CN109371118A

CN109371118A - PRSS27和/或C16orf89在制备骨性关节炎诊断制剂中的应用

Info

Publication number: CN109371118A
Application number: CN201811282114.4A
Authority: CN
Inventors: 叶伟亮; 杨跃梅; 贾冰寒
Original assignee: Beijing Zhicheng Biomedical Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Zhicheng Biomedical Technology Co Ltd
Priority date: 2018-10-31
Filing date: 2018-10-31
Publication date: 2019-02-22

Abstract

本发明提供了检测PRSS27和/或C16orf89基因及其表达产物的制剂在制备骨性关节炎诊断制剂中的应用；发明人基于高通量测序结果筛选出PRSS27和C16orf89基因，进一步，通过分子生物学方法验证，证实了PRSS27和/或C16orf89基因在骨性关节炎组织中低表达的结果，其激动剂可用于制备治疗骨性关节炎药物。本发明提供了一种新的骨性关节炎的治疗靶点，具有重要的临床应用价值。

Description

PRSS27和/或C16orf89在制备骨性关节炎诊断制剂中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及PRSS27和/或C16orf89在制备骨性关节炎诊断制剂中的应用。

背景技术

骨性关节炎(osteoarthritis，OA)是中老年人最常见的疾病之一，由于人群预期寿命的延长，骨性关节炎的发病率也明显增高，尤其是肥胖的老年人群，60岁以上人群中，50％以上在X线上有骨性关节炎表现。其常见病理改变为软骨下骨硬化、关节周围骨赘形成、慢性滑膜炎，其引起的疼痛、功能障碍严重影响患者的生活质量。

虽然近些年来世界各地的学者在OA的病因、发病机理、治疗方面进行了大量的研究，但是对于其确切的发病机制还没有完全明确，治疗方面也没有寻找到有效方法对骨性关节炎的发病进程进行预防或延缓。目前治疗上主要是通过各种方法达到止痛、保持和改善关节功能的目的，早期骨性关节炎的治疗方法包括:教育、合理的功能锻炼及限制负重；物理治疗；应用非幽体类消炎镇痛药，但这些治疗方法却不能真正有效延缓骨性关节炎关节软骨的退变，不能改变骨性关节炎的自然病程。待病程发展到晚期骨性关节炎后，治疗上只能通过人工关节置换达到止痛、改善关节功能的目的。但是，由于晚期骨性关节炎患者年龄高且多伴发高血压、糖尿病等心脑血管疾病，关节置换手术风险大，手术相关并发症发生率高，严重影响老年患者的身心健康；此外，人工关节置换费用高昂，给社会、家庭带来巨大的经济负担。因此，明确骨性关节炎的发病机制，寻找新的骨性关节的诊断标志物以及药物靶点已成为医学上亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的之一在于，提供了新的标志物在制备骨性关节炎诊断和治疗中的应用。

本发明的目的之二在于，提供了一种治疗骨性关节炎的药物。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

首先，本发明提供了检测PRSS27和/或C16orf89基因及其表达产物的制剂在制备骨性关节炎诊断制剂中的应用。

优选的，所述PRSS27和C16orf89基因在骨性关节炎组织中表达下调。

优选的，所述骨性关节炎诊断制剂采用荧光定量PCR试剂盒、基因芯片、免疫方法检测骨性关节炎组织中PRSS27和/或C16orf89基因的表达。

优选的，所述免疫方法包括ELISA试剂盒检测和/或Western Blot。

优选的，所述ELISA试剂盒中包括抗PRSS27和/或C16orf89蛋白的特异性抗体。

优选的，所述ELISA试剂盒中的抗体可采用市售的PRSS27和/或C16orf89单克隆抗体或多克隆抗体。进一步，所述的试剂盒包括：包被PRSS27和/或C16orf89抗体的固相载体，酶标抗体，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶反应终止液等。

酶联免疫吸附实验(ELISA)即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。ELISA检测试剂盒根据检测目的和操作步骤可分为间接法、双抗夹心法、竞争法、双位点一步法、捕获法测IgM抗体、应用亲和素和生物素的ELISA。ELISA检测试剂盒中生色底物可选择辣根过氧化物酶(HRP)或者碱性磷酸酶(AP)。

优选的，所述荧光定量PCR试剂盒中含有一对特异性扩增PRSS27和/或C16orf89基因的引物；所述基因芯片中包括与PRSS27和/或C16orf89基因的核苷酸序列杂交的探针。

优选的，所述荧光定量PCR试剂盒内含有特异性检测PRSS27和/或C16orf89基因的上游引物和下游引物；所述PRSS27基因的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ IDNO.2所示；所述C16orf89基因的上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物序列如SEQ IDNO.4所示。

