CN109444407A - 一种检测动物甲状腺激素的试剂盒 - Google Patents
一种检测动物甲状腺激素的试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测动物甲状腺激素的试剂盒，其包括包被了抗甲状腺激素抗体的毛细管、酶标甲状腺类似物、发光底物和洗涤液。本发明检测动物总甲状腺激素，加样量少，成本低，而且具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精密度、操作方法简单和检查效率高的优点。
Description
技术领域
本发明属于免疫分析技术领域，尤其涉及一种检测动物甲状腺激素的试剂盒。
背景技术
甲状腺激素的生理作用非常广泛，它控制着机体基础代谢率、蛋白质合成和对其他激素的敏感性等，对机体生长、发育、代谢、生殖和组织分化等各种功能均由重要影响，作用于大脑、心肌、肝脏、胃肠道、脂肪组织等多种器官和组织，是体内最重要的生理性激素之一。甲状腺激素合成和分泌不足会引起甲状腺功能减退症（甲减），甲减是各种原因导致的低甲状腺血症或甲状腺抵抗而引起的全身性代谢减低综合征。甲状腺激素合成和分泌过多会引起甲状腺功能亢进（甲亢）。因此，检测血清总甲状腺激素对于甲状腺功能亢进、甲状腺功能减低及甲状腺肿瘤的诊断或鉴别诊断，对甲状腺功能相关疾病的发展过程、疗效及预后评估中具有十分重要的意义。
目前检验甲状腺激素以磁微粒固相载体的免疫检测较多，方法有碱性磷酸酶化学发光法、生物素亲和素结合法、吖啶酯发光法、辣根过氧化物酶法等。
以磁微粒为固相载体检测甲状腺激素，该方法灵敏度高、准确性好，是检测甲状腺激素的主要方法，但是该方法仍然存在可改善的地方，例如可以在样本加样量和材料成本等方面作进一步的优化。
在动物检测甲状腺激素领域利用化学发光法检测很少，并且操作步骤还不能实现全自动，能够实现甲状腺激素项目检测的产品往往需要操作人员具有一定的专业技术知识，并且检测步骤繁杂，所需时间较长，这在一定程度上限制了宠物医院对甲状腺项目的需求。
发明内容
鉴于现有动物甲状腺激素检测存在的上述缺陷，本发明提出了一种检测动物甲状腺激素的试剂盒，通过该试剂盒检测动物总甲状腺激素，加样量少，成本低，而且具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精密度、操作方法简单和检查效率高的优点。
为了达到上述技术目的，本发明所采用的技术方案是：
一种检测动物甲状腺激素的试剂盒，其特征在于：包括包被了抗甲状腺激素抗体的毛细管、酶标甲状腺类似物、发光底物和洗涤液。
所述毛细管为高硼硅玻璃毛细管，该毛细管内径为0.5～1mm，长度为25～35mm。该毛细管成本低，内径小加样量只需要10～15uL，大大节约了样本使用量和成本。
所述包被了抗甲状腺激素抗体的毛细管是通过如下方法制成的：
步骤1，包被
1.1用pH=5.0～7.0的MES缓冲液溶解EDC，溶解后的液体中EDC的浓度为30～100 ug/mL；
1.2将甲状腺激素抗体溶解于步骤1.1制取的液体中，制成包被液，包被液中，甲状腺激素抗体的浓度为5-30ug/mL；
1.3用包被液包被毛细管，包被温度为室温，包被时间为0.5～2h，包被完成后将毛细管吹洗干净；
步骤2，封闭
用BSA缓冲液或者质量百分比为2～5%的酪蛋白对包被后的毛细管进行封闭处理， 封闭温度为25～37℃，封闭时间为1～4h，封闭完成后，将毛细管吹洗干净。
所述酶标甲状腺类似物是通过如下方法制成的：该方法包括甲状腺类似物活化步骤、酶活化步骤和偶联步骤。
所述甲状腺类似物活化步骤具体为：
步骤a，制取活化液
