CN107988187A - 一种以低廉碳源快速制备高活性纤维素酶的方法 - Google Patents
一种以低廉碳源快速制备高活性纤维素酶的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107988187A CN107988187A CN201711347862.1A CN201711347862A CN107988187A CN 107988187 A CN107988187 A CN 107988187A CN 201711347862 A CN201711347862 A CN 201711347862A CN 107988187 A CN107988187 A CN 107988187A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cellulase
- carbon source
- high active
- fermentation
- aspergillus fumigatus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 title claims abstract description 71
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 title claims abstract description 70
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 19
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 48
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 47
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 47
- 241000223221 Fusarium oxysporum Species 0.000 claims abstract description 23
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 claims abstract description 23
- 241001225321 Aspergillus fumigatus Species 0.000 claims abstract description 22
- 229940091771 aspergillus fumigatus Drugs 0.000 claims abstract description 22
- 241000202807 Glycyrrhiza Species 0.000 claims abstract description 18
- LTINPJMVDKPJJI-UHFFFAOYSA-N iodinated glycerol Chemical compound CC(I)C1OCC(CO)O1 LTINPJMVDKPJJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 claims abstract description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 12
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 11
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 11
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 11
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 8
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 6
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 claims description 5
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 229910052564 epsomite Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 2
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 claims description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 14
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 29
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 29
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 29
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 7
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 3
