促生长饲料添加剂的制备方法，其特征在于：所述液体发酵培养基包括重量比例为200份的马铃薯、20份的白砂糖、1.5份的MgSO4、1.5份的KH2PO4和1000份的水。
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