CN109419801A - 左旋奥拉西坦在制备预防或治疗蛛网膜下腔出血后早期脑损伤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供左旋奥拉西坦在制备预防或治疗蛛网膜下腔出血后早期脑损伤药物的应用。机理研究结果表明，左旋奥拉西坦对蛛网膜下腔出血后的早期脑损伤的作用机制可能与抑制神经元的凋亡和坏死有关，具体可能涉及线粒体途径或caspase途径的SAH后细胞凋亡路径从而起到神经保护作用。此外，左旋奥拉西坦在减轻SAH后的血脑屏障通透性、减轻脑水肿并改善SAH后的神经行为功能缺损方面同样作用明显。

Description

左旋奥拉西坦在制备预防或治疗蛛网膜下腔出血后早期脑损 伤药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种左旋奥拉西坦的新的医药用途，具体涉及左旋奥拉西坦在制备预防或治疗蛛网膜下腔出血后早期脑损伤药物中的应用。

背景技术

蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是指各种原因引起脑血管突然的破裂，血液流至蛛网膜下腔的统称，分为自发性和外伤性两类，其中70％～80％的疾病属于外科范畴。SAH发病率大约为每年10/100000，从儿童到老年人不同年龄阶段均可发生SAH，且随着年龄的增长，发生率逐渐升高，而且SAH是一种致残率和病死率很高的疾病。颅内动脉瘤破裂是SAH的最常见原因，约占自发性SAH的80％，其次为脑血管畸形和高血压性动脉硬化等。SAH后4～10天出现的脑血管痉挛是SAH病程中主要的并发症之一，传统观点认为其是SAH患者残疾和死亡的主要原因。但是，过去数十年间对脑血管痉挛的持续研究却未取得令人满意的成果。目前临床上主要采用尼莫地平抗血管痉挛及3H治疗(高血容量(hypervolemic)、高血压(hypertensive)、血液稀释疗法(hemodilution therapy))改善脑循环来降低死亡率。

近年来，有研究表明早期脑损伤(early brain injury,EBI)是蛛网膜下腔出血患者死亡的首要原因。EBI被定义为SAH后72小时内出现的急性神经系统损伤，包括急性颅内压增高、脑水肿、血脑屏障破坏、全脑血流量减少、急性脑血管痉挛、神经功能障碍和脑组织死亡等。虽然EBI发生于出血后即刻，但其影响却非常长远。上述急性神经系统损伤反应可导致早期脑水肿、氧化应激、凋亡以及脑梗死的发展，并可能导致患者出现死亡或者严重残疾。由于EBI的发病机制十分复杂，因而目前对于临床患者SAH后EBI的防治并没有形成有效的措施。

奥拉西坦(Oxiracetam)是一种促进学习、增强记忆力的中枢神经系统药物，其结构上属于一种合成的羟基氨基丁酸(GABOB)环状衍生物，仅作用于中枢神经系统，主要分布在大脑皮层、海马，具有激活、保护或促进神经细胞的功能恢复，改善智能障碍患者的记忆和学习功能的作用，而药物本身没有直接的血管活性，也没有中枢兴奋作用，对学习记忆能力的影响是一种持久的促进作用。机理研究结果显示，奥拉西坦可促进磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的合成，促进脑代谢，提高血脑屏障对特异中枢神经通路的刺激作用，提高大脑中ATP/ADP的比值，使得大脑中蛋白质和核酸的合成增加。奥拉西坦于1987年在意大利上市，上市剂型为片剂(800mg)以及胶囊(800mg)，注射剂(1g/5mL)。目前国内只有奥拉西坦胶囊、注射液和粉针剂上市，用于轻中度血管性痴呆、老年性痴呆以及脑外伤等症引起的记忆与智能障碍，且所用活性成分均为外消旋体，国内外尚无单一立体异构体的奥拉西坦制剂上市销售。