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- VTAJIXDZFCRWBR-UHFFFAOYSA-N Licoricesaponin B2 Natural products C1C(C2C(C3(CCC4(C)CCC(C)(CC4C3=CC2)C(O)=O)C)(C)CC2)(C)C2C(C)(C)CC1OC1OC(C(O)=O)C(O)C(O)C1OC1OC(C(O)=O)C(O)C(O)C1O VTAJIXDZFCRWBR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- LPLVUJXQOOQHMX-UHFFFAOYSA-N glycyrrhetinic acid glycoside Natural products C1CC(C2C(C3(CCC4(C)CCC(C)(CC4C3=CC2=O)C(O)=O)C)(C)CC2)(C)C2C(C)(C)C1OC1OC(C(O)=O)C(O)C(O)C1OC1OC(C(O)=O)C(O)C(O)C1O LPLVUJXQOOQHMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001685 glycyrrhizic acid Substances 0.000 description 2
- 229960004949 glycyrrhizic acid Drugs 0.000 description 2
- UYRUBYNTXSDKQT-UHFFFAOYSA-N glycyrrhizic acid Natural products CC1(C)C(CCC2(C)C1CCC3(C)C2C(=O)C=C4C5CC(C)(CCC5(C)CCC34C)C(=O)O)OC6OC(C(O)C(O)C6OC7OC(O)C(O)C(O)C7C(=O)O)C(=O)O UYRUBYNTXSDKQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019410 glycyrrhizin Nutrition 0.000 description 2
- LPLVUJXQOOQHMX-QWBHMCJMSA-N glycyrrhizinic acid Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O[C@@H]1O[C@@H]1C([C@H]2[C@]([C@@H]3[C@@]([C@@]4(CC[C@@]5(C)CC[C@@](C)(C[C@H]5C4=CC3=O)C(O)=O)C)(C)CC2)(C)CC1)(C)C)C(O)=O)[C@@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O LPLVUJXQOOQHMX-QWBHMCJMSA-N 0.000 description 2
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 2
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012549 training Methods 0.000 description 2
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 1
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 1
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 101710112457 Exoglucanase Proteins 0.000 description 1
- 244000303040 Glycyrrhiza glabra Species 0.000 description 1
- 235000006200 Glycyrrhiza glabra Nutrition 0.000 description 1
- 235000017443 Hedysarum boreale Nutrition 0.000 description 1
- 235000007858 Hedysarum occidentale Nutrition 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000235342 Saccharomycetes Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 description 1
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 description 1
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 1
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000003245 coal Substances 0.000 description 1
- 235000019784 crude fat Nutrition 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- -1 ferment 3 days When Proteins 0.000 description 1
- 229930003944 flavone Natural products 0.000 description 1
- 150000002213 flavones Chemical class 0.000 description 1
- 235000011949 flavones Nutrition 0.000 description 1
- 230000003087 glucogenic effect Effects 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000001947 glycyrrhiza glabra rhizome/root Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000012978 lignocellulosic material Substances 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000003345 natural gas Substances 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 1