在抗原缓冲液Ⅰ中加入SMCC，制成活化液，活化液中，SMCC的浓度为10-20mg/ml；
步骤b，活化甲状腺类似物
将甲状腺类似物加入到活化液中进行活化，加入甲状腺类似物后，甲状腺类似物浓度为3~5mg/mL；活化温度为室温，活化时间为10～30min，活化完成后加入终止剂终止反应；
步骤c，纯化
用葡聚糖凝胶过滤柱（PD10）纯化经过步骤b处理后得到的物质，纯化用到的洗脱液为抗原缓冲液Ⅱ；
具体纯化步骤为：首先加入15-50ml抗原缓冲液Ⅱ平衡PD10，然后将已活化的甲状腺类似物加入PD10，并且用抗原缓冲液Ⅱ将体积补充至3-5ml，收集PD10流出的液体即为已纯化的甲状腺类似物；
所述酶活化步骤具体为：
首先用酶缓冲液将碱性磷酸酶稀释至2~4 mg/mL；然后在每毫升液体中加入5-10 mg的2-IT活化剂进行酶活化反应，反应温度为室温，时间为10-30min，活化完成后加入终止剂终止反应；最后再用PD10纯化，纯化用到的洗脱液为酶缓冲液，酶活化之后的纯化方法与甲状腺类似物的纯化方法一致；
所述偶联步骤具体为：
将活化后的甲状腺类似物和活化后的酶按照质量比1:0.5—1:2混合均匀，制成偶联液，然后向偶联液中加入0.5-2mol/L的MgCl2，进行反应，反应时间为12-24h，反应温度为2-8℃，加入的MgCl2的量为偶联液体积的0.1-1%；反应结束后加入马来酰亚胺，在室温条件下反应5-30min，反应完成后，加入乙醇胺在室温条件下终止5-30min。
所述抗原缓冲液Ⅰ是在800mL去离子水中，加入三乙醇胺 14.92g、氯化钠 5.84g、EDTA.2Na.2H2O 0.41g、1M氯化镁溶液 1mL、0.1M氯化锌溶液1mL，调节溶液pH至8.5，定容为1000mL后得到的溶液。
所述上述抗原缓冲液Ⅱ是在800mL去离子水中，加入三乙醇胺 14.92g、氯化钠5.84g、EDTA.2Na.2H2O 0.37g、1M氯化镁溶液 1mL、0.1M氯化锌溶液1mL，调节溶液pH至7.3，定容为1000m后得到的溶液。
所述酶缓冲液为：在800mL去离子水中，加入三乙醇胺 4.48g、氯化钠 175.32g、1M氯化镁溶液 1mL、0.1M氯化锌溶液1mL，调节溶液pH至7.6，定容为1000mL后得到的溶液。
所述发光底物为APS-5。
所述洗涤液为在800mL去离子水中，加入1M三羟甲基氨基甲烷50mL、氯化钠 9g、CHAPS 1g、曲拉通1mL，调节溶液pH至7.4，定容为1000mL后得到的溶液。
所述终止剂选用0.5-1mol/L甘氨酸。
所述检测动物甲状腺激素的试剂盒还包括毛细管化学发光检检测装置，该毛细管化学发光检测装置采用授权公告号为CN107091923B，授权公告日为2018年1月30日的中国发明专利公开的毛细管化学发光检测装置。将酶标甲状腺类似物、发光底物和洗涤液装在其液体试剂杯里，而将包被了抗甲状腺激素抗体的毛细管替换下该专利中的毛细管本体即可。
本发明相对于现有技术具有如下优点：
本发明以抗甲状腺抗体包被毛细管作为固相抗体，以此作为开发的检测试剂盒，该试剂盒能准确灵敏地检测血液中的甲状腺激素，检测范围为5nmol/L～110 nmol/L，准确度和精密度高、批内和批间差小，检测时间短，操作方便，检测成本低，试剂易保存，无放射性污染。本发明对解决动物进行即时床边检验具有重要的现实意义。
本发明使用免疫竞争法检测。将毛细管上包被一定浓度的甲状腺激素抗体，与样本中甲状腺抗原特异性结合，经洗涤除去未结合的抗原和其他杂质后，再与ALP标记的甲状腺类似物结合，经过彻底洗涤后加底物。底物经过酶促反应，形成光信号。由于每根毛细管都均匀包被上相同浓度的抗体，加入不同浓度抗原后，剩下的毛细管抗体结合位点会与标记碱性磷酸酶的甲状腺类似物结合，因此加入高浓度抗原样本的毛细管类似物结合浓度低于低浓度抗原样本，根据这一原理，高浓度样本信号值低于低浓度样本信号值，根据用已知的抗原浓度检测所作的标准曲线，可以推算出待测样本甲状腺浓度。
