CN104774774A - 一株产pseurotin A的甘草内生真菌 - Google Patents

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Abstract

一株产pseurotin A的甘草内生真菌，涉及一株甘草内生真菌。本发明提供一株甘草内生真菌，其代谢物具有较好的抗菌活性，并能产生重要天然产物pseurotin A，可为新型抗菌药物的筛选提供参考。烟曲霉GRP13，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2015年4月1日，保藏编号为CCTCC NO：M 2015186。本发明烟曲霉GRP13具有较好抑菌活性，能产生重要的生化试剂pseurotin A，烟曲霉GRP13可作为筛选新型抗菌物质的目的菌株进行开发利用，为研发新药及新型食品防腐剂提供参考。

Description

一株产pseurotin A的甘草内生真菌
技术领域
本发明涉及一株甘草内生真菌。
背景技术
pseurotin A为重要的天然产物，是酰胺类生物碱，也是重要的生化试剂，是阿朴吗啡拮抗剂，能抑制壳聚糖合成和单胺氧化酶活性，具有诱导细胞分化，抗菌和免疫调节作用；其主要生产渠道为从微生物代谢产物中分离得到；pseurotin A结构如下，分子式：C22H25NO8，分子量为431.44。
酰胺生物碱pseurotin A是重要的微生物次生代谢产物，是研究人员于1976年从子囊菌(Pseudeurotium ovalis STORK)发酵液中分离得到，随着对pseurotin A活性的深入研究，人们开始对pseurotin A及其类似物进行化学合成以提高产量，但化学合成生产pseurotin A具有环境污染，试剂消耗高，成本高等缺点，因此发掘新型高产pseurotin A菌株是目前研究的课题。
发明内容
本发明提供一株甘草内生真菌，其代谢物具有较好的抗菌活性，并能产生重要天然产物pseurotin A，可为新型抗菌药物的筛选提供参考。
本发明产pseurotin A的甘草内生真菌为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)GRP13，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2015年4月1日，保藏编号为CCTCC NO：M 2015186。
本发明烟曲霉GRP13在PDA固体培养基上培养7天后，菌落翠绿色，边缘白色，产生翠绿色粉末，基质淡黄色，分生孢子的顶囊呈烧瓶状，小梗单层，布满顶囊上部；分生孢子呈球形，有小棘，绿色。
本发明烟曲霉GRP13可在PDA培养基上生长，最适生长温度为28℃。
将烟曲霉GRP13的ITS序列提交至NCBI网页，应用BLAST分析，进行同源性比对，并构建系统发育树，结果显示，烟曲霉GRP13与Aspergillus fumigatus(M60300.1)在同一个分支上，而且与烟曲霉GRP13在同一簇上的其他菌都属于曲霉属，结合形态学观察结果，确定烟曲霉GRP13为丝孢科(Hyohomycetaceae)，曲霉属(Aspergillus)，烟曲霉(Aspergillus fumigatus)。
对烟曲霉GRP13进行抗菌活性研究：以大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphlococcus aureus)和白假丝酵母(Candida albicans)等11株致病菌为指示菌种，对烟曲霉GRP13进行抗菌活性研究，结果表明烟曲霉GRP13具有较好抑菌活性。并且烟曲霉GRP13能产生重要的生化试剂pseurotin A，烟曲霉GRP13可作为筛选新型抗菌物质的目的菌株进行开发利用，为研发新药及新型食品防腐剂提供参考。
本发明烟曲霉GRP13属于曲霉属(Aspergillus)，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2015年4月1日，保藏编号为CCTCC NO：M 2015186。
附图说明
图1为本发明烟曲霉GRP13的菌落形态照片；图2为本发明烟曲霉GRP13的孢子形态照片；图3为本发明烟曲霉GRP13和相近菌株进行同源性比对构建的系统发育树；图4为本发明烟曲霉GRP13活性代谢物分离得到的晶体照片；图5为本发明烟曲霉GRP13活性代谢物的TLC检测结果。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式产pseurotin A的甘草内生真菌为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)GRP13，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2015年4月1日，保藏编号为CCTCC NO：M 2015186。
