CN109439697A - 利用微生物发酵产高效抗氧化活性物质的方法 - Google Patents

利用微生物发酵产高效抗氧化活性物质的方法 Download PDF

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Abstract

利用微生物发酵产高效抗氧化活性物质的方法，涉及一种抗氧化活性物质的生产方法。是要解决现有的微生物发酵产活性物质成分单一的问题。方法：一、将GRP13菌株接种于马铃薯固体培养基平板上，培养得到活化的GRP13菌株；二、将活化后的GRP13菌株接种于液体马铃薯培养基中，培养得到种子培养液；三、取种子液接种至马铃薯液体培养基中发酵，获得GRP13菌株发酵样品，真空抽滤，减压浓缩，即为抗氧化活性物质。本发明方法能够产生抗氧化活性物质，经检测为多种甘草活性成分，且纯度较高，从而起到节省药用植物甘草资源的目的。本发明用于微生物发酵产甘草活性物质。

Description

利用微生物发酵产高效抗氧化活性物质的方法
技术领域
本发明涉及一种抗氧化活性物质的生产方法。
背景技术
甘草作为一味传统中医药材，主要分布于宁夏、内蒙古、新疆和黑龙江等北部地区，因其具有多种功效，传统配方中又有“十方九草”的说法，故野生甘草被过度采挖，濒临灭绝，现已被列入《野生药材资源保护条例》的国家二级保护植物。
经大量研究发现，现有200种物质已经从甘草物种中分离出来，这些物质也会随着甘草种类、地理位置和加工方式的不同而发生明显的改变，其主要成分为：三萜皂苷类、黄酮类物质；其中三萜皂苷类物质主要包括甘草酸、甘草次酸、异甘草次酸，甘草甜素、内脂等；黄酮类物质包含多个种类，如黄烷酮、二氢黄酮、查尔酮和异黄酮等种类，主要代表成分为甘草素(Liquiritigenin)，异甘草素(Isoliquiritigenin)，甘草苷(Liquiritin)，异甘草苷(Isoliquiritin)，新甘草苷(Neoliquiritin)等。
目前能够发酵产甘草活性物质的微生物资源较少，而且产生的活性物质均为单一成分，难以代替野生甘草植物。
发明内容
本发明是要解决现有的微生物发酵产活性物质成分单一的问题，提供一种利用微生物发酵产高效抗氧化活性物质的方法。
本发明利用微生物发酵产抗氧化活性物质的方法，包括以下步骤：
一、甘草内生真菌GRP13菌株的活化：
将GRP13菌株接种于马铃薯固体培养基平板上，放置于27～29℃恒温箱中，培养3～4 d，得到活化的GRP13菌株；
二、甘草内生真菌GRP13种子液的制备：
将活化后的GRP13菌株接种于液体马铃薯培养基中，于27～29℃，130～150r/min摇床培养3～4d，制成1×107～1×108CFU/mL种子培养液；
三、甘草内生真菌GRP13发酵液供试品的制备：
取种子液接种至马铃薯液体培养基中，27～29℃、130～150r/min摇床发酵14～16d，获得GRP13菌株发酵样品，将GRP13菌株发酵样品真空抽滤，得GRP13菌株发酵液，将所得GRP13菌株发酵液至于50～55℃减压浓缩至相对密度为1.1～1.2，即为抗氧化活性物质。
所述GRP13菌株为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)GRP13，已在中文专利CN104774774B中公开，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2015年4月1日，保藏编号为CCTCC NO：M 2015186。
进一步的，步骤一中马铃薯固体培养基的配方为去皮马铃薯块200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。
进一步的，步骤二中液体马铃薯培养基的配方为去皮马铃薯块200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL。
马铃薯培养基的配置方法为：取200g马铃薯块煎汁30，过滤，加入20g葡萄糖，定容至1L，pH值7.0，121℃灭菌30min，冷却，备用。
进一步的，步骤二中将活化后的GRP13菌株接种于液体马铃薯培养基的接种量是3％～7％。
进一步的，步骤三中种子液接种至马铃薯液体培养基中的接种量是3％～7％。
本发明的有益效果：
本方法发酵获得的发酵物经过检测，具有较高的抗氧化活性，其DPPH自由基清除能力与维生素C相当。