本发明毛细管包被抗体采用EDC一步法包被，该方法相较于SMCC偶联剂、EDC和NHS两步法包被方法在步骤上更加简单，所需时间更短，包被效率更高，同时大大降低了原料的使用量。其中，毛细管最初的清洗、毛细管的羟基化和氨基化、毛细管与甲状腺激素抗体的偶联、毛细管封闭等均是在均相液体中反应，保证毛细管之间的差异很小。其中，毛细管的清洗，为了使毛细管内壁未结合的和多余的物质完全清洗掉，使用压缩空气将未结合的和多余的物质完全吹掉，这样既可以吹掉不需要的分子，又可以保留结合上的分子。毛细管的封闭液选择2%的酪蛋白，不仅可以降低背景值还可以提高检测准确度毛细管信号值的检测通过微型化学发光免疫分析仪检测，通过预存的标准曲线准确判断检测样本浓度，该化学发光仪能够在同一时间同时检测多个样本，在一定程度上大大降低了检测时间。检测样本所用的发光仪操作简单，不需要操作者具有较高的专业水平，体积较小携带方便，检测速度快，与市面上的化学发光仪相比成本更低，更适合宠物医院使用。
附图说明
图1为本发明甲状腺激素的标准曲线图。
具体实施方式
本发明提供了一种检测动物甲状腺激素的试剂盒，包括包被了抗甲状腺激素抗体的毛细管、酶标甲状腺类似物、发光底物和洗涤液。下面结合实施例对本发明作进一步的描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，并不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他所用实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例1
所述毛细管为高硼硅玻璃毛细管，该毛细管内径为0.5-1mm，长度为25-35mm。该毛细管成本低，内径小加样量只需要10-15uL，大大节约了样本使用量和成本。
所述包被了抗甲状腺激素抗体的毛细管是通过如下方法制成的：
步骤1，包被
1.1用pH=6.0的MES缓冲液溶解EDC，溶解后的液体中EDC的浓度为50 ug/mL；
1.2将甲状腺激素抗体溶解于步骤1.1制取的液体中，制成包被液，包被液中，甲状腺激素抗体的浓度为25ug/mL；
1.3用包被液包被毛细管，包被温度为室温，包被时间为0.5h，包被完成后将毛细管吹洗干净；
步骤2，封闭
用BSA缓冲液或者质量百分比为4%的酪蛋白对包被后的毛细管进行封闭处理， 封闭温度为37℃，封闭时间为2h，封闭完成后，将毛细管吹洗干净。
所述酶标甲状腺类似物是通过如下方法制成的：该方法包括甲状腺类似物活化步骤、酶活化步骤和偶联步骤。
所述甲状腺类似物活化步骤具体为：
步骤a，制取活化液
在抗原缓冲液Ⅰ中加入SMCC，制成活化液，活化液中，SMCC的浓度为15mg/ml；
步骤b，活化甲状腺类似物
将甲状腺类似物加入到活化液中进行活化，加入甲状腺类似物后，甲状腺类似物浓度为4mg/mL；活化温度为室温，活化时间为15min，活化完成后加入终止剂终止反应；
步骤c，纯化
用PD10柱纯化经过步骤b处理后得到的物质，纯化用到的洗脱液为抗原缓冲液Ⅱ。所述酶活化步骤具体为：
首先用酶缓冲液将碱性磷酸酶稀释至3mg/mL；然后在每毫升液体中加入8mg 的2-IT活化剂进行酶活化反应，反应温度为室温，时间为30min，活化完成中加入终止剂终止反应；最后再用PD10柱纯化，纯化用到的洗脱液为酶缓冲液。
所述偶联步骤具体为：
