CN109385411A

CN109385411A - 一种β-甘露糖苷酶及其应用

Info

Publication number: CN109385411A
Application number: CN201710665651.6A
Authority: CN
Inventors: 王耀辉; 谢敏; 谢建华; 何志梅; 徐莉敏; 王铮
Original assignee: DONGGUAN FANYATAI BIOLOGICAL SCI-TECH Co Ltd
Current assignee: DONGGUAN FANYATAI BIOLOGICAL SCI-TECH Co Ltd
Priority date: 2017-08-04
Filing date: 2017-08-04
Publication date: 2019-02-26
Anticipated expiration: 2037-08-04
Also published as: CN109385411B

Abstract

本发明公开了一种β‑甘露糖苷酶及其应用。本发明的β‑甘露糖苷酶的多肽的序列为：(1a)如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；或者(2a)与SEQ ID NO：1具有至少75％序列同一性且具有与SEQ ID NO：1相同功能的β‑甘露糖苷酶的氨基酸序列。本发明还公开一种β‑甘露糖苷酶的表达载体及宿主细胞。本发明公开的β‑甘露糖苷酶在pH 3.5‑8以及温度30‑65℃具有较好的甘露糖苷酶酶活稳定性。将本发明的β‑甘露糖苷酶用于生产甘露糖时，甘露糖的产量能够达到7.1mg/mL，是不添加本发明β‑甘露糖苷酶的约6倍，具有潜在的工业应用价值。

Description

一种β-甘露糖苷酶及其应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种β-甘露糖苷酶及其应用。

背景技术

β-甘露糖苷酶(EC3.2.1.25)属于半纤维素酶系的一种外切酶，它能催化水解1，4-β-D糖苷酶，在非还原端切下甘露糖，在食品、制药、石油和生物转化等行业有广泛的应用(Mccleary B V，Nurthen E，Taravel F R，et al.Characterisat ion ofoligosaccharides produced on hydrolysis of galactomannan with β-D-m annanase[J].Carbohydrate Research，1983，118(JUL)：91-109)尤其可以替代化学法生产甘露糖。甘露糖溶解性好，不易结晶，在食品和制药行业中具有潜在的应用价值。β-甘露糖苷酶另一个应用是利用它的转糖苷能力合成甘露寡糖，以替代化学方法生产功能性甘露寡糖(TaubkenN，ThiemJ.Enzymatic Synthesis of Alkyl and Hydroxyalkyl β-D-Mannopyranosides[J].Synthesis，1992，1992(6)：517-518.)，甘露寡糖不仅能增强动物的免疫能力，降低胃肠道疾病的发生率和动物的死亡率，而且还能提高动物的日增重和饲料转化率(岳文斌，车向荣，减建军，等.甘露寡糖对断奶仔猪肠道主要菌群和免疫机能的影响[J].山西农业大学学报(自然科学版)，2002，22(2)：97-101)。因此，对β-甘露糖苷酶的开发具有重要的工业化应用前景。

国外己有少数微生物来源β-甘露糖苷酶基因克隆和表达的报道(ChauhanPS，GuptaN.Insight into microbial mannosidases：a review[J].Critical Reviews inBiotechnology，2016，8：1-12.)，但文献中报道的大多数β-甘露糖苷酶的分子量较大，在90～130KDa，难于表达，限制了β-甘露糖苷酶的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种β-甘露糖苷酶的多肽、其编码基因、表达该β-甘露糖苷酶的多肽的菌株、宿主细胞及表达载体，并提供一种β-甘露糖苷酶的应用。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案为：一种β-甘露糖苷酶的多肽，所述β-甘露糖苷酶的多肽的序列为：

