CN109438562B - 一种通过生成环肽晶体制备高纯度环肽单体的方法 - Google Patents

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Abstract

一种通过生成环肽晶体制备高纯度环肽单体的方法，包括：（1）将粗环肽固体粉末溶于纯甲醇中，离心5~20 min，收集得到上清液；（2）将上清液旋转浓缩至干，得到初步纯化的固体产物；（3）逐滴加入纯甲醇，并在40~65℃水浴温度中边加边溶解，直至得到饱和溶液；（4）保持水浴温度不变，在饱和溶液中逐滴加入蒸馏水，直至得到过饱和白色乳浊液；（5）自然冷却静置1~3天，直至得到环肽晶体。本发明通过将纯度不高的粗环肽作为原料，采用特定质量体积比的纯甲醇作为溶剂，再采用特定质量体积比的纯甲醇作为溶剂结合水浴加热形成饱和溶液后，加入蒸馏水并自然冷却静置得到纯度≥96%的环肽晶体，且无任何有机溶剂残留。

Description

一种通过生成环肽晶体制备高纯度环肽单体的方法
技术领域
本发明涉及环肽的纯化领域，特别涉及一种通过生成环肽晶体制备高纯度环肽单体的方法及由其得到的环肽晶体。
背景技术
环肽是由直链型前体肽的环化反应形成的。亚麻籽环肽是一组由核糖体合成的，天然存在于亚麻籽和根茎中的疏水性同源环型植物肽（多肽链N端和C端由酰胺键环合，没有环胱氨酸节），由8-9个氨基酸组成，其分子量近似1kDa。研究表明，亚麻籽环肽具有免疫调节、抗疟疾、抗真菌、抗炎、抗癌等活性。
目前国内外对于环肽的纯化方法，主要有盐析法、等电点沉淀法、凝胶过滤法、离子交换层析、吸附层析、过滤法等，这些方法得到的环肽纯度往往不高。而要通过纯化方法得到高纯度的环肽（>95%），目前主要的方法是采用制备液相、中高压液相等。然而这些方法对仪器要求高，操作费用和生产成本高。因此，急需一种低成本纯化粗环肽，并得到高纯度环肽的解决方案。
发明内容
为了克服上述现有技术中存在的缺陷或不足，本发明的目的在于提供一种通过生成环肽晶体制备高纯度环肽单体的方法。
本发明是通过以下技术方案实现。
一种通过生成环肽晶体制备高纯度环肽单体的方法，包括如下步骤。
（1）将粗环肽固体粉末溶于纯甲醇中，在3000~10000 r/min的转速下离心5~20min，收集得到上清液。
（2）将上清液旋转浓缩至干，得到初步纯化的固体产物。
（3）在得到的初步纯化的固体产物中逐滴加入纯甲醇，并在40~65℃水浴温度中边加甲醇边溶解，直至得到饱和溶液。
（4）保持步骤（3）的水浴温度不变，在步骤（3）得到的饱和溶液中逐滴加入蒸馏水，直至得到过饱和白色乳浊液。
（5）将得到的白色乳浊液自然冷却静置1~3天，直至得到环肽晶体。
其中，步骤（1）中，所述粗环肽固体粉末与纯甲醇的质量体积比为1g:10~20ml。所述粗环肽固体粉末的纯度为75.8%；所述纯甲醇的甲醇纯度为100%，即纯甲醇的含水量为0。
其中，步骤（2）中，所述旋转浓缩的温度为40~65℃。
其中，步骤（3）中，所述初步纯化的固体产物与最终加入纯甲醇的质量体积比为1g:2~6ml。
只有在溶解温度40~65℃下，调整初步纯化的环肽固体产物与最终加入纯甲醇的质量体积比为1g:2~6ml，制备得到的环肽晶体的纯度才能达到≥96%，且晶体结构稳定；如果调整初步纯化的环肽固体产物与最终加入纯甲醇的质量体积比过小（小于1g: 2ml），固体产物溶解不全，杂质去除不彻底；如果调整初步纯化的环肽固体产物与最终加入纯甲醇的质量体积比过大（大于1g: 6ml），不利于晶体的生成。
其中，步骤（4）中，所述饱和溶液与蒸馏水的体积比为100:1~5。
其中，步骤（5）中，所述自然冷却静置的温度为4~25℃。
本发明制备方法得到的环肽晶体的结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
其中CLA为[1–9-NαC]-linusorb B3。
其中，所述环肽晶体的纯度≥96%，优选为≥99%。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果。
1）本发明通过将纯度不高的粗环肽作为原料，采用特定质量体积比的纯甲醇作为溶剂充分溶解粗环肽并初步除去甲醇不溶杂质，得到初步纯化物后，再采用特定质量体积比的纯甲醇作为溶剂结合水浴加热形成饱和溶液后，加入蒸馏水并自然冷却静置得到纯度≥96%的环肽晶体，所得环肽晶体具有良好的稳定性，且无任何有机溶剂残留。
2）本发明的制备工艺简单，成本低廉，制作条件容易控制，可广泛应用于环肽的纯化。
附图说明
图1为实施例1制备得到环肽晶体的晶体形状示意图。
图2为实施例1制备得到环肽晶体的NMR图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
各性能指标的测试方法或评价方法：
环肽晶体纯度的测试方法：精确称取5 mg环肽晶体溶于0.5 mL氘代甲醇，并加入质量比为0.01%内标3-(三甲基硅基)氘代丙酸钠，用Bruker 500 MHz超导核磁共振波谱仪进行扫描分析。
环肽晶体稳定性的测试方法：参照药物稳定性试验指导原则（2015版药典）中的高温试验、高温度试验、强光照射试验、加速试验进行测定。
环肽晶体溶剂残留总量的测试方法：参照有机溶剂残留量测定法（中国药典2015年版0861）测定。
实施例1。
一种通过生成环肽晶体制备高纯度环肽单体的方法，包括如下步骤。
（1）将粗环肽固体粉末按照粗环肽固体粉末与纯甲醇的质量体积比为1g:16ml的比例溶于纯甲醇中，在4500 r/min的转速下离心7 min，收集得到上清液。
（2）将上清液在温度为50℃下旋转浓缩至干，得到初步纯化的固体产物。
（3）在得到的初步纯化的固体产物中按照初步纯化的固体产物与最终加入纯甲醇的质量体积比为1g:4.2ml的比例逐滴加入纯甲醇，并在50℃水浴温度中边加甲醇边溶解，直至得到饱和溶液。
