CN109456896A - 一种具有食用价值的蘑菇属真菌新种及其应用 - Google Patents

一种具有食用价值的蘑菇属真菌新种及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有食用价值的蘑菇属真菌新种及其应用。本发明提供的蘑菇属真菌新种为中国四孢蘑菇(Agaricus sinotetrasporus)ZRL20161020，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.14353。中国四孢蘑菇(Agaricus sinotetrasporus)ZRL20161020在制备食品、药品和保健品中具有重要的应用价值，同时对蘑菇的研究与开发，及保护我国野生种质资源和食用菌遗传育种都有着重要意义。

Description

一种具有食用价值的蘑菇属真菌新种及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体涉及一种具有食用价值的蘑菇属真菌新种及其应用。
背景技术
蘑菇属(Agaricus L.)在分类学上隶属于真菌界(Fungi)、担子菌门(Basidiomycota)、伞菌纲(Agaricomycetes)、蘑菇目(Agaricales)、伞菌科(Agaricaceae)的模式属。该属子实体肉质，菌盖比较厚，表面光滑或有鳞片，菌柄生于菌盖下正中央，易于分离；有膜质菌环，单层或双层；菌肉厚，有的伤处变淡黄或红色；菌褶离生，初期近无色，或粉红渐变褐色或黑褐色；孢子印粉红、红棕、棕至黑色；孢子光滑、褐色、卵圆或椭圆形；菌丝通常无锁状联合；以四孢蘑菇(Agaricus campestris)为模式种。蘑菇属包含有世界范围著名的栽培种，如双孢蘑菇(A.bisporus)是世界上栽培最广泛，产量最大的食用菌，姬松茸又名巴西蘑菇(A.subrufescens)是继双孢蘑菇后世界范围的栽培种，此外双环蘑菇又名大肥菇(A.bitorquis)和野蘑菇(A.arvensis)等也已商业化栽培。仅双孢蘑菇的产量接近于世界人工栽培食用菌总产量的一半，在世界食用菌产业中占据着非常重要的位置。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种蘑菇属真菌新种。
本发明所提供的蘑菇属真菌新种为中国四孢蘑菇(Agaricus sinotetrasporus)ZRL20161020，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.14353。
所述中国四孢蘑菇(Agaricus sinotetrasporus)ZRL20161020CGMCC No.14353在制备食品中的应用也属于本发明的保护范围。
所述中国四孢蘑菇(Agaricus sinotetrasporus)ZRL20161020CGMCC No.14353在制备药品中的应用也属于本发明的保护范围。
所述中国四孢蘑菇(Agaricus sinotetrasporus)ZRL20161020CGMCC No.14353在制备保健品中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还保护培养所述中国四孢蘑菇(Agaricus sinotetrasporus)ZRL20161020CGMCC No.14353的方法，可包括将所述中国四孢蘑菇(Agaricussinotetrasporus)ZRL20161020CGMCC No.14353在用于培养蘑菇的培养基中培养的步骤。
上述方法中，所述“用于培养蘑菇的培养基”可为PDA加富培养基。
所述PDA加富培养基的制备方法可如下：取去皮的马铃薯200g(已切成小块)和130g小麦粒，加入1L蒸馏水煮沸30min，过滤，向滤液中加入葡萄糖20g、磷酸氢二钾1g、硫酸镁0.5g和琼脂20g，用蒸馏水定容至1L，pH值自然，115℃高压灭菌20min。
本发明的发明人提供的中国四孢蘑菇(Agaricus sinotetrasporus)ZRL20161020CGMCC No.14353是一个具有食用价值的新物种，在制备食品、药品和保健品中具有重要的应用价值，同时对蘑菇的研究与开发，及保护我国野生种质资源和食用菌遗传育种都有着重要意义。
保藏说明
菌种名称：中国四孢蘑菇
拉丁名：Agaricus sinotetrasporus
菌株编号：ZRL20161020
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2017年07月17日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.14353
附图说明
图1为真菌ZRL20161020的形态学鉴定结果。
图2为真菌ZRL20161020的形态学鉴定结果。
图3为系统发育树的实验结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
PDA加富培养基：取去皮的马铃薯200g(已切成小块)和130g小麦粒，加入1L蒸馏水煮沸30min，过滤，向滤液中加入葡萄糖20g、磷酸氢二钾1g、硫酸镁0.5g和琼脂20g，用蒸馏水定容至1L，pH值自然，115℃高压灭菌20min。
实施例1、中国四孢蘑菇(Agaricus sinotetrasporus)ZRL20161020CGMCCNo.14353的分离、鉴定和保藏
一、真菌ZRL20161020的分离