(1a)如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；或者

(2a)与SEQ ID NO：1具有至少75％序列同一性且与SEQ ID NO：1具有相同的β-甘露糖苷酶功能的氨基酸序列。

本发明提供了上述β-甘露糖苷酶的多肽的编码基因，所述新型β-甘露糖苷酶多肽的编码基因由以下序列组成：

(1b)SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；或者

(2b)与SEQ ID NO：2具有至少75％序列同一性且与SEQ ID NO：2具有相同的β-甘露糖苷酶功能的核苷酸序列。

本发明涉及的β-甘露糖苷酶的编码基因来源于自行筛选的多枝横梗霉(Lichtheimia ramose)，与基因数据库中公开的β-甘露糖苷酶基因的相似性较低，是一种新型糖基水解酶5家族β-甘露糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，该β-甘露糖苷酶由444个氨基酸组成，相对分子量约60kDa，与传统的β-甘露糖苷酶相比易于表达。本发明的β-甘露糖苷酶多肽还可为含有与SEQ ID NO：1具有由BLAST算法所测定的至少75％(如80％，90％，95％或99％)氨基酸相似性的序列，且该多肽具有β-甘露糖苷酶活性。与该β-甘露糖苷酶氨基酸同源性最高的是Lichtheimia corymbiferaJMRC：FSU：9682glycosidehydrolase family5protein(序列号：CDH53051.1)两者的一致性为305/408(75％)；其次是Rhizomu cor Miehei米黑根毛霉mannosidase(序列号：AGV01048.1)两者的一致性为312/425(73％)。

本发明还提供了一种表达载体，本发明的表达载体由上述β-甘露糖苷酶的编码基因和基础载体组成。

优选地，所述基础载体为毕赤酵母表达载体。

优选地，所述基础表达载体为pPIC9、pPIC9k或pHIL-S1、pPICZαA、pYAM75P中的一种。

更优选地，所述毕赤酵母表达载体为pPICZαA。

本发明提供了一种β-甘露糖苷酶基因表达盒，所述基因表达盒的表达元件包括启动子，上述的编码基因以及终止子。

优选地，所述基因表达盒的表达元件从5’到3’依次为AOX 1启动子，促进β-甘露糖苷酶分泌的信号肽，β-甘露糖苷酶的编码基因，以及AOX 1终止子。其中β-甘露糖苷酶的编码基因序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明提供了一种基因工程化的宿主细胞，所述宿主细胞包含表达载体或者基因表达盒。优选地，所述宿主细胞为甲醇营养型酵母菌宿主细胞。

更优选地，所述宿主细胞为巴斯德毕赤酵母。

本发明提供了所述多肽、所述编码基因、所述表达载体、所述基因表达盒，所述宿主细胞在制备β-甘露糖苷酶中的应用。

本发明提供了一种β-甘露糖苷酶在生产甘露糖方面的应用。

优选地，所述β-甘露糖苷酶在生产甘露糖方面的应用为β-甘露糖苷酶在酶解刺槐豆胶生产甘露糖方面的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供了一种β-甘露糖苷酶多肽及其编码基因，该β-甘露糖苷酶多肽具有由BLAST算法所测定的至少75％(如80％，90％，95％或99％)氨基酸相似性的序列，且该多肽具有β-甘露糖苷酶活性。

(2)使用本发明的β-甘露糖苷酶基因所表达的β-甘露糖苷酶，当将其用于生产甘露糖时，甘露糖的产量能够达到7.1mg/mL，是不添加本发明β-甘露糖苷酶的约6倍，具有潜在的工业应用价值。

附图说明

图1是pPICZαA-LrMan5表达载体示意图；

图2是实施例2中的菌落PCR图；

图3是β-甘露糖苷酶LrMan5的SDS-PAGE图；

图4是pH对LrMan5酶活力影响结果图；

图5是温度对LrMan5酶活力影响结果图；

图6是LrMan5的pH稳定性结果图；

图7是LrMan5的温度稳定性结果图；

图8是LrMan5的动力学常数分析图；

图9是LrMan5与甘露聚糖协同降解刺槐豆胶生产甘露糖的HPLC图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和有益效果，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。需说明的是，下述实施所述方法是对本发明做的进一步解释说明，不应当作为对本发明的限制。本发明的实施例中所用的材料、试剂若无特殊说明皆可从商业途径获得。

实施例1 β-甘露糖苷酶LrMan5基因的克隆

提取Lichtheimia ramose的基因组DNA，以基因组DNA为模板，设计引物LrMan5-F/R，序列如表1所示(SEQ ID：3/SEQ ID：4)，通过常规PCR的方法获得β-甘露糖苷酶(LrMan5)的基因，基因序列如SEQ ID NO：1所示。

