CN109342622A - 禽饲料中杀虫剂残留量的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种禽饲料中杀虫剂残留量的测定方法，该方法是通过在禽饲料样品中加入提取剂进行充分提取，离心，得到提取液；对得到的提取液利用复合填料进行萃取净化，离心，得净化液；将得到的净化液利用液相色谱串联质谱仪进行检测，该方法可以同时测定禽饲料中59种杀虫剂的残留量，同时通过复合填料对禽饲料样品的提取液进行充分的净化处理，以降低提取液中的干扰物质对检测结果的影响，后利用液相色谱串联质谱仪进行检测，对杀虫剂进行定性定量的分析，提高了测定的准确性。

Description

禽饲料中杀虫剂残留量的测定方法

技术领域

本发明涉及分析化学技术领域，特别是涉及一种禽饲料中杀虫剂残留量的测定方法。

背景技术

杀虫剂在农业生产的过程中有着至关重要的作用，它满足了人们在农业生产过程中的需求，使现代化农业向着高产、高效的方向发展。近年来，各种新型的杀虫剂不断地研制成功，并被广泛的应用于现代农业中。随着杀虫剂的快速研发，杀虫剂的种类也在不断的增加，目前杀虫剂主要有有机磷类、氨基甲酸酯类、菊酯类、苯甲酰脲类、杂环类、苯基吡唑类等，但杀虫剂的不合理的使用不仅会造成环境的污染，还会通过禽饲料进入禽类食物链中，最终会被人们食用。

在禽类饲养过程中，单一饲料不能满足家禽对营养物质的需求，需要根据禽饲料的配方将不同类型的原料按照一定的比例进行搭配，从而达到营养成分均衡的目的。其中，禽饲料的能量原料主要有玉米、麸皮，蛋白质原料是饼粕，例如豆饼或者菜籽饼。那么这些植物性原料中的农药残留就将成为禽饲料中农药残留的主要来源，虽然农药的使用能够增加农作物的产量，但也会造成杀虫剂残留的问题，这些植物性食物的外皮、外壳以及根茎部的农药残留要比可食用部分高。然而禽饲料不像进入人们餐桌的食物那样经过脱皮、清洗等处理，加之禽类不能有效的分解饲料中残留的杀虫剂，那么通过食物链的传递，处于食物链终端的人们是最终的受害者。

此外，其禽饲料在养殖场贮存的过程中，如果温度和湿度控制不当，容易导致禽饲料生虫变质，为了预防禽饲料的生虫变质，养殖者会在禽饲料贮存场所甚至禽饲料中喷洒杀虫剂。例如，鸡农常用有机磷类杀虫剂，如敌敌畏、氟虫腈、马拉硫磷、乐果和亚胺硫磷等，以及苯并咪唑类、拟除虫菊酯类杀虫剂，将杀虫剂兑水稀释喷撒预防生虫，此举会增加禽饲料被杀虫剂的污染的可能性。因此，禽饲料中的农药残留问题应引起人们的重视，严格监控禽饲料中杀虫剂的残留量。

目前，对禽饲料中杀虫剂的残留量的测定大多数以色谱法检测为主，存在一定几率的假阳性和假阴性，影响结果准确度。

发明内容

基于此，有必要提出一种禽饲料中杀虫剂残留量的测定方法，以解决传统检测方法检测结果不准确的问题。

一种禽饲料中杀虫剂残留量的测定方法，包括以下步骤：

步骤一：在禽饲料样品中加入提取剂进行充分提取，离心，得提取液；

步骤二：对步骤一中得到的提取液利用复合填料进行萃取净化，离心，得净化液；

步骤三：将步骤二中得到的净化液利用液相色谱串联质谱仪进行检测。

上述禽饲料中杀虫剂残留量的测定方法，能够有效地对禽饲料中多种杀虫剂进行充分的提取，也能够利用复合填料进行分散萃取的方式有效的净化干扰物质，提高检测的准确性。传统的色谱法是二维分析只用保留时间进行定性峰面积定量，质谱法是三维逐级筛查除了保留时间，还对该物质的碎片组成扫描定性。上述方法采用液相色谱串联质谱仪进行测定，可根据母离子筛选第一次定性，保留时间和两个子离子丰度比值第二次定性，通过其中一个子离子峰面积进行定量，提高检测结果的准确度，并且方便，快捷，测定更为准确。

