CN109394932A - 棕榈果不同状态多酚提取物的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了棕榈果不同状态多酚提取物的制备方法,属于食品或天然药物技术领域,其先用超高压对棕榈果进行预处理,然后在超声辅助下进行提取,最后经萃取、旋蒸和干燥后得到棕榈果不同状态多酚提取物;与传统提取方法相比,其总酚含量测定结果表明,超高压处理能够极显著提高棕榈果不同状态多酚提取物中酚类物质的提取率和生物可获得率。同时,经实验证实,超高压处理后的棕榈果三种不同状态多酚提取物的生物活性均显著提高,其对胰脂肪酶活性的抑制率、α‑糖苷酶活性的抑制率以及对细胞氧化损伤的保护能力均显著增强。本发明的棕榈果多酚提取物具有更好的降脂减肥、降血糖和防治机体氧化损伤的作用,可用于制备相关的保健食品或药品。
Description
技术领域
本发明涉及一种棕榈果不同状态多酚提取物的制备方法及其在降脂减肥、降血糖和防治人体组织氧化损伤等相关疾病方面的食品或药品中的应用,属于食品或天然药物技术领域。
背景技术
在现代社会,随着物质条件富裕和生活节奏的加快,不健康的高脂高碳水化合物饮食和不良生活习惯诱发了多种慢性疾病的发生,例如肥胖、高血脂和糖尿病等,严重威胁了人们的身体健康,降低了人们的生活水平。在日常饮食中,食物中的脂肪和碳水化合物需要经过胃肠道中相应的消化酶的水解后才能够被身体吸收,研究表明食物中的脂肪约有70%是由胰脂肪酶进行水解消化,而食物中的淀粉则主要由α-糖苷酶进行水解。因此,通过抑制胰脂肪酶和α-糖苷酶的活性,可以延缓脂肪和葡萄糖的吸收,从而可以有效缓解肥胖、高血脂和高血糖等健康问题。所以,积极寻找和开发新的药物和保健食品以控制高糖高脂饮食带来的不健康影响的意义重大。
目前,临床上使用的胰脂肪酶抑制剂主要为奥利司他,而阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇则是已被批准用于临床糖尿病治疗的α-糖苷酶抑制剂。这些抑制剂虽然具有良好的作用效果,但是作为化学药剂通常伴随着一定的副作用。而且,更重要的是这些抑制剂具有非常高的专一性,因此,往往只能单一地针对胰脂肪酶或者α-糖苷酶,并不能同时有效地抑制胰脂肪酶和α-糖苷酶的活性,从而导致患者需同时服用两种不同的酶抑制剂,增加了用药成本和用药麻烦,甚至可能会引起药物的相互作用而加重药物的副作用。目前全世界都在积极寻找新型的复合型消化酶抑制剂以便能够同时抑制胰脂肪酶和α-糖苷酶的活性,从而应对高糖高脂饮食所带来的日益严峻的肥胖、高血脂及糖尿病等相关疾病问题。因此,新型复合型胰脂肪酶和α-糖苷酶抑制剂的探寻至关重要。
另外,在正常人体生理活动过程中会不可避免地产生活性氧自由基,在正常情况下,这些自由基会被身体的抗氧化系统及时清除,从而可以避免自由基对人体组织的氧化损伤。但是,由于环境污染以及现代社会其他压力的不断加重,导致人体氧化应激水平不断升高,从而体内会产生过多的自由基,这些自由基已经超出人体自身抗氧化系统的清除能力。当这些自由基未能及时清除,就会攻击体内细胞组织,从而使组织器官受到破坏,合成代谢发生紊乱及障碍,身体机能衰老加快,增加多种慢性疾病(例如糖尿病、心血管疾病)的发病率并加重病情。因此,及时清除体内过多的自由基对维持机体健康至关重要。