表1：LrMan5扩增引物序列

获得LrMan5基因的PCR反应体系如表2所示，反应条件如表3所示。

表2：PCR反应体系

表3：PCR反应条件

实施例2 包含LrMan5编码基因的毕赤酵母表达载体构建与验证

(1)LrMan5基因与质粒pPICZαA分别双酶切

LrMan5基因双酶切反应体系如表4所示，质粒pPICZαA双酶切反应体系如表5所示。

表4：LrMan5基因双酶切反应体系

表5：质粒pPICZαA双酶切反应体系

(2)pPICZαA载体与LrMan5基因的连接

连接体系如表6所示，构建表达载体pPICZαA-LrMan5(表达载体图谱如图1所示)，转化大肠杆菌DH5a，进行载体的筛选和扩增。

表6：pPICZαA载体与LrMan5连接体系

(3)转化

a、制备巴斯德毕赤酵母感受态细胞

挑取生长良好的毕赤酵母单菌落，接种于5mL YPD的指形瓶中，30℃过夜培养。取0.5mL过夜培养物，转接至含125mL新鲜培养基的500mL摇瓶中。30℃250rpm培养至OD600＝1.3-1.5。于4℃，1500g离心3min收集菌体，用125mL预冷的无菌水重悬菌体。如上离心，用60mL预冷的无菌水重悬菌体。如上离心，用5mL预冷的1M山梨醇重悬。如上离心，用0.25mL预冷的1M山梨醇重悬。

b、转化巴斯德毕赤酵母宿主细胞

取100μL上述菌液与2μL约1ug SacI限制性内切酶线性化的重组DNA混合，转入预冷的电转杯中。冰上放置5min。按装置推荐的真核细胞转化参数(电压1.5kV、电阻200Ω、电容25μF、电击时间为4-10msec)电击。立刻加入1mL预冷的1M山梨醇，转入灭菌的离心管中取适量菌液涂布YPDS平板上，30℃恒温孵育直至2天后单菌落出现。

(4)重组pPICZαA-LrMan5质粒的鉴定

随机挑取YPDS平板上长出的毕赤酵母单菌落，提取重组pPICZαA-LrMa n5质粒，以5′AOX和3′AOX为引物(如表7所示)，进行菌落PCR鉴定重组子。菌落PCR结果如图2所示，经测序证明LrMan5基因及载体片段已确实成功整合至毕赤酵母X-33基因组上，重组酵母菌中确实含有相应外源基因。

菌落PCR引物序列如表7所示(SEQ ID：5/SEQ ID：6)；菌落PCR反应体系如表8所示；菌落PCR反应条件如表9所示。

表7：菌落PCR引物序列

表8：菌落PCR反应体系

表9：菌落PCR反应条件

(5)重组pPICZαA-LrMan5质粒的提取

重组pPICZαA-LrMan5质粒提取操作方法如下：

1)取1ml过夜培养的菌液，12000g离1min，弃上清；

2)加入100μL破菌缓冲液，电动研磨器研磨菌体1-2min；

3)加入500μL binding buffer(DNA cycle pure试剂盒中的结合液)，颠倒混匀；

4)12000g离心5min，取上清加入离心柱中，10000g离心1min；

5)弃收集管中液体，向离心柱中加入500μL washing buffer，10000g离心1min；

6)重复步骤5)；

7)弃收集管中的液体，10000g离心2min，将离心柱转移到新的1.5mL离心管中，加入30μL无菌水(65℃预热)，37℃放置5min，10000g离心1min。将重组质粒成功整合至毕赤酵母X-33基因组上的。

实施例3 重组β甘露糖苷酶LrMan5的表达与纯化

挑取生长良好的毕赤酵母单菌落，接种含5mL BMG的指形瓶中，30℃震荡培养过夜。将培养过夜的菌液转接至含有50mL YPDG的500mL三角瓶内，用八层纱布封口，保证良好的透气环境，28℃，250rpm培养过夜。将培养过夜的菌液1500g离心3min，重悬50mL新鲜的BMMY培养基于500mL三角瓶中，用八层纱布封口，28℃，250rpm振荡培养。每隔6h加入甲醇至终浓度为1.2-1.5％的甲醇。每12h取适量培养液测定OD600值以及酶活力，以确定重组蛋白表达的最佳收获时间。将发酵产物6000rpm离心10min，过HITRAPQFF层析柱层析，通过SDS-PAGE分析纯化产物。