将活化后的甲状腺类似物和活化后的酶混合均匀，制成偶联液，然后向偶联液中加入1M的MgCl2，进行反应，反应时间为12h，反应温度为4℃，加入的MgCl2的量为偶联液体积的0.2%；反应结束后加入马来酰亚胺，在室温条件下反应10min，反应完成后，加入乙醇胺在室温条件下终止10min。
所述抗原缓冲液Ⅰ是在800mL去离子水中，加入三乙醇胺 14.92g、氯化钠 5.84g、EDTA.2Na.2H2O 0.41g、1M氯化镁溶液 1mL、0.1M氯化锌溶液1mL，调节溶液pH至8.5，定容为1000mL后得到的溶液。
所述上述抗原缓冲液Ⅱ是在800mL去离子水中，加入三乙醇胺 14.92g、氯化钠5.84g、EDTA.2Na.2H2O 0.37g、1M氯化镁溶液 1mL、0.1M氯化锌溶液1mL，调节溶液pH至7.3，定容为1000m后得到的溶液。
所述酶缓冲液为：在800mL去离子水中，加入三乙醇胺 4.48g、氯化钠 175.32g、1M氯化镁溶液 1mL、0.1M氯化锌溶液1mL，调节溶液pH至7.6，定容为1000mL后得到的溶液。
所述发光底物为：APS-5。
所述洗涤液为在800mL去离子水中，加入1M三羟甲基氨基甲烷50mL、氯化钠 9g、CHAPS 1g、曲拉通1mL，调节溶液pH至7.4，定容为1000mL后得到的溶液。
所述终止剂选用1M甘氨酸。
实施例2
本实施例提供了一种检测动物甲状腺激素的试剂盒，其包括包被了抗甲状腺激素抗体的毛细管、酶标甲状腺类似物、发光底物和洗涤液。
所述毛细管为高硼硅玻璃毛细管，该毛细管内径为1mm，长度为35mm。该毛细管成本低，内径小加样量只需要15uL，大大节约了样本使用量和成本。
所述包被了抗甲状腺激素抗体的毛细管是通过如下方法制成的：
步骤1，包被
1.1用pH=5.0的MES缓冲液溶解EDC，溶解后的液体中EDC的浓度为30 ug/mL；
1.2将甲状腺激素抗体溶解于步骤1.1制取的液体中，制成包被液，包被液中，甲状腺激素抗体的浓度为5ug/mL；
1.3用包被液包被毛细管，包被温度为室温，包被时间为0.5h，包被完成后将毛细管吹洗干净；
步骤2，封闭
用BSA缓冲液或者质量百分比为2%的酪蛋白对包被后的毛细管进行封闭处理， 封闭温度为25℃，封闭时间为1h，封闭完成后，将毛细管吹洗干净。
所述酶标甲状腺类似物是通过如下方法制成的：该方法包括甲状腺类似物活化步骤、酶活化步骤和偶联步骤。
所述甲状腺类似物活化步骤具体为：
步骤a，制取活化液
在抗原缓冲液Ⅰ中加入SMCC，制成活化液，活化液中，SMCC的浓度为10mg/ml；
步骤b，活化甲状腺类似物
将甲状腺类似物加入到活化液中进行活化，加入甲状腺类似物后，甲状腺类似物浓度为3mg/mL；活化温度为室温，活化时间为10min，活化完成后加入终止剂终止反应；
步骤c，纯化
用葡聚糖凝胶过滤柱（PD10）纯化经过步骤b处理后得到的物质，纯化用到的洗脱液为抗原缓冲液Ⅱ；
具体纯化步骤为：首先加入15ml抗原缓冲液Ⅱ平衡PD10，然后将已活化的甲状腺类似物加入PD10，并且用抗原缓冲液Ⅱ将体积补充至3ml，收集PD10流出的液体即为已纯化的甲状腺类似物；
所述酶活化步骤具体为：
首先用酶缓冲液将碱性磷酸酶稀释至2 mg/mL；然后在每毫升液体中加入5 mg 的2-IT活化剂进行酶活化反应，反应温度为室温，时间为10min，活化完成后加入终止剂终止反应；最后再用PD10纯化，纯化用到的洗脱液为酶缓冲液，酶活化之后的纯化方法与甲状腺类似物的纯化方法一致；
所述偶联步骤具体为：