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 description 1
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供一种以低廉碳源快速制备高活性纤维素酶的方法，涉及生物技术领域。所述以低廉碳源快速制备高活性纤维素酶的方法，以甘草渣为碳源，采用里氏木霉、尖孢镰刀菌、烟曲霉菌混合发酵，制备高活性的纤维素酶。将Trichoderma reesei ATCC 56764、Fusarium oxysporum BN和Aspergillus fumigatus HY混合发酵，不仅能够显著缩短发酵时间，而且能够显著提高纤维素酶活力。三种菌株混合发酵后，产生的纤维素酶活性大于各菌株单独发酵产生的纤维素酶活性之和，即三种菌株混合发酵产生了协同增效作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及以低廉碳源快速制备高活性纤维素酶的 方法。
背景技术
随着经济的发展，人类对石油、天然气、煤炭等不可再生化石能源的需求越 来越大，由此产生了能源安全、石油消耗、全球变暖等诸多问题。这些问题促使 世界各国加快了对安全、清洁、可再生的替代能源的研究。燃料乙醇是当前研究 和应用都取得很大进展的一种清洁的可替代能源，但目前其生产主要依赖于淀粉 和糖类原料，这两种原料利用涉及到与人畜争粮争地的问题，由此带来的粮食价 格上涨问题已经显现。开发粮食以外的廉价原料对制取燃料乙醇技术意义重大。
木质纤维素原料生产燃料乙醇的工艺流程主要包括预处理、纤维素酶水解以 及发酵菌种和发酵工艺三步。纤维素酶是使纤维素降解生成葡萄糖的一组酶的总 称，主要包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。纤维素酶的三个 组分经过协同作用，将大分子的纤维素降解为低分子量的寡糖、双糖或多糖。纤 维素酶广泛的应用于食品加工业、酿造业、造纸工业、饲料添加剂、纺织工业、 医药领域、植物细胞融合等方面。纤维素酶的产生菌包括细菌、真菌、酵母菌等， 但目前主要用于纤维素酶生产的菌种主要为丝状真菌。丝状真菌产生的纤维素酶 酶系较全，且其产生的酶多为胞外酶，便于后期的分离提取。目前传统工艺均采 用单种菌株发酵产纤维素酶，酶活力较低，发酵生产时间过长。
甘草(Glycyrrhiza)属豆科甘草属的一种多年生草本植物，在我国集中分 布在新疆、内蒙古、宁夏和甘肃等地区，中心区在新疆塔里木河流域和内蒙古西 鄂尔多斯高原。目前，对甘草其药理方面的研究较多，主要是提取甘草中有药效 作用的部分，如甘草酸，甘草黄酮等。甘草渣是甘草在提取甘草浸膏、甘草酸等 产品后的残渣，通常作为废弃物遗弃，会对环境造成一定的危害。甘草渣营养成 分非常丰富，据分析，每千克干甘草渣含粗蛋白75克、粗纤维43克、粗脂肪 8克，除此之外还含有许多甘草产生的生物活性成份。若能有效利用甘草渣，变 废为宝，对于可持续发展有重大意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种以低廉碳源—废弃甘草渣为原料，巧妙通过菌种的 协同效应制备纤维素酶的方法，能够在较短的时间内获得较高的纤维素酶活力。
本发明的目的采用如下技术方案实现。
一种以低廉碳源快速制备高活性纤维素酶的方法，以甘草渣为碳源，采用里
氏木霉、尖孢镰刀菌、烟曲霉菌混合发酵，制备高活性的纤维素酶。
在本发明中，所述里氏木霉为Trichoderma reesei ATCC 56764，所述尖孢镰刀菌为Fusarium oxysporum BN，所述烟曲霉菌为Aspergillus fumigatus HY。
优选的技术方案中，所述Trichoderma reesei ATCC 56764、Fusarium oxysporumBN和Aspergillus fumigatus HY的比例为15-20:4-6:10-15。
优选的技术方案中，将Trichoderma reesei ATCC 56764、Fusarium oxysporumBN和Aspergillus fumigatus HY分别划线接种至PDA培养基，培养2-5天后，用生 理盐水洗下孢子，接种至发酵培养基进行混合发酵。
在本发明中，所述发酵培养基含有如下成分：甘草渣8-11g/l，葡萄糖0.5-2.0g/l，(NH4)2SO4 2-5g/l，KH2PO4 1-4g/l，MgSO4·7H2O 0.4-0.6g/l，大豆粉7-10g/l， pH 4.0-5.0。
优选的技术方案中，发酵温度为25-35℃，发酵时间90-100h。
优选的技术方案中，将发酵液离心，取上清液作为纤维素酶液。
申请人通过大量筛选实验，发现将Trichoderma reesei ATCC 56764、Fusarium oxysporum BN和Aspergillus fumigatus HY混合发酵，不仅能够显著缩短发酵时间，而且能够显著提高纤维素酶活力。三种菌株混合发酵后，产生的纤维素酶活性大于各菌株单独发酵产生的纤维素酶活性之和，即三种菌株混合发酵产生了协同增效作用。另外，采用本发明方法制备高活性纤维素酶，由于碳源是甘草渣，原料易得、成本低廉，减少了甘草渣焚烧带来的环境污染，且发酵过程对环境无污染，具有广阔的市场前景。采用本发明方法制备的纤维素酶，最适反应温度为60度，而且在该温度下酶活力稳定，应用于水解秸秆，耗时短，葡萄糖含量高。
附图说明
图1显示了反应pH对纤维素酶活力的影响。
图2显示了反应温度对纤维素酶活力的影响。
具体实施方式
实施例一
采用Trichoderma reesei ATCC 56764、Fusarium oxysporum BN和Aspergillusfumigatus HY发酵制备纤维素酶。
1.菌株来源