结果如图3所示，在66KDa附近有明显条带，与预期大小相符，表明LrMan5在毕赤酵母中成功表达。

实施例4 β-甘露糖苷酶的生产方法

(1)经过一级种二级种后，将含有重组pPICZαA-LrMan5质粒的毕赤酵母接种于BSM发酵培养基中，培养24h，继续补料甘油，培养至菌体OD值达到300。

(2)进行甲醇诱导7天，使重组毕赤酵母生产新型β-甘露糖苷酶。

(3)从发酵液中分离β-甘露糖苷酶。

实施例5 LrMan5酶学特性的研究

LrMan5酶活测定，以对硝基苯酚-β-D甘露糖苷(p-NPM)为底物测定β-甘露糖苷酶活力：

(1)取pH 5.5的缓冲液150μL，加入50μLp-NPM底物溶液，放入水浴锅中预热5min，加入50μL适当稀释的酶液，65℃下保温反应10min。

(2)加入1mL1M Na₂CO₃溶液以终止反应。

(3)吸取200μL反应液入96孔酶标板，酶标仪测定405nm下的吸光值。根据之前制作的p-NP标准曲线，计算体系中产生p-NP的量。

计算公式如下：

式中：

X-试样β-甘露糖苷酶的活力，U/mL；

A-从标准曲线中查得的p-NP量，μmoL；

N-稀释倍数(总稀释倍数)；

V-加入的酶液体积，mL；

10-10分钟的反应时间。

同一试样两个平行测定值的相对误差不超过8.0％，二者的平均值为最终的酶活力测定值。

酶活力单位(U)的定义：在最适测定条件下，每分钟生成1μmol的pNP所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)，其中样品的酶活力以U/g(固体酶)或U/mL(液体酶)表示。

实施例6 pH对LrMan5酶活力的影响

在50℃下，测定β-甘露糖苷酶在不同pH(3.0～10.0)缓冲液条件下的酶活力，所用缓冲液为0.2M柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液。

结果如图4所示，表明β-甘露糖苷酶在4.5-6.0之间都具有较高的活性，在pH为5.5时，即达到最高酶活，随着pH增加酶活力缓慢下降，在pH为6.5时，保留50％的酶活力。

实施例7 温度对LrMan5酶活力的影响

确定最适pH后，在pH 5.5条件下测定不同温度(35～75℃)下的酶活力，确定酶的最适作用温度。

结果如图5所示，表明β-甘露糖苷酶LrMan5在温度为65℃时达到最大值，当温度超过65℃时，酶活力急剧下降，到75℃时酶活力减少至40％。

实施例8 LrMan5pH耐受性的测定

将酶保存在不同pH值的缓冲液中，40℃保存1小时，最适作用pH和最适作用温度条件下测定酶活力(pH5.5的0.2M柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液，65℃反应10min)。

该酶在pH3-8.0的范围内测定LrMan5的pH稳定性，结果如图6所示，LrMan5在pH为3.5-8都具有较好的稳定性。

实施例9 LrMan5温度耐受性的测定

将酶在不同温度下(30～70℃)保存0.5h，最适pH和最适温度条件下测定酶活力(pH5.5的0.2M柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液，65℃反应10min)。

结果如图7所示，表明LrMan5具有较好的热稳定性，65℃处理0.5h仍有80％以上的酶活力。在60℃及以下温度处理0.5h都具有90％以上的酶活力。

实施例10 LrMan5动力学常数分析

在最适条件下，以pNP-M为底物，在不同底物浓度下测定β-甘露糖苷酶比活力。用GraphPad Prism 5软件进行分析。

结果如图8所示，表明该酶的Km和Vmax分别为27.44mM和18.65μmol/mim·mg。

实施例11 甘露聚糖酶与β-甘露糖苷酶协同作用生产甘露糖的HPLC分析

以甘露糖为标准样，刺槐豆胶为底物，分别加入甘露聚糖酶以及甘露聚糖酶和β-甘露糖苷酶在50℃作用1h。然后将反应物沸水中煮沸10min终止反应，室温冷却，12000rpm离心20min。使用岛津色谱仪进行HPLC分析。色谱条件：色谱柱为Alltima Aminoz氨基柱(4.6x250mm，5μm)；流动相为乙睛∶水(75∶25)；流速为1mL/min；柱温为40℃。

结果如图9所示，其中各数字编号分别表示为1∶0.1g刺槐豆胶+90U甘露聚糖酶；2∶0.1g刺槐豆胶+180U甘露聚糖酶；3∶0.1g刺槐豆胶+360U甘露聚糖酶；4∶0.1g刺槐豆胶+1440U甘露聚糖酶；5∶5mg/mL甘露糖标样；6∶0.1g刺槐豆胶+720U甘露聚糖酶+0.012ULrMan5；7∶0.1g刺槐豆胶+720U甘露聚糖酶+0.025U LrMan5；8∶0.1g刺槐豆胶+720U甘露聚糖酶+0.050U LrMan5；9∶0.1g刺槐豆胶+720U甘露聚糖酶+0.100U LrMan5；10∶0.1g刺槐豆胶+720U甘露聚糖酶+0.25U LrMan5。