将活化后的甲状腺类似物和活化后的酶按照质量比1:0.5混合均匀，制成偶联液，然后向偶联液中加入0.5mol/L的MgCl2，进行反应，反应时间为12h，反应温度为2℃，加入的MgCl2的量为偶联液体积的0.1%；反应结束后加入马来酰亚胺，在室温条件下反应5min，反应完成后，加入乙醇胺在室温条件下终止5min。
所述抗原缓冲液Ⅰ是在800mL去离子水中，加入三乙醇胺 14.92g、氯化钠 5.84g、EDTA.2Na.2H2O 0.41g、1M氯化镁溶液 1mL、0.1M氯化锌溶液1mL，调节溶液pH至8.5，定容为1000mL后得到的溶液。
所述上述抗原缓冲液Ⅱ是在800mL去离子水中，加入三乙醇胺 14.92g、氯化钠5.84g、EDTA.2Na.2H2O 0.37g、1M氯化镁溶液 1mL、0.1M氯化锌溶液1mL，调节溶液pH至7.3，定容为1000m后得到的溶液。
所述酶缓冲液为：在800mL去离子水中，加入三乙醇胺 4.48g、氯化钠 175.32g、1M氯化镁溶液 1mL、0.1M氯化锌溶液1mL，调节溶液pH至7.6，定容为1000mL后得到的溶液。
所述发光底物为APS-5。
所述洗涤液为在800mL去离子水中，加入1M三羟甲基氨基甲烷50mL、氯化钠 9g、CHAPS 1g、曲拉通1mL，调节溶液pH至7.4，定容为1000mL后得到的溶液。
所述终止剂选用0.5mol/L甘氨酸。
实施例3
一种检测动物甲状腺激素的试剂盒，其包括包被了抗甲状腺激素抗体的毛细管、酶标甲状腺类似物、发光底物和洗涤液。
所述毛细管为高硼硅玻璃毛细管，该毛细管内径为0.5mm，长度为25mm。该毛细管成本低，内径小加样量只需要10uL，大大节约了样本使用量和成本。
所述包被了抗甲状腺激素抗体的毛细管是通过如下方法制成的：
步骤1，包被
1.1用pH=7.0的MES缓冲液溶解EDC，溶解后的液体中EDC的浓度为100 ug/mL；
1.2将甲状腺激素抗体溶解于步骤1.1制取的液体中，制成包被液，包被液中，甲状腺激素抗体的浓度为30ug/mL；
1.3用包被液包被毛细管，包被温度为室温，包被时间为2h，包被完成后将毛细管吹洗干净；
步骤2，封闭
用BSA缓冲液或者质量百分比为5%的酪蛋白对包被后的毛细管进行封闭处理， 封闭温度为37℃，封闭时间为4h，封闭完成后，将毛细管吹洗干净。
所述酶标甲状腺类似物是通过如下方法制成的：该方法包括甲状腺类似物活化步骤、酶活化步骤和偶联步骤。
所述甲状腺类似物活化步骤具体为：
步骤a，制取活化液
在抗原缓冲液Ⅰ中加入SMCC，制成活化液，活化液中，SMCC的浓度为20mg/ml；
步骤b，活化甲状腺类似物
将甲状腺类似物加入到活化液中进行活化，加入甲状腺类似物后，甲状腺类似物浓度为5mg/mL；活化温度为室温，活化时间为30min，活化完成后加入终止剂终止反应；
步骤c，纯化
用葡聚糖凝胶过滤柱（PD10）纯化经过步骤b处理后得到的物质，纯化用到的洗脱液为抗原缓冲液Ⅱ；
具体纯化步骤为：首先加入50ml抗原缓冲液Ⅱ平衡PD10，然后将已活化的甲状腺类似物加入PD10，并且用抗原缓冲液Ⅱ将体积补充至5ml，收集PD10流出的液体即为已纯化的甲状腺类似物；
所述酶活化步骤具体为：
首先用酶缓冲液将碱性磷酸酶稀释至4 mg/mL；然后在每毫升液体中加入10 mg 的2-IT活化剂进行酶活化反应，反应温度为室温，时间为30min，活化完成后加入终止剂终止反应；最后再用PD10纯化，纯化用到的洗脱液为酶缓冲液，酶活化之后的纯化方法与甲状腺类似物的纯化方法一致；
所述偶联步骤具体为：
将活化后的甲状腺类似物和活化后的酶按照质量比1: 2混合均匀，制成偶联液，然后向偶联液中加入2mol/L的MgCl2，进行反应，反应时间为24h，反应温度为8℃，加入的MgCl2的量为偶联液体积的1%；反应结束后加入马来酰亚胺，在室温条件下反应30min，反应完成后，加入乙醇胺在室温条件下终止30min。