附图说明

图1为利用乙腈、1％乙酸乙腈和乙酸铵+乙腈(1g+20mL)三种提取剂对禽饲料中59种杀虫剂的回收率的分布的影响图；

图2为C18、ALN和PSA三种萃取填料对禽饲料中59种杀虫剂回收率分布的影响图；

图3为C18填料和ALN填料不同萃取方式对禽饲料中59种杀虫剂回收率分布的影响图；

图4为C18、ALN和(C18+ALN)复合填料对59种杀虫剂回收率分布的影响图；

图5～10分别为有机磷类、氨基甲酸酯类、菊酯类、苯基吡唑类、苯甲酰脲类和杂环类农药的标准曲线和空白基质标准曲线图；

图11为样品溶液配制校准曲线定量和空白基质配制校准曲线定量对禽饲料中59种杀虫剂回收率分布的影响图；

图12为采用液相色谱串联质谱法检测禽饲料中59种杀虫剂的总离子流图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关实施例对本发明进行更全面的描述。并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

本发明涉及一种禽饲料中杀虫剂残留量的测定方法，包括以下步骤：

步骤一：在禽饲料中先加水，浸泡3min～7min，以5︰(2～5)的比例加入氯化钠，再加入乙酸酸化的乙腈溶液作为提取剂对禽饲料中的杀虫剂进行提取，乙酸酸化的乙腈溶液中乙酸的体积分数为1％，其酸碱度为pH＝4，振荡提取5～10min，在5000～8000r/min的速度下离心3～5min，得到提取液。

步骤二：采用十八烷基硅烷键合硅胶(C18)和中性氧化铝(ALN)的混合物对步骤一中得到的提取液进行分散萃取净化，十八烷基硅烷键合硅胶和中性氧化铝的混合物中十八烷基硅烷键合硅胶与中性氧化铝的比例为1︰1，将萃取后得到的混合物涡旋振荡1min后在5000～8000r/min的速度下离心3～5min得净化液。

步骤三：将步骤二中得到的净化液利用0.22μm的滤膜进行过滤，得到的溶液采用液相色谱串联三重四级杆质谱仪进行测定，液相色谱的条件优选但不限于是：

色谱柱：规格为3μm，2.1mm×100mm的Venusil MP C18色谱柱；

流动相：0.1％甲酸水溶液与乙腈溶液的混合物；

0.1％甲酸水溶液与乙腈溶液的不同体积配比的混合液的梯度洗脱条件如表1所示：

表1

进样量：5μL

流速：0.4mL/m；

柱温：40℃。

质谱的条件优选但不限于是：

毛细管电压：5000V(电喷雾离子化+)/-4500V(电喷雾离子化-)

离子源温度：500℃

气帘气：30μL/min

喷雾器:50μL/min

辅助加热器:50μL/min

碰撞气：中度

扫描模式：多反映检测。

59种杀虫剂的质谱条件如表2所示：

表2

上表中“-”的表示负电压模式，“*”表示定量离子，入口电压和出口电压分别指碰撞室入口电压和碰撞室出口电压。

以下为具体实施例部分。

1仪器和试剂

1.1仪器：液相色谱串联三重四级杆质谱仪

1.2试剂

标准物质：59种杀虫剂标准品均购于德国Ehrensyorfer公司；

分析纯试剂：乙酸(华润化学，500mL)，乙酸铵(广州，500g)，氯化钠(广州，500g)；

色谱纯试剂：乙腈(CNW 4L)；

萃取填料：PSA(N-丙基乙二胺固相吸附剂)，C18(十八烷基硅烷键合硅胶)，ALN(中性氧化铝)。

2实验过程

2.1储备液的制备

59种杀虫剂混合储备液：称取各标准物质适量，用乙腈溶解并稀释成异柳磷、毒死蜱、灭菌磷、醚菊酯、苯醚菊酯、特丁硫磷的浓度约为5μg/mL，其他杀虫剂的浓度约为0.5μg/mL的储备液。

2.2样品溶液的制备

禽饲料样品粉碎，混合均匀，取5g样品于50mL聚乙烯离心管中，加水5mL浸泡5min，加入3.5g氯化钠，加入1％乙酸酸化乙腈20mL、振荡提取8min，在6000r/min的速度下离心4min，得上清液备用；

取上清液6mL，加入复合填料(0.3g C18+0.3g ALN)进行分散萃取，涡旋净化并离心，准确移取4mL上清液于40℃下氮吹至近干，用1mL复溶液复溶，复溶液为0.1％甲酸水溶液和乙腈的混合液，其中，复溶液中的0.1％甲酸水溶液和乙腈的体积比为1:1，最后得样品溶液。