表明当只添加甘露聚糖酶，即使添加量达到14400U/g，甘露糖的含量仍仅为1.25mg/mL，而当添加7200U/g甘露聚糖酶的同时添加2.5U β-甘露糖苷酶LrMan5时，甘露糖的含量达7.1mg/mL，表明添加β-甘露糖苷酶LrMan5能有效增加甘露糖的含量，在工业上生产甘露糖有重要应用。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 东莞泛亚太生物科技有限公司

<120> 一种β-甘露糖苷酶及其应用

<130> 20170803

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 444

<212> PRT

<213> Lichtheimia ramose

<400> 1

Met Val Leu Lys Thr Ser Leu Phe Thr Leu Ala Leu Ala Ile Gly Leu

1 5 10 15

Val Ser Ala Gln Pro Leu Asp Ser Arg Lys Glu His His His His His

20 25 30

Ala Asp Glu Ala Tyr Val Gln Ile Ala Lys Asp Gly Ser Gly Phe Thr

35 40 45

Arg Tyr Gly Val Pro Tyr Met Ile Arg Gly Ser Asn Tyr Trp Tyr Gly

50 55 60

Met Trp Leu Gly Ala Asp Asp Cys Asn Gly Gly Asp Arg Lys Arg Leu

65 70 75 80

Glu Thr Glu Val Arg Gln Leu Ala Glu Met Gly Val Asn Asn Leu Arg

85 90 95

Ile Met Ala Ala Ser Glu Gly Pro Asp Asp Gln Pro Tyr Arg Val Arg

100 105 110

Pro Ser Phe Met Arg Lys Pro Gly Glu Tyr Asn Glu Ala Val Phe Lys

115 120 125

Gly Leu Asp Tyr Leu Leu Asp Thr Met Asp Lys Tyr Asn Met Thr Ala

130 135 140

Val Met Thr Met Asn Asn Phe Trp His Trp Ser Gly Gly Phe Gly Gln

145 150 155 160

Tyr Val Ala Trp Ile Ser Gly Asn Gln Thr Ile Pro Tyr Pro Val Gly

165 170 175

Asp Val Thr Tyr Asp Glu Phe Thr Gln Tyr Ala Ala Arg Phe Tyr Asn

180 185 190

Asp Ser Ser Ile Ala Pro Lys Ala Gln Glu Ile Phe Lys Asn His Ile

195 200 205

Thr Thr Val Gln Asn Arg Val Asn Thr Val Asn Gly Lys Thr Tyr Lys

210 215 220

Glu Asp Pro Val Ile Met Ser Trp Gln Leu Ala Asn Glu Pro Gln Gln

225 230 235 240

Gly Pro Ala Trp Trp Phe Glu Glu Ile Ser Thr Tyr Met Lys Lys Gly

245 250 255

Ala Pro Lys His Leu Val Ser Ala Gly Leu Glu Ser Ile Leu Asp Lys

260 265 270

Tyr Asp Phe Asp Arg Ala His Lys His Lys Asn Ile Asp Tyr Thr Thr

275 280 285

Cys His Leu Trp Val Glu Asn Arg Gly Ile Tyr Asp Pro Arg Asn Val

290 295 300

Ser Thr Leu Ala Leu Ala Gln Ala Ala Ala Thr Asp Phe Ile Ser Ser

305 310 315 320

Arg Ser Glu Trp Ala Glu Thr Leu Asn Lys Pro Ile Leu Leu Glu Glu

325 330 335

Phe Gly Met Ala Arg Asp Ala Trp Arg Lys Pro Asp Asp Leu Glu Tyr

340 345 350

Glu Tyr Asn Pro Ser Thr Pro Thr Thr His Lys Asp Lys Phe Tyr His

355 360 365

Asp Ile Phe Lys Gln Ile Val Ser Leu Ala Lys Asp Gly Lys Phe Ser

370 375 380

Gly Ser Gly Phe Trp Ala Tyr Ser Gly Glu Gly Arg Ser Thr Asp Tyr

385 390 395 400

Pro Asn Lys Tyr Gly Met Val Phe Leu Gly Asp Pro Pro His Glu Pro

405 410 415

Arg Gly Trp Tyr Ser Val Tyr Asp Lys Asp Thr Thr Val Lys Val Ile

420 425 430

Arg Asp Tyr Asn Ala Glu Leu Lys Lys Leu Glu His

435 440

<210> 2

<211> 1278

<212> DNA

<213> Lichtheimia ramose

<400> 2

caaccattgg attctagaaa ggaacatcat catcatcatg ctgatgaggc ttacgttcaa 60