所述抗原缓冲液Ⅰ是在800mL去离子水中，加入三乙醇胺 14.92g、氯化钠 5.84g、EDTA.2Na.2H2O 0.41g、1M氯化镁溶液 1mL、0.1M氯化锌溶液1mL，调节溶液pH至8.5，定容为1000mL后得到的溶液。
所述上述抗原缓冲液Ⅱ是在800mL去离子水中，加入三乙醇胺 14.92g、氯化钠5.84g、EDTA.2Na.2H2O 0.37g、1M氯化镁溶液 1mL、0.1M氯化锌溶液1mL，调节溶液pH至7.3，定容为1000m后得到的溶液。
所述酶缓冲液为：在800mL去离子水中，加入三乙醇胺 4.48g、氯化钠 175.32g、1M氯化镁溶液 1mL、0.1M氯化锌溶液1mL，调节溶液pH至7.6，定容为1000mL后得到的溶液。
所述发光底物为APS-5。
所述洗涤液为在800mL去离子水中，加入1M三羟甲基氨基甲烷50mL、氯化钠 9g、CHAPS 1g、曲拉通1mL，调节溶液pH至7.4，定容为1000mL后得到的溶液。
所述终止剂选用1mol/L甘氨酸。
实施例4
一种检测动物甲状腺激素的试剂盒，其包括包被了抗甲状腺激素抗体的毛细管、酶标甲状腺类似物、发光底物和洗涤液。
所述毛细管为高硼硅玻璃毛细管，该毛细管内径为0.7mm，长度为30mm。该毛细管成本低，内径小加样量只需要12uL，大大节约了样本使用量和成本。
所述包被了抗甲状腺激素抗体的毛细管是通过如下方法制成的：
步骤1，包被
1.1用pH=6.0的MES缓冲液溶解EDC，溶解后的液体中EDC的浓度为50 ug/mL；
1.2将甲状腺激素抗体溶解于步骤1.1制取的液体中，制成包被液，包被液中，甲状腺激素抗体的浓度为20ug/mL；
1.3用包被液包被毛细管，包被温度为室温，包被时间为1h，包被完成后将毛细管吹洗干净；
步骤2，封闭
用BSA缓冲液或者质量百分比为4%的酪蛋白对包被后的毛细管进行封闭处理， 封闭温度为30℃，封闭时间为3h，封闭完成后，将毛细管吹洗干净。
所述酶标甲状腺类似物是通过如下方法制成的：该方法包括甲状腺类似物活化步骤、酶活化步骤和偶联步骤。
所述甲状腺类似物活化步骤具体为：
步骤a，制取活化液
在抗原缓冲液Ⅰ中加入SMCC，制成活化液，活化液中，SMCC的浓度为15mg/ml；
步骤b，活化甲状腺类似物
将甲状腺类似物加入到活化液中进行活化，加入甲状腺类似物后，甲状腺类似物浓度为4mg/mL；活化温度为室温，活化时间为20min，活化完成后加入终止剂终止反应；
步骤c，纯化
用葡聚糖凝胶过滤柱（PD10）纯化经过步骤b处理后得到的物质，纯化用到的洗脱液为抗原缓冲液Ⅱ；
具体纯化步骤为：首先加入40ml抗原缓冲液Ⅱ平衡PD10，然后将已活化的甲状腺类似物加入PD10，并且用抗原缓冲液Ⅱ将体积补充至4ml，收集PD10流出的液体即为已纯化的甲状腺类似物；
所述酶活化步骤具体为：
首先用酶缓冲液将碱性磷酸酶稀释至3mg/mL；然后在每毫升液体中加入8mg 的2-IT活化剂进行酶活化反应，反应温度为室温，时间为20min，活化完成后加入终止剂终止反应；最后再用PD10纯化，纯化用到的洗脱液为酶缓冲液，酶活化之后的纯化方法与甲状腺类似物的纯化方法一致；
所述偶联步骤具体为：
将活化后的甲状腺类似物和活化后的酶按照质量比1:1混合均匀，制成偶联液，然后向偶联液中加入1mol/L的MgCl2，进行反应，反应时间为20h，反应温度为6℃，加入的MgCl2的量为偶联液体积的0.5%；反应结束后加入马来酰亚胺，在室温条件下反应20min，反应完成后，加入乙醇胺在室温条件下终止20min。