Trichoderma reesei ATCC 56764购自美国模式培养物保藏所。Fusariumoxysporum BN的GenBank accession No.KM979515)、Aspergillus fumigatus HY 的GenBank Accession No.KF813024)。
2.种子液的获得
种子液的获得：将Trichoderma reesei ATCC 56764、Fusarium oxysporum BN、Aspergillus fumigatus HY分别接种于PDA培养基(每升培养基组成：马铃薯200g， 葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH自然)上，30℃培养3d。用生理盐 水分别洗下各菌株的孢子，将各菌株的孢子悬液混合得到了种子液。种子液中， 所有菌株的集落形成单位数目为1×107CFU/ml，其中Trichoderma reesei ATCC 56764、Fusarium oxysporum BN、Aspergillus fumigatus HY集落形成单位数目之 比为20:5:15。
3.制备纤维素酶
发酵培养基含有如下成分：甘草渣(含水率为5％，粉碎至200目-300目)10g/l， 葡萄糖1g/l,(NH4)2SO4 4g/l，KH2PO4 2g/l，MgSO4·7H2O 0.5g/l，大豆粉8g/l， pH 4.5。
采用本发明方法制备纤维素酶，包括如下步骤：将1ml种子液接种至100ml 发酵培养基中，在30℃、180rpm条件下震荡培养6天，每隔24小时，取发酵液， 离心取上清液作为纤维素酶液。检测纤维素酶液的活力(滤纸酶活力)。
滤纸酶活力(FPA)按照国际理论和应用化学协会推荐的标准方法测定(Ghose TK.Measurement of cellulase activities.Pure&Appl.chem.,1987,59(2):257～ 268),以国际单位(IU)表示。一个国际滤纸酶活力单位(IU)等于酶水解反应中 每分钟由滤纸(Whatman No.1)生成1μmol葡萄糖的酶量。
对比试验1：将1ml的Trichoderma reesei ATCC 56764孢子悬液(集落形成单 位数目为5×106CFU/ml)接种至100ml发酵培养基，在30℃、180rpm条件下震荡 培养6天，每隔24小时，取发酵液，离心取上清液检测纤维素酶活力(滤纸酶活 力)。
对比试验2：将1ml的Fusarium oxysporum BN孢子悬液(集落形成单位数目 为1.25×106CFU/ml)接种至100ml发酵培养基，在30℃、180rpm条件下震荡培养6 天，每隔24小时，取发酵液，离心取上清液检测纤维素酶活力(滤纸酶活力)。
对比试验3：将1ml的Aspergillus fumigatus HY孢子悬液(集落形成单位数目 为3.75×106CFU/ml)接种至100ml发酵培养基，在30℃、180rpm条件下震荡培养6 天，每隔24小时，取发酵液，离心取上清液检测纤维素酶活力(滤纸酶活力)。
对比试验4：将1ml的Trichoderma reesei ATCC 56764和Fusarium oxysporum BN孢子悬液(集落形成单位数目分别为5×106CFU/ml和1.25×106CFU/ml)接种至 100ml发酵培养基，在30℃、180rpm条件下震荡培养6天，每隔24小时，取发酵 液，离心取上清液检测纤维素酶活力(滤纸酶活力)。
对比试验5：将1ml的Trichoderma reesei ATCC 56764和Aspergillus fumigatusHY孢子悬液(集落形成单位数目分别为5×106CFU/ml和3.75×106CFU/ml)接种至 100ml发酵培养基，在30℃、180rpm条件下震荡培养6天，每隔24小时，取发酵 液，离心取上清液检测纤维素酶活力(滤纸酶活力)。
对比试验6：将1ml的Fusarium oxysporum BN和Aspergillus fumigatus HY孢子悬液(集落形成单位数目分别为1.25×106CFU/ml和3.75×106CFU/ml)接种至100ml 发酵培养基，在30℃、180rpm条件下震荡培养6天，每隔24小时，取发酵液，离 心取上清液检测纤维素酶活力(滤纸酶活力)。
表1本发明方法发酵不同时间的纤维素酶活力(IU/ml)
| 发酵时间(天) | 本发明方法 |
| 1 | 42.5 |
| 2 | 202.1 |
| 3 | 753.2 |
| 4 | 609.4 |
| 5 | 515.2 |
| 6 | 495.5 |
表2对比试验不同发酵时间的纤维素酶活力(IU/ml)
从表1和2可以看到，采用本发明方法以Trichoderma reesei ATCC 56764、Fusarium oxysporum BN和Aspergillus fumigatus HY混合发酵制备纤维素酶，发酵3 天时，纤维素酶活力达到了753.2IU/ml，之后纤维素酶活力逐步降低。采用 Trichodermareesei ATCC 56764、Fusarium oxysporum BN和Aspergillus fumigatus HY中的单一菌株或者任意两种混合进行发酵，达到最大纤维素酶活力的时间较 长，且酶活力最大仅有298.3IU/ml。
实施例二
采用Trichoderma reesei ATCC 56764、Fusarium oxysporum BN和Aspergillusfumigatus HY混合发酵制备纤维素酶。
1.种子液的获得
将Trichoderma reesei ATCC 56764、Fusarium oxysporum BN、Aspergillusfumigatus HY分别接种于PDA培养基(每升培养基组成：马铃薯200g，葡萄糖 20g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH自然)上，30℃培养3d。用生理盐水分别 洗下各菌株的孢子，然后混合得到了种子液。种子液中，所有菌株的集落形成单 位数目为1×107CFU/ml)，其中Trichoderma reesei ATCC 56764、Fusarium oxysporum BN、Aspergillus fumigatus HY集落形成单位数目之比为15:5:10。
