CN101129396A - 淫羊藿苷在制备治疗老年痴呆的药物中的应用及产品 - Google Patents

Abstract

本发明公开了淫羊藿苷在制备治疗老年痴呆的药物中的应用及产品，所述淫羊藿苷是从小檗科淫羊藿属植物中提取的黄酮醇苷类化合物，本发明药物制剂是以淫羊藿苷为原料制成的单方制剂。与现有技术相比，本发明所用原料及制备工艺简单，成本低廉，疗效显著，服用量小，无毒副作用，为老年痴呆症的治疗提供了一种疗效可靠的药物。

Description

淫羊藿苷在制备治疗老年痴呆的药物中的应用及产品

技术领域：

本发明涉及淫羊藿苷在制备治疗老年痴呆的药物中的应用及产品，属于中药制药的技术领域。

背景技术：

老年痴呆又名阿兹海默氏症。目前我国已进入了老龄化社会，每年新增600万老年人口。随着老年人口的数量和比例的不断提高，老年痴呆的发病率也在逐年增高。据不完全统计，65岁以上人群中患重度老年痴呆的比率达5％以上，而到80岁，此比率就上升到15～20％。而老年痴呆病人的平均生存期为5.5年，使该病成为现代社会老年人的主要致死疾病之一。随着人类寿命的延长和社会老龄化问题的日益突出，老年痴呆患者的数量和比例还将持续增加。由于老年痴呆的病因及发病机制仍不明确，尚无有效的治疗方法，目前国内外的治疗手段仍以药物为主，但由于缺乏有针对性的治疗药物，故相应的治疗效果并不理想，因此，进一步寻找治疗老年痴呆的有效药物仍然是当今药理学工作者的努力方向。

老年性痴呆的临床用药多为缓颊症状，且疗效不够满意。研制更为有效的药物，尤其是从中草药中发掘有效成分，提供一种原料及制备简单、疗效好、副作用小且成本低廉的治疗老年痴呆的药物显得非常必要。申请号为200510094412.7的发明专利申请公开了一种预防和治疗老年痴呆症的药物及其制剂，该药物是以淫羊藿总黄酮为主要成分制成的，对老年痴呆症的预防和治疗有一定效果，但效果不够理想。淫羊藿总黄酮是从小蘖科淫羊藿属植物茎叶中提取的淫羊藿苷和淫羊藿次苷等多种黄酮类成分的总称，经过大量的试验研究得知，其中对老年痴呆症发挥作用的成分主要为淫羊藿苷。

发明内容：

本发明的目的在于：提供淫羊藿苷在制备治疗老年痴呆的药物中的应用及产品。本发明针对现有技术的不足，研制出了淫羊藿苷的单方制剂，其原料及制备工艺简单，成本低廉，为老年痴呆症的治疗提供了一种疗效可靠的药物。

本发明是这样构成的：淫羊藿苷在制备治疗老年痴呆的药物中的应用。

所述的淫羊藿苷是从小檗科淫羊藿属植物中提取的黄酮醇苷类化合物。

所述淫羊藿苷的提取方法为：干燥淫羊藿全株经粉粹、过筛后，用75％工业乙醇回流提取，回收溶剂，用氯仿萃取，母液再用正丁醇萃取，回收溶剂得浸膏，浸膏经硅胶柱层析，再经重结晶，即得单体化合物淫羊藿苷。

更具体的说，淫羊藿苷的提取方法为：干燥淫羊藿全株经粉粹后，过60～80目筛，用75％工业乙醇回流提取3次，每次2小时，过滤，合并提取液，回收溶液至无醇味；加入适量水，用等体积氯仿萃取3次，母液再用等体积正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液并回收得到浸膏；浸膏经硅胶柱层析，以氯仿-甲醇＝5∶1为洗脱剂进行分离，再经重结晶，即得单体化合物淫羊藿苷。

一种治疗治疗老年痴呆的药物制剂，是以淫羊藿苷为原料，加入适量辅料制成的。

所述的药物制剂为口服制剂、注射制剂或舌下含服制剂。

具体的说，所述的药物制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂、软胶囊、滴丸剂、糖浆剂、注射剂或舌下含片。

所述片剂的制备方法为：取淫羊藿苷10～400毫克、硬脂酸镁0.1～0.40毫克、羧甲基淀粉钠4～12毫克、微晶纤维素50～100毫克，将淫羊藿苷与羧甲基淀粉钠、微晶纤维素混合，过筛，使其混匀，加入适量水或乙醇制粒，干燥后，整粒，加入硬脂酸镁，然后用冲压装置将颗粒压制成片，即得；胶囊剂的制备方法为：取淫羊藿苷50～400毫克、硬脂酸镁0.1～0.30毫克、羧甲基淀粉钠4～12毫克、淀粉50～100毫克，将淫羊藿苷与羧甲基淀粉钠、淀粉混合均匀，加入适量乙醇制粒，干燥，整粒，加入硬脂酸镁，然后装入明胶胶囊中，即得；颗粒剂的制备方法为：取淫羊藿苷1～10克、糊精或蔗糖1～10克、矫味剂和甜味剂适量，将淫羊藿苷与蔗糖/糊精、矫味剂和甜味剂混合均匀，加入适量水或乙醇制成软材，过筛制粒，干燥，整粒，分装，即得；软胶囊的制备方法为：取淫羊藿苷10～400毫克、聚乙醇或豆油100～400毫克、助悬剂3～10毫克、乳化剂3～10毫克和明胶50～100毫克、甘油10～30毫克、纯化水50～100毫克及防腐剂适量，将明胶置于溶胶罐中，加入纯化水，70℃下加热使溶解，加入甘油和防腐剂，搅拌均匀，真空除去气泡后保温静置，按比例将淫羊藿苷与聚乙醇/豆油、乳化剂、助悬剂混合均匀，再和制备好的明胶置旋转压囊机，压制成软胶囊，定型，干燥，即得；滴丸的制备方法为：取淫羊藿苷1～10毫克、基质(如聚乙二醇4000)20～40毫克、甲基硅油适量，将淫羊藿苷加水制成均匀糊状，再加入溶融的基质液，加热熔融成澄清液体，倒入已预热的滴丸器中，控制滴制温度和速度，滴入甲基硅油冷凝液中，成丸后吸干冷凝液，收集滴丸，置干燥器内，即得；糖浆剂的制备方法为：取淫羊藿苷1～20克、羧甲基纤维素纳1.5克、糖精钠0.1克、矫味剂适量、防腐剂适量和纯化水100毫升，将羧甲基纤维素纳分散在热水中，冷却，然后与含有淫羊藿苷、糖精钠、矫味剂和防腐剂的含水混悬液混合，将溶液调配成所需体积并混合均匀，灭菌后分装，即得；注射剂的制备方法为：取淫羊藿苷1～50毫克、注射用0.9％氯化钠溶液5～10毫升，将淫羊藿苷溶解于注射用0.9％氯化钠溶液中，并将溶液调至所需体积，调PH值，灌装后在高温下加热灭菌，即得；舌下含片的制备方法为：取淫羊藿苷10～400毫克、可压蔗糖40～80毫克、硬脂酸镁0.1～0.3毫克，将淫羊藿苷过筛后与可压蔗糖、硬脂酸镁混合均匀，并用冲压装置压片，即得。

以往研究表明淫羊藿苷具有增加脑血流量、改善冠脉循环、调节免疫、影响内分泌和抗衰老等作用。本申请人通过对淫羊藿药材的化学成分、药理作用、作用机制等方面进行深入细致的研究，发现淫羊藿苷对血管性痴呆模型和脑缺血再灌损伤神经元有良好的保护作用，可明显改善三种痴呆大鼠模型的学习记忆成绩。

为了验证淫羊藿苷对老年痴呆症的治疗效果，申请人主要进行了以下方面的研究：

1.采用大鼠神经元进行原代培养，利用缺氧缺糖/复氧复糖损伤模型模拟脑缺血再灌作用模型观察其保护作用；

2.采用Fe²⁺/维生素C(Fe²⁺/VitC)氧自由基生成系统建立氧自由基损伤线粒体外模型；

3.双侧颈总动脉结扎慢性脑损伤大鼠模型的影响；

4.小鼠双侧颈总动脉夹闭合并取血降压脑缺血再灌损伤模型；

5.大鼠双侧颈总动脉结扎再灌大鼠病理模型；

6.对铝盐诱导大鼠痴呆模型影响；

7.迷宫法观察药物对正常与痴呆大鼠和小鼠的学习、记忆功能影响；跳台法、暗回避、自发活动方法观察小鼠的学习、记忆功能影响；

8.脑组织病理学、电子显微镜、免疫组化法、RT-PCR等方法观察淫羊藿苷对上神经细胞损伤保护作用及并探讨其作用机制。

具体的试验研究过程及结果如下：

(一)淫羊藿苷对原代培养神经元缺血再灌损伤保护作用

1.实验方法和观察指标

1.1原代神经元培养

出生2天以内的新生Wistar大鼠乳鼠，用75％的酒精浸泡消毒3～5分钟后，无菌条件下断头取脑。在预冷的D-Hank’s液中解剖分离大脑皮层。去除脑膜和血管，D-Hank’s液洗2-3次，剪成1mm³左右的小块。加入0.25％胰蛋白酶37℃消化30min。取出吹打，并用含小牛血清的DMEM/F12培养基终止反应。200目筛网过滤，1000r.min^-1离心10min。弃上清液，再用含20％小牛血清的DMEM/F12培养基洗一次。调节细胞悬液浓度为1×10⁹/L，接种于经0.01％多聚赖氨酸浸泡过夜的孔板或培养瓶中，37℃恒温CO₂孵箱内(5％CO₂，湿度85-98％)培养。接种第4天全量换液，并加入终浓度为5μg/mL的阿糖胞苷作用24h，抑制胶质细胞的增殖。按瓶内培养基指示剂颜色变化，2-3天换液一次。细胞培养至第10天，经神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫细胞化学法鉴定，神经元占全部细胞的95％以上，仅少数细胞是星型细胞和其他胶质细胞。

1.2实验分组和处理

实验随机分为三组：A组为对照组，B组为损伤模型组，C组为淫羊藿苷组(终浓度分别为0.25mg/L，0.5mg/L和1mg/L)。每组所用96孔板的孔数n＝4-6。

细胞缺氧缺糖损伤模型的建立：以缺氧室来诱导细胞损伤。取培养8-9d的神经细胞，去除原培养液后，对照组用含糖Earle’s液洗两次，再加入含糖Earl’s液置于37℃5％CO₂孵箱中继续培养。模型组用无糖Earle’s液洗两次，加入无糖Earle’s液后，置于37℃95％N₂和5％CO₂的密闭缺氧室中孵育。分别处理不同时间后换为无血清培养基37℃5％CO₂孵箱中(复氧复糖)继续正常培养。淫羊藿苷药物组在缺氧缺糖和复氧复糖的同时加入不同浓度的药物，其余处理同模型组。分别在缺氧状态下孵育4、6、8h、复氧复糖后继续培养3、12、24h后检测各指标。

缺氧室的制备：采用密闭性好的家用微波炉保鲜盒(聚乙烯，体积1L)、医用三通管、输液器和装有无菌生理盐水的输液瓶制备了简易、方便、实用的缺氧小容器。按实验的不同要求，将细胞培养板或细胞培养瓶更换为无糖型Earle’s液后，放入自制缺氧容器中，缺氧容器底部加入少许无菌三蒸水起湿化作用。将缺氧容器密闭并置于37℃培养箱中，打开进气、出气三通管阀门，先以2L/h速度注入含有95％N₂和5％CO₂的混合气体10min，然后以1L/h的速度持续缓慢通入混合气体。

1.3MTT检测

用四唑盐(噻唑蓝，MTT)，即溴化-3(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑[3-(4，5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2，5-dipenylterazolium bromide]检测培养的细胞生存率。MTT可被活细胞内的琥珀酸脱氢酶还原，形成不溶于水的蓝紫色结晶，测定吸光度大小可间接反映细胞的数量及活性。96孔细胞培养板去除原培养液后，每孔加入180mL培养基和20μL MTT(终浓度为0.5mg/mL)，37℃95％空气+5％CO₂孵箱中继续培养4h。小心吸去上清液，D-Hank’s液洗一次。加入二甲基亚砜100μL，37℃水浴摇床10min，使结晶充分溶解。待结晶充分溶解后，酶标仪测定各孔的吸光度值(Absorbance，A)。

1.4LDH检测

乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH)在氧化型辅酶I存在时能催化乳酸生成丙酮酸，后者与2，4-二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中呈棕红色，在波长440nm下通过比色测定丙酮酸二硝基苯腙的含量，从而推算LDH的活性。每克组织蛋白37℃与基质作用15分钟，在反应体系中产生1μmol丙酮酸为1个活性单位。其计算公式为：

LDH活力(U/mgprot)＝(测定管OD值-测定空白管OD值)/(标准管OD值-标准空白管OD值)×标准管浓度(2μmol/ml)÷蛋白浓度(mgprot/ml)

分别收集细胞裂解前后的培养基上清液，LDH活性参照LDH试剂盒说明书测定。LDH释放百分率定义为培养细胞释放的LDH活性与总LDH活性之比。通过测定释放到培养基中LDH的量来判断细胞损伤状况。