多酚是一类广泛存在于植物体内的天然化合物,植物中的多酚一般以游离状态、酯化状态和结合状态等三种方式存在,由于植物中大量纤维素和细胞壁的存在大大限制了这些不同状态多酚的提取率和生物可获得率。因此,如何提高植物中这些不同状态多酚的提取率和生物可获得率是该领域一个亟需要克服的问题。
棕榈果是一种大型热带油料作物,属被子植物门单子叶植物纲棕榈属,果实呈橙红色,中有硬核,主要产地有马来西亚、印度尼西亚等,我国海南省和云南省也有大量分布。棕榈果的主要用途是用作榨油,出油率高,全球约1/4的食用油都是由它供给。另外,棕榈果也富含胡萝卜素、维生素A、维生素E和多酚类物质等营养成分,长期食用可有效抵抗人体氧化衰老,降低心血管疾病的发生。本发明将提供一种能够显著提高棕榈果中不同状态多酚提取物得率和生物可获得率的制备方法,获得的不同状态多酚提取物具有更好的降脂减肥、降血糖和防治机体氧化损伤的作用,可用于制备相关的保健食品或药品。
发明内容
本发明的目的是提供一种棕榈果不同状态多酚提取物的制备方法;该方法先用超高压对棕榈果进行预处理,然后在超声辅助下进行提取,最后经萃取、旋蒸和干燥后得到棕榈果不同状态多酚提取物;该方法在于利用超高压处理技术提高棕榈果不同状态多酚提取物的得率和生物可利用率。
上述方法的具体步骤如下:
(1)将棕榈果切碎去核后装入真空袋中,真空密封后,放入超高压处理釜,在300-600MPa处理5-10min;取出处理好的果肉,冷冻干燥后打成粉末;
(2)将步骤(1)粉末脱脂后,按料液比g:mL 为1:4-6的比例,在脱脂后的棕榈果粉中加入甲醇-丙酮混合液,混匀后超声提取20-40min,超声波功率为200-300W,过滤,将滤渣再重复提2-3次,收集合并滤液旋蒸去除有机试剂,收集水相用于游离和酯化态多酚的提取;游离态多酚的提取是先用6mol/L盐酸将水相pH调节为2-3,然后用乙醚-乙酸乙酯混合液萃取水相,直至萃取液为无色为止,合并萃取液并旋蒸冻干,得到游离态多酚提取物;酯化态多酚提取是在室温下,按水相与氢氧化钠溶液体积比为1:1-1:2的比例,在水相中加入4-6mol/L NaOH溶液,水解4-8 h,随后用6mol/L盐酸调节pH为2-3,然后用乙醚-乙酸乙酯混合液萃取,直至萃取液为无色为止,合并萃取液旋蒸冻干,得到酯化态多酚提取物;按滤渣与氢氧化钠溶液体积比为1:1-3的比例,在超声过滤后的滤渣中加入4-6 mol/LNaOH溶液水解4-8 h,随后用6mol/L盐酸调节pH为2-3,然后用乙醚-乙酸乙酯混合液萃取,直至萃取液为无色为止,合并萃取液旋蒸冻干,得到结合态多酚提取物。
所述甲醇-丙酮混合液是质量浓度70-80%甲醇溶液和质量浓度70-80%丙酮溶液按体积比1:1-1:3的比例混合制得。
所述乙醚-乙酸乙酯混合液是乙醚和乙酸乙酯按体积比1:1-1:3的比例混合制得。
本发明另一目的是将上述方法制得游离态多酚提取物、酯化态多酚提取物、结合态多酚提取物应用在作为胰脂肪酶抑制剂、作为α-糖苷酶抑制剂、制备防治人体组织氧化损伤的药物或保健食品中。
本发明致力于超高压处理对棕榈果不同状态多酚提取物的提取率、生物可获得率以及生物活性的影响等方面研究。经实验证实超高压处理后,棕榈果的游离、酯化和结合态多酚的提取率和生物可获得率显著提高,并且其对胰脂肪酶活性的抑制率、α-糖苷酶活性的抑制率以及对细胞氧化损伤的保护能力均显著增强。因此可以用于制备和开发为降脂减肥、降血糖和保护细胞免于氧化损伤的新药或保健食品。利用该方法所得到的棕榈果不同状态多酚提取物的得率和生物可获得率以及生物活性均明显增高,提取和制备工艺流程简单、市场前景可观、蕴含着广阔的市场前景。