取甘草内生真菌GRP13发酵液供试品，先采用水饱和正丁醇萃取3次，合并萃取液；再采用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液；最后采用乙醚萃取3次，合并萃取液；50～55℃减压浓缩后，分别得到GRP13菌株发酵液水饱和正丁醇萃取部位A、乙酸乙酯萃取部位 B和乙醚萃取部位C。甘草内生真菌GRP13发酵液各有效部位对DPPH自由基均具有一定的清除作用，清除作用为：乙醚部位C>乙酸乙酯部位B>水饱和正丁醇部位A。
进一步对甘草内生真菌GRP13发酵液中活性成分进行分离，确定其中包含4种化合物，分别为苯甲酸、甘草次酸、甘草素、甘草苷，其中有三种为甘草活性成分，更接近于甘草中的实际活性成分。且所分离得到的4种活性成分均具有较好的纯度，纯度分别为 97％、96.3％、96％、95.7％。
本发明方法能够产生抗氧化活性物质，经检测为多种甘草活性成分，且纯度较好，从而起到节省药用植物甘草资源的目的，且工艺简单，成本低，使用生物发酵来生产，不污染环境。
附图说明
图1为甘草内生真菌GRP13发酵液及各有效部分的抗氧化活性测试结果；
图2为实施例1中化合物A的HPLC图谱；
图3为实施例1中化合物B的HPLC图谱；
图4为实施例1中化合物C的HPLC图谱；
图5为实施例1中化合物D的HPLC图谱。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式利用微生物发酵产抗氧化活性物质的方法，包括以下步骤：
一、甘草内生真菌GRP13菌株的活化：
将GRP13菌株接种于马铃薯固体培养基平板上，放置于27～29℃恒温箱中，培养3～4 d，得到活化的GRP13菌株；
二、甘草内生真菌GRP13种子液的制备：
将活化后的GRP13菌株接种于液体马铃薯培养基中，于27～29℃，130～150r/min摇床培养3～4d，制成1×107～1×108CFU/mL种子培养液；
三、甘草内生真菌GRP13发酵液供试品的制备：
取种子液接种至马铃薯液体培养基中，27～29℃、130～150r/min摇床发酵14～16d，获得GRP13菌株发酵样品，将GRP13菌株发酵样品真空抽滤，得GRP13菌株发酵液，将所得GRP13菌株发酵液至于50～55℃减压浓缩至相对密度为1.1～1.2，即为抗氧化活性物质。
所述GRP13菌株为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)GRP13，已在中文专利CN104774774B中公开，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2015年4月1日，保藏编号为CCTCC NO：M 2015186。
本方法发酵获得的发酵物经过检测，具有较高的抗氧化活性，其DPPH自由基清除能力与维生素C相当。
取甘草内生真菌GRP13发酵液供试品，先采用水饱和正丁醇萃取3次，合并萃取液；再采用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液；最后采用乙醚萃取3次，合并萃取液；各萃取液于50～55℃减压浓缩后，分别得到GRP13菌株发酵液水饱和正丁醇萃取部位A、乙酸乙酯萃取部位B和乙醚萃取部位C。甘草内生真菌GRP13发酵液各有效部位对DPPH自由基均具有一定的清除作用，清除作用为：乙醚部位C>乙酸乙酯部位B>水饱和正丁醇部位 A。
进一步对甘草内生真菌GRP13发酵液中活性成分进行分离，确定其中包含4种化合物，分别为苯甲酸、甘草次酸、甘草素、甘草苷，其中有三种为甘草活性成分，更接近于甘草中的实际活性成分。且所分离得到的4种活性成分均具有较好的纯度，纯度分别为 97％、96.3％、96％、95.7％。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中马铃薯固体培养基的配方为去皮马铃薯块200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤二中液体马铃薯培养基的配方为去皮马铃薯块200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤二中将活化后的GRP13菌株接种于液体马铃薯培养基的接种量是3％～7％。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤二中将活化后的GRP13菌株接种于液体马铃薯培养基的接种量是4％～6％。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤二中将活化后的GRP13菌株接种于液体马铃薯培养基的接种量是5％。