2.制备纤维素酶
发酵培养基含有如下成分：甘草渣(含水率为5％，粉碎至200目-300目)15g/l， 葡萄糖0.5g/l,(NH4)2SO4 3g/l，KH2PO4 3g/l，MgSO4·7H2O 0.6g/l，大豆粉9g/l， pH 5.0。
将1ml种子液接种至100ml发酵培养基，在30℃、180rpm条件下震荡培养6天， 每隔24小时，取发酵液，离心取上清液作为纤维素酶液。按照实施例1中相同方 法，检测纤维素酶液的活力(滤纸酶活力)。
表3发酵不同时间的酶活(IU/ml)
| 发酵时间(天) | 酶活 |
| 1 | 56.5 |
| 2 | 224.3 |
| 3 | 762.8 |
| 4 | 618.4 |
| 5 | 525.8 |
| 6 | 504.5 |
从表3中可见，采用Trichoderma reesei ATCC 56764、Fusarium oxysporum BN、Aspergillus fumigatus HY混合发酵制备纤维素酶，在发酵3天时，纤维素 酶活力最高，达到762.8IU/ml。
实施例3
采用Trichoderma reesei ATCC 56764、Fusarium oxysporum BN和Aspergillusfumigatus HY混合发酵制备纤维素酶。
1.种子液的获得
将Trichoderma reesei ATCC 56764、Fusarium oxysporum BN、Aspergillusfumigatus HY分别接种于PDA培养基(每升培养基组成：马铃薯200g，葡萄糖 20g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH自然)上，30℃培养3d。用生理盐水分别 洗下各菌株的孢子，然后混合得到了种子液。种子液中，所有菌株的集落形成单 位数目为1×107CFU/ml，其中Trichodermareesei ATCC 56764、Fusarium oxysporum BN、Aspergillus fumigatus HY集落形成单位数目之比为15:6:15。
2.制备纤维素酶
发酵培养基含有如下成分：甘草渣(含水率为5％，粉碎至200目-300目)8g/l， 葡萄糖2g/l,(NH4)2SO4 2g/l，KH2PO4 1g/l，MgSO4·7H2O 0.5g/l，大豆粉10g/l， pH 4.5。
将1ml种子液接种至100ml发酵培养基，在30℃、180rpm条件下震荡培养6天， 每隔24小时，取发酵液，离心取上清液作为纤维素酶液。按照实施例1中相同方 法，检测纤维素酶液的活力(滤纸酶活力)。
表4发酵不同时间的酶活(IU/ml)
| 发酵时间(天) | 酶活 |
| 1 | 69.6 |
| 2 | 224.5 |
| 3 | 770.6 |
| 4 | 629.1 |
| 5 | 514.8 |
| 6 | 482.1 |
从表4中可见，采用Trichoderma reesei ATCC 56764、Fusarium oxysporum BN、Aspergillus fumigatus HY混合发酵制备纤维素酶，在发酵3天时，纤维素 酶活力最高，达到770.6IU/ml。
实施例4纤维素酶的性质
1.最适反应pH
检测实施例1中采用本发明方法制备的纤维素酶的最适反应pH，结果如图1。从图1可以看出，该纤维素酶的最适反应pH为5.0。
2.最适反应温度及温度稳定性
检测实施例1中采用本发明方法制备的纤维素酶的最适反应温度，结果如图 2。从图2可以看，该纤维素酶的最适反应温度为60℃。
另外，检测了实施例1采用本发明方法制备的纤维素酶在60℃下放置不同时间后的 滤纸酶活。结果如下：在60℃下放置42小时，仍然能够达到初始酶活力(在60℃ 处理前的酶活力)的80％。说明本发明方法制备的纤维素酶能够耐受高温，且在 高温下稳定，因此在用于降解纤维素时，非常有利。
实施例5纤维素酶的应用
采用实施例1中本发明方法制备的纤维素酶降解玉米芯。将玉米芯粉碎至小 于1cm，利用0.3wt％硫酸165℃处理1h，抽滤得到滤渣。将滤渣以干剂质量算， 以5％的质量比加入水中，利用1M氢氧化钠溶液调节pH为4.8，置于60℃、130prm 恒温水浴摇床中。按每克滤渣干剂加入10IU纤维素酶。酶解反应30h后取上清 液利用高效液相色谱测定葡萄糖浓度。经检测，反应液中葡萄糖浓度为40.1g/L。
Claims (7)
1.一种以低廉碳源快速制备高活性纤维素酶的方法，其特征在于以甘草渣为碳源，采用里氏木霉、尖孢镰刀菌、烟曲霉菌混合发酵，制备高活性的纤维素酶。
2.根据权利要求1所述以低廉碳源快速制备高活性纤维素酶的方法，其特征在于所述里氏木霉为Trichoderma reesei ATCC 56764，所述尖孢镰刀菌为Fusarium oxysporumBN，所述烟曲霉菌为Aspergillus fumigatus HY。
3.根据权利要求2所述以低廉碳源快速制备高活性纤维素酶的方法，其特征在于所述Trichoderma reesei ATCC 56764、Fusarium oxysporum BN和Aspergillus fumigatus HY的比例为15-20:4-6:10-15。
4.根据权利要求1-3之一所述以低廉碳源快速制备高活性纤维素酶的方法，其特征在于将Trichoderma reesei ATCC 56764、Fusarium oxysporum BN和Aspergillus fumigatus HY分别划线接种至PDA培养基，培养2-5天后，用生理盐水洗下孢子，接种至发酵培养基进行混合发酵。
5.根据权利要求4所述以低廉碳源快速制备高活性纤维素酶的方法，其特征在于所述发酵培养基含有如下成分：甘草渣5-15g/l，葡萄糖0.5-2.0g/l，(NH4)2SO4 2-5 g/l，KH2PO41-4 g/l，MgSO4·7H2O 0.4-0.6 g/l，大豆粉7-10 g/l，pH 4.0-5.0。