本发明的发明人从甘肃省张掖市肃南县祁连山国家自然保护区(E 100°14'31.13"，N 38°32'52.71"；海拔2810-2980m)采集野生真菌子实体(野外采集号ZRL20161020)。挑取其菌盖和菌柄交接处组织，然后置于装有PDA加富培养基的斜面培养基上，25℃暗培养5d，得到菌丝。挑出菌丝纯化两次，获得真菌ZRL20161020的纯化菌株。每次纯化的步骤为：将菌丝置于装有PDA加富培养基的斜面培养基上，25℃暗培养5d。
采集到的野生子实体剩余部分制备成干标本，并保存于中国科学院微生物研究所菌物标本馆(馆藏号HMAS255155，http://biaobenguan.im.ac.cn；地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号)。在下文中，将该干标本称为干标本HMAS255155。
二、真菌ZRL20161020的鉴定
1、形态学鉴定
首先观察真菌ZRL20161020的子实体的组成部分和形态特征，然后观察各显微特征。
实验结果见图1(a-d为宏观形态，e为担子，f为担孢子，g为褶缘囊体，h为菌盖表皮菌丝)和图2(菌丝形态)。
形态学特征结果如下：幼时菌盖直径2-4cm，半球形，成熟后渐平展，中部微凹，直径8-9cm。菌盖表面通常覆盖有密的褐色或咖啡色鳞片，平伏，有时由于雨水冲刷，鳞片脱落，露出白灰色的菌盖表皮。菌褶初为粉红色，渐变为深褐色，离生，不等长。菌柄中生，圆柱形，幼时直径15-20mm，长度25-40mm，成熟时顶部直径8-11mm、基部直径25-30mm，长度55-65mm；基部膨大呈球基状，内部松软。菌环白色，形成方式是从菌柄上部向下延伸，厚，双层。菌肉切开后明显变红。气味蘑菇味。担孢子(6.3-7.6)μm×(4.5-5.7)μm，椭圆形，光滑，褐色。担子(24-29)μm×(7.6-12)μm，棒形，每个担子大多具有4个担子小梗，少数2个担子小梗。褶缘囊体(27-35)μm×(13-16)μm，近棒形，无色。
形态学特征上，真菌ZRL20161020与双孢菇四孢变种(A.bisporusvar.eurotetrasporus)有诸多相似之处(如菌盖颜色、担子、担孢子的形状和大小等)，主要区别在于真菌ZRL20161020的菌环形成方式是从菌柄上部向下延伸，而双孢菇四孢变种不具有此特性。在地理分布上，双孢菇四孢变种只分布于欧洲。
2、分子系统发育分析
(1)按照广谱植物基因组提取试剂盒(北京博迈德生物技术有限公司的产品)的操作步骤，提取真菌ZRL20161020的基因组DNA。
(2)以真菌ZRL20161020的基因组DNA为模板，分别采用引物对ITS(由ITS-F：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′和ITS-R：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′组成)、引物对LSU(由LSU-F：5′-ACCCGCTGAACTTAAGC-3′和LSU-R：5′-TCCTGAGGGAAACTTCG-3′组成)、引物对EF1(由EF1-F：5′-GCYCCYGGHCAYCGTGAYTTYAT-3′(Y为C或T，H为A或T或C)和EF1-R：5′-ACHGTRCCRATACCACCRATCTT-3′(H为A或T或C，R为A或G)组成)和引物对MIP(由MIP-F：5′-ACAGGCGCAGATGATTATGC-3′和MIP-R：5′-GGTTCAGGTGGGCAATAAA-3′组成)进行PCR扩增，依次得到PCR扩增产物甲、PCR扩增产物乙、PCR扩增产物丙和PCR扩增产物丁。
反应体系为25μL，由1μL模板(含10pg-1μg真菌ZRL20161020的基因组DNA)、1μL上游引物(即引物名称中含有“-F”的引物)、1μL下游引物(即与上游引物对应的、引物名称中含有“-R”的引物)、12μL 2×Taq PCR Master Mix和10μL ddH2O组成。
2×TaqPCR Master Mix为含0.4mM dNTPs、4.0mM MgCl2和0.05unit/μL Taq DNA聚合酶的水溶液。
反应程序：94℃变性4min；94℃变性40s、50℃退火50s、72℃延伸50s，共35个循环；72℃延伸8min。
(3)完成步骤(2)后，由北京博迈德生物技术有限公司分别对各个PCR扩增产物进行测序。
测序结果表明，PCR扩增产物甲、PCR扩增产物乙、PCR扩增产物丙和PCR扩增产物丁的核苷酸序列依次如序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4所示。
(4)按照上述(1)-(3)的步骤，将真菌ZRL20161020替换为干标本HMAS255155，其它步骤均不变。结果表明，干标本HMAS255155和真菌ZRL20161020的PCR扩增产物的核苷酸序列完全一致，因此，干标本HMAS255155和真菌ZRL20161020为相同物种。
(5)将步骤(3)得到的测序结果先用SeqMan软件(http://www.dnastar.com/t-seqmanpro.aspx)进行校订拼接，然后将整理好的四个基因序列在SequenceMatrix中连接。从GenBank下载相关序列并构建DNA序列数据集。该数据集先用BioEdit软件进行自动比对，然后手动调整，再进行系统发育分析。分别采用RaxML软件(raxmlGUI v.1.3DanieleSilvestro&Ingo Michalak，http://sourceforge.net/projects/raxmlgui/)最大似然法(ML)和MrBayes软件的贝叶斯法构建系统发育图谱。用自展值(Parsimony bootstrap，BS；大于50％的视为支持)和后验概率(Posterior probability，PP；大于0.8的视为支持)来检验各个系统发育节点的可靠性。