1.5病理形态学观察

从6孔板中取出长有神经细胞的载玻片，用预冷的PBS冲洗，然后用4％的多聚甲醛固定30分钟，再用PBS冲洗3次，进行常规HE染色，透明封片。光镜下观察神经元病理形态学变化

1.6凋亡检测

参照试剂盒说明操作，主要过程包括：取细胞悬液，充分清洗后，加入AnnexinV/FITC混匀，室温避光孵育10min，离心去上清。用结合缓冲液清洗、重悬细胞，加入碘化丙啶(终浓度1μg/mL)混匀。上流式细胞仪检测2*10⁴个细胞。经计算机系统分析，打印结果。

1.7细胞内游离钙离子浓度检测

制备细胞悬液，利用5μmol/L的钙荧光指示剂Fura-2/AM负载细胞，37℃恒温避光振摇50min，离心去上清液。用含2g/L牛血清白蛋白的Hank’S液冲洗2次以防止胞内Fura-2/AM外排。用Hank’s液重悬，调节细胞数为10⁶/ml。RF-5000荧光分光光度计检测。发射波长500nm，激发和发射光栅分别为5nm、10nm。先以激发波长300-400nm连续测定荧光强度，如在340nm处可见荧光强峰则表明Fura-2/AM负载成功，然后以340nm作为激发波长观察不同状态下荧光强度的变化。计算公式为：

[Ca²⁺]_i＝Kd×(F-F_min)/(F_max-F)。其中Kd为Fura-2/AM与Ca²⁺结合反应的解离常数(224nmol/L)，F为在某因素影响下测得的荧光强度，F_max是加入Triton X-100(终浓度为0.98g/L)测得的最大荧光值，F_min为加入EGTA(终浓度为5mmol/L)后测得的最小荧光值。

统计学处理：结果以均数±标准差

表示，组间比较用方差分析ANAVO和t检验。P＜0.05和P＜0.01有显著性差异。

2.结果

2.1原代培养神经元的鉴定

成熟的神经元可以由其分泌的特殊物质做鉴定。本实验中采用神经元特异性烯醇化酶(NSE)进行免疫细胞化学染色分析。

2.2MTT检测结果

正常培养神经细胞加入淫羊藿苷(0.25mg/L、0.5mg/L、1mg/L)分别培养6h、9h、18h、30h时各组MTT吸光度值没有显著性差异。说明淫羊藿苷对正常培养神经细胞没有明显影响。

与对照组相比，缺氧缺糖4、6、8h的模型组A值均明显降低，有显著性差异(P＜0.01)，显示缺氧缺糖后神经细胞生长能力下降。淫羊藿苷处理组A值均有所上升，显示有不同程度的保护作用。与模型组相比，缺氧缺糖4h时0.25mg/L、0.5mg/L淫羊藿苷组A值上升无显著性差异，仅1mg/L淫羊藿苷组有显著性差异(P＜0.05)。缺氧缺糖6h时0.25mg/L、0.5mg/L、1mg/L淫羊藿苷组A值均明显高于模型组，具有显著性差异(P＜0.01)。缺氧缺糖8h，0.25mg/L淫羊藿苷组与模型组A值无显著性差异；0.5mg/L、1mg/L淫羊藿苷组与模型组A值相比，有显著性差异(分别为P＜0.05、P＜0.01)。

缺氧缺糖(6h)/复氧复糖(3、12、24h)模型组A值均明显降低，与对照组相比具有显著性差异(P＜0.01)，提示神经细胞损伤较严重。与模型组相比，缺氧缺糖(6h)/复氧复糖(3h、12h)时各淫羊藿苷组A值均明显高于模型组(P＜0.05或0.01)。缺氧缺糖(6h)/复氧复糖(24h)，0.25mg/L淫羊藿苷组与模型组A值无显著性差异；0.5mg/L、1mg/L淫羊藿苷组与模型组相比，A值有显著性差异(分别为P＜0.05、0.01)。显示淫羊藿苷对缺氧缺糖(6h)/复氧复糖致神经元损伤有不同程度的浓度依赖性保护作用。

2.3LDH检测结果

缺氧缺糖4h、6h、8h模型组LDH漏出率均比正常组明显上升(P＜0.05或0.01)，显示细胞损伤程度逐渐加大。与模型组相比，缺氧缺糖4h时各组LDH漏出率下降无显著性差异。缺氧缺糖6h时0.25mg/L、0.5mg/L淫羊藿苷组LDH漏出率下降与模型组无显著性差异，仅1mg/L淫羊藿苷组有显著性差异(P＜0.05)。缺氧缺糖8h，各淫羊藿苷组LDH漏出率均明显下降，与模型组相比均有显著性差异(P＜0.05或0.01)。

缺氧缺糖(6h)/复氧复糖(3h、12h、24h)各模型组LDH漏出率均比对照组明显上升(P＜0.01)，提示细胞损伤程度随复氧复糖时间延长而逐渐加大。缺氧缺糖(6h)/复氧复糖(3、12h)时各淫羊藿苷组LDH漏出率均明显低于模型组(P＜0.05或0.01)，且呈浓度依赖性，进一步提示淫羊藿苷对缺氧缺糖/复氧复糖致神经元损伤有明显保护作用。缺氧缺糖(6h)/复氧复糖(24h)，0.25mg/L淫羊藿苷组LDH漏出率有所下降，但与模型组比较无显著性差异，仅0.5mg/L、1mg/L淫羊藿苷组LDH漏出率下降有显著性差异(P＜0.01)。

2.4病理形态学变化

倒置相差显微镜下观察可见：正常情况下接种24h后，大部分细胞贴壁良好，有的细胞伸出粗细不等的突起。随后，胞体逐渐增大，突起伸长变粗，光晕明显且不断扩大。正常培养至8-10d时神经元细胞胞体较大，形态多样，呈圆形、星形或锥体形等。细胞核大而透亮，可见较为明显的核仁。细胞贴壁较好。细胞轮廓明显，胞体有明显的折光性，立体感强。神经突起相互交联呈网络状。而缺氧缺糖/复氧复糖损伤后模型组细胞失去折光性，胞体轮廓模糊；突起减少或回缩、断裂；有的胞体内可见颗粒和空泡；细胞数量减少；部分缩小变圆的细胞和死亡崩解的细胞从板壁脱离，悬浮于培养液中。HE检测发现模型组细胞还有核固缩、浓染等现象。说明缺氧缺糖/复氧复糖对神经细胞造成了较严重的损伤。淫羊藿苷组对细胞形态具有一定的保护作用，细胞损伤程度有所降低，细胞形态基本正常。

2.5淫羊藿苷对缺氧缺糖(6h)/复氧复糖(12h)的神经细胞凋亡的影响

与对照组比较，缺氧缺糖(6h)/复氧复糖(12h)模型组神经细胞凋亡率显著升高(P＜0.01)。淫羊藿苷0.25mg/L、0.5mg/L和1mg/L各浓度组均可降低细胞凋亡率，与模型组比较有显著性差异(P＜0.05或0.01)。

2.6淫羊藿苷对缺氧缺糖(6h)/复氧复糖(12h)神经细胞内游离Ca²⁺浓度

缺氧缺糖(6h)/复氧复糖(12h)模型组细胞内游离Ca²⁺浓度比对照组显著升高(P＜0.01)。淫羊藿苷0.25mg/L、0.5mg/L和1mg/L各浓度组均可降低细胞内游离Ca²⁺浓度，均明显低于模型组(P＜0.01)。

本实验研究了淫羊藿苷对模拟脑缺血再灌损伤神经细胞内游离钙离子浓度的影响。结果表明淫羊藿苷可减轻神经细胞内Ca²⁺负荷，提示淫羊藿苷对脑缺血再灌损伤神经元的保护作用机制可能与其抑制细胞内游离钙离子浓度升高有关。

以上结果说明淫羊藿苷对脑缺血性疾病有一定的防治作用。

(二)淫羊藿苷对大鼠双侧颈总动脉结扎致慢性脑损伤大鼠模型的影响

1实验方法

1.1模型制作

雄性大鼠，体重200-240克，购自第三军医大学大坪医院动物中心，清洁级(合格证号2003003)。先对所有大鼠进行Morris水迷宫训练，筛选出达到学会标准的大鼠(学习记忆正常鼠)120只，随机抽取其中12只作为对照组，其余108只为实验组。大鼠自由饮食，饲以普通饲料并饮用自来水。

1.2实验分组及给药

按2-VO方法结扎双侧颈总动脉，其方法是35％水合氯醛(1ml.kg^-1体重)腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位固定，颈正中去毛，碘酒酒精消毒，行颈正中切口，分离双侧颈总动脉并将其永久性结扎，缝合切口。对照组：除不结扎双侧颈总动脉外，其余处理与实验组相同。术后1月进行Morris水迷宫检测发现实验组和对照组大鼠的学习记忆能力出现显著性差别时，将实验组大鼠分为4组，分别为模型组(n＝12)、ICA低剂量组(30mg.kg^-1)(n＝12)、ICA中剂量组(60mg.kg^-1)(n＝12)、高剂量组(120mg.kg^-1)(n＝12)。连续灌胃给药三个月。每给药满一个月时，进行一次行为学检测。

1.3标本制备

未次灌胃给药结束后，取大鼠6只，经35％水合氯醛(1ml.kg^-1)麻醉。每只大鼠各眼球采血2ml，于试管中4℃静置过夜，次日取上清液备用。透心灌注及取脑放入4％的福尔马林溶液4℃过夜。次日取出大脑标本置于20％蔗糖防腐液中4℃保存，待标本沉底后切片。每个脑组织标本正中矢状切分，一侧大脑用于冰冻切片，用于检测AChE、ChAT的表达。另一侧用于石蜡切片，HE染色，光学显微镜下观察皮层及海马细胞形态变化。

取大鼠6只，眼球采血后立即断头剥取脑组织，在冰盘上取出大脑皮层和海马，电子天平称重，按1∶10(每克组织中加10ml冷生理盐水)加生理盐水，用超声粉碎机制成10％组织匀浆(6秒/次，间隔10秒，共20次，匀浆过程始终处于冰水中)，组织匀浆分成数份，-80℃冰箱保存。光化学法测定血清中AChE测定；检测脑组织匀浆中AChE、SOD、MD含量。

2.2实验结果

2.2.1形为学实验结果

迷宫实验表明，2-VO手术一月后，VD(血管性痴呆)模型组与假手术组比较，前者在定位航行实验中大鼠的逃避潜伏期及搜索距离明显延长，空间探索实验中在原安全岛所在象限的搜索时间明显减少，原安全岛所在象限的游泳距离占总距离的百分比明显降低，提示VD模型组大鼠的空间学习记忆功能出现障碍。ICA灌胃3个月后，ICA30mg.kg^-1组、ICA60mg.kg^-1组和ICA120mg.kg^-1组与VD模型组相比较，前者在定位航行中均可缩短大鼠的逃避潜伏期及搜索距离，在空间探索实验中在原安全岛所在象限的搜索时间明显延长，原安全岛所在象限的游泳距离占总距离的百分比明显增大，且高剂量组优于低剂量组，提示ICA对2-VO法建立的VD模型大鼠的学习记忆障碍的改善有作用。

2.2.2ICA对大鼠海马神经细胞形态学的影响

光镜下观察，假手术组皮层细胞形态结构未见异常，海马锥体细胞排列紧密，细胞核圆而大，核仁清晰。模型组海马锥体细胞层次减少，排列见稀疏，细胞核体积变小，深染，结构不清，有核固缩现象。给ICA三个月组，海马锥体细胞排列较整齐，结构清晰，无核固缩现象。

2.2.3ICA对大鼠海马内AChE表达的影响

连续灌胃给药3个月后透心灌注取脑，恒冷冰冻切片后经免疫组化法检测大鼠海马内AChE的表达。假手术组及VD模型组切片中染色较浅，提示AChE表达量低，ICA组病理切片中海马神经元可见明显的胞膜及胞浆黄染，提示AChE在给药组表达增强。经图象分析测定，假手术组及VD模型组的平均光密度和平均灰度值无差异，ICA组的平均光密度(meanabsorbanee)较VD模型组增强，平均灰度值(mean gradation)相应的较VD模型组降低，且呈现剂量依赖性(表1)。

表1ICA对大鼠海马AChE的影响

Group	n	mean absorbance	mean gradation
				shammodelICA30mg.kg-1ICA60mg.kg-1ICA120mg.kg-1	66666	0.2933±0.0080.2892±0.0020.3662±0.009**0.3858±0.009**0.4106±0.009**	189.5896±2.986190.9476±0.442176.8152±1.563**173.3763±1.590**169.1371±1.505**

*P＜0.05，**P＜0.01 vs.model。

2.2.4ICA对大鼠海马内ChAT表达的影响

连续灌胃给药3个月后透心灌注取脑，恒冷冰冻切片后经免疫组化法检测大鼠海马内AChE的表达。假手术组切片中海马神经元可见明显的胞膜及胞浆黄染，提示ChAT表达量高；VD模型组切片中染色很浅，提示ChAT表达量低；ICA组病理切片中海马神经元可见明显的胞膜及胞浆黄染，提示ChAT在给药组表达增强。经图象分析测定，假手术组的平均光密度(mean absorbance)较VD模型组高，平均灰度值(mean gradation)较VD模型组低；ICA组的平均光密度(mean absorbance)较VD模型组增强，平均灰度值(mean gradation)相应的较VD模型组降低，且呈现剂量依赖性(表2)。