6.根据权利要求5所述以低廉碳源快速制备高活性纤维素酶的方法，其特征在于发酵温度为25-35℃，发酵时间67-77 h。
7.根据权利要求6所述以低廉碳源快速制备高活性纤维素酶的方法，其特征在于将发酵液离心，取上清液作为纤维素酶液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711347862.1A CN107988187B (zh) | 2017-12-15 | 2017-12-15 | 一种以低廉碳源快速制备高活性纤维素酶的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711347862.1A CN107988187B (zh) | 2017-12-15 | 2017-12-15 | 一种以低廉碳源快速制备高活性纤维素酶的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107988187A true CN107988187A (zh) | 2018-05-04 |
| CN107988187B CN107988187B (zh) | 2020-12-29 |
Family
ID=62038730
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201711347862.1A Expired - Fee Related CN107988187B (zh) | 2017-12-15 | 2017-12-15 | 一种以低廉碳源快速制备高活性纤维素酶的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107988187B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109750018A (zh) * | 2019-03-11 | 2019-05-14 | 大连大学 | 一种制备纤维素酶的方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101100660B (zh) * | 2007-06-14 | 2011-10-12 | 东莞理工学院 | 一种微生物混合发酵生产纤维素酶的方法 |
| CN102660467A (zh) * | 2012-05-29 | 2012-09-12 | 黑龙江大学 | 一株产甘草次酸的甘草内生真菌 |
| CN103059067A (zh) * | 2013-01-15 | 2013-04-24 | 淮阴师范学院 | 木质纤维素水解残渣两步法制备芳香醛的方法 |
| CN104206436A (zh) * | 2014-09-04 | 2014-12-17 | 淮阴师范学院 | 一种以柚子全皮无残留制备系列产品的方法 |
| CN104774774A (zh) * | 2015-05-08 | 2015-07-15 | 黑龙江大学 | 一株产pseurotin A的甘草内生真菌 |
| CN105028908A (zh) * | 2015-08-11 | 2015-11-11 | 新疆石河子职业技术学院 | 一种甘草渣蛋白饲料及其制备方法 |
| CN107141092A (zh) * | 2017-05-27 | 2017-09-08 | 东兴易新环保科技有限公司 | 一种节能环保的中药渣有机肥 |
-
2017
- 2017-12-15 CN CN201711347862.1A patent/CN107988187B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101100660B (zh) * | 2007-06-14 | 2011-10-12 | 东莞理工学院 | 一种微生物混合发酵生产纤维素酶的方法 |
| CN102660467A (zh) * | 2012-05-29 | 2012-09-12 | 黑龙江大学 | 一株产甘草次酸的甘草内生真菌 |
| CN103059067A (zh) * | 2013-01-15 | 2013-04-24 | 淮阴师范学院 | 木质纤维素水解残渣两步法制备芳香醛的方法 |
| CN104206436A (zh) * | 2014-09-04 | 2014-12-17 | 淮阴师范学院 | 一种以柚子全皮无残留制备系列产品的方法 |
| CN104774774A (zh) * | 2015-05-08 | 2015-07-15 | 黑龙江大学 | 一株产pseurotin A的甘草内生真菌 |
| CN105028908A (zh) * | 2015-08-11 | 2015-11-11 | 新疆石河子职业技术学院 | 一种甘草渣蛋白饲料及其制备方法 |
| CN107141092A (zh) * | 2017-05-27 | 2017-09-08 | 东兴易新环保科技有限公司 | 一种节能环保的中药渣有机肥 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 罗建军: "抑菌植物的筛选及甘草对 5 种植物病原真菌抑菌活性的研究", 《华南农业大学学报》 * |
| 蔡向红: "《养生堂《本草纲目》食物药物养生速查全书》", 31 October 2013 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109750018A (zh) * | 2019-03-11 | 2019-05-14 | 大连大学 | 一种制备纤维素酶的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN107988187B (zh) | 2020-12-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| de Figueiredo et al. | Chemical input reduction in the arabinoxylan and lignocellulose alkaline extraction and xylooligosaccharides production | |