所述抗原缓冲液Ⅰ是在800mL去离子水中，加入三乙醇胺 14.92g、氯化钠 5.84g、EDTA.2Na.2H2O 0.41g、1M氯化镁溶液 1mL、0.1M氯化锌溶液1mL，调节溶液pH至8.5，定容为1000mL后得到的溶液。
所述上述抗原缓冲液Ⅱ是在800mL去离子水中，加入三乙醇胺 14.92g、氯化钠5.84g、EDTA.2Na.2H2O 0.37g、1M氯化镁溶液 1mL、0.1M氯化锌溶液1mL，调节溶液pH至7.3，定容为1000m后得到的溶液。
所述酶缓冲液为：在800mL去离子水中，加入三乙醇胺 4.48g、氯化钠 175.32g、1M氯化镁溶液 1mL、0.1M氯化锌溶液1mL，调节溶液pH至7.6，定容为1000mL后得到的溶液。
所述发光底物为APS-5。
所述洗涤液为在800mL去离子水中，加入1M三羟甲基氨基甲烷50mL、氯化钠 9g、CHAPS 1g、曲拉通1mL，调节溶液pH至7.4，定容为1000mL后得到的溶液。
所述终止剂选用0.8mol/L甘氨酸。
试剂盒操作
（1） 待测血清或血浆经过裂解缓冲液处理后使甲状腺激素复合物裂解为甲状腺激素小分子。
（2）试剂盒拆开包装袋后，取出毛细管化学发光检测装置套件，吸取血清或血浆12ul加入至检测 装置的加样口，37℃孵育15分钟。洗涤液清洗3次。
（3）加入酶标抗原12ul，37℃孵育15分钟。洗涤液清洗3次。
（4）将检测装置放入化学发光免疫分析仪，检测发光值。
试剂盒保存期实验
将试剂盒放置于4℃保存，分别取0、10、20、30、60、90、120、150和180天的试剂盒，以抗体包被浓度为15ug/mL，酶标抗原浓度为0.1ug/mL。进行标准样品检测以测定其检测效果。稳定性测定结果如下表：
表一 试剂盒保存实验结果
| 时间（天） | 0 | 10 | 20 | 30 | 60 | 90 | 120 | 150 | 180 |
| 发光值（RLU） | 203400 | 198806 | 200553 | 202688 | 198725 | 205364 | 203998 | 201463 | 200226 |
| 拟合值（ug/mL） | 10.26 | 10.03 | 10.12 | 10.22 | 10.02 | 10.36 | 10.29 | 10.16 | 10.10 |
从以上结果可以看出，发光值变化不大，试剂盒在4℃下至少可保存6个月以上。
试剂盒精密度实验
分别采用两个批号的试剂盒对质控品高值（QCH）和低值(QCL)进行检测，每个样本复测10次一共检测20次，得到如下结果：
表二 试剂盒精密度实验结果
准确性实验
在已知T4浓度的血清中加入三种不同T4标准浓度（10、50、100nmol/L）的血清，测定回收率分别为97.2%、99.3%、101.6%。
英文缩写解释：
EDC ：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐
MES：2-(N-吗啉代)乙烷磺酸一水
BSA：牛血清白蛋白
CHAPS：3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐
2-IT：2-亚氨基硫烷盐酸盐
SMCC：4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯
PD10：葡聚糖凝胶过滤柱。
Claims (10)
1.一种检测动物甲状腺激素的试剂盒，其特征在于：包括包被了抗甲状腺激素抗体的毛细管、酶标甲状腺类似物、发光底物和洗涤液。
2.根据权利要求1所述的一种检测动物甲状腺激素的试剂盒，其特征在于：所述包被了抗甲状腺激素抗体的毛细管是通过如下方法制成的：