与现有技术相比,本发明具有如下优点:
1、与传统方法相比,本发明的棕榈果不同状态多酚制备方法可以非常显著地提高其游离、酯化和结合态多酚的提取率和生物可获得率;
2、与传统方法相比,经本发明方法提取的棕榈果各状态多酚提取物具有更好的生物活性,其对胰脂肪酶、α-糖苷酶的抑制率以及对细胞氧化损伤的保护能力均显著增强;
3、本发明所采用的超高压前处理方法具有安全性高、无化学排放、环境友好等优点。
附图说明
图1是超高压处理前后棕榈果不同提取物中酚类物质的含量;
图2是超高压处理前后棕榈果不同提取物对胰脂肪酶的抑制活性,F:游离多酚组分,E:酯化多酚组分,IB:结合多酚组分;
图3是超高压处理前后棕榈果不同提取物对α-糖苷酶的抑制活性;
图4是超高压处理前后棕榈果不同提取物对H2O2诱导的HepG2细胞凋亡的影响-流式图;
图5是超高压处理前后棕榈果不同提取物对H2O2诱导的HepG2细胞凋亡的影响-柱状图;
图6是超高压处理前后棕榈果不同提取物对H2O2诱导的HepG2细胞内ROS的影响-流式图;
图7是超高压处理前后棕榈果不同提取物对H2O2诱导的HepG2细胞内ROS的影响-柱状图。
具体实施方式
下面结合具体实施实例对本发明作进一步说明,这些实验的事例仅用于说明本发明,不用于限制本发明的应用范围。在阅读了本发明的记载以后,本领域的科技人员对其等效的各种改动、修改和修饰,都属于本发明权利要求所限定的范围。
实施例1:本棕榈果不同状态多酚提取物的制备方法如下:
(1)将棕榈果切碎去核后装入真空袋中,真空密封后,放入超高压处理釜,在500MPa处理10min;取出处理好的果肉,冷冻干燥后打成粉末;
(2)将步骤(1)粉末脱脂后,按料液比g:mL 为1:5的比例,在脱脂后的棕榈果粉中加入甲醇-丙酮混合液(质量浓度70%甲醇溶液和质量浓度70%丙酮溶液按体积比1:1的比例混合制得),混匀后超声提取30min,超声波功率为200W,过滤,将滤渣再重复提2次,收集合并滤液旋蒸去除有机试剂,收集水相用于游离和酯化态多酚的提取;游离态多酚的提取是先用6mol/L盐酸将水相pH调节为2,然后用乙醚-乙酸乙酯混合液萃取水相,直至萃取液为无色为止,合并萃取液并旋蒸冻干,得到游离态多酚提取物;酯化态多酚提取是在室温下,按水相与氢氧化钠溶液体积比为1:1的比例,在水相中加入4mol/L NaOH溶液,水解8 h,随后用6mol/L盐酸调节pH为2,然后用乙醚-乙酸乙酯混合液萃取,直至萃取液为无色为止,合并萃取液旋蒸冻干,得到酯化态多酚提取物;按滤渣与氢氧化钠溶液体积比为1:1的比例,在超声过滤后的滤渣中加入4mol/LNaOH溶液水解5h,随后用6mol/L盐酸调节pH为2,然后用乙醚-乙酸乙酯混合液萃取,直至萃取液为无色为止,合并萃取液旋蒸冻干,得到结合态多酚提取物。
实施例2:本棕榈果不同状态多酚提取物的制备方法如下:
(1)将棕榈果切碎去核后装入真空袋中,真空密封后,放入超高压处理釜,在300MPa处理10min;取出处理好的果肉,冷冻干燥后打成粉末;