关于消旋或单一构型的奥拉西坦的应用，CN103735545A中提到左旋奥拉西坦对酒精中毒所致昏迷的促醒作用明显，而右旋奥拉西坦基本没有作用，左旋奥拉西坦的促醒作用为消旋奥拉西坦的2倍，左旋奥拉西坦对外伤、麻醉所致昏迷的促醒作用均显著；CN103599101A公开了左旋奥拉西坦对液压及自由落体所致创伤性脑损伤大鼠学习记忆认知功能障碍均有明显的改善作用，且药效远高于右旋奥拉西坦；CN107028939A公开了奥拉西坦在制备治疗过敏性鼻炎的药物中的用途；CN106166150A公开了右旋奥拉西坦在制备预防或治疗癫痫药物中的应用，且实验结果表明右旋奥拉西坦作为治疗癫痫全身性发作、癫痫部分性发作和癫痫持续状态的作用明显。尚未有文献报道奥拉西坦或其单一构型异构体在SAH后EBI方面的防治效果。

可见，对于SAH后的EBI，目前仍然缺乏有效的治疗药物，临床上仍存在相应的迫切需求。

发明内容

本发明的目的在于提供左旋奥拉西坦在制药领域的新用途，具体是提供左旋奥拉西坦在预防或治疗蛛网膜下腔出血后早期脑损伤药物中的应用。

本发明首次披露了左旋奥拉西坦和右旋奥拉西坦在治疗蛛网膜下腔出血后早期脑损伤方面的药效学实验研究结果，明确了它们之间在药学特性上的区别和联系，为该医药用途的确立奠定了坚实的基础。

本发明所述的左旋奥拉西坦在制备预防或治疗蛛网膜下腔出血后早期脑损伤药物中的应用，具体来说，所述左旋奥拉西坦是通过改善SAH后的神经行为功能缺损、抑制SAH后神经元的凋亡和坏死、减轻脑水肿和/或减轻SAH后的血脑屏障通透性而发挥所述预防或治疗效果。

根据本发明的左旋奥拉西坦可以单独或以几种化合物的混合物使用，任选地与常规载体和赋形剂组合。通过以下方式选择用量：所得的制剂含有的活性成分的量相当于0.1～4g左旋奥拉西坦。优选的本发明的制剂含有总量为0.25～2g的左旋奥拉西坦，更优选为含有1g的左旋奥拉西坦。

本发明还涉及一种可用于预防或治疗蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的含左旋奥拉西坦活性成分的药物组合物，其中含有左旋奥拉西坦化合物，以及药学上可接受的辅料。

该活性成分可以被制备为片剂、胶囊剂、微片剂、丸剂、微丸剂或颗粒剂形式的口服制剂，口服制剂可以被肠溶包衣或薄膜包衣包被，胶囊可以是软或硬的明胶胶囊；也可以被制备为注射用冻干粉、注射液等注射剂。其中优选注射剂型，并优选采用静脉滴注给药。以上剂型均可以按照常规方法制得。

上述包含左旋奥拉西坦的组合物的给药剂量以左旋奥拉西坦化合物的含量计为0.4～8.0g/天，优选2.0～6.0g/天，更优选为4.0～6.0g/天。

本发明制备预防或治疗蛛网膜下腔出血后早期脑损伤药物中所使用的左旋奥拉西坦原料纯度优选为99.5％(光学纯度)以上，以重量百分数计。

发明人通过对左旋奥拉西坦进行了药效学试验研究，发现一定浓度的左旋奥拉西坦能够改善蛛网膜下腔出血后的早期脑损伤，对蛛网膜下腔出血大鼠早期脑损伤具有神经保护作用，并且可减轻脑水肿、降低神经元的死亡和凋亡，改善血脑屏障的破坏，进而对脑组织起到保护作用。

发明人推测左旋奥拉西坦对蛛网膜下腔出血后的早期脑损伤的作用机制可能与抑制神经元的凋亡和坏死有关，具体可能涉及线粒体途径或caspase途径的SAH后细胞凋亡路径从而起到神经保护作用。此外，左旋奥拉西坦还可减轻SAH后的血脑屏障通透性、减轻脑水肿并改善SAH后的神经行为功能缺损，提示左旋奥拉西坦可能对实验性蛛网膜下腔出血后的早期脑损伤具有保护作用。