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤三中种子液接种至马铃薯液体培养基中的接种量是3％～7％。其它与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤三中种子液接种至马铃薯液体培养基中的接种量是4％～6％。其它与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤三中种子液接种至马铃薯液体培养基中的接种量是5％。其它与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是：步骤一中放置于28℃恒温箱中，培养3d。其它与具体实施方式一至九之一相同。
具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式一至十之一不同的是：步骤二中于 28℃，140r/min摇床培养3d。其它与具体实施方式一至十之一相同。
具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式一至十一之一不同的是：步骤三中 28℃、140r/min摇床发酵15d。其它与具体实施方式一至十一之一相同。
下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：
一、甘草内生真菌GRP13菌株的活化：将GRP13菌株接种于马铃薯固体培养基平板上，放置于28℃恒温箱中，培养3d，得到活化的GRP13菌株；
二、甘草内生真菌GRP13种子液的制备：将活化后的GRP13菌株接种于60mL液体马铃薯培养基中(n＝3)，于28℃，140r/min摇床培养3d，制成1×107CFU/mL种子培养液；
三、甘草内生真菌GRP13发酵液供试品的制备：取种子液15mL，接种至含300mL 马铃薯液体培养基中的500mL锥形瓶中，共发酵20L，28℃、140r/min摇床发酵15d，获得GRP13菌株发酵样品，将GRP13菌株发酵样品真空抽滤，得GRP13菌株发酵液，将所得GRP13菌株发酵液至于50℃减压浓缩至200mL作为供试品；
四、甘草内生真菌GRP13发酵液活性部位制备：取甘草内生真菌GRP13发酵液供试品，分别采用极性不同的三种有机溶剂(水饱和正丁醇、乙酸乙酯和乙醚)萃取3次 (3×200mL)，合并各萃取液。50℃减压浓缩后，得到GRP13菌株发酵液水饱和正丁醇萃取部位A，乙酸乙酯萃取部位B，乙醚萃取部位C。
本实施例所述GRP13菌株为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)GRP13，已在中文专利 CN104774774B中公开，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2015年4月1日，保藏编号为CCTCC NO：M 2015186。
(一)甘草内生真菌GRP13各活性部位抗氧化活性测定
采用DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)法。
供试品制备：分别取干燥后的发酵液及各有效部位A、B、C各5mg，用甲醇配置得到质量浓度为100μg/mL的样品溶液，并依次稀释为50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL等不同的浓度，各供试品液4℃条件下保藏，备用。
DPPH溶液的配置：DPPH药品2.95mg，甲醇定容至50mL，充分震荡使其混合均匀，得到质量浓度为0.059mg/mL的DPPH溶液，4℃条件下避光保藏。
对照品溶液的配制：Vc(抗坏血酸)10mg，甲醇溶解，得到浓度为0.1mg/mL的对照品溶液，4℃保藏，备用。
DPPH自由基清除能力的测定：分别取上述不同浓度的各样品溶液2mL，小心加入4mL DPPH溶液，混匀，避光反应30min，在517nm波长条件下测定各个反应的吸光度值 (n＝3)。计算公式如下：
清除率＝[1-(Ai-Aj)/A0]×100％
Ai为样品与DPPH反应后的吸光度；Aj为样品与甲醇混合后的吸光度；A0为DPPH 与甲醇混合后的吸光度。
结果见图1，图1中▼表示发酵液，●表示有效部位C，▲表示有效部位B，■表示有效部位A，◆表示Vc。由图1可以看出，甘草内生真菌GRP13的发酵产物具有良好的抗氧化活性，甘草内生真菌GRP13发酵液各有效部位对DPPH自由基均具有一定的清除作用，浓度在0～100μg/mL范围内清除作用呈上升趋势，清除作用结果为：乙醚部位 C>乙酸乙酯部位B>水饱和正丁醇部位A。根据抗氧化作用结果，选取乙醚部位C及乙酸乙酯部位B进行活性代谢物分离。