系统发育树的实验结果见图3(粗下划线为真菌ZRL20161020；ZRL20161862A.sinotetrasporus、ZRL20162148A.sinotetrasporus和ZRL20162192A.sinotetrasporus均为本发明的发明人从甘肃省张掖市肃南县祁连山国家自然保护区(E 100°14'31.13"，N 38°32'52.71"；海拔2810-2980m)不同地点采集的野生真菌；其它名称中含有“ZRL”的真菌的相关DNA序列均在已发表的文献中公开；剩余真菌为从GenBank下载的相关序列对应的真菌)：真菌ZRL20161020、ZRL20161862A.sinotetrasporus、ZRL20162148A.sinotetrasporus和ZRL20162192A.sinotetrasporus聚在一起形成一个单系群，并获得较高支持率(85％BS，1PP)。
真菌ZRL20161020属于蘑菇属中Pseudochitonia亚属，Bivelares组，并且和广泛商业化栽培的双孢蘑菇(A.bisporus)具有很近的遗传进化关系。
综合上述各个鉴定结果，将真菌ZRL20161020鉴定为蘑菇属的新种，将该新种命名为中国四孢蘑菇(Agaricus sinotetrasporus)。
三、真菌ZRL20161020的保藏
真菌ZRL20161020已于2017年07月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNo.14353。真菌ZRL20161020的全称为中国四孢蘑菇(Agaricus sinotetrasporus)ZRL20161020CGMCC No.14353。
实施例2、中国四孢蘑菇(Agaricus sinotetrasporus)ZRL20161020CGMCCNo.14353的食用性
将中国四孢蘑菇(Agaricus sinotetrasporus)ZRL20161020CGMCC No.14353的子实体喂食给动物均无毒，试吃后确定该种为可食性蘑菇。中国四孢蘑菇(Agaricussinotetrasporus)ZRL20161020CGMCC No.14353菌柄菌盖的鲜菇清香，炖汤、清炒均味道鲜味，口感好。因此，本发明提供的中国四孢蘑菇(Agaricus sinotetrasporus)ZRL20161020CGMCC No.14353具有食用性，可开发为人工栽培食用菌。
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 一种具有食用价值的蘑菇属真菌新种及其应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 722
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
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gagcatgtgc acgcctgtct ggacttcatt ttcatccacc tgtgcacctt ttgtagtctt 120
tttcaggtat tgaaggaagt ggtcagccta tcagctcttt gctggatgta aggacttgca 180
gtgtgaaaac agtgctgtcc tttaccttga ccatggactc tttttcctgt cagagtctat 240
gttattcatt atactcttag aatgtcattg aatgtcttta catgggctat gcctatgaaa 300
attattatac aactttcagc aacggatctc ttggctctcg catcgatgaa gaacgcagcg 360
aaatgcgata agtaatgtga attgcagaat tcagtgaatc atcgaatctt tgaacgcatc 420
ttgcgctcct tggtattccg aggagcatgc ctgtttgagt gtcattatat tctcaactct 480
ccaatacctt gttgtaaagg agagcttgga ttgtggaggt ttgctggcca cttgcttggg 540
gtcagctcct ctgaaatgca ttagcggaac cgtctgcgat ctgccacaag tgtgataact 600
tatctacact ggcgagggga ttgctttctg tgatgttcag cttctaatcg tctgaggaca 660
atttcttgaa tgcttgacct caaatcaggt aggactaccc gctgaactta agcatatcat 720
aa 722
<210> 2
<211> 911
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
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ggtctttggc cgtccgagtt gtaatctaga gaagtaatgc ccgtgctgga ccgtgtataa 120
gtctcctggg atggggcgtc atagagggtg agaatcccgt ctttgacacg gactaccagt 180