步骤1，包被
1.1用pH=5.0～7.0的MES缓冲液溶解EDC，溶解后的液体中EDC的浓度为30～100 ug/mL；
1.2将甲状腺激素抗体溶解于步骤1.1制取的液体中，制成包被液，包被液中，甲状腺激素抗体的浓度为5～30ug/mL；
1.3用包被液包被毛细管，包被温度为室温，包被时间为0.5～2h，包被完成后将毛细管吹洗干净；
步骤2，封闭
用BSA缓冲液或者质量百分比为2-5%的酪蛋白对包被后的毛细管进行封闭处理， 封闭温度为25～37℃，封闭时间为1～4h，封闭完成后，将毛细管吹洗干净。
3.根据权利要求1所述的一种检测动物甲状腺激素的试剂盒，其特征在于：所述酶标甲状腺类似物是通过如下方法制成的：该方法包括甲状腺类似物活化步骤、酶活化步骤和偶联步骤。
4.根据权利要求3所述的一种检测动物甲状腺激素的试剂盒，其特征在于：所述甲状腺类似物活化步骤具体为：
步骤a，制取活化液
在抗原缓冲液Ⅰ中加入SMCC，制成活化液，活化液中，SMCC的浓度为10-20mg/ml；
步骤b，活化甲状腺类似物
将甲状腺类似物加入到活化液中进行活化，加入甲状腺类似物后，甲状腺类似物浓度为3~5mg/mL；活化温度为室温，活化时间为10～30min，活化完成后加入终止剂终止反应；
步骤c，纯化
用PD10柱纯化经过步骤b处理后得到的物质，纯化用到的洗脱液为抗原缓冲液Ⅱ。
5.根据权利要求3所述的一种检测动物甲状腺激素的试剂盒，其特征在于：所述酶活化步骤具体为：
首先用酶缓冲液将碱性磷酸酶稀释至2~4 mg/mL；然后在每毫升液体中加入5-10 mg的2-IT活化剂进行酶活化反应，反应温度为室温，时间为10~30min，活化完成中加入终止剂终止反应；最后再用PD10柱纯化，纯化用到的洗脱液为酶缓冲液。
6.根据权利要求3所述的一种检测动物甲状腺激素的试剂盒，其特征在于：所述偶联步骤具体为：
将活化后的甲状腺类似物和活化后的酶混合均匀，制成偶联液，然后向偶联液中加入0.5~2M的MgCl2，进行反应，反应时间为12~24h，反应温度为2~8℃，加入的MgCl2的量为偶联液体积的0.1~1%；反应结束后加入马来酰亚胺，在室温条件下反应5~30min，反应完成后，加入乙醇胺在室温条件下终止5~30min。
7.根据权利要求4所述的一种检测动物甲状腺激素的试剂盒，其特征在于：所述抗原缓冲液Ⅰ是在800mL去离子水中，加入三乙醇胺 14.92g、氯化钠 5.84g、EDTA.2Na.2H2O0.41g、1M氯化镁溶液 1mL、0.1M氯化锌溶液1mL，调节溶液pH至8.5，定容为1000mL后得到的溶液。
8.根据权利要求4所述的一种检测动物甲状腺激素的试剂盒，其特征在于：所述上述抗原缓冲液Ⅱ是在800mL去离子水中，加入三乙醇胺 14.92g、氯化钠 5.84g、EDTA.2Na.2H2O0.37g、1M氯化镁溶液 1mL、0.1M氯化锌溶液1mL，调节溶液pH至7.3，定容为1000m后得到的溶液。
9.根据权利要求5所述的一种检测动物甲状腺激素的试剂盒，其特征在于：所述酶缓冲液为：在800mL去离子水中，加入三乙醇胺 4.48g、氯化钠 175.32g、1M氯化镁溶液 1mL、0.1M氯化锌溶液1mL，调节溶液pH至7.6，定容为1000mL后得到的溶液。
10.根据权利要求1所述的一种检测动物甲状腺激素的试剂盒，其特征在于：所述洗涤液为在800mL去离子水中，加入1M三羟甲基氨基甲烷50mL、氯化钠 9g、CHAPS 1g、曲拉通1mL，调节溶液pH至7.4，定容为1000mL后得到的溶液。
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