(二)硅胶柱色谱法分离甘草内生真菌GRP13发酵液中活性成分
湿法上柱。称取柱层析硅胶(200～300目)150g，柱层析硅胶(80～100目)20g，于120℃活化120min。将活化后的200～300目硅胶加入石油醚制成混悬液，将硅胶混悬液缓慢倒入层析柱内，打开下部活塞，缓慢加入石油醚以稳定柱床后，以两倍体积的洗脱液再次稳定硅胶柱。
取不同萃取部位，分别加入80～100目的层析硅胶20g，搅拌均匀，将各萃取部位粉末缓慢均匀的铺在已经稳定的硅胶柱上，依次用不同梯度的洗脱液处理硅胶柱。
对萃取部位B进行一次硅胶柱分离，以石油醚∶乙酸乙酯(15:5)为洗脱液，每10mL收一馏分，TLC检识，合并9～21号流分，继续收集洗脱液，合并135～143号流分，挥干有机溶剂，得到粗晶体1，粗晶体1进行二次硅胶柱纯化，按石油醚∶乙酸乙酯(17:3) 洗脱，5mL收一馏分，归并18～28号流分，4℃冷藏36h后，得到化合物A，该化合物微溶于水，易溶于甲醇、乙醚。
对萃取部位C进行硅胶柱分离，以石油醚：乙酸乙酯(20：5)为洗脱液，每10mL 收集一份馏分，TLC检识，合并5-35号流分，合并43-63号流分，合并80-102号流分，挥去溶剂得到三个粗样品，即为样品1，样品2，样品3。
取样品1进行二次硅胶柱分离纯化，分别以石油醚：乙酸乙酯(20：10)和石油醚：乙酸乙酯(20：20)进行洗脱，每5mL收集一份馏分，对比不同展开剂条件下TLC检识结果，合并石油醚：乙酸乙酯(20：10)洗脱的5-17号馏分，挥去溶剂，得到粗晶体A，在4℃条件下保存36h，重结晶，得到化合物B，该化合物呈白色粉末状，溶于氯仿，极易溶于甲醇。
(三)大孔树脂柱法分离甘草内生真菌GRP13活性成分
甘草内生真菌GRP13菌株发酵液15L通过D101大孔吸附树脂柱洗脱后，采用乙醇梯度洗脱，收集不同浓度乙醇洗脱液，于50℃减压浓缩，其中90％乙醇洗脱部位通过聚酰胺柱分离，再次以不同浓度乙醇梯度洗脱，每10mL收集一份馏分，TLC检识，合并1-20 号馏分，31-41号馏分，自然挥干有机溶剂，得到粗样品，对粗样品进行二次硅胶柱分离，采用石油醚：乙酸乙酯(15:5)为洗脱液，每5mL收集一份馏分，TLC检识，合并2-8 号馏分，挥干溶剂，在4℃条件下冷藏36h，重结晶，得到化合物C，该化合物为淡黄色粉末状，易溶于甲醇。
对D101大孔吸附树脂柱70％乙醇洗脱部位进行聚酰胺柱分离，采用不同浓度乙醇梯度洗脱，10mL收集一份馏分，TLC检识，合并13-30号馏分，挥干溶剂，得到粗样品，再以石油醚：乙酸乙酯(5:15)为洗脱相，对所得粗样品进行二次硅胶柱分离，每5mL 收集一份馏分，TLC检识，合并45-56号馏分，挥去溶剂，重结晶，得到化合物E，该化合物为白色粉末状物质，易溶解于甲醇，溶液为无色透明状，化合物D。
(四)活性成分结构鉴定
1.活性成分纯度鉴定：采用HPLC法。
(1)色谱条件
色谱柱：Venusil XBP-C18柱(4.6mm×250mm，5μm，USA)；
流动相：①甲醇:水:甲酸(60:40:0.5)
②乙腈:水(80:20)
③乙腈:水(65:35)
流速：1mL·min-1；
柱温：25℃；
检测波长：254nm；
进样量：10μL。
(2)供试品溶液的制备
精密称取分离得到的各活性化合物1mg，溶于500μL甲醇，配置成0.2mg/mL的供试品溶液后，备用。
(3)对照品液的制备
按照(2)的方法配置相同浓度的对照品液，备用。
(4)样品测定
精密吸取各样品液20μL进样，检测(n＝3)。
2.活性成分结构鉴定
采用液-质联(MS)和核磁共振(1H-NMR及13C-NMR)的手法对单体物质进行鉴定，并查阅相关文献，最终确定单体物质的结构。
3.结构鉴定结果
(1)活性化合物纯度鉴定结果：
采用①号流动相，化合物A的HPLC图谱见图2所示。
由图2可知，化合物A在5.357min时出现单一色谱峰，经测定甘草内生真菌GRP13中分离纯化得到的化合物A纯度为97％。
使用②号流动相，化合物B的HPLC图谱如图3所示。
将化合物B与对照品做对比实验，发现化合物B与甘草次酸对照品在保留时间8.581min时出现相同的吸收峰，且都为单一色谱峰，说明从甘草内生真菌GRP13菌株发酵液中分离得到的化合物B疑似为甘草次酸，且其纯度为96.3％。
使用③号流动相，化合物C的HPLC图谱如图4所示。