(2)将步骤(1)粉末脱脂后,按料液比g:mL 为1:4的比例,在脱脂后的棕榈果粉中加入甲醇-丙酮混合液(质量浓度80%甲醇溶液和质量浓度80%丙酮溶液按体积比1:2的比例混合制得),混匀后超声提取25min,超声波功率为300W,过滤,将滤渣再重复提3次,收集合并滤液旋蒸去除有机试剂,收集水相用于游离和酯化态多酚的提取;游离态多酚的提取是先用6mol/L盐酸将水相pH调节为3,然后用乙醚-乙酸乙酯混合液萃取水相,直至萃取液为无色为止,合并萃取液并旋蒸冻干,得到游离态多酚提取物;酯化态多酚提取是在室温下,按水相与氢氧化钠溶液体积比为1:2的比例,在水相中加入6mol/L NaOH溶液,水解4 h,随后用6mol/L盐酸调节pH为3,然后用乙醚-乙酸乙酯混合液萃取,直至萃取液为无色为止,合并萃取液旋蒸冻干,得到酯化态多酚提取物;按滤渣与氢氧化钠溶液体积比为1:2的比例,在超声过滤后的滤渣中加入5mol/LNaOH溶液水解4h,随后用6mol/L盐酸调节pH为3,然后用乙醚-乙酸乙酯混合液萃取,直至萃取液为无色为止,合并萃取液旋蒸冻干,得到结合态多酚提取物。
实施例3:超高压前后棕榈果不同提取物总酚含量的测定
采用福林酚法进行测定,具体操作如下:各提取物用甲醇溶解,稀释成1.0mg/mL;提取物溶液、福林酚试剂各取1mL混匀;静置1分钟后加入1.5mL Na2CO3;用蒸馏水定容至10mL。70℃水浴10分钟,冷却至室温后,于765nm处测定吸光值,总酚的含量通过没食子酸标曲计算得到;结果如图1所示,未超高压处理获得的各提取物的总酚含量分别为(mg没食子酸/g棕榈果):游离态多酚81.20±6.07 mg/g,酯化态多酚163.06±3.06 mg/g,结合态多酚220.49±14.43 mg/g,而经过超高压技术预处理后的棕榈果不同状态多酚提取物的总酚含量均显著提高,分别为:游离态多酚133.49±12.60 mg/g,酯化态多酚267.90±23.00 mg/g,结合态多酚461.38±19.84 mg/g。从总酚结果可以看出,超高压处理提高了棕榈果不同状态多酚的提取率和生物可获得率,其中结合态多酚的提取率提高了一倍多。
实施例4:超高压前后棕榈果不同提取物对胰脂肪酶活性的抑制
猪胰脂肪酶用蒸馏水配成15mg/mL,10000 rpm离心5分钟后,取上清液;在5mmol/L的乙酸钠缓冲溶液中加入1%的曲拉X-100和1%的对硝基苯月桂酸酯配成反应底物;棕榈果各提取物用DMSO溶解,用Tris缓冲溶液稀释成适当浓度(见图2);样品组加入100μL提取物溶液、400μL Tris缓冲溶液、350μL底物反应液和150μL酶液;空白对照组则加入100μL的样品溶剂;各组混匀后于37℃孵育2小时,孵育结束,10000 rpm离心5分钟后取上清液,于400nm处测定各组吸光值。胰脂肪酶抑制率(%)=(ODcontrol-ODsample)/ODcontrol×100,其中ODsample为样品组的吸光值,ODcontrol为空白对照组的吸光值;结果如图2所示,常压下棕榈果三种状态的多酚对胰脂肪酶的抑制活性IC50值(μg/mL)分别为:游离态多酚141.51±0.93 μg/mL,酯化态多酚117.06±1.90 μg/mL,结合态多酚74.77±1.02 μg/mL,超高压处理后的棕榈果三种状态的多酚对胰脂肪酶的抑制活性IC50值(μg/mL)分别为:游离态多酚118.95±9.5μg/mL,酯化态多酚89.16±2.04μg/mL,结合态多酚61.68±1.36μg/mL;从IC50值可以看出超高压处理后的各状态多酚提取物抑制胰脂肪酶的能力均得到显著地提高。
实施例5:超高压前后棕榈果不同多酚提取物对α-糖苷酶活性抑制的测定