优选的，所述荧光定量PCR试剂盒还包括10×Buffer、dNTP、MgCl₂、Taq酶、逆转录酶和RNA酶抑制剂。

优选的，所述荧光定量PCR试剂盒还包括内参引物；所述内参为GAPDH。

优选的，所述荧光定量PCR试剂盒还可以包括RNA提取试剂。

优选的，所述荧光定量PCR试剂盒还可以包括正常对照组，所述正常对照组为正常人的cDNA。

进一步地，本发明提供一种治疗骨性关节炎的药物，所述药物中含有促进PRSS27和/或C16orf89基因的转录或表达的试剂或化合物。

优选的，所述治疗骨性关节炎的药物中含有促进PRSS27和/或C16orf89基因的转录或表达的载体，和/或激活PRSS27和/或C16orf89基因的启动子，和/或激活PRSS27和/或C16orf89基因表达的蛋白或因子。

优选的，所述促进PRSS27和/或C16orf89基因的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

在本发明中，是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。表达载体向宿主细胞中的导入可以使用电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚糖法、显微注射、病毒感染、脂质体转染、与细胞膜透过性肽的结合等周知的方法。

在本发明中，“宿主细胞”可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS或293细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

进一步地，本发明还提供了所述的治疗骨性关节炎药物在制备预防或治疗骨性关节炎药物中的应用。

有益效果

本发明首次发现了一种骨性关节炎的诊疗标志物PRSS27和C16orf89，并提供了检测PRSS27和/或C16orf89基因及其表达产物的制剂在制备骨性关节炎诊断制剂中的应用。

本发明提供了PRSS27和/或C16orf89可以作为骨性关节炎的诊治靶标，指导相关药物的研发。

本发明提供了一种治疗骨性关节炎的药物，为骨性关节炎早期治疗的实现提供了可能性。

附图说明

图1是利用实时荧光定量PCR检测PRSS27基因在骨性关节炎滑膜组织中的表达情况；

图2是利用实时荧光定量PCR检测C16orf89基因在骨性关节炎滑膜组织中的表达情况。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

发明人对8例骨性关节炎滑膜组织及4例对照样本进行高通量测序，结合生物信息学方法进行基因筛选，挑选出候选基因PRSS27和C16orf89，现有研究中并没有PRSS27和C16orf89基因或其蛋白与骨性关节炎相关的报道；进一步，发明人进行了分子生物学方法验证，证实了PRSS27和C16orf89在骨性关节炎组织中低表达，其激动剂可用于制备治疗骨性关节炎药物。本发明提供了一种新的骨性关节炎的治疗靶点，具有重要的临床应用价值。

实施例1样本收集

取2016年10月到2018年5月期间在北京协和医院骨科就诊骨性关节炎患者，病例组共收集8例，对照来源于同时期骨科住院的其他疾病患者，收集共4例。获取所有研究对象的滑膜组织样本，编号后置-80℃低温冰箱保存。病例组均符合膝关节OA诊断标准，进行膝关节人工关节置换术患者；对照组为半月板损伤及交叉韧带损伤进行关节镜手术治疗的患者。实验经北京协和医院伦理委员会同意，并取得每位受试者的书面知情同意。

实施例2高通量测序及分析

对组织进行RNA提取，RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提取的RNA样品质量合格与否，是否可以用于进一步的转录组分析。进而通过NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品的提取情况，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。

测序平台为Illumina公司的HiSeq 2500高通量测序平台，进行高通量转录组深度测序，测序后运用Fast-QC软件对测序数据的质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布，质量值的位置分布，GC含量，PCR duplication含量，kmer的frequency等。在差异基因表达分析时，根据得到的FPKM值，采用国际公认算法EBSeq进行差异筛选。其中，筛选时，LOG2FC>1或<-1,FDR<0.05。为了更好的理解差异表达基因的功能，发明人对差异表达基因进行了Gene Ontology和信号通路分析，并对差异表达基因进行功能注释和蛋白质互相作用网络分析，鉴于以上数据分析的结果，结合文献发明人筛选了差异表达基因PRSS27和C16orf89。

实施例3验证骨性关节炎患者及对照滑膜组织PRSS27和C16orf89基因表达情况

选取27例骨性关节炎患者滑膜组织及8例对照滑膜组织，对其进行分组及编号。病例组均符合膝关节OA诊断标准，进行膝关节人工关节置换术患者；对照组为半月板损伤及交叉韧带损伤进行关节镜手术治疗的患者。实验经北京协和医院伦理委员会同意，并取得每位受试者的书面知情同意。

1、骨性关节炎患者及对照的滑膜组织总RNA的提取

采用Reagent(invitrogen，货号15596-018)进行样本RNA提取，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：

收集样本后冻存于液氮，取出后把组织放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本成粉末状后：

①加入Trizol，室温保存5分钟；

②加氯仿0.2mL，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5分钟-10分钟；

③12000rpm高速离心15分钟后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管管中,注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管,加入等体积的-20℃预冷异丙醇,充分颠倒混匀，置于冰上10分钟；