表2ICA对大鼠海马ChAT的影响

group	n	mean absorbance	mean gradation
				shammodelICA30mg.kg-1ICA60mg.kg-1ICA120mg.kg-1	66666	0.41 19±0.0060.3323±0.0020.4074±0.004**0.4131±0.001**0.4295±0.012**	168.9007±1.028182.9016±0.308169.68±0.698**168.7068±0.199**165.9709±2.024**

*P＜0.05，**P＜0.01 vs.model P＜0.05，P＜0.01 vs.sham

2.2.5ICA对大鼠血清中AChE的影响

给ICA治疗3月后，各组大鼠血清AChE无差异(表3)。

表3ICA对大鼠血清中AChE的影响

Group	n	AChE(U/ml)
			shammodelICA30mg.kg-1ICA60mg.kg-1ICA120mg.kg-1	66666	43.32±9.7135.61±9.8038.06±7.1641.62±11.9137.12±13.05

*P＜0.05，**P＜0.01 vs.model  P＜0.05，P＜0.01 vs.sham

2.2.6对大鼠脑组织中AChE、SOD、MDA的影响

给ICA治疗3个月后，各组大鼠断头取脑，制备脑组织匀浆，用光化学法检测AChE的含量、SOD的活性及MDA的含量。与假手术组比较，VD模型组大鼠脑内SOD活性降低，MDA含量增高，AChE含量无明显变化；与VD模型组比较，ICA组大鼠脑内SOD活性增高，MDA含量降低，AChE含量增加(表4)。

表4ICA对大鼠脑组织中AChE、SOD、MDA的影响

Group	n	AChE(U/ml)	SOD(U/mgprot)	MDA(nmol/mgprot)
					shammodelICA30mg.kg-1ICA60mg.kg-1ICA120mg.kg-1	66666	0.243±0.1040.172±0.0940.253±0.1060.296±0.057**0.344±0.098**	15.11±3.698.76±1.7610.52±1.09*11.82±1.64**12.14±2.22**	5.818±1.22712.63±1.0379.769±1.699**9.726±1.968**7.032±1.553**

*P＜0.05，**P＜0.01 vs.model  P＜0.05，P＜0.01 vs.sham

结论：

1.淫羊藿苷对由2-VO法及I10-R10-I10法建立的VD模型大鼠的空间学习记忆障碍具有改善作用。

2.淫羊藿苷可以增加VD模型大鼠海马内AChE及ChAT的合成及表达。

3.淫羊藿苷可以提高VD模型大鼠皮层及海马内SOD活性，降低MDA活性，增加AChE的含量

4.淫羊藿苷可以减轻VD模型大鼠海马神经元的损伤，抑制神经元凋亡。

(三)淫羊藿苷改善Aβ_25-35所致AD(阿尔茨海默病)模型大鼠学习记忆的实验研究

1.实验方法

1.1实验动物筛选自发活动活跃的雄性wistar大鼠96只，月龄14～16个月，体重400～600g，购自第三军医大学大坪医院动物中心，清洁级动物(合格证号：2003003)。颗粒饲料饲养，自由饮水，12h/12h光/暗环境；以及出生3天内的乳鼠。

1.2实验方法

实验一淫羊藿苷对Aβ_25-35海马内注射所致AD大鼠的影响

实验动物分组及处理行Morris水迷宫训练，淘汰掉学习成绩太好和太差者，训练至成绩稳定后将剩余的96只大鼠随机分为6个组，分别是生理盐水组(NS)，Sham组，模型组，淫羊藿苷低、中、高剂量(淫羊藿苷30mg.kg^-1.d^-1、淫羊藿苷60mg.kg^-1.d^-1、淫羊藿苷120mg.kg^-1.d^-1)治疗组，每组16只。NS组在相应脑区注射与Aβ_25-35等容积的NS，不给予淫羊藿苷治疗；Sham组不用Aβ_25-35制模，也不给予淫羊藿苷治疗；模型组用Aβ_25-35制模但不给予淫羊藿苷治疗；淫羊藿苷低、中、高剂量组在用Aβ_25-35制模后再给予淫羊藿苷(30mg.kg^-1.d^-1、60mg.kg^-1.d^-1、120mg.kg^-1.d^-1)治疗。

Aβ_25-35孵育无菌生理盐水将Aβ_25-35稀释成5μg.μl^-1，37℃孵育一周，使其变为聚集态的Aβ_25-35。

动物模型的制备Aβ组、淫羊藿苷低、中、高剂量治疗组大鼠经10％水合氯醛腹腔注射麻醉后固定于大鼠脑立体定位仪上，预定海马进针坐标为：AP-4mm(前囟后)，ML-2.8mm(中线右侧)，H-3mm(自脑膜起的深度)。定位后钻开颅骨，微量注射器垂直进针3mm，将2μl Aβ_25-35缓慢注入，留针5分钟。NS组注入等体积无菌生理盐水，Sham组钻开颅骨后即缝合伤口。各组动物术后常规腹腔注射苄星青霉素抗感染。

药物干预待动物清醒后治疗组即开始灌胃给药。淫羊藿苷低、中、高剂量治疗组每日定时(早上8时)灌胃给药一次，剂量分别为30mg.kg^-1.d^-1、60mg.kg^-1.d^-1、120mg.kg^-1.d^-1；Aβ组、Sham组及NS组用等体积蒸馏水代替，连续14天。

Morris水迷宫训练大鼠空间辨别学习记忆是检测空间定向、反映时间、视知觉和结构应用等能力，从而评价其认知水平的一种行为模式，是一类关于场景和事件的学习记忆。常用于检测空间辨别学习记忆能力的装置有Morris水迷宫、多向选择迷宫、放射臂迷宫、循环平台等。Morris水迷宫是英国心理学家GM.Morris于1981年发明并用于学习记忆的研究中，基本原理是让动物利用空间信息对行为做出正确的选择。

水迷宫的组成同前。

检测方法实验共5天，分为定位航行实验及空间探索实验。检测前将大鼠置于无安全岛的水池中游泳2分钟，使其适应水环境。检测中将大鼠置于放置安全岛的池中游泳并由BI2000图象处理系统中的行为学模块自动记录游泳轨迹及时间。每次实验安全岛固定在同一位置，入水点可以更改。具体方法如下：定位航行实验历时4天，每天上下午定时各训练一次，检测大鼠找到安全岛的时间(逃避潜伏期)及游泳路径长度(搜索距离)，第5天撤除安全岛作空间探索实验，将大鼠从同一入水点放入水中，记录120秒内大鼠在原安全岛所在象限的搜索时间及原安全岛所在象限游泳距离占总距离百分比。

制备脑组织切片

制备脑组织石蜡切片

1)麻醉：水迷宫检测结束后，每组大鼠各取4只，经10％水合氯醛(3.5-4ml.kg^-1)腹腔注射麻醉。

2)固定标本：断头剥取脑组织，放入4℃的4％福尔马林液中，放置8小时后放入70％乙醇溶液5分钟，取出后分别放入80％、90％、95％及无水乙醇中各4小时，最后放入二甲苯中浸泡30分钟。

3)切片制备：取视交叉至乳头体组织，常规石蜡包埋，冠状切片，厚度6μm，每隔2张取1张，HE染色，光学显微镜下观察皮层及海马细胞数量及形态变化；刚果红染色，光学显微镜下观察有无淀粉样沉淀。

制备脑组织冰冻切片

1)麻醉：水迷宫检测结束后，每组大鼠各取6只，经10％水合氯醛(3.5-4ml.kg^-1)腹腔注射麻醉。

2)透心灌注及取脑：将麻醉的大鼠仰卧固定，剪开胸骨及两侧肋骨，以充分暴露胸腔和心脏。用连于恒流泵的16号针头经心尖部插入升主动脉，剪开右心耳，夹闭腹主动脉后顺行灌流预冷的4℃ 0.1M PBS液，速度为10～15ml.min^-1，待动物右心耳流出液清澈后改灌4％的4℃福尔马林液，动物尸体僵硬后，小心取出脑组织放入4％的福尔马林溶液4℃过夜。次日取出大脑标本置于20％蔗糖防腐液(加入0.1％NaN₃)中4℃保存，待标本沉底后切片。

3)制备切片：恒冷切片机在各标本相应点连续冠状切片，片厚30μm，置于盛20％蔗糖防腐液(加入0.1％NaN₃)小瓶中，用于检测AchE和ChAT的表达及Aβ_1-40的含量。

制备脑组织匀浆

水迷宫检测结束后，每组大鼠各取6只，经10％水合氯醛(3.5-4ml.kg^-1)腹腔注射麻醉。断头剥取脑组织，在冰盘上取出大脑皮质和海马，电子天平称重，按1∶10(每克组织中加10ml冷生理盐水)加生理盐水，用超声粉碎机制成10％组织匀浆(6秒/次，间隔10秒，共20次，匀浆过程始终处于冰水中)，组织匀浆分成数份，-80℃冰箱保存备用。

免疫组化检测AchE和ChAT的表达及Aβ_1-40的含量采用漂染法结合SABC法染色，步骤如下：

1)从小瓶中取出组织切片于平皿中，0.1M PBS清洗3次；

2)转移组织切片于含0.6％H₂O₂的0.5％甲醇溶液(蒸馏水配制)中放置30min；

3)0.1M PBS清洗3次，每次5min；

4)加入稀释后的一抗(兔抗鼠)，4℃冰箱过夜；

5)次日37℃水浴振荡孵育2.5h；

6)0.1M PBS清洗4次，每次10min；

7)加入Envision后，37℃水浴振荡孵育1h；

8)0.1M PBS清洗3次，每次5min；

9)DAB显色5-10min；

10)0.1M PBS清洗3次，每次5min；

11)转移组织切片至载玻片(载玻片需事先用多聚赖氨酸处理)；

12)梯度酒精脱水(75％、95％、100％)，二甲苯透明，每步各2min；

13)中性树胶封片；

14)显微镜下观察。

图象分析及处理采用成都泰盟公司的BI2000图象处理系统中的免疫组化分析模块进行AchE和ChA T表达及Aβ_1-40含量的半定量检测。

脑组织匀浆中AchE、NOS、SOD及GSH-PX的活性测定

具体操作均按试剂盒说明书进行。

实验二淫羊藿苷对Aβ_25-35的神经毒性的影响

试剂配制

培养基含10％小牛血清的完全培养基：90ml的DMEM-F12溶液+10ml小牛血清+104U的青霉素+104U的链霉素。

缓冲液PBS的配制：NaCl 8.00g，KCl 0.20g，Na₂HPO₄·12H₂O 3.48g，KH₂PO₄ 0.20g，加三蒸水至1000ml。8磅消毒15分钟。

D-Hank’s NaCl 8.00g，KCl 0.40g，Na₂HPO₄·12H₂O 0.134g，KH₂PO₄ 0.06g，NaHCO₃0.35g，加三蒸水至1000ml。8磅消毒15分钟。

药物的配制

不同浓度的Aβ_25-35用无菌生理盐水将Aβ_25-35稀释成5μg.μl^-1，37℃孵育一周，使其变为聚集态的Aβ_25-35，用培养基稀释成400μmol.l^-1。

不同浓度的淫羊藿苷用无水乙醇将淫羊藿苷溶解稀释为1g.l^-1，用培养基将其稀释为0.01～100mg.l^-1。

溶媒对照用培养基将无水乙醇浓度稀释为10％。

其它液体5mg.ml^-1的噻唑兰：称取台盼蓝100mg，加生理盐水配至20ml，过滤除菌；0.125％胰蛋白酶：称取125mg胰蛋白酶，加D-Hank’s至100ml，过滤除菌。

神经细胞的培养将新生大鼠放入酒精中消毒，然后放入超净工作台平皿内，剪下头，剥离头皮及颅骨，分离大脑皮层，剥离血管，剪碎脑组织，并在37℃下用0.125％胰蛋白酶消化20分钟，然后用含20％小牛血清的培养基终止消化，取出吹打均匀后，200目尼龙网过滤，离心(1000转.分^-1，5分钟)，吸去上清液，调整细胞密度为1×10⁶个.ml^-1，接种于预先用多聚赖氨酸处理的96孔培养板，每孔200μl。接种后72小时全量换液，第5天加入10μg.ml^-1阿糖胞苷以抑制非神经细胞的增殖，以后每周半量换液3次，于接种后第10天制模。

制模接种后第10天，分别加入终浓度为5μmol.l^-1、10μmol.l^-1、20μmol.l^-1“老化”的Aβ_25-35，培养24小时，终止培养前4小时进行MTT测定。

药物干预选择合适的制模浓度(10μmol.l^-1 Aβ_25-35)后，加入“老化”的Aβ_25-35和终浓度为0.001～10mg.l^-1的淫羊藿苷，溶媒对照组加入终浓度为1％的无水乙醇，空白对照组加入培养基，培养24小时，终止培养前4小时进行MTT测定

MTT测定^[23]Aβ_25-35对神经细胞存活、增殖的影响及淫羊藿苷的干预作用

终止培养前4h加入5mg.ml^-1的MTT溶液20μl.孔^-1。终止培养，小心吸出培养基，加入有机溶剂DMSO 20μL.孔^-1，置于37℃摇床20min，使所形成的结晶溶解，在酶标仪上于492nm波长处读取吸光度值，结果以复孔A的均值表示。