attgctaagg atggttcagg ttttactaga tacggtgttc cttacatgat tagaggatct 120

aactactggt acggaatgtg gttgggagct gatgattgta acggagggga cagaaagaga 180

ttggaaactg aagttagaca attggctgaa atgggagtta acaacttgag aattatggct 240

gcttccgaag gaccagatga tcaaccatac agagttagac cttcctttat gagaaagcca 300

ggtgaataca acgaagctgt ttttaagggt ttggattact tgttggatac tatggataag 360

tacaacatga ctgctgttat gactatgaac aacttttggc attggtccgg aggttttggt 420

caatacgttg cttggatttc aggtaaccaa actattccat acccagttgg cgacgttact 480

tacgatgagt tcactcaata cgctgctaga ttttacaacg attcttctat tgctccaaag 540

gctcaagaaa tttttaagaa ccatattact actgttcaaa acagagttaa cactgttaac 600

gggaaaactt acaaggaaga tccagttatt atgtcctggc aattggctaa cgaacctcaa 660

caaggacctg cttggtggtt tgaagaaatt tccacttaca tgaagaaggg cgcgccaaag 720

catttggttt ccgctggatt ggaatctatt ttggataagt acgattttga tagggcccat 780

aagcataaga acattgatta cactacttgt catttgtggg ttgaaaacag aggtatatac 840

gatcctagaa acgtttccac tttggctttg gctcaagctg ctgctactga ttttatttct 900

tctagatccg aatgggctga aactttgaac aagcctattt tgttggaaga atttggtatg 960

gctagagatg cttggagaaa gccagatgat ttggaatacg aatacaaccc atccactcca 1020

actactcata aggataagtt ttaccatgat atttttaagc aaattgtttc cttggctaag 1080

gatgggaagt tttcaggttc cggattttgg gcttactccg gtgaaggtag atccactgat 1140

taccctaaca agtacggtat ggtcttcttg ggagatcctc cacatgaacc tagaggatgg 1200

tactccgttt acgataagga tactactgtt aaggttatta gagattacaa cgctgaattg 1260

aagaagttgg aacattaa 1278

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

atagaattcc aaccattgga ttctagaaag g 31

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

atagcggccg cttaatgttc caacttcttc aat 33

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gactggttcc aattgacaag c 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

gcaaatggca ttctgacatc c 21

Claims

1.一种β-甘露糖苷酶的多肽，其特征在于，所述β-甘露糖苷酶的多肽的序列为：

(1a)如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；或者

2.一种β-甘露糖苷酶的编码基因，其特征在于，所述β-甘露糖苷酶的编基因的核苷酸序列为：

(1b)SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；或者

3.一种表达载体，其特征在于：所述表达载体由权利要求2所述的编码基因和基础载体组成；优选地，所述基础载体为毕赤酵母表达载体。

4.一种β-甘露糖苷酶基因表达盒，其特征在于：所述基因表达盒的表达元件包括启动子，权利要求2所述的编码基因以及终止子。

5.一种基因工程化的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞包含如权利要求3所述的表达载体或者如权利要求4所述的基因表达盒。

6.如权利要求5所述的宿主细胞，所述宿主细胞为甲醇营养型酵母菌宿主细胞；优选地，所述宿主细胞为巴斯德毕赤酵母。

7.如权利要求1所述多肽、如权利要求2所述编码基因、如权利要求3所述表达载体、如权利要求4所述基因表达盒，或如权利要求5～6中任一项所述宿主细胞在制备β-甘露糖苷酶中的应用。

8.一种β-甘露糖苷酶，其特征在于：如下(a)～(d)中的任意一种：

(a)所述β-甘露糖苷酶的多肽如权利要求1所述；

(b)所述β-甘露糖苷酶的编码基因如权利要求2所述；

(c)所述β-甘露糖苷酶由如权利要求3所述表达载体或如权利要求4所述基因表达盒表达得到；

(d)所述β-甘露糖苷酶由培养如权利要求5～6中任一项所述宿主细胞得到。

9.如权利要求8所述β-甘露糖苷酶在制备甘露糖中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于通过水解刺槐豆胶制备甘露糖。