（4）保持步骤（3）的50℃水浴温度不变，在步骤（3）得到的饱和溶液中按照饱和溶液与蒸馏水的体积比为100:5的比例逐滴加入蒸馏水，直至得到过饱和白色乳浊液。
（5）将得到的白色乳浊液在温度为20℃下自然冷却静置2天，直至得到如图1所示的环肽晶体。结合如图2所示的NMR图谱分析，所得环肽晶体的纯度＞99.5%，所得环肽晶体的稳定性及晶体的溶剂残留总量等性能指标如表1所示。
实施例2。
一种通过生成环肽晶体制备高纯度环肽单体的方法，包括如下步骤。
（1）将粗环肽固体粉末按照粗环肽固体粉末与纯甲醇的质量体积比为1g:12.5ml的比例溶于纯甲醇中，在3000 r/min的转速下离心10min，收集得到上清液。
（2）将上清液在温度为40℃下旋转浓缩至干，得到初步纯化的固体产物。
（3）在得到的初步纯化的固体产物中按照初步纯化的固体产物与最终加入纯甲醇的质量体积比为1g:3.5ml的比例逐滴加入纯甲醇，并在60℃水浴温度中边加甲醇边溶解，直至得到饱和溶液。
（4）保持步骤（3）的水浴温度不变，在步骤（3）得到的饱和溶液中按照饱和溶液与蒸馏水的体积比为100:2的比例逐滴加入蒸馏水，直至得到过饱和白色乳浊液。
（5）将得到的白色乳浊液在温度为10℃下自然冷却静置1天，直至得到环肽晶体。所得环肽晶体的纯度、稳定性及溶剂残留总量等性能指标如表1所示。
实施例3。
一种通过生成环肽晶体制备高纯度环肽单体的方法，包括如下步骤。
（1）将粗环肽固体粉末按照粗环肽固体粉末与纯甲醇的质量体积比为1g:20ml的比例溶于纯甲醇中，在4000 r/min的转速下离心15min，收集得到上清液。
（2）将上清液在温度为45℃下旋转浓缩至干，得到初步纯化的固体产物。
（3）在得到的初步纯化的固体产物中按照初步纯化的固体产物与最终加入纯甲醇的质量体积比为1g:5ml的比例逐滴加入纯甲醇，并在45℃水浴温度中边加甲醇边溶解，直至得到饱和溶液。
（4）保持步骤（3）的水浴温度不变，在步骤（3）得到的饱和溶液中按照饱和溶液与蒸馏水的体积比为100:2的比例逐滴加入蒸馏水，直至得到过饱和白色乳浊液。
（5）将得到的白色乳浊液在温度为10℃下自然冷却静置2天，直至得到环肽晶体。所得环肽晶体的纯度、稳定性及溶剂残留总量等性能指标如表1所示。
实施例4。
一种通过生成环肽晶体制备高纯度环肽单体的方法，包括如下步骤。
（1）将粗环肽固体粉末按照粗环肽固体粉末与纯甲醇的质量体积比为1g: 10ml的比例溶于纯甲醇中，在10000 r/min的转速下离心5 min，收集得到上清液。
（2）将上清液在温度为65℃下旋转浓缩至干，得到初步纯化的固体产物。
（3）在得到的初步纯化的固体产物中按照初步纯化的固体产物与最终加入纯甲醇的质量体积比为1g:2ml的比例逐滴加入纯甲醇，并在65℃水浴温度中边加甲醇边溶解，直至得到饱和溶液。
（4）保持步骤（3）的水浴温度不变，在步骤（3）得到的饱和溶液中按照饱和溶液与蒸馏水的体积比为100:1的比例逐滴加入蒸馏水，直至得到过饱和白色乳浊液。
（5）将得到的白色乳浊液在温度为18℃下自然冷却静置3天，直至得到环肽晶体。所得环肽晶体的纯度、稳定性及溶剂残留总量等性能指标如表1所示。
对比例1。
一种通过生成环肽晶体制备高纯度环肽单体的方法，包括如下步骤：步骤（1）中粗环肽固体粉末与纯甲醇的质量体积比为1g: 5ml的比例，其他同实施例1。所得环肽晶体的纯度、稳定性及溶剂残留总量等性能指标如表1所示。
对比例2。
一种通过生成环肽晶体制备高纯度环肽单体的方法，包括如下步骤：步骤（3）中初步纯化的固体产物与最终加入纯甲醇的质量体积比为1g: 10ml的比例，其他同实施例1。所得环肽晶体的纯度、稳定性及溶剂残留总量等性能指标如表1所示。
对比例3。
一种通过生成环肽晶体制备高纯度环肽单体的方法，包括如下步骤：步骤（3）中加入甲醇后，在25℃温度中边加甲醇边溶解，其他同实施例1。所得环肽晶体的纯度、稳定性及溶剂残留总量等性能指标如表1所示。
对比例4。
一种通过生成环肽晶体制备高纯度环肽单体的方法，包括如下步骤：步骤（3）中加入80%甲醇/水或者80%异丙醇/水或者80%甲醇/异丙醇或者100%氯仿，其他同实施例1。所得环肽晶体的纯度、稳定性及溶剂残留总量等性能指标如表1所示。
对比例5。
一种纯化环肽的方法，包括如下步骤：将粗环肽固体粉末按照粗环肽固体粉末与80%甲醇水溶液的质量体积比为1g:15ml的比例溶于80%甲醇水溶液中，经0.45 µM有机滤头过滤后做为制备液相进样液。制备液相流动相为乙腈和水，洗脱梯度为：0-10 min，45-65%乙腈；10-30 min，65% 乙腈；30-35 min，45% 乙腈。流速为12mL/min，色谱柱型号为SepaxGP-C18 (21.2 × 250 mm, 5 µm)，收集波长为214nm。收集流出峰，旋转浓缩至干得到环肽固体粉末单体。所得的环肽固体粉末的纯度、稳定性及溶剂残留总量等性能指标如表1所示。由于制备液相每次进样量100mg左右，制备1g环肽样品需要10次进样，耗时长，有机试剂消耗量大，仪器设备要求高，需要的成本远远高于结晶法。
表1 实施例1-4及对比例1-5制备得到的环肽晶体的性能指标测试结果
纯度 稳定性 溶剂残留总量
实施例1 99.5% 好 低于检测限
实施例2 99.5% 好 低于检测限
实施例3 99.5% 好 低于检测限
实施例4 99.0% 好 低于检测限
对比例1 无晶体生成 无 低于检测限
对比例2 晶体生成量极少 无 低于检测限
对比例3 无晶体生成 无 低于检测限
对比例4 98.0% 好 25％(质量百分比)
对比例5 98.5% 无 低于检测限
从表1的实施例和对比例的比较可知：实施例1-4通过将纯度不高的粗环肽作为原料，采用特定质量体积比的纯甲醇作为溶剂充分溶解粗环肽并初步除去甲醇不溶杂质，得到初步纯化物后，再采用特定质量体积比的纯甲醇作为溶剂结合水浴加热形成饱和溶液后，加入蒸馏水并自然冷却静置得到纯度≥96%的环肽晶体，所得环肽晶体具有良好的稳定性，且无任何有机溶剂残留。