④12000rpm高速离15分钟后小心弃掉上清液，按1ml/ml Trizol的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振荡混合，4℃下12000rpm高速离心5分钟；

⑤弃去乙醇液体，室温下放置5分钟以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解沉淀；

⑥用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-80℃。RNA质量判定标准：RNA样本的OD260/OD280值为1.7-2.2之间；总RNA电泳图谱有清晰的28S、18S条带；70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。

2、逆转录合成cDNA

采用III Reverse Transcriptase(invitrogen，货号18080-044)进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，获得的cDNA保存放-20℃冰箱备用。

3、Real-Time PCR

用ABI 7500型荧光定量PCR仪，采用2^-△△CT法进行数据的相对定量分析。

引物设计：采用在线引物设计软件，基因序列参照NCBI:NM_001318395.1(PRSS27)和NM_001098514.2(C16orf89)，内参选GAPDH，引物设计后由invitrogen公司合成。

PRSS27扩增引物序列：

上游引物：AGCAACAGCACCTCTGAGAC(SEQ ID NO.1)；

下游引物：CCAGTGACCCAGCAGTTCAT(SEQ ID NO.2)；

C16orf89扩增引物序列：

上游引物：TTTCCAGATGGCTGCTCCTC(SEQ ID NO.3)；

下游引物：GGGGTGGCTTTGCTTATCCT(SEQ ID NO.4)；

GAPDH扩增引物序列：

上游引物：GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT(SEQ ID NO.5)；

下游引物：GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG(SEQ ID NO.6)。

反应体系：用Power GreenPCRMasterMix(invitrogen，货号4367659)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。

PCR反应体系：2×mix 10μL；浓度为10μM的上游引物和下游引物各0.5μL；模板2μL；灭菌蒸馏水补平至25μL；

扩增程序为：95℃ 5min，(95℃ 15sec，60℃ 45s)×40个循环。

样品Real-Time PCR检测：将各样品cDNA倍稀释后取2μL作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。

4、统计方法

所有数据以平均值±标准差显示。方差分析多组数据组间差异，P<0.05为有统计学差异。

5、结果

结果显示，PRSS27基因在骨性关节炎滑膜组织中的表达水平为对照的0.35倍，C16orf89基因在骨性关节炎滑膜组织中的表达水平为对照的0.45倍(如图1、2所示)。以上结果验证了高通量转录组表达数据的整合分析PRSS27和C16orf89基因在骨性关节炎患者滑膜组织中低表达的结果。

本发明采用高通量测序筛选出骨性关节炎相关基因PRSS27和C16orf89，结合分子生物学实验证实了PRSS27和C16orf89是骨性关节炎诊治标志物。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京致成生物医学科技有限公司

<120> PRSS27和/或C16orf89在制备骨性关节炎诊断制剂中的应用

<130> p18069

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agcaacagca cctctgagac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccagtgaccc agcagttcat 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tttccagatg gctgctcctc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggggtggctt tgcttatcct 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggagcgagat ccctccaaaa t 21

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggctgttgtc atacttctca tgg 23

Claims

1.检测PRSS27和/或C16orf89基因及其表达产物的制剂在制备骨性关节炎诊断制剂中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述PRSS27和C16orf89基因在骨性关节炎组织中表达下调。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述骨性关节炎诊断制剂采用荧光定量PCR试剂盒、基因芯片、免疫方法检测骨性关节炎组织中PRSS27和/或C16orf89基因的表达。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述免疫方法包括ELISA试剂盒检测和/或WesternBlot。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述ELISA试剂盒中包括抗PRSS27和/或C16orf89蛋白的特异性抗体。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述荧光定量PCR试剂盒中含有一对特异性扩增PRSS27和/或C16orf89基因的引物；所述基因芯片中包括与PRSS27和/或C16orf89基因的核苷酸序列杂交的探针。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述荧光定量PCR试剂盒内含有特异性检测PRSS27和/或C16orf89基因的上游引物和下游引物；所述PRSS27基因的上游引物序列如SEQID NO.1所示，下游引物序列如SEQ IDNO.2所示；所述C16orf89基因的上游引物序列如SEQID NO.3所示，下游引物序列如SEQ IDNO.4所示。

8.一种治疗骨性关节炎的药物，其特征在于，所述药物中含有促进PRSS27和/或C16orf89基因的转录或表达的试剂或化合物。

9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述治疗骨性关节炎的药物中含有促进PRSS27和/或C16orf89基因的转录或表达的载体，和/或激活PRSS27和/或C16orf89基因的启动子，和/或激活PRSS27和/或C16orf89基因表达的蛋白或因子。

10.权利要求8或9所述的治疗骨性关节炎药物在制备预防或治疗骨性关节炎药物中的应用。