2.3样品溶液的检测

取样品溶液过0.22μm滤膜，装瓶，上机进行液相色谱串联质谱法进行测定，色谱条件为：

色谱柱：规格为3μm，2.1mm×100mm的Venusil MP C18色谱柱；

流动相：0.1％甲酸水溶液与乙腈溶液的混合物；

0.1％甲酸水溶液与乙腈溶液的不同体积配比的混合液的梯度洗脱条件如表3所示：

表3

进样量：5μL

流速：0.4mL/L；

柱温：40℃。

质谱的条件是：

毛细管电压：5000V(电喷雾离子化+)/-4500V(电喷雾离子化-)

离子源温度：500℃

气帘气：30μL/min

喷雾器:50μL/min

辅助加热器:50μL/min

碰撞气：中度

扫描模式：多反映检测。

59种杀虫剂的质谱条件如表4所示：

表4

上表中“-”的表示负电压模式，“*”表示定量离子，入口电压和出口电压分别指碰撞室入口电压和碰撞室出口电压。

3方法验证

3.1检出限和定量限

按照2.1制备储备液，取储备液逐级稀释，稀释成异柳磷、毒死蜱、灭菌磷、醚菊酯、苯醚菊酯、特丁硫磷浓度为0.050μg/mL，其他杀虫剂为0.005μg/mL的标准溶液，以信噪比为3时的浓度为检出限，信噪比为10时的浓度为定量限，结果如表5所示。

表5

从表5可以看出，检出限0.004mg/kg～0.0400mg/kg之间，定量限0.0133mg/kg～0.133mg/kg之间，检出限和定量限均较低。

3.2线性范围

按照2.1中的方法配制储备液，将储备液逐级稀释。

异柳磷、毒死蜱、灭菌磷、醚菊酯、苯醚菊酯、特丁硫磷的标准工作溶液浓度为：0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL和2.00μg/mL；

其他杀虫剂的标准工作溶液浓度为：0.005μg/mL、0.01μg/mL、0.02μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL和0.2μg/mL。

上机测定，相关系数见表6。

表6

从表6可以看出，线性相关系数在0.9928～0.9997之间，线性关系良好。

3.3精密度

按照2.2制备禽饲料的样品溶液，分别按2.1配制59种杀虫剂的储备液，以异柳磷、毒死蜱、灭菌磷、醚菊酯、苯醚菊酯、特丁硫磷为0.200mg/kg，其他杀虫剂为0.020mg/kg的含量标准进行加标回收量的实验，每种杀虫剂的加标回收量的实验重复6次，精密度结果见表7。

表7

3.4准确度

针对59种杀虫剂中的每一种杀虫剂，称取9份混合均匀的样品5g(精确到0.001g)分别置于9个50mL聚乙烯离心管中，进行三个水平加标回收率的测定，水平一：将按照2.1制备得到储备液按照异柳磷、毒死蜱、灭菌磷、醚菊酯、苯醚菊酯、特丁硫磷为0.20mg/kg其他杀虫剂为0.020mg/kg的比例加入上述离心管中，然后再按照2.2样品溶液的制备方法制备得到样品溶液，进行测试，计算加入含量标准物质的回收率，结果见表8；水平二：加入异柳磷、毒死蜱、灭菌磷、醚菊酯、苯醚菊酯、特丁硫磷为0.40mg/kg其他杀虫剂为0.040mg/kg的比例加入储备液，测定标准物质的回收率，结果见表9；水平三：加入异柳磷、毒死蜱、灭菌磷、醚菊酯、苯醚菊酯、特丁硫磷为0.80mg/kg，其他杀虫剂0.080mg/kg的比例加入储备液，测定标准物质的回收率，结果见表10。

表8

表9

表10

3.7样品适用性的验证

在市场随机采购一批中鸽配合饲料、大鸡配合饲料、蛋鸡料、鹅配合饲料、蛋鸡食槽料粉碎样品，按照上述禽饲料中杀虫剂中残留量的测定方法开展检测工作，结果如表11所示。

表11

对禽饲料样品的提取液利用分散萃取的净化方式进行净化，有效除去提取液中的干扰测定的基质，空白样品基质配标，利用液相色谱串联质谱仪检测，以母离子筛选第一次定性，保留时间和子离子丰度比第二次定性，其中一个子离子峰面积定量，同时测定59种杀虫剂残留量。

禽饲料样品的提取液经过萃取净化后，其中59种目标化合物回收率达到71.0％～109.0％，24h内精密度和稳定性测试RSD≤15％，线性范围在0.005mg/kg～2.000mg/kg之间，检出限和定量限均能满足国家标准中关于禽饲料中59种杀虫剂残留限量的最低要求。