1.3数据的统计分析

实验数据用SPSS统计软件统计。所有数据以均数±标准差

表示。组间比较采用单因素方差分析进行统计学处理。P＜0.05认为有差异，P＜0.01认为有显著性差异。

2.实验结果

2.1行为学实验结果

正常大鼠的学习成绩及分组成绩

在分组前对每只大鼠进行Morris水迷宫训练，一直到成绩稳定为止(连续两天成绩无显著性差异，表1)。成绩稳定后，随机分为6个组，经q检验各组问成绩无显著性差异(表2，3)。

表1正常大鼠的定位航行成绩(逃避潜伏期及搜索距离)

Day	n	Latency(sec)	Distance(cm)
				Day1	96	48.92±26.76	3803.08±2013.54
Day2	96	32.25±21.71	2567.01±1566.21
				Day3	96	26.92±19.06	2076.86±1433.70
Day4	96	20.10±15.90	1570.85±1234.71
				Day5	96	18.97±13.81	1423.84±1114.20

表2正常大鼠分组后的定位航行成绩(逃避潜伏期及搜索距离)

Group	n	latency(sec)	Distance(cm)
				Sham	16	22.79±26.74	1531.54±1312.23
NS	16	18.97±2.05	1548.66±1490.77
				Model	16	21.26±28.45	1391.52±957.05
淫羊藿苷30mg.kg-1	16	16.20±15.31	1535.13±1194.32
				淫羊藿苷60mg.kg-1	16	18.99±19.04	1276.53±940.07
淫羊藿苷90mg.kg-1	16	20.51±24.47	1259.69±703.51

表3正常大鼠分组后的空间探索成绩(安全岛所在象限的搜索时间及原平台象限游泳距离占总距离百分比)

Group	n	explore time(sec.)	the distance of D area/total area(％)
				Sham	16	23.45±4.10	23.54±4.39
NS	16	24.32±6.5	22.60±3.76
				Model	16	22.89±6.31	22.37±3.78
淫羊藿苷30mg.kg-1	16	26.35±8.35	26.18±5.02
				淫羊藿苷60mg.kg-1	16	26.18±7.37	24.29±6.11
淫羊藿苷90mg.kg-1	16	24.24±8.35	26.38±8.95

水迷宫实验表明，Aβ_25-35海马内注射14天后，AD模型组与假手术组比较，前者在定位航行实验中大鼠的逃避潜伏期及搜索距离明显延长(表4、5)，空间探索实验中在原安全岛所在象限的搜索时间明显减少(表6)，原安全岛所在象限的游泳距离占总距离的百分比降低(表7)，提示AD模型组大鼠的空间学习记忆功能出现障碍。

淫羊藿苷灌胃14天后，淫羊藿苷各治疗组与AD模型组相比较，前者在定位航行中均可缩短大鼠的逃避潜伏期及搜索距离(表4、5)，在空间探索实验中原安全岛所在象限的搜索时间明显延长(表6)，原安全岛所在象限的游泳距离占总距离的百分比明显增大(表7)。

表4淫羊藿苷灌胃后大鼠定位航行实验成绩(逃避潜伏期)

Group	n	Day1(sec)	Day2(sec)	Day3(sec)	Day4(sec)
						Sham	16	13.50±6.14	9.98±5.85	5.00±1.44	8.17±4.30
NS	16	13.23±4.28	12.03±11.78	5.30±1.11	8.28±4.22
						Model	16	44.88±30.75#	35.16±30.66#	16.69±6.99#	16.88±9.90#
淫羊藿苷30mg.kg-1	16	33.74±23.72	17.83±12.20	10.93±4.12*	8.5±1.18*
						淫羊藿苷60mg.kg-1	16	28.06±16.03	8.81±2.78*	7.35±4.27*	7.60±4.003*
淫羊藿苷120mg.kg-1	16	22.71±19.84*	11.56±4.42	7.19±2.10*	6.68±3.46*

^#P＜0.05 vs sham，*P＜0.05 vs model

表5淫羊藿苷灌胃后大鼠定位航行实验成绩(搜索距离)

Group	n	Day1(cm)	Day2(cm)	Day3(cm)	Day4(cm)
						Sham	16	872.57±340.82	626.55±268.73	419.81±114.27	670.28±416.63
NS	16	700.43±249.68	578.53±307.87	427.72±105.05	661.99±330.50
						Model	16	3064.33±2159.82#	2329.79±2089.45#	1008.10±586.62#	1334.99±977.18#
淫羊藿苷30mg.kg-1	16	2078.72±2038.39	1370.93±927.54	927.54±496.23	569.23±94.78*
						淫羊藿苷60mg.kg-1	16	1568.52±943.35	623.12±179.63*	557.79±299.44*	589.46±347.98*
淫羊藿苷120mg.kg-1	16	1315.06±1391.53*	900.95±474.73	590.38±260.71*	542.94±289.22*

^#P＜0.05 vs sham，*P＜0.05 vs model

表6淫羊藿苷灌胃后大鼠空间探索成绩(搜索时间)

Group	n	Explore time(sec)
			Sham	16	31.46±1.36
NS	16	34.31±3.29
			Model	16	21.79±7.47#
淫羊藿苷30mg.kg-1	16	26.39±4.83
			淫羊藿苷60mg.kg-1	16	28.72±6.89
淫羊藿苷120mg.kg-1	16	31.54±6.04*

^#P＜0.05 vs sham，*P＜0.05 vs model

表7淫羊藿苷灌胃后大鼠的空间探索成绩(原平台象限游泳距离占总距离百分比)

Group	n	the distance of D area/total area(％)
			Sham	16	0.28±0.06
NS	16	0.25±0.03
			Model	16	0.23±0.04
淫羊藿苷30mg.kg-1	16	0.23±0.04
			淫羊藿苷60mg.kg-1	16	0.27±0.04
淫羊藿苷120mg.kg-1	16	0.31±0.04*

*P＜0.05 vs model

2.2淫羊藿苷对大鼠海马神经细胞形态学的影响

光镜下观察，假手术组皮层细胞形态结构未见异常，海马锥体细胞排列紧密，结构清晰。模型组海马锥体细胞层次减少，排列见稀疏，细胞核体积变小，深染，有核固缩现象，海马及皮层胶质细胞反应性增生。给淫羊藿苷14天组，海马锥体细胞排列较整齐，结构清晰，无核固缩现象。刚果红染色，模型组见淀粉样沉淀，而假手术组未见淀粉样沉淀。

2.3免疫组化检测结果

2.3.1淫羊藿苷对大鼠海马内AChE表达的影响

连续灌胃给药14天后透心灌注取脑，恒冷冰冻切片后经免疫组化法检测大鼠海马内AChE的表达。假手术组切片中海马神经元可见明显的胞膜及胞浆黄染，提示AChE表达量高；AD模型组切片中染色很浅，提示AChE表达量低；淫羊藿苷组切片中海马神经元可见明显的胞膜及胞浆黄染，提示AChE在给药组表达增强。经图象分析测定，假手术组的平均光密度(mean absorbance，MA)较AD模型组高(表8)，平均灰度值(mean gradation，MG)较AD模型组低(表8)；淫羊藿苷组的MA较AD模型组增强(表8)，MG相应地较AD模型组降低(表8，)，且呈剂量依赖性。

表8淫羊藿苷对大鼠海马AChE的影响

Group	n	mean absorbance	mean gradation
				Sham	6	0.0348±0.0060	236.3554±3.1011
NS	6	0.0331±0.0056	237.4217±2.5865
				Model	6	0.0249±0.0056##	240.8100±3.1196##
淫羊藿苷30mg.kg-1	6	0.0247±0.0041	240.9879±2.3606
				淫羊藿苷60mg.kg-1	6	0.0291±0.0046**	238.4999±2.5070**
淫羊藿苷120mg.kg-1	6	0.0348±0.0083**	235.4228±4.5061**

^##P＜0.01 vs sham，**P＜0.01 vs model

2.3.2淫羊藿苷对大鼠海马内ChAT表达的影响

连续灌胃给药14天后透心灌注取脑，恒冷冰冻切片后经免疫组化法检测大鼠海马内ChAT的表达。假手术组切片中海马神经元可见明显的胞膜及胞浆黄染，提示ChAT表达量高；AD模型组切片中染色很浅，提示ChAT表达量低；淫羊藿苷组切片中海马神经元可见明显的胞膜及胞浆黄染，提示ChAT在给药组表达增强。经图象分析测定，假手术组的MA较AD模型组高(表9)，MG较AD模型组低(表9)；淫羊藿苷组的MA较AD模型组增强(表9)，MG相应的较AD模型组降低(表9)。

表9淫羊藿苷对大鼠海马ChAT的影响

Group	n	mean absorbance	mean gradation
				Sham	6	0.0412±0.0097	231.9739±5.1324
NS	6	0.0406±0.0098	232.3120±5.1992
				model	6	0.0282±0.0038##	238.7360±2.3757##
淫羊藿苷30mg.kg-1	6	0.0298±0.0043	238.4068±2.2902
				淫羊藿苷60mg.kg-1	6	0.0302±0.0058	237.8970±3.1727
淫羊藿苷120mg.kg-1	6	0.0399±0.0099**	232.7006±5.2549**

^##P＜0.01 vs the sham，**P＜0.01 vs the model

2.3.3淫羊藿苷对大鼠海马内Aβ_1-40含量的影响

连续灌胃给药14天后透心灌注取脑，恒冷冰冻切片后经免疫组化法检测大鼠海马内Aβ_1-40的含量。假手术组切片中海马神经元染色很浅，提示Aβ_1-40含量低；AD模型组切片中可见明显的胞膜及胞浆黄染，提示Aβ_1-40含量高；淫羊藿苷组病理切片中海马神经元染色浅，提示Aβ_1-40在给药组含量降低。经图象分析测定，假手术组的MA较AD模型组低(表10)，MG较AD模型组高(表10)；淫羊藿苷组的MA较AD模型组降低(表10)，MG相应的较AD模型组增强(表10)，且呈剂量依赖性。

表10淫羊藿苷对大鼠海马Aβ_1-40含量的影响

Group	n	mean absorbance	mean gradation
				Sham	6	0.0616±0.0060	221.3011±3.0503
NS	6	0.0616±0.0069	221.2803±3.5086
				Model	6	0.0970±0.0130##	204.0466±6.1287##
淫羊藿苷30mg.kg-1	6	0.0905±0.0193**☆☆	207.2436±9.1740**☆☆
				淫羊藿苷60mg.kg-1	6	0.0873±0.0125**☆☆	208.6709±5.9942**☆☆
淫羊藿苷120mg.kg-1	6	0.0784±0.0170**☆☆	213.0052±8.2574**☆☆

**P＜0.1 vs model，^##P＜0.01 vs sham，☆☆P＜0.01 vs sham

2.4淫羊藿苷对大鼠脑组织中NOS、SOD、GSH-PX的影响

给淫羊藿苷治疗14天后，与假手术组比较，AD模型组大鼠脑内NOS活性增加(表11)，SOD(表12)及GSH-PX(表12)活性降低；与AD模型组比较，淫羊藿苷组大鼠脑内NOS(表11)活性降低，且高剂量组较低剂量组降低明显，SOD(表12)和GSH-PX(表12)的活性增加，且呈剂量依赖性。

表11淫羊藿苷对大鼠脑组织中NOS的影响

Group	n	Nos(U.mgprot-1)
			Sham	6	11.96±5.17
NS	6	10.96±3.50
			Model	6	28.70±14.43#
淫羊藿苷30mg.kg-1	6	23.96±9.34
			淫羊藿苷60mg.kg-1	6	15.64±2.11
淫羊藿苷120mg.kg-1	6	12.06±5.50*

^#P＜0.05 vs Sham，^*P＜0.05 vs model

表12淫羊藿苷对大鼠脑组织中SOD和GSH-PX的影响

Group	SOD(U.mgprot-1)	GSH-PK(U.mgprot-1)
			Sham	71.97±3.77	22.32±3.33
NS	69.83±3.10	22.38±5.53
			Model	64.98±2.77#	12.80±3.03#
淫羊藿苷30mg.kg-1	69.13±3.72	14.69±4.94
			淫羊藿苷60mg.kg-1	71.12±1.44*	26.27±4.90*
淫羊藿苷120mg.kg-1	72.99±0.98**	29.40±8.39*

^#P＜0.05 vs Sham，*P＜0.05 vs model，**P＜0.01 vs model

2.5Aβ_25-35的神经细胞毒性及淫羊藿苷的影响

5μmol.l^-1，10μmol.l^-1，20μmol.l^-1的Aβ_25-35与神经细胞培养24小时，10μmol.l^-1，20μmol.l^-1的Aβ_25-35对细胞造成较明显的损伤(表13)，二者差异不大，故选用10μmol.l^-1制模。淫羊藿苷可减轻Aβ_25-35的神经毒性作用(表14)。

表13Aβ_25-35的神经细胞毒性作用

Group	n	OD
			20μmol.l-1Aβ25-35	4	0.59±0.11#
10μmol.l-1Aβ25-35	4	0.62±0.05#
			5μmol.l-1Aβ25-35blank	44	0.76±0.090.80±0.09