由图4可知，将化合物C与甘草素对照品做对比实验，发现化合物C与甘草素对照品在保留时间10.481min时出现相近的吸收峰，且都为单一色谱峰，说明从甘草内生真菌GRP13菌株发酵液中分离得到的化合物C疑似为甘草素，经测定，其纯度为96％。
使用②号流动相，化合物D的HPLC图谱见图5所示。
由图5可知，化合物D在保留时间2.434min时出现单一色谱峰，从甘草内生真菌GRP13菌株发酵液中分离纯化得到的化合物D，其纯度为95.7％。
(2)活性化合物结构鉴定结果
化合物A：淡黄色针状结晶(产率为3.497mg/L)。MS鉴定结果：Positive MS：145.2[M+Na]+，267.3[2M+Na]+，283.4[2M+k]+，Negetive MS：121.3[M－H]—。1H-NMR (MeOD，400MHz)δ：8.01(d，J＝49.9Hz，H-2)，7.46(t，J＝53.6Hz，H-3)，7.59(t， J＝52.7Hz，H-4)。13C–NMR(MeOD，150MHz)δ：169.91(C1)，130.70(C2)，129.46 (C3)，134.04(C4)，129.46(C5)，130.70(C6)，131.93(C7)。
综合HPLC、MS、1H-NMR以及13C–NMR鉴定可知，化合物A相对分子质量为 122.12，分子式为C7H6O2，元素分析结果为C:68.81，H:4.95，O:26.27，同时结合其理化性质，以及参阅文献，最终确定化合物A为苯甲酸，其结构式如下：
化合物B：白色粉末状化合物(产率为2.165mg/L)。ESI-MS m/z：469.35[M-H]-，结果：1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：5.71(1H，s，H-12，3.50(1H， H-3)3.25(dd，J＝10.6Hz，5.3Hz，H-5)，2.80(d，J＝13.5Hz，H-2)，2.36(1H，m， H-9)，1.88-0.70(21H，s，7×CH3)。13C-NMR(101MHz，CDCl3)δ200.3(C-29)， 180.1(C-11)，169.2(C-13)，128.6(C-12)，78.8(C-3)，61.8(C-18)，55.0(C-5)，48.3 (C-9)，45.4(C-14)，43.7(C-22)，43.2(C-8)，40.9(C-19)，39.1(C-21)，37.7(C-4)， 37.1(C-10)，32.8(C-17)，31.9(C-20)，29.7(C-7)，28.5(C-28)，28.4(C-16)，28.1(C-23)， 27.3(C-2)，26.5(C-6)，26.4(C-15)，23.5(C-30)，18.7(C-27)，17.5(C-24)，16.4(C-25)， 15.6(C-26)。
综合TLC、HPLC、MS、1H-NMR和13C-NMR的鉴定可知，单体化合物B相对分子质量为470.68，分子式为C30H46O4，同时结合其理化性质以及参阅文献，最终可以确定化合物B为甘草次酸(glycyrrhetinic acid)，其结构式如下：
化合物C：该化合物为淡黄色粉末状物质(产率为1.66mg/L)，在紫外254nm下呈深蓝色点状。MS鉴定结果：ESI-MS：255.03[M-H]-，511.25[2M-H]-。1H-NMR(400MHz， MeOD)δ：7.75(1H，d，J＝8.7Hz，H-5)，7.33(2H，d，J＝8.5Hz，H-2’，6’)，6.81 (2H，d，J＝8.6Hz，H-3’，5’)，6.51(1H，dd，J＝8.8Hz，2.3Hz，H-6)，6.36(1H，d， J＝2.3Hz，H-6)，5.38(1H，dd，J＝13.0Hz，2.9Hz，H-2)，3.09(1H，dd，J＝17.0Hz，13.0Hz， H-3a)，2.72(1H，dd，J＝16.9Hz，3.0Hz，H-3b)。13C-NMR(101MHz，MeOD)δ： 192.1(C-4)，165.4(C-7)，164.2(C-9)，157.6(C-4’)，129.9(C-1’)，128.4(C-5)， 127.6(C-6’)，127.6(C-2’)，114.9(C-3’)，113.6(C-10)，110.3(C-6)，102.4(C-8)， 79.6(C-2)，43.6(C-3)。
综合TLC、HPLC、MS、1H-NMR和13C-NMR的鉴定可知，单体化合物D相对分子质量为256.25，分子式为C15H12O4，同时结合其理化性质以及参阅文献，最终可以确定化合物C为甘草素(liquiritigenin)，其结构式如下：