gcattgtggt atgctctcaa agagtcgagt tgtttgggaa tgcagctcaa aatgggtggt 240
aaattccatc taaagctaaa tattggcgag agaccgatag cgaacaagta ccgtgaggga 300
aagatgaaaa gaactttgga aagagagtta aacagtacgt gaaattgctg aaagggaaac 360
gcttgaagtc agtcgcgttg gccagggatc agccttgctt ttgcatggtg tactttctgg 420
ttgacgggtc agcatcaatt ttgaccgctg gaaaagggcc tggggaatgt ggcagcttcg 480
gctgtgttat agcccctggt cgcatacagc ggttgggatt gaggaactca gcacgccgca 540
aggccgggtt ttgaccacgt ttcgtgctta ggatgctggc ataatggctt taagcgaccc 600
gtcttgaaac acggaccaag gagtctaaca tgcctgcgag tatttgggtg gaaaacccga 660
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<211> 547
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
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atcatcgccg gtggtactgg tgaattcgag gctggtatct ccaaggatgg tcagactcgc 120
gagcacgctc tccttgcctt cactcttggt gtccgtcaac ttattgttgc cgtcaacaag 180
atggacacaa ccaaggtttg ttcaaaactt tgttactgct ccatgaatac ttacaatttg 240
aacagtggag tgaggaccgc ttcaatgaaa tcatcaagga aacctccacc ttcatcaaga 300
aggtcggcta caaccccaag accgttgcct tcgtccccat ctctggatgg cacggtgata 360
acatgttgga agaatccccc aagtaagtgc atccgaaaca ttggactacc taaagttctc 420
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tcactaaggg caagactctt cttgatgcta ttgacgctat cgagcccccc gtccgtccct 540
ccgacaa 547
<210> 4
<211> 392
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
gcaataaaaa tcgcggtccc aggcttgaat tgtgggtggt gaggagagag cgtggtgtgc 60
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ctggtacata aaggacagac actcacctgg tgttttagcc attttgtcat ccagagtcat 240
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ttccaatgtg ttgatatcct tctccgcact cgaatttgat gcaatatata atctttttcg 360
aggttcctca tctggcgctg agcgcataat ca 392

Claims (6)

1.中国四孢蘑菇(Agaricus sinotetrasporus)ZRL20161020，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.14353。
2.权利要求1所述中国四孢蘑菇(Agaricus sinotetrasporus)ZRL20161020CGMCCNo.14353在制备食品中的应用。
3.权利要求1所述中国四孢蘑菇(Agaricus sinotetrasporus)ZRL20161020CGMCCNo.14353在制备药品中的应用。
4.权利要求1所述中国四孢蘑菇(Agaricus sinotetrasporus)ZRL20161020CGMCCNo.14353在制备保健品中的应用。
5.培养权利要求1所述中国四孢蘑菇(Agaricus sinotetrasporus)ZRL20161020CGMCCNo.14353的方法，包括将所述中国四孢蘑菇(Agaricus sinotetrasporus)ZRL20161020CGMCC No.14353在用于培养蘑菇的培养基中培养的步骤。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：用于培养蘑菇的培养基为PDA加富培养基。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN110982708A (zh) * 2019-12-23 2020-04-10 云南大学 菌株及其在重金属污染环境生物修复中的应用

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