^#P＜0.05 vs blank

表14淫羊藿苷对Aβ_25-35的神经细胞毒的影响

Group	n	OD
			Model	4	0.53±0.10##
淫羊藿苷10mg.l-1	4	0.78±0.05**
			淫羊藿苷1mg.l-1	4	0.70±0.07*
淫羊藿苷0.1mg.l-1	4	0.64±0.05
			淫羊藿苷0.01mg.l-1	4	0.60±0.06
1％alcohol	4	0.78±0.06
			Blank	4	0.79±0.09

^##P＜0.01 vs blank，**P＜0.01 vs model，*P＜0.05 vs model

结论：

淫羊藿苷对Aβ_25-35海马内注射所致AD模型大鼠的空间学习记忆瘴碍具有改善作用。其机制可能是(1)增加AChE和ChAT的表达，促进胆碱能系统的功能恢复；(2)减少皮质及海马神经元的死亡；(3)降低NOS的活性，减少NO的生成；(4)清除自由基，抗脂质过氧化；(5)减少Aβ的生成。

(四)淫羊藿苷对脑缺血再灌小鼠智力障碍模型的保护作用

1.实验方法和观察指标

1.1脑缺血再灌诱导的VD小鼠模型的制备

采用双侧颈总动脉夹闭合并缺血降压再灌注法制备小鼠VD模型。实验鼠术前12小时禁食，自由饮水。4％水合氯醛(0.1ml/10g体重)腹腔注射麻醉后，仰卧固定于鼠解剖板，颈正中剃毛，以碘酒和75％酒精做皮肤常规消毒，沿前后方向颈正中线纵向剪开颈部皮肤约0.5cm，钝性分离组织和肌肉，暴露并分离出双侧颈总动脉，下穿丝线备用。注意不要损伤迷走神经。于锁骨上方剪一0.5cm切口，分离颈总静脉，下穿丝线。结扎颈总静脉远心端，近心端处打一活结。在结扎端近心侧用眼科剪小心剪口，将连接于注射器针头上的聚乙烯导管(导管预先肝素内浸泡，导管外径0.5mm，长约4cm)，沿颈总静脉向心脏方向插入。至导管尖端距离小鼠上切齿约3.7cm时停止，抽血降压，缓慢抽取小鼠理论血量的30％。然后提起颈总动脉下丝线，用无创性微动脉夹夹闭双侧颈总动脉20min。记时结束，松开动脉夹，并回输血液，拔出导管，结扎颈总静脉近心端，缝合伤口。在全部造模过程中观察动物体温，保持动物肛温在36±0.5℃左右，以防止低温对脑缺血损伤的保护作用。

1.2实验分组与处理

分组与给药同前。术后第15天开始进行自发活动和被动回避实验，第17天开始进行空间分辨学习记忆实验。行为学检测完毕后每组取3只小鼠，进行在体灌流固定，制作石蜡切片，HE检测和免疫组化染色分析。每组随机取1只小鼠做电镜检测。每组5-6只小鼠迅速断头取大脑组织，制备10％的脑组织匀浆，离心取上清液进行各种生化检测。其余标本70℃冻存备用。

1.3行为学测试

1.3.1小鼠自发活动记数

采用电脑程控全自动自发活动计数仪进行。有四个测试室，测试室周围有三对光电管，通过数据传输线与电脑相连。由于动物行为活动本身有一定的昼夜节律性，因此，一般在下午6点至晚上12点进行。在清洁干净和安静的环境中进行测试。每次测试将小鼠放入暗室中，记录3分钟内小鼠的自发活动。

1.3.2小鼠被动回避学习记忆能力测试

采用WCX-2型小鼠跳台仪。跳台仪测试箱每孔大小为11×11×25cm，边角有一3×3×3cm绝缘跳台，底为间隔0.5cm能通以交流电的铜栅构成。将小鼠放入测试箱熟悉环境3min，然后接通36V交流电，持续通电5min。小鼠为了逃避遭受电击而跃上安全平台，此时断开电源；当小鼠走下平台时，又接通电源。如此反复间隔通电。实验时保持环境安静。当小鼠跃上安全平台后不再跳下平台时，我们认为小鼠已学会逃避电击。记录小鼠上台时间(即上台潜伏期，Escape latency，EL)、受电击时间、错误次数。小鼠学会逃避电击遭受的电击次数，即为错误次数，电击次数越多，学习能力越差。24h后测其记忆能力：跳台箱不通电，将训练过的小鼠稳稳当当放于跳台上，开始记时，观察5分钟。记录小鼠下台潜伏期、在平台总的停留时间、错误次数。记时开始至小鼠走下平台所需的时间，即下台潜伏期(Stepdown latency，SDL)，SDL超过300秒，则以300秒计算。SDL越长，说明小鼠记忆能力越好

1.3.3小鼠空间辨别学习记忆能力的测试

采用电脑程控SMG-2型小鼠水迷宫。该迷宫共有4个盲端和1个平台。各处分别设置一对光电管，当小鼠进入盲端阻断光线时，电脑记录错误次数1次。当小鼠爬上平台阻断光线时，实验记数终止。从实验开始到小鼠达到平台所用时间为寻台潜伏期。训练开始时，将小鼠鼻孔朝箱壁放在靠近平台的盲端，按由近及远的顺序分阶段进行训练，让其学会找到平台。连续训练5天，分别记录每天成绩：3min内到达平台的潜伏期和错误次数。3min内未成功找到平台的寻台潜伏期以3min记算。

1.3.4在体灌流固定以及切片制备

小鼠用4％的水合氯醛i.p.麻醉，仰卧固定于蛙板上，剪开胸腔，暴露心脏，剥离心包膜，经左心室快速滴入肝素化PBS液约50mL，然后缓慢滴入4％的多聚甲醛(0.1mol/L PBS，PH7.4，4℃)约50mL；同时剪碎肝脏作为血液和灌注液出口。实施内固定脑组织后将大鼠断头，快速分离脑组织，放入4％多聚甲醛中固定，切冠状切片，石蜡包埋，将组织切片粘贴于经多聚赖氨酸处理过的载玻片上。一部分切片用于HE染色分析，其余切片用于免疫组化染色分析。

1.3.5组织病理学分析

HE染色，光镜下进行组织病理学观察。

1.3.6蛋白含量测定

采用双缩脲蛋白质定量法。双缩脲试剂中的铜离子可与蛋白质中肽键及硌氨酸残基起反应，形成紫色复合物，分光光度计540nm处比色，根据吸光度大小可推算出样品中蛋白质含量。具体步骤按蛋白定量试剂盒说明书进行。

1.3.7脑组织SOD、MDA等生化指标的检测

1.3.7.1总抗氧化能力检测

机体中许多抗氧化物质能使Fe³⁺还原为Fe²⁺，后者与菲啉类物质形成稳固的络合物，通过520nm的吸光度值反映其抗氧化能力的高低。按试剂盒说明书进行操作。活性单位定义：37℃时每毫克组织蛋白使反应体系中吸光度值增加0.01时为一个总抗氧化能力单位(U/mg.prot)。

1.3.7.2SOD的活性测定

通过黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，550nm处有最大吸收峰。而SOD则抑制此反应。根据吸光度大小可推算出样品中SOD活性。具体步骤按SOD试剂盒说明书进行。酶的活性单位定义：每毫克组织蛋白在1毫升反应液中SOD抑制率达50％时所对应的SOD量为一个酶活性单位(U/mg.prot)。

1.3.7.3脑组织MDA含量测定

过氧化脂质降解产物中的MDA可与硫代巴比妥酸缩合，形成红色产物，在532nm处有最大吸收峰，根据吸光度大小可推算出样品中MDA含量。取10％脑组织匀浆0.1mL，具体步骤按MDA试剂盒说明书进行。单位为nmol/mg.prot。

1.3.7.4乙酰胆碱酯酶活性测定

乙酰胆碱酯酶是催化胆碱能神经递质乙酰胆碱水解的酶。产物胆碱和巯基显色剂反应生成黄色化合物。412nm处比色测定，根据颜色深浅反映酶的活性。具体操作按试剂盒说明书进行。以每毫克组织蛋白在37℃保温6min，水解反应体系中1μmol基质为1个酶活性单位(U/h/mg.prot)。

1.3.8免疫组化分析

石蜡切片经二甲苯和梯度乙醇脱蜡处理后，进行胆碱乙酰化转移酶(CholineAcetyltransferase，ChAT)免疫组织化学染色和半定量分析ChAT的蛋白含量。

1.3.9电镜检测

随机从各组中抽取一只小鼠，断头取脑，分离海马组织。2.5％戊二醛中固定。经0.1mol/L PBS漂洗，2％锇酸后固定，酒精丙酮梯度脱水，包埋剂包埋。制作超薄切片，常规铅铀染色，透射电镜下观察拍照。

2.结果

2.1对小鼠行为学的影响

2.1.1对小鼠自发活动的影响

结果显示，与正常组相比，正常Ica MD组和假手术组的小鼠自发活动均无显著性差异。而模型组小鼠自发活动比假手术组小鼠明显减少(P＜0.01)。与模型组相比，Ica LD灌胃对于增加模型小鼠的自发活动无明显影响。Ica MD和Ica HD灌胃能剂量依赖性增加模型小鼠的自发活动(P＜0.05和0.01)。阳性药尼莫地平也可以明显增加模型小鼠的自发活动(P＜0.05)。

2.1.2小鼠被动回避反射实验

2.1.2.1对小鼠被动学习错误次数的影响

结果显示，在跳台实验的第一天，与正常组相比，正常Ica MD组的小鼠被动学习错误次数有所减少，但无显著性差异。模型组小鼠被动学习错误次数比假手术组小鼠增加无显著性差异。与模型组相比，Ica各剂量组和阳性药尼莫地平对小鼠被动学习错误次数也无明显影响。

2.1.2.2对小鼠被动学习上台潜伏期的影响

结果显示，与正常组相比，正常Ica MD组和假手术组的小鼠被动学习上台潜伏期均无显著性差异。模型组小鼠被动学习上台潜伏期比假手术组小鼠明显增多，二者相比有显著性差异(P＜0.05)。与模型组相比，Ica LD、Ica MD和阳性药尼莫地平组上台潜伏期缩短无显著性差异。Ica HD灌胃能明显缩短模型小鼠的上台潜伏期(P＜0.05)。

2.1.2.3对小鼠被动学习受电击时间的影响

结果显示，与正常组相比，正常Ica MD组和假手术组的小鼠被动学习受电击时间均无显著性差异。模型组小鼠被动学习受电击时间比假手术组小鼠明显增多，二者相比有显著性差异(P＜0.05)。与模型组相比，Ica LD、Ica MD受电击时间缩短无显著性差异。而Ica HD和阳性药尼莫地平组能明显缩短模型小鼠的受电击时间(P＜0.05)。

2.1.2.4对小鼠记忆能力错误次数的影响

在跳台实验的第二天，与正常组相比，正常Ica MD和假手术组的小鼠记忆能力错误次数均无显著性差异。而模型组小鼠记忆错误次数比假手术组小鼠明显增加，二者有显著性差异(P＜0.01)。Ica LD组小鼠的记忆错误次数有所降低，但与模型组相比，无显著性差异。Ica MD、Ica HD组和阳性药尼莫地平组均能明显减少小鼠的错误次数(P＜0.01)。

2.1.2.5对小鼠下台潜伏期的影响

结果显示，与正常组比较，正常Ica MD和假手术组的小鼠下台潜伏期均无显著性差异。而模型组小鼠下台潜伏期比假手术组小鼠明显减少，二者有显著性差异(P＜0.01)。IcaLD组小鼠的下台潜伏期有所增加，但与模型组相比，无显著性差异。Ica MD、Ica HD组和阳性药尼莫地平组均能明显增加小鼠的下台潜伏期(P＜0.01)。

2.1.2.6对小鼠台上总停留时间的影响

结果显示，与正常组比较，正常Ica MD和假手术组的小鼠台上总停留时间均无显著性差异。而模型组小鼠台上总停留时间比假手术组小鼠明显减少，二者有显著性差异(P＜0.01)。Ica LD组小鼠的台上总停留时间有所增加，但与模型组相比，无显著性差异。Ica MD、Ica HD组和阳性药尼莫地平组均能明显增加小鼠的台上总停留时间(P＜0.01)。

2.2小鼠空间分辨学习记忆实验

2.2.1对错误次数的影响

结果显示。与正常组比较，正常Ica MD和假手术组小鼠D3，D4，D5的错误次数均无显著性差异。而模型组小鼠D3，D4，D5的错误次数比相应假手术组小鼠明显增加(P＜0.05)。与相应模型组相比，Ica LD组小鼠的错误次数减少不明显。Ica MD、Ica HD组和阳性药尼莫地平组能不同程度的减少小鼠的错误次数。

2.2.2对寻台潜伏期的影响

结果显示，与正常组比较，正常Ica MD和假手术组小鼠D3，D4，D5的寻台潜伏期均无显著性差异。而模型组D3的寻台潜伏期显著上升，与假手术组相比有显著性差异(P＜0.01)。随着训练次数增多，模型组D4、D5的潜伏期仍显著增加(P＜0.05)。与相应模型组相比，Ica LD组对小鼠的寻台潜伏期影响不明显。Ica MD、Ica HD和尼莫地平组能不同程度的缩短小鼠的寻台潜伏期