上述禽饲料中杀虫剂残留量的测定方法对禽饲料中的杀虫剂提取效果良好，专属性强，检出限和定量限足够低，线性范围良好，重复性好，准确可靠，可推广应运用于禽饲料的日常监督检测。

在进行上述实验之前，发明人还对实验中所使用的提取剂的提取效果以及所使用的净化填料的净化效果进行验证。

一、对本发明所使用的提取剂的提取效果的考察。

取三份5g禽饲料样品，分别加入5mL水浸泡5min，分别利用20mL的乙腈、乙酸酸化乙腈(乙酸的体积分数为1％)以及乙酸铵+乙腈(1g+20mL)三种提取剂进行提取，得到含有标准物质的样品溶液。

以异柳磷、毒死蜱、灭菌磷、醚菊酯、苯醚菊酯、特丁硫磷为0.20mg/kg其他杀虫剂为0.020mg/kg的比例加入标准在禽饲料中加入储备液，再按上述步骤进行禽饲料中杀虫剂的提取，最后进行加标回收计算(提取溶液未作净化处理)，对比不同提取溶剂对杀虫剂的提取效率，禽饲料中59种杀虫剂的回收率分布见表12及图1所示。

表12

由表12和图1可知，以1％乙酸酸化的乙腈溶液作为禽饲料中59种杀虫剂的提取剂时，有39种杀虫剂回收率在70％～120％，明显优于其他两种提取剂。因此，本发明采用1％乙酸酸化乙腈作为禽饲料中59种杀虫剂的提取剂。

二、对本发明所使用的萃取净化填料的净化效果的考察。

基于上述对提取剂提取效果的验证结果，本试验采用1％的乙酸酸化乙腈作为禽饲料中59种杀虫剂的提取液。

取上述一中的样品溶液4mL进行固相萃取净化，对比填料分别为十八烷基硅烷键合硅胶(C18)、中性氧化铝(ALN)和N-丙基乙二胺(PSA)，且规格均为0.3g/3mL的固相萃取柱的萃取效果，观察其对禽饲料基质的净化效果，旨在找出一种净化效果较好的净化填料。以异柳磷、毒死蜱、灭菌磷、醚菊酯、苯醚菊酯、特丁硫磷为0.20mg/kg，其他杀虫剂为0.020mg/kg的比例加入标准在禽饲料中加入储备液，禽饲料中59种杀虫剂的回收率分布见表13及图2。

表13

由表13以及图2可知，0.3g/3mL的C18和ALN固相萃取柱的净化效果较好。

在上述实验的基础之上，对比C18和ALN这两种填料的分散萃取效果和固相萃取效果，以异柳磷、毒死蜱、灭菌磷、醚菊酯、苯醚菊酯、特丁硫磷为0.20mg/kg，其他杀虫剂为0.020mg/kg的比例加入标准在禽饲料中加入储备液，其萃取效果对回收率分布的影响见表14和图3。

表14

从表14和图3可以看出C18和ALN两种填料分别以固相萃取和分散萃取的方式进行，0.3g C₁₈和0.3g ALN进行分散萃取效果均优于固相萃取的效果。

基于上述实验结果，将0.3g C18、0.3g ALN以及0.3g C18+0.3g ALN这三种填料进行分散萃取效果的对比实验，观察其对禽饲料样品的净化效果，旨在找出一种具有较好净化效果的净化填料。以异柳磷、毒死蜱、灭菌磷、醚菊酯、苯醚菊酯、特丁硫磷为0.20mg/kg其他杀虫剂为0.020mg/kg的比例加入标准在禽饲料中加入储备液，禽饲料中59种杀虫剂的回收率分布见表15和图4。

表15

从表15和图4中可以看出这两种填料的复合分散萃取效果优于其单独的分散萃取效果。

除对提取剂以及萃取填料的效果的验证和考察之外，本发明还通过样品空白基质配标，空白基质配标是通过取空白样品进行方法前处理所得的样液作为溶剂配制标液，然后利用外标法定量，进一步提高本发明的准确性。通过溶剂和空白基质配制标准溶液建立6点校正曲线，以下为实验过程。

以马拉硫磷、克百威、胺菊酯、氟虫腈、氟虫脲和噻嗪酮分别作为有机磷类、氨基甲酸酯类、菊酯类、苯基吡唑类、苯甲酰脲类和杂环类农药的代表。各曲线图如图5～10所示。通过其斜率进行计算：ME(％)＝(基质标曲斜率/溶剂标曲斜率-1)×100；ME：0％～20％：弱基质效应；ME：20％～50％，中等基质效应；ME＞50％，强基质效应；若为负值则是负效应。