本实施方式烟曲霉GRP13在PDA固体培养基上培养7天后，菌落翠绿色，边缘白色，产生翠绿色粉末，基质淡黄色，分生孢子的顶囊呈烧瓶状，小梗单层，布满顶囊上部；分生孢子呈球形，有小棘，绿色。
本发明烟曲霉GRP13可在PDA培养基上生长，最适生长温度为28℃。
本实施方式烟曲霉GRP13是由甘草根、茎中筛选得到。筛选按以下步骤进行：
1、表面消毒法的建立：将冲洗干净的药用植物乌拉尔甘草根、茎，在无菌条件下分 别切成1.0cm长的小段，用无菌小刀刮去外皮，先在75％酒精中浸泡1min，然后置于2％NaClO中漂洗15min，无菌水冲洗3次。用无菌手术刀将样品从中间切开，分别置于PDA固体培养基和PDA液体培养基中，于28℃恒温培养箱和摇床中培养，待其边缘及顶端长出菌丝后，及时挑取菌落转移到相应的培养基中。
2、表面消毒效果检验：采用漂洗液检验法进行灭菌效果的检验：即把最后一次漂洗消毒材料的漂洗液吸取0.3mL涂布于PDA固体平板上中，28℃培养，观察培养结果。
采用组织印迹法进行灭菌效果的检验：即用灭过菌的镊子夹住消毒后的的实验材料，使其表面与PDA固体平板接触3-5min后取出，28℃培养3-7d后，观察结果。
结果：将甘草进行表面消毒后，将最后一次漂洗消毒材料的漂洗液吸取0.3mL涂布于PDA固体平板上进行培养，周围无任何菌长出，证明该样品表面灭菌彻底；采用组织印迹法的检验：用灭过菌的镊子夹住消毒后的实验材料，使其表面与PDA固体平板接触3-5min后取出，置于相同条件下培养3-7d后，发现培养皿中无菌落出现，证明得到的真菌来源于甘草组织内部，而不是甘草表面的附生菌。获得的纯化后的菌株即为烟曲霉GRP13。
筛选出的甘草内生真菌根据《真菌分类学》、《真菌鉴定手册》和《半知菌属图解》进行形态学鉴定，根据其形态学特征初步鉴定为丝孢科曲霉属。其菌落形态和孢子形态显微结构如图1和2所示。
对分离纯化得到的烟曲霉GRP13进行分子生物学鉴定：
烟曲霉GRP13发酵液经抽滤得菌丝体用25％乙醇漂洗2次，灭菌去离子水冲洗2次，吸干残留液体，使沉淀尽可能干燥，于液氮中迅速研磨至粉末状，提取总DNA后进行目的片段的PCR扩增，将含有目的条带的PCR产物全部进行再次点样，2％的琼脂糖凝胶电泳，于紫外灯下将目的条带切下，用上海生工UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒，制备大肠杆菌感受态细胞，将PCR产物与PMD18-T载体进行连接后，链接产物加入到感受态细胞中，进行菌落PCR验证；挑取单菌落进行大肠杆菌转化子的PCR检测，证明目的片段已成功转化进入感受态细胞中，将克隆阳性菌株送上海生工生物工程技术服务有限公司测序；所测定的核苷酸序列在NCBI数据库中应用BLAST分析，进行同源性比对，并使用MEGA5.0构建系统发育树，确定目的菌株的分类地位。
甘草内生真菌GRP13菌株18S rDNA提取后进行扩增，结果显示菌株的18S rDNA大小为1305bp，PCR产物纯化后进行测序，其序列如SEQ ID NO：1所示，将测序结果应用BLAST进行同源性比对，并使用MEGA5.0构建系统发育树，如图3所示，结果显示， 烟曲霉GRP13与Aspergillus fumigatus(M60300.1)在同一个分支上，而且与烟曲霉GRP13在同一簇上的其他菌都属于曲霉属，结合形态学观察结果，确定烟曲霉GRP13为丝孢科(Hyohomycetaceae)，曲霉属(Aspergillus)，烟曲霉(Aspergillus fumigatus)。
以下对本实施方式烟曲霉GRP13进行抗菌活性研究及活性代谢物分离研究，具体步骤如下：
(一)烟曲霉GRP13抗菌活性研究：
供试品液制备：将烟曲霉GRP13于28℃，140r/min发酵培养14天后取出，真空抽滤，滤液于70℃下减压浓缩，甲醇溶解后作为供试品液，备用。
采用滤纸片法测定烟曲霉GRP13的抑菌活性：将活化后的10株细菌接于含有牛肉膏蛋白胨固体培养基试管平面上，于37℃恒温培养24h；将活化后的1株真菌接于一个含有PDA固体培养基的试管平面上，然后，于28℃恒温培养3d。取培养好的试管斜面，每个试管加入5mL无菌水，振荡至斜面上菌体混悬于无菌水中，取一滴菌液滴于血球计数板上，盖上盖玻片后在显微镜下观察计数并稀释菌体浓度至1×107CFU/mL，按菌悬液和培养基的体积比为1:100的比例向55℃左右的液体培养基中加入菌悬液(细菌加入到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，真菌加入到PDA液体培养基中)，振荡混匀后迅速的倒入已灭菌空平板中，每个平板含培养基25mL，待培养基凝固，制成含菌平板，备用。在无菌条件下，取三片灭菌后滤纸片(Φ＝6mm)对称放置于含供试菌平板中，精确量取20μL供试品液加在滤纸片上，待样品吸收后，将含有供试细菌的平板水平放置于37℃恒温箱中培养，24h后测量抑菌圈直径；将含有供试真菌的平板水平放置于28℃恒温箱中培养，3d后测量抑菌圈直径，每个样品平行做3次；以链霉素溶液和制霉素菌溶液(0.1mg/mL)作为阳性对照，甲醇溶液作为阴性对照。