用pH=6.8的PBS缓冲溶液把α-对硝基苯葡萄糖苷配成2.5mmoL/L反应底物,α-糖苷酶配成1Unit/mL的酶液,棕榈果不同多酚提取物用甲醇稀释成适当浓度(见图3),样品组加入50μL提取物溶液或阿卡波糖(阳性对照)和100μL酶溶液,25℃孵育10 min,空白对照组则加入50μL的纯水;孵育结束后加入50μL底物反应液再孵育5min。反应结束后,于405nm处测定各组吸光值。α-糖苷酶抑制率(%)=(ODcontrol-ODsample)/ODcontrol×100,其中ODsample为样品组的吸光值,ODcontrol为空白对照组的吸光值;结果如图3所示,常压下棕榈果三种状态的α-糖苷酶的抑制活性IC50值(μg/mL)分别为:游离态多酚128.64±0.97 μg/mL,酯化态多酚90.72±1.45 μg/mL和结合态多酚74.25±0.98 μg/mL,超高压处理后的棕榈果三种状态的多酚对α-糖苷酶的抑制活性IC50值(μg/mL)分别为:游离态多酚113.89±0.84μg/mL,酯化态多酚80.75±0.64μg/mL,结合态多酚65.08±1.34μg/mL。从IC50值同样可以看出超高压处理后的各状态多酚提取物抑制α-糖苷酶的能力也均得到显著地提高。
实施例6:超高压前后棕榈果不同提取物抑制H2O2氧化损伤导致的细胞凋亡
用含10%胎牛血清的完全培养基培养肝癌细胞(HepG2),待细胞长至80%-90%,用胰酶把细胞消化下来,经计数板计数后用完全培养基稀释成2×105,接于6孔板,每孔2mL;生长24h后,吸出完全培养基加入含有不同提取物或VC(阳性对照)的完全培养基再处理24h;然后加入1mM H2O2诱导活性氧产生,造成细胞损伤;6h后用胰酶消化收集细胞,按照凋亡试剂盒说明书(4A Biotech Co.Ltd,北京)操作细胞,先用Annexin V-FITC进行预染,PI复染之后,用流式细胞仪(Guava easyCyte 6-2L; Millipore, Hayward, CA, USA)检测细胞凋亡情况;图4显示了经棕榈果不同多酚提取物或VC预处理过的细胞凋亡流式图,图5为细胞凋亡率量化之后的柱状图,图4和图5结果表明未超高压处理获得的棕榈果不同多酚提取物都能有效地抑制细胞因H2O2氧化损伤导致的细胞凋亡;与H2O2损伤组相比,游离态多酚、酯化态多酚和结合态多酚在120 μg/mL时,细胞凋亡率分别减少了15.47±1.11%、36.20±0.19%和47.41±1.66%,而经过超高压处理的棕榈果不同多酚提取物对细胞的保护作用要稍好一些,具体为游离态多酚的细胞凋亡率减少了22.42±1.64%,酯化态多酚减少了38.92±0.73%,结合态多酚减少了50.56±2.19%。
实施例7:超高压前后棕榈果不同提取物处理后细胞内ROS含量
用含10%胎牛血清的完全培养基培养肝癌细胞(HepG2),待细胞长至80%-90%,用胰酶把细胞消化下来,经计数板计数后用完全培养基稀释成2×105,接于6孔板,每孔2mL;生长24h后,吸出完全培养基加入含有不同提取物或VC(阳性对照)的完全培养基再处理24h;然后加入1mM H2O2诱导活性氧产生,造成细胞损伤;6h后用胰酶消化收集细胞,用PBS清洗三次去除完全培养基,再加入探针DCF-DA与细胞结合,在37℃.孵育20分钟。离心去除探针,用无血清培养基清洗两次,吹打均匀后用流式细胞仪(Guava easyCyte 6-2L; EMDMillipore,Hayward, CA, USA)检测细胞内ROS含量。图6和图7分别显示了未超高压处理获得的棕榈果不同多酚提取物或VC预处理过的细胞内ROS含量, H2O2损伤组细胞内ROS含量高达294.05±1.15%,游离态多酚为278.32±1.10%、酯化态多酚256.01±2.61%、结合态多酚235.78±0.64%,表明棕榈果不同多酚提取物都能有效清除细胞内的活性氧,而超高压之后各状态多酚提取物抑制细胞内ROS生成的能力更强,游离态多酚为253.19±1.60%、酯化态多酚223.36±1.43%、结合态多酚199.64±1.37%。