具体的实验方法和实验结果如下：

1材料

1.1实验动物

健康雄性SD大鼠(体重240～280g)共计50只，由南通大学实验动物中心提供。通风，饲养温度平均25℃，湿度40％～50％。自由摄食、饮水。

1.2主要试剂及设备

左旋奥拉西坦、右旋奥拉西坦、10％水合氯醛、大鼠脑立体定位仪、颅骨钻、恒温解剖台、手术器械、保温灯、生理盐水、4％多聚甲醛、10％福尔马林溶液、蛋白酶K、TUNEL试剂盒、caspase-3一抗、Cyte-c一抗、β-actin一抗、山羊抗小鼠二抗、山羊抗兔二抗、PMSF、SDS-PAGE等蛋白提取试剂、制胶装置、电泳槽、半干式转膜仪、光学显微镜。

以上除左旋奥拉西坦和右旋奥拉西坦为南京优科制药有限公司自制外，其他试剂及设备均购自市售产品或采用市售产品配制。

2实验方法

2.1分组：将50只雄性SD大鼠按照随机数字表法分为对照组、假手术组、蛛网膜下腔出血组、左旋奥拉西坦组、右旋奥拉西坦组，每组10只。

2.2大鼠蛛网膜下腔出血模型的建立

按照视交叉前池注血法(Prunell GF,Mathiesen T,Diemer NH,eta1.Experimental sub-arachnoid hemorrhage:subarachnoid blood volume,mortalityrate,neuronal death,cerebral blood flow,and perfusion pressure in threedifferent rat models[J].Neurosurgery,2003,52(1):165-176.)建立蛛网膜下腔出血早期脑损伤模型：10％水合氯醛对大鼠进行腹腔麻醉(0.3mL/100g)，约5min后俯卧位固定于立体定位仪，常规额部消毒，切开表面皮肤，钝性分离肌肉、骨膜。冠状缝前5mm、中线旁开3mm处钻一直径约2mm小孔，EP10管沿双耳假想线中点递进约1cm，回抽可见清亮脑脊液。对照组仅钻孔。假手术组钻孔并注入0.2mL等渗盐水。蛛网膜下腔出血组钻孔后注入0.2mL自体股动脉血。左旋奥拉西坦组钻孔后注入0.2mL自体股动脉血，术后腹腔注射左旋奥拉西坦(100mg/kg，2次/天)。右旋奥拉西坦组钻孔后注入0.2mL自体股动脉血，术后腹腔注射右旋奥拉西坦(100mg/kg，2次/天)。各组大鼠建模成功后背部皮下注射10mL生理盐水防止术后脱水，保温灯保温至清醒后单笼饲养，自由饮食饮水。

2.3标本留取

各组动物在SAH后48h再次以10％水合氯醛腹腔注射过量麻醉致死，迅速开颅进行大体观察并快速切取额颞底皮层脑组织两份，一份即刻用于检测脑水肿指数，一份存于福尔马林液中，用于检测脑组织IgG含量分析血脑屏障变化；并取海马组织，部分采用4％多聚甲醛固定，部分冻存于-80℃冰箱，用于检测细胞凋亡情况。

2.4神经行为功能评分

采用Garcia法评分标准(如下表1所示)，对SAH后48h的各组大鼠进行神经行为学评分。评分范围4～18分，18分正常，4分最差。评分采用双盲法。

表1 Garcia法评分标准

2.5左旋奥拉西坦对SAH大鼠神经元凋亡的影响

2.5.1 TUNEL检测细胞凋亡情况

将固定于4％多聚甲醛的海马组织取出，用石蜡包埋，5μm连续切片。脱蜡、水化后使用蛋白酶K消化蛋白(每张50μL，15min，37℃温箱)。DEPC水浸泡60min，振洗后滴加TUNEL混合液(A:B-1:15，每张32μL，60min，37℃温箱)。再次振洗，滴加POD液(每张32μL，30min，37℃温箱)。DAB显色后苏木精复染、自来水返蓝、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。于高倍(×400)光镜下观察细胞凋亡情况。

2.5.2 Western-blot检测caspase-3、Cyte-c表达水平

将海马组织从-80℃冰箱中取出，提取蛋白。制备12％分离胶、5％浓缩胶，静置过夜。SDS-PAGE电泳(每孔上样5μL，90V，约2～2.5h)，使用半干转膜仪转膜：60mA，12～16h。封闭1h后过夜孵育一抗：caspase-3一抗(1:1000)、Cyte-c一抗(1:500)、β-actin一抗(1:1000)，1×TBST漂洗后孵育二抗120min(1:2000)，漂洗后加发光试剂、曝光。