所述10株供试细菌为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、粪肠球菌(Enterococcus facalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baummanii)和铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa)，供试真菌为白假丝酵母(Candida albicans)，均购买自黑龙江省科学院微生物研究所。
结果显示：烟曲霉GRP13对单增李斯特菌和肺炎链球菌具有较好的抗菌活性，抑菌圈直径可达到12.2mm，而对粪肠杆菌和屎肠杆菌的抗菌效果较弱，其抑菌圈直径只有7.3mm左右。结果如表1所示：
表1
(二)烟曲霉GRP13活性代谢物的分离研究：
(1)供试品制备：将烟曲霉GRP13进行发酵培养14天后，抽滤，发酵液减压浓缩，保存备用。
(2)有效部位的制备：用乙醚(3×100mL)对烟曲霉GRP13发酵液进行萃取，得到有效部位，保存备用。
(3)称取200-300目柱层层析硅胶25g，80-100目柱层层析硅胶3g，于120℃活化2h，于干燥器中冷却至室温。
(4)采用湿法装柱：将活化好的200-300目硅胶加入石油醚浸泡，搅拌均匀除去气泡，制成混悬液，将硅胶混悬液缓慢倒入层析柱(内径2cm，柱长50cm)内，打开下部活塞，缓慢加入石油醚冲洗硅胶柱至柱床不再下沉，再用两倍柱体积的洗脱液体系稳定柱子。
(5)采用干法上样：取待分离样品的甲醇溶液低温减压至干，加入80-100目柱层层析硅胶3g，搅拌均匀，自然挥干，将样品粉末缓慢均匀的添加在柱子上方。
(6)活性有效部位的分离：将样品按TLC确定的体系，以石油醚：乙酸乙酯(15:5)为洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，每10mL收集一馏分，共收集325份，以石油醚-乙酸乙酯-甲酸(15:15:2)为展开剂，应用TLC对馏分进行检测，根据TLC检测结果，合并相同的馏分，将201-255号馏分合并后，回收溶剂，以石油醚：乙酸乙酯(17:3)为洗脱液进行二次硅胶柱分离，得到淡黄色颗粒状晶体，该晶体易溶于甲醇，且在254nm下有荧光，365nm下无荧光。得到的晶体如图4所示，其TLC检测结果如图5所示；该化合物经MS，1H-NMR，13C-NMR进行结构鉴定结果见表2，经查阅文献，确定该化合物为pseurotin A。
表2化合物pseurotin A1H-NMR，和13C-NMR测试结果
Position 1H-NMR 13C-NMR
C(2)   169.2
C(3)   114.4
C(4)   199.2
C(5)   93.8
C(6)   188.6
C(8)   93.5
C(9) 4.43(s) 76.3
C(10) 4.40(d,6.4Hz) 72.9
C(11) 4.57(dd,6.4,8.8Hz) 69.5
C(12) 5.36(dd,8.8,9.8Hz) 128.7
C(13) 5.52(dt,7.6,9.8Hz) 137.3
C(14) 1.23(o),1.14(t,7.2Hz) 22.2
C(15) 0.87(t,7.2Hz) 14.5
C(16) 1.66(s) 5.8
C(17)   197.1
C(18)   134.8
C(19)andC(23) 8.25(d,7.6Hz) 131.7
C(20)andC(22) 7.40(t,7.6Hz) 129.5
C(21) 7.55(t,7.6Hz) 135.1
CH3O 3.24(s) 52.4

Claims (1)

1.一株产pseurotin A的甘草内生真菌，其特征在于该菌株为烟曲霉(Aspergillusfumigatus)GRP13，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2015年4月1日，保藏编号为CCTCC NO：M 2015186。
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