由图5～10可知，利用液相色谱串联质谱仪测定禽饲料中59种杀虫剂，其基质效应以负效应为主。基质效应不能被消除，但可以通过基质配标准工作曲线，对基质效应进行校正，相比传统的溶剂配标准工作曲线，其定量准确性更高。经过基质曲线校正后，按照优选的1％乙酸酸化乙腈作为提取剂，以及0.3g C18+0.3g ALN复合填料进行分散萃取净化，以0.02mg/kg加标量进行加标回收实验，其回收率分布情况如图11和表16所示。

表16

另外，本发明还通过液相色谱串联三重四级杆质谱仪进行检测，进一步优化禽饲料中杀虫剂残留量测定过程。使用液相色谱串联质谱法进行检测时，每针总时长为8.5min，与气相色谱法、气相质谱法和液相色谱法完成整套数据分析需要≥35min相比，检测效率大大提高。色谱与质谱相比，质谱除了能通过保留时间和定量离子丰度准确定量之外，还能通过定性离子对杀虫剂进行定性确认，降低假阳性机率，59种杀虫剂总离子流图如图12所示。此外，液相色谱串联质谱法利用多种电离方式对目标化合物检测选择性更强。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种禽饲料中杀虫剂残留量的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：在禽饲料样品中加入提取剂进行充分提取，离心，得提取液；

步骤二：对步骤一中得到的提取液利用复合填料进行萃取净化，离心，得净化液；

步骤三：将步骤二中得到的净化液利用液相色谱串联质谱仪进行检测。

2.根据权利要求1所述的禽饲料中杀虫剂残留量的测定方法，其特征在于，所述步骤一中，所述提取剂为1％乙酸酸化的乙腈溶液，所述1％乙酸酸化的乙腈溶液中乙酸的体积分数为1％，所述1％乙酸酸化乙腈溶液的酸碱度为pH＝4。

3.根据权利要求2所述的禽饲料中杀虫剂残留量的测定方法，其特征在于，所述步骤一中，所述在禽饲料样品中加入提取剂进行充分提取还包括：在禽饲料样品中先加水，充分浸泡，加入乙酸酸化的乙腈溶液，再以禽饲料样品与氯化钠的重量比为5︰(2～5)的比例加入氯化钠，进行涡旋振荡提取。

4.根据权利要求1～3任意一项所述的禽饲料中杀虫剂残留量的测定方法，其特征在于，所述步骤二中，所述萃取净化是以分散萃取的方式进行萃取净化。

5.根据权利要求4所述的禽饲料中杀虫剂残留量的测定方法，其特征在于，所述步骤二中，所述复合填料为十八烷基硅烷键合硅胶和中性氧化铝的混合物。

6.根据权利要求5所述的禽饲料中杀虫剂残留量的测定方法，其特征在于，所述十八烷基硅烷键合硅胶和中性氧化铝的混合物中十八烷基硅烷键合硅胶与中性氧化铝的质量比为1︰1。

7.根据权利要求1所述的禽饲料中杀虫剂残留量的测定方法，其特征在于，所述步骤三中，所述将步骤二中得到的净化液利用液相色谱串联质谱仪进行检测前还包括将步骤二中得到的净化液利用0.22μm的滤膜进行过滤的步骤。

8.根据权利要求7所述的禽饲料中杀虫剂残留量的测定方法，其特征在于，所述步骤三中，色谱的检测条件是：

色谱柱：规格为3μm，2.1mm×100mm的Venusil MP C18色谱柱；

流动相：0.1％甲酸水溶液与乙腈溶液的混合物；

0.1％甲酸水溶液与乙腈溶液的不同体积配比的混合液的梯度洗脱条件如下：

进样量：5μL；

流速：0.4mL/min；

柱温：40℃。

9.根据权利要求8所述的禽饲料中杀虫剂残留量的测定方法，其特征在于，所述步骤三中，质谱的检测条件是：

毛细管电压：5000V(电喷雾离子化+)/-4500V(电喷雾离子化-)

离子源温度：500℃

气帘气：30μL/min

喷雾器:50μL/min

辅助加热器:50μL/min

碰撞气：中度

扫描模式：多反映检测。

10.根据权利要求9所述的禽饲料中杀虫剂残留量的测定方法，其特征在于，所述步骤三中，质谱的检测条件是：

59种杀虫剂的质谱检测条件如下：

上表中“-”的表示负电压模式，“*”表示定量离子，入口电压和出口电压分别指碰撞室入口电压和碰撞室出口电压。