Claims (2)

1.一种通过生成环肽晶体制备高纯度环肽单体的方法，其特征是包括如下步骤：
（1）将粗环肽固体粉末溶于纯甲醇中，在3000~10000 r/min的转速下离心5~20 min，收集得到上清液；
（2）将上清液旋转浓缩至干，得到初步纯化的固体产物；
（3）在得到的初步纯化的固体产物中逐滴加入纯甲醇，并在40~65℃水浴温度中边加甲醇边溶解，直至得到饱和溶液；
（4）保持步骤（3）的水浴温度不变，在步骤（3）得到的饱和溶液中逐滴加入蒸馏水，直至得到过饱和白色乳浊液；
（5）将得到的白色乳浊液自然冷却静置1~3天，直至得到环肽晶体；
步骤（1）中所述的粗环肽固体粉末与纯甲醇的质量体积比为1g: 12.5~20ml；所述粗环肽固体粉末的纯度为75.8%；所述纯甲醇的甲醇纯度为100%；
步骤（2）中所述的旋转浓缩的温度为40~65℃；
步骤（3）中所述的初步纯化的固体产物与最终加入纯甲醇的质量体积比为1g: 3.5~5ml；
步骤（4）中所述的饱和溶液与蒸馏水的体积比为100:1~5。
2.根据权利要求1所述的一种通过生成环肽晶体制备高纯度环肽单体的方法，其特征是步骤（5）中所述的自然冷却静置的温度为4~25℃。
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