化合物D，白色粉末状固体(产率为1.88mg/L)，紫外条件254nm下显深蓝色。MS 鉴定结果：Positive MS：362.29[M-3OH]+，387.6[M-CH2OH]+，475.37[M+3OH]+；Negetive MS：417.02[M-H]-，437.02[M+OH]-。1H-NMR(400MHz，MeOD)δ：7.74(1H，d， J＝8.7Hz，H-5)，7.45(2H，d，J＝8.6Hz，H-2’6’)，7.16(2H，d，J＝8.7Hz，H-3’，5’)， 6.52(1H，dd，J＝8.7Hz，2.2Hz，H-6)，6.37(1H，d，J＝8.7Hz，H-8)，5.45(1H，dd， J＝12.7Hz，2.9Hz，H-2)，4.94(1H，d，J＝7.4Hz，H-1”)，3.91(1H，dd，J＝12.2Hz，2.3Hz，H-6”a)，3.68(1H，dd，J＝12.0Hz，2.3Hz，H-6”b)，3.4～3.31(4H，m，H-2”～5”)，3.09(1H，dd，J＝16.8Hz，12.7Hz，H-3a)，2.76(1H，dd，J＝16.8Hz，2.9Hz， H-3b)。13C-NMR(101MHz，MeOD)δ：191.8(C-4)，165.5(C-7)，164.0(C-8a)， 157.8(C-4’)，133.1(C-5)，128.4(C-1’)，127.4(C-2’，6’)，116.4(C-3’，5’)，113.6 (C-4a)，112.0(C-6)，102.4(C-8)，79.31(C-2)，43.6(C-3)；glucose：100.8(C-1”)， 76.79(C-5”)，76.6(C-3”)，73.5(C-2”)，69.9(C-4”)，61.1(C-6”)。
综合TLC、HPLC、MS、1H-NMR和13C-NMR的鉴定可知，单体化合物D相对分子质量为418.39，分子式为C21H22O9，同时结合其理化性质以及参阅文献，最终可以确定化合物E为甘草苷(liquiritin)，其结构式如下：
采用上述分离方法可以利用甘草内生真菌GRP13生产甘草活性成分，为工业化生产甘草活性成分原料提供新方法。

Claims (7)

1.利用微生物发酵产高效抗氧化活性物质的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
一、甘草内生真菌GRP13菌株的活化：
将GRP13菌株接种于马铃薯固体培养基平板上，放置于27～29℃恒温箱中，培养3～4d，得到活化的GRP13菌株；
二、甘草内生真菌GRP13种子液的制备：
将活化后的GRP13菌株接种于液体马铃薯培养基中，于27～29℃，130～150r/min摇床培养3～4d，制成1×107～1×108CFU/mL种子培养液；
三、甘草内生真菌GRP13发酵液供试品的制备：
取种子液接种至马铃薯液体培养基中，27～29℃、130～150r/min摇床发酵14～16d，获得GRP13菌株发酵样品，将GRP13菌株发酵样品真空抽滤，得GRP13菌株发酵液，将所得GRP13菌株发酵液至于50～55℃减压浓缩至相对密度为1.1～1.2，即为抗氧化活性物质。
2.根据权利要求1所述的利用微生物发酵产高效抗氧化活性物质的方法，其特征在于：步骤一中马铃薯固体培养基的配方为：去皮马铃薯块200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。
3.根据权利要求1或2所述的利用微生物发酵产高效抗氧化活性物质的方法，其特征在于：步骤二中液体马铃薯培养基的配方为：去皮马铃薯块200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL。
4.根据权利要求3所述的利用微生物发酵产高效抗氧化活性物质的方法，其特征在于：步骤二中将活化后的GRP13菌株接种于液体马铃薯培养基的接种量是3％～7％。
5.根据权利要求3所述的利用微生物发酵产高效抗氧化活性物质的方法，其特征在于：步骤二中将活化后的GRP13菌株接种于液体马铃薯培养基的接种量是4％～6％。
6.根据权利要求4所述的利用微生物发酵产高效抗氧化活性物质的方法，其特征在于：步骤三中种子液接种至马铃薯液体培养基中的接种量是3％～7％。
7.根据权利要求4所述的利用微生物发酵产高效抗氧化活性物质的方法，其特征在于：步骤三中种子液接种至马铃薯液体培养基中的接种量是4％～6％。
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