2.3病理形态学变化

HE染色后，光镜下观察可见假手术组小鼠海马神经元数目多，呈多层，排列整齐紧密。细胞核呈圆形，大而清晰，核仁明显。神经纤维密集，排列整齐。脑缺血再灌模型组海马神经元数目有所减少，脱失现象明显，层次少而不清，排列紊乱。核固缩为三角形或多角形，浓染。神经纤维稀疏，排列紊乱，间隙扩大。药物防治组海马神经元损伤有不同程度的改善。阳性药尼莫地平组(20mg/kg)能明显改善海马神经元的损伤。使神经元细胞形态基本正常，排列较为整齐，核固缩现象有所改善，神经纤维明显增加。低剂量Ica组(10mg/kg)改变不明显。中剂量(30mg/kg)和高剂量(100mg/kg)Ica组能剂量依赖性明显改善细胞形态，海马神经元趋于正常。

2.4对脑缺血再灌小鼠脑组织总抗氧化能力的影响

结果表明，脑缺血再灌后脑组织匀浆总抗氧化能力明显下降，与假手术组比较差异有显著性(P＜0.01)。Ica LD组总抗氧化能力与模型组相比差异无统计学意义。Ica MD、Ica HD和尼莫地平组均能明显升高总抗氧化能力，与模型组比较，差异有显著性(P＜0.01)。

2.5对脑缺血再灌小鼠脑组织SOD酶活性的影响

结果显示，脑缺血再灌模型组小鼠脑组织总SOD活性明显下降，与假手术组相比，两者差异有显著性(P＜0.01)。与模型组比较，尼莫地平组能明显升高SOD活性(P＜0.01)。Ica各组均能明显升高SOD活性，呈一定的量效关系(P＜0.05或0.01)。

2.6对脑缺血再灌小鼠脑组织MDA含量的影响

结果显示，脑缺血再灌可使脑组织中MDA含量比假手术组明显升高(P＜0.01)，说明缺血再灌引起了脂质过氧化损伤。Ica LD组MDA含量虽然有所下降，但与模型组相比差异无统计学意义。Ica MD、Ica HD和阳性药尼莫地平组MDA含量均显著降低，与模型组相比有显著性差异(P＜0.01)。

2.7对脑缺血再灌小鼠脑组织AchE酶活性的影响

结果显示，与假手术组比较小鼠脑缺血再灌后脑组织AchE酶活性明显下降(P＜0.05)。与模型组相比，Ica LD、Ica MD组AchE酶活性无显著变化。Ica HD和阳性药尼莫地平组均能明显阻遏AchE酶活性的降低(P＜0.05)。

2.8对脑缺血再灌小鼠脑组织ChAT表达的影响

小鼠脑组织切片胆碱乙酰化酶免疫组化显示，抗ChAT抗体阳性细胞在皮质和海马内广泛分布，呈卵圆形、三角形或不规则形，胞质和胞膜均着色。与假手术组比较，模型组小鼠皮质和海马区ChAT免疫反应阳性细胞数目减少，并可能降低ChAT表达着色较浅，提示脑缺血再灌可能损伤胆碱能神经元。用生物医学图像分析系统进行ChAT半定量分析发现，与模型组比较，Ica MD、Ica HD组和尼莫地平组ChAT免疫反应阳性细胞着色较深，低剂量组改变不明显

2.9超微结构

通过透射电镜可以观察到：假手术组神经细胞结构正常。核大呈圆形或椭圆形，常染色质分布均匀，核仁明显。核膜清晰、完整。线粒体双层膜完整、线粒体嵴正常。内质网丰富，高尔基体发达。脑缺血再灌模型组可见神经细胞核染色质发生浓缩，染色质聚集于细胞核周边(边集化)。细胞核形状不规则，核膜凹陷。胶质细胞增生、浸润和吞噬神经元。神经元缩小、变形。胞浆和核灶性空泡化。核糖体减少。线粒体肿胀，空泡样变，线粒体嵴断裂。神经细胞周围有变性髓鞘。Ica LD组部分细胞有核染色质边集化、胞浆空泡化、线粒体嵴断裂、与周围组织连接疏松等现象。Ica MD组细胞损伤明显减轻，大多数神经细胞结构正常，有的可见核仁增多、靠边，高尔基体有少许扩张，游离核糖体增多等现象，说明细胞处于修复期。Ica HD组神经细胞基本正常。

(五)淫羊藿苷对氧自由基损伤大鼠脑线粒体保护作用

1.实验方法

1.1大鼠脑线粒体的提取

用蔗糖密度梯度离心法提取大鼠脑线粒体。大鼠断头迅速取全脑(去小脑)，称重后按1∶9(w/v)比例加入预冷的匀浆液(mmol·L^-1：蔗糖250，EDTA 0.5，Tris-HCl 10，pH7.40)置于玻璃匀浆器中冰浴手动匀浆。2000×g离心3min。取上清液，12000×g离心8min。将沉淀仔细悬于Ficoll梯度中，11500×g离心30min。弃上清液，沉淀用匀浆液洗1次，12000×g离心8min，所得沉淀即为线粒体。以上所有操作均在4℃进行。Follin酚法测定线粒体悬液的蛋白含量，调整浓度为线粒体蛋白2g·L^-1。用于测定呼吸链复合体酶的线粒体蛋白悬液分装后-70℃保存，保存时间不超过2周。测定前将线粒体蛋白置于20℃/-20℃反复冻融3次，使之成为线粒体膜片段以达到最大酶活性。用于测定线粒体肿胀度的线粒体蛋白置于冰浴，放置加测定的时间不超过72h，以保持线粒体膜的完整性。其余实验所用线粒体均于-20℃保存。

1.2 Fe²⁺/维生素C(Fe²⁺/VitC)自由基产生体系损伤线粒体模型的建立和分组

用Tris-HCL缓冲液配制不同浓度的FeSO₄和VitC，分别加入新鲜分离的线粒体0.2ml(含线粒体蛋白1mg)，37℃孵育30min，20mM EDTA终止反应。10000×g离心10min，用悬浮介质洗一次。实验分组：正常对照组；损伤组(1mM Fe²⁺/1mM VitC、10mM Fe²⁺/10mMVitC)；淫羊藿苷处理组(0.01mg·L^-1、0.03mg·L^-1、0.1mg·L^-1)。在相同条件下只含线粒体，不含药物和Fe²⁺、VitC的作为对照组。药物组，预先向线粒体悬液中加入不同浓度的淫羊藿苷(淫羊藿苷用少量无水乙醇助溶，体积比小于5％)，三蒸水配制为1g·L^-1原液，100℃水浴加热溶解。依次用三蒸水稀释为1、3、10mg·L^-1的工作液，临用时100倍稀释为所需浓度，5min后再加入Fe²⁺/VitC，37℃反应30min，其余同模型组。

1.3线粒体肿胀程度

所用线粒体为新鲜制备未经冻融的，测定前于4℃放置。含线粒体蛋白0.5mg，加入不同浓度的淫羊藿苷，温孵5min后加入Fe²⁺/VitC，反应终体积1mL。分别于加入Fe²⁺/VitC之后0，2，4，6，8，10，20min用分光光度计测定520nm处的吸光度(A₅₂₀nm)值。以不同时间点A_520nm与0min时A_520nm的差值表示结果。A_520nm值的降低与线粒体肿胀度呈正比。

1.4线粒体呼吸链复合体酶活性测定

按方法1.3处理后离心收集的线粒体蛋白，测定前置于20℃/-20℃反复冻融3次，使之成为线粒体膜片段以进行线粒体呼吸链复合体酶活性测定。测定温度为30℃，反应体积为1mL

1.4.1呼吸链复合体酶I活性测定

5-10μg线粒体蛋白加入反应缓冲体系(mmol·L^-1：pH 7.2磷酸钾缓冲液35，MgCl₂ 5，迭氮钠2)中，加入抗霉素A(2mg·L^-1)、CoQ₁₀(65μmol·L^-1)混匀后，30℃温孵5min。加入NADH(0.13mmol·L^-1)启动反应，1min内连续测定340nm处吸光值的变化。空白管加入鱼藤酮(2mg·L^-1)以抑制复合体酶I的活性。以1min内NADH降低速率表示呼吸链复合体酶I的活性，单位μmol·min^-1·mg^-1。

1.4.2呼吸链复合体酶II活性测定

5-10μg线粒体蛋白加入反应缓冲体系(mmol·L^-1：pH 7.2磷酸钾缓冲液35，MgCl₂ 5，迭氮钠2)中，加入抗霉素A(2mg·L^-1)、CoQ₁₀(65μmol·L^-1)、鱼藤酮(2mg·L^-1)、DCPIP(88mmol·L^-1)混匀后，30℃温孵5min。加入新配的琥珀酸钠(25 mmol·L^-1)启动反应，1min内连续测定600nm处吸光值的变化。通过监测被FADH₂还原的DCPIP的量变化来反应呼吸链复合体酶II的活性。

1.4.3呼吸链复合体酶III活性测定

5-10μg线粒体蛋白加入反应缓冲体系(mmol·L^-1：pH 7.2磷酸钾缓冲液35，MgCl₂ 5，迭氮钠2，EDTA 0.5，氧化型细胞色素C 0.035)中，混匀后，加入新还原的CoQ₁₀(0.1mmol·L^-1)启动反应，1min内连续测定A_550nm值的变化。根据A_550nm处细胞色素C吸光度值的变化来反应呼吸链复合体酶III的活性。

还原型CoQ₁₀的制备：将10μmol的CoQ₁₀完全溶解于2mL四氢呋喃中，加入NaBH₄ 1mg，反复吹打至溶液由黄色变为无色为止。再加入无水乙醚2mL萃取2次，合并萃取液后挥发干乙醚。所得淡黄色粉末溶于1mL四氢呋喃和无水乙醇的混合液(1∶1)中，即得新还原的CoQ₁₀(0.1mmol·L^-1)。临用前现配制。

1.4.4呼吸链复合体酶IV活性测定

40-60μg线粒体蛋白加入反应缓冲体系(8.8mmol·L^-1磷酸钾缓冲液，pH 7.0)加入0.1％还原型细胞色素C(以过量VitC还原至A_550nm/A_565nm＞12)启动反应，1min内连续测定A_550nm值的变化。根据A_550nm处细胞色素C吸光度值的变化来反应呼吸链复合体酶IV的活性。

1.5MDA含量测定

过氧化脂质降解产物中的丙二醛可与硫代巴比妥酸缩合，形成红色产物，在532nm处有最大吸收峰。具体操作按试剂盒说明书进行。单位为nmol/mg prot。

2.实验结果

2.1淫羊藿苷对自由基损伤线粒体肿胀度的影响

结果显示，与空白对照组比较，模型组0.1mM Fe²⁺/0.1mM VitC造成线粒体肿胀作用不明显；而1mM Fe²⁺/1mM VitC、10mM Fe²⁺/10mM VitC均能造成线粒体明显肿胀(P＜0.01)，且10mM Fe²⁺/10mM VitC对线粒体损伤更为严重。

在1mM Fe²⁺/1mM VitC损伤的线粒体中预先加入淫羊藿苷(0.03mg·L^-1、0.1mg·L^-1)能显著抑制线粒体肿胀(P＜0.01或0.05)，而淫羊藿苷(0.01mg·L^-1)组对线粒体肿胀无明显抑制作用。在10mM Fe²⁺/10mM VitC损伤的线粒体中预先加入淫羊藿苷(0.03mg·L^-1、0.1mg·L^-1)能显著抑制线粒体肿胀(P＜0.01或0.05)，而淫羊藿苷(0.01mg·L^-1)组抑制效果不明显。

2.2淫羊藿苷对自由基损伤线粒体呼吸链复合体酶I活性的影响

结果显示，与对照组相比，1mM Fe²⁺/1mM VitC损伤的线粒体模型组呼吸链复合体酶I活性略有升高；随着Fe²⁺/VitC浓度的增高，10mM Fe²⁺/10mM VitC损伤的线粒体模型组呼吸链复合体酶I活性有所上升。但与对照组相比，模型组复合体酶I活性变化均无显著性差异。在1mM Fe²⁺/1mM VitC损伤线粒体中预先加入淫羊藿苷(0.01、0.03mg·L^-1、0.1mg·L^-1)对呼吸链复合体酶I活性无显著性影响。在10mM Fe²⁺/10mM VitC损伤的线粒体中预先加入淫羊藿苷(0.01、0.03mg·L^-1、0.1mg·L^-1)能使升高的呼吸链复合体酶I活性降低(P＜0.05)。

2.3淫羊藿苷对自由基损伤线粒体呼吸链复合体酶II活性的影响

结果显示，1mM Fe²⁺/1mM VitC损伤的线粒体模型组呼吸链复合体酶II活性变化无显著性差异。但是与对照组相比，10mM Fe²⁺/10mM VitC损伤的线粒体模型呼吸链复合体酶II活性显著降低(P＜0.01)。预先加入淫羊藿苷(0.01、0.03mg·L^-1、0.1mg·L^-1)对1mMFe²⁺/1mM VitC损伤线粒体的呼吸链复合体酶II活性无明显影响。在10mM Fe²⁺/10mM VitC损伤线粒体组预先加入淫羊藿苷(0.01mg·L^-1)对酶II活性的降低无明显影响，而预先加入淫羊藿苷(0.03mg·L^-1、0.1mg·L^-1)均能一定程度的阻止呼吸链复合体酶II活性的降低(P＜0.05或0.01)，而且呈一定的剂量效应关系。