| Dias et al. | Biomass sorghum as a novel substrate in solid‐state fermentation for the production of hemicellulases and cellulases by Aspergillus niger and A. fumigatus | |
| Lodha et al. | Optimised cellulase production from fungal co-culture of Trichoderma reesei NCIM 1186 and Penicillium citrinum NCIM 768 under solid state fermentation | |
| US9506096B2 (en) | Sugar preparation process by enzymatically hydrolyzing sweet potato dreg | |
| Kobakhidze et al. | Induction and catabolite repression of cellulase and xylanase synthesis in the selected white-rot basidiomycetes | |
| Kadarmoidheen et al. | Effect of cellulolytic fungi on the degradation of cellulosic agricultural wastes | |
| Zheng et al. | The influence of soluble polysaccharides derived from rice straw upon cellulase production by Trichoderma reesei | |
| Liu et al. | Consolidated bioprocess for bioethanol production with alkali-pretreated sugarcane bagasse | |
| CN105154986A (zh) | 一种碱预处理、低压力蒸汽闪爆与生物酶联合处理综合利用棉秆皮的方法 | |
| Shah et al. | Optimization of cellulase production by Penicillium oxalicum using banana agrowaste as a substrate | |
| CN102703298A (zh) | 一种快速利用纤维素固体发酵生产食醋的方法 | |
| Alhomodi et al. | Estimation of cellulase production by Aureobasidium pullulans, Neurospora crassa, and Trichoderma reesei during solid and submerged state fermentation of raw and processed canola meal | |
| Chen et al. | Cellulase production from the corn stover fraction based on the organ and tissue | |
| CN103535743A (zh) | 一种雷竹笋膳食纤维及其制备方法 | |
| Abada et al. | Optimization of cellulase production from Bacillus albus (MN755587) and its involvement in bioethanol production | |
| Taskin et al. | Utilization of waste loquat (Eriobotrya japonica Lindl.) kernel extract for a new cheap substrate for fungal fermentations | |
| CN103734748A (zh) | 一种从海带中提取膳食纤维的方法 | |
| Ghazali et al. | The effect of dilute acid pre-treatment process in bioethanol production from durian (Durio zibethinus) seeds waste | |
| CN107988187A (zh) | 一种以低廉碳源快速制备高活性纤维素酶的方法 | |
| Chandra et al. | Optimization of extraction of β-endoglucanase from the fermented bran of Aspergillus niger | |
| Buenrostro-Figueroa et al. | Juice extraction from mango pulp using an enzymatic complex of Trichoderma sp. produced by solid-state fermentation | |
| CN102329833A (zh) | 用废糖蜜和废甘油发酵生产槐糖酯的方法 | |
| CN102212482B (zh) | 一种黑曲霉及其固态曲发酵生产饲料的方法 | |
| Mihajlovski et al. | The role of plant cell wall degrading enzymes in biorefinery development | |
| CN107090485A (zh) | 一种制备活性多糖的方法及其专用培养基和专用复合菌剂 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20201229 |