综上所述,可以确定,与传统提取方法相比,超高压处理能够极显著地提高棕榈果不同状态多酚提取物中酚类物质的提取率和生物可获得率。同时,超高压处理后的棕榈果三种不同状态多酚提取物的生物活性均显著提高,其对胰脂肪酶活性的抑制率、α-糖苷酶活性的抑制率以及对细胞氧化损伤的保护能力均显著增强。本发明的超高压处理后的棕榈果多酚提取物具有更好的降脂减肥、降血糖和防治机体氧化损伤的作用,可用于制备相关的保健食品或药品。
Claims (7)
1.一种棕榈果不同状态多酚提取物的制备方法,其特征在于:先用超高压对棕榈果进行预处理,然后在超声辅助下进行提取,最后经萃取、旋蒸和干燥后得到棕榈果不同状态多酚提取物。
2.根据权利要求1所述的棕榈果不同状态多酚提取物的制备方法,其特征在于,步骤如下:
(1)将棕榈果切碎去核后装入真空袋中,真空密封后,放入超高压处理釜,在300-600MPa处理5-10min;取出处理好的果肉,冷冻干燥后打成粉末;
(2)将步骤(1)粉末脱脂后,按料液比g:mL 为1:4-6的比例,在脱脂后的棕榈果粉中加入甲醇-丙酮混合液,混匀后超声提取20-40min,超声波功率为200-300W,过滤,将滤渣再重复提2-3次,收集合并滤液旋蒸去除有机试剂,收集水相用于游离和酯化态多酚的提取;游离态多酚的提取是先用6mol/L盐酸将水相pH调节为2-3,然后用乙醚-乙酸乙酯混合液萃取水相,直至萃取液为无色为止,合并萃取液并旋蒸冻干,得到游离态多酚提取物;酯化态多酚提取是在室温下,按水相与氢氧化钠溶液体积比为1:1-1:2的比例,在水相中加入4-6mol/L NaOH溶液,水解4-8 h,随后用6mol/L盐酸调节pH为2-3,然后用乙醚-乙酸乙酯混合液萃取,直至萃取液为无色为止,合并萃取液旋蒸冻干,得到酯化态多酚提取物;按滤渣与氢氧化钠溶液体积比为1:1-3的比例,在超声过滤后的滤渣中加入4-6 mol/LNaOH溶液水解4-8 h,随后用6mol/L盐酸调节pH为2-3,然后用乙醚-乙酸乙酯混合液萃取,直至萃取液为无色为止,合并萃取液旋蒸冻干,得到结合态多酚提取物。
3.根据权利要求2所述的棕榈果不同状态多酚提取物的制备方法,其特征在于:甲醇-丙酮混合液是质量浓度70-80%甲醇溶液和质量浓度70-80%丙酮溶液按体积比1:1-1:3的比例混合制得。
4.根据权利要求2所述的棕榈果不同状态多酚提取物的制备方法,其特征在于:乙醚-乙酸乙酯混合液是乙醚和乙酸乙酯按体积比1:1-1:3的比例混合制得。
5.权利要求1-4中任一项所述的棕榈果不同状态多酚提取物的制备方法制得多酚提取物在作为胰脂肪酶抑制剂中的应用。
6.权利要求1-4中任一项所述的棕榈果不同状态多酚提取物的制备方法制得多酚提取物在作为α-糖苷酶抑制剂中的应用。
7.权利要求1-4中任一项所述的棕榈果不同状态多酚提取物的制备方法制得多酚提取物在制备防治人体组织氧化损伤的药物或保健食品中的应用。
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