2.4淫羊藿苷对自由基损伤线粒体呼吸链复合体酶III活性的影响

结果显示，与对照组比较，1mM Fe²⁺/1mM VitC损伤的线粒体模型呼吸链复合体酶III活性显著降低(P＜0.05)。预先加入淫羊藿苷(0.01mg·L^-1、0.03mg·L^-1、0.1mg·L^-1)对阻止呼吸链复合体酶III活性的降低无显著性影响。随着Fe²⁺/VitC浓度的增高，10mMFe²⁺/10mM VitC损伤的线粒体模型呼吸链复合体酶III活性进一步显著降低(P＜0.01)。而预先加入淫羊藿苷(0.03mg·L^-1、0.1mg·L^-1)均能显著阻止呼吸链复合体酶III活性的降低(P＜0.01)。

2.5淫羊藿苷对自由基损伤线粒体呼吸链复合体酶IV活性的影响

结果显示，与对照组比较，1mM Fe²⁺/1mM VitC损伤的线粒体模型组呼吸链复合体酶IV活性显著降低(P＜0.05)。随着Fe²⁺/VitC浓度的增高，10mM Fe²⁺/10mM VitC损伤的线粒体模型呼吸链复合体酶IV活性进一步显著降低(P＜0.01)。在1mM Fe²⁺/1mM VitC损伤的线粒体中预先加入淫羊藿苷(0.01mg·L^-1、0.03mg·L^-1)对呼吸链复合体酶IV活性的降低无明显影响，而预先加入淫羊藿苷(0.1mg·L^-1)能阻遏呼吸链复合体酶IV活性的降低(P＜0.05)。在10mM Fe²⁺/10mM VitC组线粒体预先加入淫羊藿苷(0.03mg·L^-1、0.1mg·L^-1)均能显著阻止呼吸链复合体酶IV活性的降低(P＜0.05或0.01)，而且呈一定的剂量效应关系。

2.6淫羊藿苷对自由基损伤线粒体MDA含量的影响

结果显示，与对照组比较，Fe²⁺/VitC损伤的线粒体模型组中，随着Fe²⁺/VitC浓度的升高，线粒体的MDA含量显著增加(P＜0.01)。预先加入淫羊藿苷能明显抑制Fe²⁺/VitC引起的线粒体MDA生成。与相应模型组比较，淫羊藿苷(0.01mg·L^-1)组抑制效果均不明显。而淫羊藿苷(0.03mg·L^-1、0.1mg·L^-1)组均能显著抑制MDA生成(P＜0.01)。

以上结果说明淫羊藿苷可保护脑线粒体，防止氧化损伤，这对改善氧应激状态下的能量代谢障碍具有重要意义。提示淫羊藿苷在脑保护方面具有潜在的应用价值。

(六)脑缺血再灌对小鼠脑细胞色素C氧化酶亚基II mRNA的影响及淫羊藿苷的作用

1.实验方法和观察指标

1.1动物模型的制备

小鼠脑缺血再灌模型的建立方法同(五)。

1.2实验分组和处理

随机分组为：正常对照组(不分时间点)，模型组(分别设脑缺血再灌术后1h、3h、24h、72h、14d几个时间点)和淫羊藿苷防治组。防治组按淫羊藿苷(临用时用0.3％羧甲基纤维素钠制成混悬液)100mg/kg的剂量，于术前30min和术后每天早晨空腹灌胃一次，直至进行检测。模型组予以0.3％羧甲基纤维素钠灌胃。

1.3小鼠大脑组织总RNA的提取

在规定的时间点，每组取4只动物，分离脑组织，去除脑干。按华舜生物工程公司的组织细胞总RNA抽提试剂盒说明进行操作。

(1)取小鼠脑组织约50mg，加入裂解液TCL 0.5ml，在冰浴中用玻璃匀浆器将脑组织彻底匀浆。将匀浆液移入1.5mL离心管中，立即用带针头的一次性5mL注射器反复抽打裂解物10次。室温下，12000g离心3min。

(2)将上清液移入另一个1.5mL离心管中，加入250μL 75％乙醇。彻底混匀后全部移入吸附柱中，12000g离心30sec。

(3)倒掉收集管中的液体。在吸附柱中加入500μL RP液。12000g离心30sec。

(4)倒掉收集管中的液体。在吸附柱中加入500μL W3液。室温放置1min，12000g离心15sec。

(5)倒掉收集管中的液体。在吸附柱中再次加入500μL W3液。室温放置1min，12000g离心15sec。

(6)倒掉收集管中的液体。室温下，12000g离心1min，彻底去除多余液体。

(7)将吸附柱放入另一个干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入50μL纯水。室温放置5min，12000g离心1min。

(8)RNA提取物经1％琼脂糖凝胶电泳，以检查鉴定RNA是否被降解。

(9)用紫外分光光度计测定RNA含量和纯度。要求A₂₆₀/A₂₈₀比值在1.8-2.0范围内为合格。并根据A₂₆₀的值估计RNA含量，使每个样品RNA浓度为1mg/ml。所得RNA于-70℃保存备用

1.4逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)测定CO II mRNA表达

1.4.1引物制备

分别参照GenBank基因库中关于小鼠COII和b-actin的mRNA序列设计引物。其中，β-actin引物对为5’CATCTCTTGCTCGAAGTCCA3’和5’ATCATGTTTGAGACCTTCAACA3’。用来扩增300bp的b-actin片段，作为内参照。引物由北京鼎国生物技术发展中心合成。目的基因COII引物对为5’GCCTACCCATTCCAACTTGGTC3’和5’AATTATTGAAGCAGATCAGTTTTCG3’。用来扩增683bp的COII片段。引物由TaKaRa生物工程公司合成。

1.4.2RT-PCR

(1)采用TaKaRa生物工程公司的一步法RT-PCR试剂盒，按照其说明书进行。

(2)RT-PCR条件

第一阶段：50℃×30min(逆转录)，94℃×2min，1个循环。

第二阶段：94℃×30s，56℃×30s，72℃×30s，25个循环。

第三阶段：72℃×7min，4℃保持。

(3)PCR产物-20℃保存。

1.5RT-PCR产物的电泳和半定量分析

经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定。扩增出300bp(β-actin)和683bp(CO II)的两条片段。紫外照射下照相，用BIORAD凝胶成像分析系统分析。以目的片段和内参照的扫描积分光密度值之比反映各目的片段mRNA量的相对高低。

2.实验结果

2.1总RNA的提取与鉴定

紫外分光光度计测量A₂₆₀和A₂₈₀，其A₂₆₀/A₂₈₀值在1.8-2.0范围内。说明RNA纯度较好。经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见清晰的2-3条带。RNA电泳后18S、28S两条带非常清晰而且具有较高的亮度，未见明显的降解条带，证明RNA提取质量较好。

2.2脑缺血再灌损伤对小鼠大脑CO II mRNA表达量的影响

结果显示，经电泳条带经BIORAD凝胶成像分析系统分析，结果发现，在脑缺血再灌后1h、3h时小鼠大脑CO II mRNA的表达量呈降低趋势，并且3h时CO II mRNA的表达量与对照组比较差异有显著性(P＜0.01)。24h时COIImRNA的表达量趋近于正常，与对照组相比无显著性差异。72h时COIImRNA的表达量明显上升，差异有显著性(P＜0.01)。在脑缺血再灌后14d时COIImRNA的表达量又有所降低，(P＜0.05)。

2.3淫羊藿苷对脑缺血再灌小鼠大脑CO II mRNA表达量的影响

结果显示，淫羊藿苷对小鼠脑缺血再灌后3h时CO II mRNA表达量的降低略有所阻遏，但与相应模型组比较无显著性差异。在脑缺血再灌后72h时CO II mRNA表达量显著上升，而灌胃给予淫羊藿苷可以明显阻止COIImRNA表达量的升高，与相应模型组比较有显著性差异。在脑缺血再灌后14d时CO II mRNA表达量又有所降低，而灌胃给予淫羊藿苷可阻止CO II mRNA表达量的降低。

(七)淫羊藿苷对铝盐诱导痴呆模型大鼠的影响

1.实验方法

取72只合格大鼠随机分为对照组(n＝24)和模型组(n＝48)，模型组饮用1.6g·L^-1 AlCl₃溶液诱导大鼠的痴呆模型，Morris水迷宫检测大鼠的空间辨别学习记忆能力，饮铝5个月学习记忆下降后，再将其分为模型对照组、ICA低(30mg·kg^-1·d^-1)、中(60mg·kg^-1·d^-1)、高(120mg·kg^-1·d^-1)剂量治疗组，每组12只。24只对照组大鼠分为正常给药组(ICA 60mg·kg^-1·d^-1)和正常对照组。ICA灌胃3月后免疫组化法检测海马内AChE、ChAT表达及Aβ_1-40含量，并通过图象处理软件半定量分析；光化学法检测大鼠大脑皮层及海马组织中AChE活性、SOD活性、MDA含量和Na⁺K⁺-ATPase、Ca²⁺-ATPase活性。另选12只合格大鼠随机分为正常对照组(n＝6)和模型对照组(n＝6)，模型对照组处理办法同前，3月后用石墨炉原子吸收光谱法检测大鼠脑内铝含量。

2.结果

结果显示模型组大鼠饮用1.6g·L^-1 AlCl₃溶液5个月后出现明显的空间辨别学习记忆障碍。ICA连续灌胃给药3个月后，与模型对照组比较，ICA ICA 60mg·kg^-1及120mg·kg^-1可以缩短大鼠在定向航行实验中逃避潜伏期及搜索距离，增加空间探索实验中大鼠在原安全岛所在象限的搜索时间及原安全岛所在象限游泳距离占总距离百分比(P＜0.05；P＜0.01)；免疫组化结果显示，ICA明显降低海马内AChE表达减少AChE活性，抑制ChAT表达下降(P＜0.01)；升高SOD活性、降低MDA含量(P＜0.05，P＜0.01)；脑组织匀浆测定显示，ICA 120mg·kg^-1明显增加Na⁺K⁺-ATPase、Ca²⁺-ATPase活性；降低Aβ_1-40含量(P＜0.01)。饮用AlCl₃溶液3个月的模型对照组大鼠学习记忆下降(P＜0.05)，同时脑铝含量较正常对照组明显增加(P＜0.01)。结论：ICA对铝盐诱导的痴呆模型大鼠学习记忆有保护作用，其机制可能与以下因素有关：1.增加大鼠脑内Ach含量；2.清除氧自由基，抑制铝负荷引起的氧化应激反应；3.稳定细胞膜，保护神经细胞；4.减少Aβ生成。

综上所述，通过对上述老年痴呆模型作用及其机理研究，结果表明，淫羊藿苷可明显改善上述三种痴呆大鼠模型的学习记忆成绩；同时可提高小鼠的自发活动，改善被动学习记忆成绩和空间学习记忆成绩；提高损伤的原代培养神经细胞的存活率，减少神经细胞LDH释放，降低缺氧(糖)/复氧(糖)损伤的神经细胞调亡率，抑制细胞内游离钙离子浓度的升高，对缺氧(糖)/复氧(糖)损伤的神经细胞保护作用；减轻线粒体肿胀，减少MDA含量，提高呼吸链复合体酶II-IV的活性。淫羊藿苷对铝盐诱导的痴呆模型大鼠学习记忆有保护作用，其机制可能与以下因素有关：1.增加大鼠脑内ACh含量；2.清除氧自由基，抑制铝负荷引起的氧化应激反应；3.稳定细胞膜，保护神经细胞；4.减少Aβ的生成、减轻病理性损伤程度。

此外，申请人还进行了毒性试验和与专利申请200510094412.7的对比实验，具体如下：

(一)急性毒性实验：

采用改进寇氏法测定，7.0g/Kg淫羊藿苷(药物最大溶解度，动物最大胃容量)灌胃给药7天未引起小鼠死亡，不能测定半数致死量。按最大给药量实验说明该药毒性小。

(二)与专利申请200510094412.7的对比：

淫羊藿总黄酮(epimedium total flavonoids)、淫羊藿苷对Aβ_25-35海马内注射所致AD大鼠行为学的影响

1.材料和方法

1.1实验动物：清洁级(II级)雄性KM小鼠，28-33克，由重庆医科大学实验动物中心提供。合格证书号SCXK(渝)20020001。饲养和实验过程中遵守实验动物管理与保护的有关准则。

主要试剂与药品：淫羊藿苷  由贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室提供，HPLC(高效液相色谱分析)纯度大于98％。

1.2实验动物分组及处理行Morris水迷宫训练，淘汰掉学习成绩太好和太差者，训练至成绩稳定后将剩余的36只大鼠随机分为6个组，分别为假手术组，模型组，淫羊藿总黄酮低、高剂量治疗组，淫羊藿苷低、高剂量治疗组，每组6只。