2.6脑水肿指数测定

各组大鼠于蛛网膜下腔出血后48h水合氯醛麻醉，开颅取全脑，切取颞底脑皮质迅速放入预先称好重量的玻片上称重，此重量减去玻片重量即为湿重，随后放入烤箱中在100℃条件下烘72h后再次称重，此重量减去玻片重量即为干重，脑水肿指数即可用下述公式求得。脑水肿指数＝[(湿重-干重)/湿重]×100％。

2.7 IgG检测血脑屏障的变化

各组大鼠于蛛血蛛网膜下腔出血后48h水合氯醛麻醉，开颅取全脑，切取颞底脑皮质组织，保存于10％福尔马林溶液中，使用免疫组化方法IgG抗体处理标本，检测各组皮层脑组织中IgG含量，光学显微镜下观察各组标本IgG阳性细胞表达情况。显微镜下观察并摄像，每张切片随机选取l0个高倍镜(×100)视野进行观察。细胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性细胞。判断标准：随机观察10个高倍视野，每个视野计数100个细胞，根据其中阳性细胞的比率进行评估：<25％为1分，25％～49％为2分，>50％为3分。

3统计学分析

本发明所述实验中的所有数据以均数±SD表示，采用SPSS 17.0统计软件，进行单因素方差分析或t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结果如下：

1)大鼠神经行为学评分结果发现，对照组、假手术组、蛛网膜下腔出血组、左旋奥拉西坦组和右旋奥拉西坦组的神经行为学评分分别为(17.91±0.37)分、(17.60±0.47)分、(14.38±0.59)分、(15.92±0.51)分、(14.89±0.62)分。可见，SAH组大鼠出现明显的神经功能障碍，神经功能评分明显低于对照组、假手术组和左旋奥拉西坦组，且差异有统计学意义(P＜0.05)。提示左旋奥拉西坦在48h改善了大鼠蛛网膜下腔出血后的神经功能缺损，减轻了脑损伤。

2)TUNEL检测细胞凋亡情况结果发现，对照组和假手术组有少量神经元着色为阳性，而SAH组可见大量阳性细胞堆积，且神经元体积变小、核膜皱缩、核固缩且着色较深。对照组、假手术组、SAH组、左旋奥拉西坦组、右旋奥拉西坦组的阳性细胞率分别为(7.35±0.92)％、(7.85±0.86)％、(44.72±2.41)％、(31.63±3.05)％、(39.12±2.90)％。与SAH组相比，左旋奥拉西坦组表现出一定的抗凋亡作用，且差异具有统计学意义(P＜0.05)，而右旋奥拉西坦组则不明显。

3)在caspase-3、Cyte-c表达水平检测中，由Western-blot图像可见：caspase-3、Cyte-c蛋白表达在SAH组较对照组和假手术组有所升高，而在左旋奥拉西坦治疗组明显下降，参见附图图1。

4)脑水肿指数结果如表2所示，SAH组与对照组相比P<0.01，脑水肿指数明显升高；假手术组与SAH组相比P＞0.05，两者无明显差异；左旋奥拉西坦组与SAH组相比P＜0.05，脑水肿指数降低；右旋奥拉西坦组与SAH组相比P＞0.05，脑水肿指数有所降低但未达到统计学显著程度。

表2 脑水肿指数

5)IgG检测血脑屏障变化结果显示，对照组、假手术组、SAH组、左旋奥拉西坦组、右旋奥拉西坦组脑组织中IgG阳性细胞表达评分分别为：0.89±0.07、2.73±0.13、2.81±0.11、1.77±0.09、2.70±0.12。与对照组相比，SAH组阳性细胞表达明显增多(**P＜0.01)；SAH组与假手术组相比无明显差异(#P>0.05)；左旋奥拉西坦组可见阳性细胞表达明显减少(*P＜0.05)，而右旋奥拉西坦组仍可见较多阳性细胞表达，与SAH组相比无明显差异(#P>0.05)。参见附图图2。