1.3动物模型的制备同实验一

1.4药物干预  待动物清醒后治疗组即开始灌胃给药。治疗组每日定时(早上8时)灌胃给药一次，淫羊藿总黄酮低、高剂量治疗组分别给予淫羊藿总黄酮30mg.kg^-1.d^-1、60mg.kg^-1.d^-1；淫羊藿苷低、高剂量组分别给予淫羊藿苷30mg.kg^-1.d^-1、60mg.kg^-1.d^-1；连续14天。

1.5Morris水迷宫训练同前。

1.6数据的统计分析

实验数据用SPSS统计软件统计。所有数据以均数±标准差

表示。组间比较采用单因素方差分析进行统计学处理。P＜0.05认为有差异，P＜0.01认为有显著性差异。

2.实验结果

水迷宫实验表明，Aβ_25-35海马内注射14天后，AD模型组与假手术组比较，前者在定位航行实验中大鼠的逃避潜伏期及搜索距离明显延长(表15、16)，空间探索实验中在原安全岛所在象限的搜索时间明显减少(表17)，原安全岛所在象限的游泳距离占总距离的百分比降低(表18)，提示AD模型组大鼠的空间学习记忆功能出现障碍。

淫羊藿苷灌胃14天后，各治疗组与AD模型组相比较，前者在定位航行中均可缩短大鼠的逃避潜伏期及搜索距离(表15、16)，在空间探索实验中原安全岛所在象限的搜索时间明显延长(表17)，原安全岛所在象限的游泳距离占总距离的百分比明显增大(表18)。淫羊藿苷对AD模型大鼠行为学的改善较淫羊藿总黄酮更明显。

表15淫羊藿苷灌胃后大鼠定位航行实验成绩(逃避潜伏期)

Group	n	Day1(sec)	Day2(sec)	Day3(sec)	Day4(sec)
						Sham	6	13.50±6.14	9.98±5.85	5.00±1.44	8.17±4.30
Model	6	44.88±30.75#	35.16±30.66#	16.69±6.99#	16.88±9.90#
						淫羊藿苷(低)	6	33.74±23.72	17.83±12.20	10.93±4.12*	8.5±1.18*
淫羊藿苷(高)	6	28.06±16.03	8.81±2.78*	7.35±4.27*	7.60±4.03*
						淫羊藿总黄酮(低)	6	40.71±19.84	25.56±4.42	13.19±2.10*	12.68±3.46*
淫羊藿总黄酮(高)	6	36.32±10.34*	20.65±8.32	11.13±3.12*	9.65±2.65*

^#P＜0.05 vs sham，*P＜0.05 vs model。

表16淫羊藿苷灌胃后大鼠定位航行实验成绩(搜索距离)

Group	n	Day1(cm)	Day2(cm)	Day3(cm)	Day4(cm)
						Sham	6	957.23±231.92	657.55±286.37	445.81±141.72	502.28±316.63
Model	6	3146.33±1985.82#	2186.79±1809.45#	1088.01±526.26#	1325.99±924.81#
						淫羊藿苷(低)	6	2024.27±1468.39	1256.93±898.54	898.45±469.32	538.23±101.78*
淫羊藿苷(高)	6	1586.25±983.53*	654.12±128.63*	534.29±286.14*	527.46±361.98*
						淫羊藿总黄酮(低)	6	2128.06±1725.53	1527.33±474.73	1003.45±260.71*	729.14±289.22*
淫羊藿总黄酮(高)	6	2057.27±1835.93	1015.27±927.54*	752.31±436.92*	659.23±74.24*

^#P＜0.05 vs sham，*P＜0.05 vs model。

表17淫羊藿苷灌胃后大鼠空间探索成绩(搜索时间)

Group	n	Explore time (sec)
			Sham	6	32.64±2.36
Model	6	20.39±8.74#
			淫羊藿苷(低)	6	27.32±4.83*
淫羊霍苷(高)	6	30.75±8.81*
			淫羊藿总黄酮(低)	6	22.54±9.04
淫羊霍总黄酮(高)	6	26.32±3.48*

^#P＜0.05 vs sham，*P＜0.05 vs model。

表18淫羊藿苷灌胃后大鼠的空间探索成绩(原平台象限游泳距离占总距离百分比)

Group	n	the di stance of D area/total area(％)
			Sham	6	0.29±0.05
Model	6	0.23±0.02
			淫羊藿苷(低)	6	0.23±0.04
淫羊霍苷(高)	6	0.29±0.04*
			淫羊藿总黄酮(低)	6	0.23±0.04
淫羊霍总黄酮(高)	6	0.26±0.03

*P＜0.05 vs model。

与现有技术相比，本发明为淫羊藿苷的单方制剂，其原料及制备工艺简单，成本低廉，疗效显著，服用量小，无毒副作用，为老年痴呆症的治疗提供了一种疗效可靠的药物。

具体实施方式：

本发明的实施例1：淫羊藿苷的提取：干燥淫羊藿全株经粉粹后，过60～80目筛，用75％工业乙醇回流提取3次，每次2小时，过滤，合并提取液，回收溶液至无醇味；加入适量水，用等体积氯仿萃取3次，母液再用等体积正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液并回收得到浸膏；浸膏经硅胶柱层析，以氯仿-甲醇＝5∶1为洗脱剂进行分离，再经重结晶，即得单体化合物淫羊藿苷。

本发明的实施例2：取淫羊藿苷200毫克、硬脂酸镁0.25毫克、羧甲基淀粉钠8毫克、微晶纤维素80毫克，将淫羊藿苷与羧甲基淀粉钠、微晶纤维素混合，过筛，使其混匀，加入适量水或乙醇制粒，干燥后，整粒，加入硬脂酸镁，然后用冲压装置将颗粒压制成片，即得治疗老年痴呆的片剂。

本发明的实施例3：取淫羊藿苷200毫克、硬脂酸镁0.20毫克、羧甲基淀粉钠8毫克、淀粉80毫克，将淫羊藿苷与羧甲基淀粉钠、淀粉混合均匀，加入适量乙醇制粒，干燥，整粒，加入硬脂酸镁，然后装入明胶胶囊中，即得治疗老年痴呆的胶囊剂。

本发明的实施例4：取淫羊藿苷5克、糊精或蔗糖5克、矫味剂和甜味剂适量，将淫羊藿苷与蔗糖/糊精、矫味剂和甜味剂混合均匀，加入适量水或乙醇制成软材，过筛制粒，干燥，整粒，分装，即得治疗老年痴呆的颗粒剂。

本发明的实施例5：取淫羊藿苷200毫克、聚乙醇或豆油250毫克、助悬剂6毫克、乳化剂6毫克和明胶80毫克、甘油20毫克、纯化水80毫克及防腐剂适量，将明胶置于溶胶罐中，加入纯化水，70℃下加热使溶解，加入甘油和防腐剂，搅拌均匀，真空除去气泡后保温静置，按比例将淫羊藿苷与聚乙醇/豆油、乳化剂、助悬剂混合均匀，再和制备好的明胶置旋转压囊机，压制成软胶囊，定型，干燥，即得治疗老年痴呆的软胶囊。

本发明的实施例6：取淫羊藿苷5毫克、基质(聚乙二醇4000)30毫克、甲基硅油适量，将淫羊藿苷加水制成均匀糊状，再加入溶融的基质液，加热熔融成澄清液体，倒入已预热的滴丸器中，控制滴制温度和速度，滴入甲基硅油冷凝液中，成丸后吸干冷凝液，收集滴丸，置干燥器内，即得治疗老年痴呆的滴丸。

本发明的实施例7：取淫羊藿苷10克、羧甲基纤维素纳1.5克、糖精钠0.1克、矫味剂适量、防腐剂适量和纯化水100毫升，将羧甲基纤维素纳分散在热水中，冷却，然后与含有淫羊藿苷、糖精钠、矫味剂和防腐剂的含水混悬液混合，将溶液调配成所需体积并混合均匀，灭菌后分装，即得治疗老年痴呆的糖浆剂。

本发明的实施例8：取淫羊藿苷25毫克、注射用0.9％氯化钠溶液8毫升，将淫羊藿苷溶解于注射用0.9％氯化钠溶液中，并将溶液调至所需体积，调PH值，灌装后在高温下加热灭菌，即得治疗老年痴呆的注射剂。

本发明的实施例9：取淫羊藿苷200毫克、可压蔗糖60毫克、硬脂酸镁0.2毫克，将淫羊藿苷过筛后与可压蔗糖、硬脂酸镁混合均匀，并用冲压装置压片，即得治疗老年痴呆的舌下含片。通过改变淫羊藿苷与辅料的比例可压制成不同重量或不同强度的含片。

Claims (8)

1.淫羊藿苷在制备治疗老年痴呆的药物中的应用。

2.按照权利要求1所述淫羊藿苷的应用，其特征在于：所述的淫羊藿苷是从小檗科淫羊藿属植物中提取的黄酮醇苷类化合物。

3.按照权利要求1或2所述淫羊藿苷的应用，其特征在于：所述淫羊藿苷的提取方法为：干燥淫羊藿全株经粉粹、过筛后，用75％工业乙醇回流提取，回收溶剂，用氯仿萃取，母液再用正丁醇萃取，回收溶剂得浸膏，浸膏经硅胶柱层析，再经重结晶，即得单体化合物淫羊藿苷。

4.按照权利要求3所述淫羊藿苷的应用，其特征在于：所述淫羊藿苷的提取方法为：干燥淫羊藿全株经粉粹后，过60～80目筛，用75％工业乙醇回流提取3次，每次2小时，过滤，合并提取液，回收溶液至无醇味；加入适量水，用等体积氯仿萃取3次，母液再用等体积正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液并回收得到浸膏；浸膏经硅胶柱层析，以氯仿-甲醇＝5∶1为洗脱剂进行分离，再经重结晶，即得单体化合物淫羊藿苷。

5.一种治疗老年痴呆的药物制剂，其特征在于：它是以淫羊藿苷为原料，加入适量辅料制成的。

6.按照权利要求5所述治疗老年痴呆的药物制剂，其特征在于：所述的药物制剂为口服制剂、注射制剂或舌下含服制剂。

7.按照权利要求6所述治疗老年痴呆的药物制剂，其特征在于：所述的药物制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂、软胶囊、滴丸剂、糖浆剂、注射剂或舌下含片。

8.按照权利要求5、6或7所述治疗老年痴呆的药物制剂，其特征在于：片剂的制备方法为：取淫羊藿苷10～400毫克、硬脂酸镁0.1～0.40毫克、羧甲基淀粉钠4～12毫克、微晶纤维素50～100毫克，将淫羊藿苷与羧甲基淀粉钠、微晶纤维素混合，过筛，使其混匀，加入适量水或乙醇制粒，干燥后，整粒，加入硬脂酸镁，然后用冲压装置将颗粒压制成片，即得；胶囊剂的制备方法为：取淫羊藿苷50～400毫克、硬脂酸镁0.1～0.30毫克、羧甲基淀粉钠4～12毫克、淀粉50～100毫克，将淫羊藿苷与羧甲基淀粉钠、淀粉混合均匀，加入适量乙醇制粒，干燥，整粒，加入硬脂酸镁，然后装入明胶胶囊中，即得；颗粒剂的制备方法为：取淫羊藿苷1～10克、糊精或蔗糖1～10克、矫味剂和甜味剂适量，将淫羊藿苷与蔗糖/糊精、矫味剂和甜味剂混合均匀，加入适量水或乙醇制成软材，过筛制粒，干燥，整粒，分装，即得；软胶囊的制备方法为：取淫羊藿苷10～400毫克、聚乙醇或豆油100～400毫克、助悬剂3～10毫克、乳化剂3～10毫克和明胶50～100毫克、甘油10～30毫克、纯化水50～100毫克及防腐剂适量，将明胶置于溶胶罐中，加入纯化水，70℃下加热使溶解，加入甘油和防腐剂，搅拌均匀，真空除去气泡后保温静置，按比例将淫羊藿苷与聚乙醇/豆油、乳化剂、助悬剂混合均匀，再和制备好的明胶置旋转压囊机，压制成软胶囊，定型，干燥，即得；滴丸的制备方法为：取淫羊藿苷1～10毫克、基质20～40毫克、甲基硅油适量，将淫羊藿苷加水制成均匀糊状，再加入溶融的基质液，加热熔融成澄清液体，倒入已预热的滴丸器中，控制滴制温度和速度，滴入甲基硅油冷凝液中，成丸后吸干冷凝液，收集滴丸，置干燥器内，即得；糖浆剂的制备方法为：取淫羊藿苷1～20克、羧甲基纤维素纳1.5克、糖精钠0.1克、矫味剂适量、防腐剂适量和纯化水100毫升，将羧甲基纤维素纳分散在热水中，冷却，然后与含有淫羊藿苷、糖精钠、矫味剂和防腐剂的含水混悬液混合，将溶液调配成所需体积并混合均匀，灭菌后分装，即得；注射剂的制备方法为：取淫羊藿苷1～50毫克、注射用0.9％氯化钠溶液5～10毫升，将淫羊藿苷溶解于注射用0.9％氯化钠溶液中，并将溶液调至所需体积，调PH值，灌装后在高温下加热灭菌，即得；舌下含片的制备方法为：取淫羊藿苷10～400毫克、可压蔗糖40～80毫克、硬脂酸镁0.1～0.3毫克，将淫羊藿苷过筛后与可压蔗糖、硬脂酸镁混合均匀，并用冲压装置压片，即得。