附图说明

图1为对照组、假手术组、SAH组、左旋奥拉西坦组和右旋奥拉西坦组大鼠海马组织中caspase-3、Cyte-c蛋白的表达水平情况，其中：1——对照组；2——假手术组；3——SAH组；4——左旋奥拉西坦组；5——右旋奥拉西坦组。

图2为对照组、假手术组、SAH组、左旋奥拉西坦组和右旋奥拉西坦组大鼠皮层脑组织中IgG阳性细胞表达评分情况。

具体实施方式

下面将描述本发明的几个实施例，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1

处方组成为

以制成左旋奥拉西坦注射液为例，制备方法：取80％处方量注射用水，加入处方量的主药和其他辅料，搅拌下溶解，用1mol/L盐酸溶液或1mol/L氢氧化钠溶液调pH值，使得在用注射用水稀释至活性成分浓度为1g/20mL时的pH值为5.2，按照配制量加0.1％针用活性炭，将药液加热至约60℃，搅拌0.5h，过滤脱碳后，加注射用水至总量，检测合格后，用0.22μm微孔滤膜精滤，灌装于安瓿瓶中，每瓶10mL，封口，旋转湿热灭菌(121℃，15min)即可。

实施例2

处方组成为

制备方法：称取处方量的甘露醇和磷酸二氢钠，加入到约处方量70％的注射用水中，控制水温50～60℃，搅拌使完全溶解，再加入处方量的左旋奥拉西坦，继续保温搅拌至完全溶解，并用0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液调节pH至4.8～5.2，再补加注射用水至全量，加入0.1％(g/ml)的活性炭搅拌15min，钛棒滤过脱炭。经0.45μm和0.22μm微孔滤膜除菌滤过后取中间体测pH值、含量。中间体检测合格后，按每支5mL分装于15mL西林瓶中，半压胶塞。放入冷冻干燥机中，冷冻干燥，即得。

实施例3

处方组成为

以制成1000片左旋奥拉西坦片剂为例，具体制备方法是：先将原辅料过100目筛，称取处方量的左旋奥拉西坦、预胶化淀粉和微晶纤维素混合均匀，加8％淀粉浆制软材，制粒，烘干，整粒，向颗粒中加入处方量的硬脂酸镁和羧甲基淀粉钠，压片，用8％欧巴代的95％乙醇溶液包衣。

实施例4

处方组成为

以制成1000粒左旋奥拉西坦胶囊剂为例，具体制备方法是：先将原辅料过100目筛，称取处方量的左旋奥拉西坦、乳糖、羧甲基淀粉钠混合均匀，加10％聚乙烯吡咯烷酮溶液制成软材，制粒，烘干，整粒，向颗粒中加入处方量的滑石粉，混合均匀，充填胶囊。

实施例5

处方组成为

以制备1000袋左旋奥拉西坦颗粒剂为例，具体制备方法是先将原辅料过100目筛，称取处方量的左旋奥拉西坦、甘露醇、蔗糖和羧甲基淀粉钠混合均匀，加8％淀粉浆制软材，制粒，烘干，整粒，包装。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实例的限制，上述实例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (8)

1.左旋奥拉西坦在制备预防或治疗蛛网膜下腔出血后早期脑损伤药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述左旋奥拉西坦是通过改善蛛网膜下腔出血后的神经行为功能缺损、抑制蛛网膜下腔出血后神经元的凋亡和坏死、减轻脑水肿和/或减轻蛛网膜下腔出血后的血脑屏障通透性而发挥所述预防或治疗效果。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述左旋奥拉西坦的药物选自口服制剂或注射剂。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的口服制剂为片剂、胶囊剂、微片剂、丸剂、微丸剂或颗粒剂。

5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的注射剂为注射用冻干粉或注射液。

6.根据权利要求1-5任一项所述的用途，其特征在于，所述左旋奥拉西坦的药物的给药剂量以左旋奥拉西坦化合物的含量计为0.4～8.0g/天，优选2.0～6.0g/天，更优选为4.0～6.0g/天。

7.根据权利要求1-5任一项所述的用途，其特征在于，所述左旋奥拉西坦的药物中除左旋奥拉西坦外，还含有药学上可接受的辅料。

8.根据权利要求1-5任一项所述的用途，其特征在于所述左旋奥拉西坦的药物中左旋奥拉西坦原料药的纯度为99.5％以上，以重量百分数计。