CN109320561A - 一种去除植物来源黄酮类提取物中塑化剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种去除植物来源黄酮类提取物中塑化剂的方法，所述方法是根据乳杆菌具有吸附介质中塑化剂的能力，利用乳杆菌发酵并将其附载于活性炭上制成的生物吸附载体，从而高效截留吸附塑化剂。其有益效果在于：去除率高，成本低，全程无有害物质参与，保障产物的安全性；属于物理吸附，处理过程温和，能最大程度的保留植物提取物的活性；工艺简单，适合大规模生产应用；无有机溶剂，环保，无二次污染。

Description

一种去除植物来源黄酮类提取物中塑化剂的方法
技术领域
本发明属于有害物质去除技术领域，更具体地，涉及一种去除植物来源黄酮类提取物中塑化剂的方法。
背景技术
塑化剂也称邻苯二甲酸酯类物质，通常用于软化包装制品和饮料的塑料容器。由于它们与塑料分子之间由氢键或范德华力连接，彼此保留各自相对独立的化学性质，因此比较容易在包装或者制造过程中迁移到食物、饮用水中。加上化工厂、垃圾填埋场、城市和工业污水处理厂的排放，使得地表水、地下水、饮用水中都不同程度地受到了塑化剂的污染，在地表水、城市污水厂、底泥中的污染也很严重。有研究表明，由于邻苯二甲酸酯具有亲脂性和难降解特性，可通过生态系统的食物链网富集积累，再由食物链到达人体内，进而生成伪激素，并发送影响激素水平的伪化学信号，这将会破坏原有的内分泌系统，进一步造成内分泌失调。塑化剂进入人体也可能引发生殖系统异常、出生缺陷、癌症等危害。美国国家环保局（EPA）已将该物质列为优先控制的污染物。
研究表明，植物来源提取物中塑化剂的来源主要有两方面：1植物从土壤，水等环境中迁移；尤其是木本植物；2提取过程中，譬如有机溶剂等。
目前的塑化剂去除方法有：1有机溶剂提取法，该方法是利用塑化剂的实质是邻苯二甲类有机物质，根据它与溶剂具有不同的极性，用差异性极性的有机溶剂将其萃取出来，缺点是，容易带入有机溶剂，增加二次污染的风险。2紫外法，3超声法，这两种方法都是利用紫外或超声波破坏邻苯二甲酸酯类物质的结构，将其降解为小分子物质的原理来去除塑化剂。缺点是，去除率低，且对含有塑化剂的本体物质的质量有损害。4电催化氧化法，利用电荷迁移带动邻苯二甲类有机物质迁移，目前还处于实验阶段，实际应用条件难把控。5强氧化剂法，也是破坏邻苯二甲酸酯类物质的结构，可能会影响植物提取物本身的活性。6絮凝剂法，去除率低，易二次污染。7物理吸附法，如大孔树脂，超滤膜，去除率高，对提取物的活性小，但是成本高。
益生菌是正常肠道菌群中一类极其重要的微生物，具有维持肠道微生态平衡和其他许多重要的生理功能。乳酸菌是常见的益生菌，研究表明乳杆菌具有吸附致突变因子的能力，是一种很有潜力的致突变因子生物脱除剂。有文献“乳杆菌吸附塑化剂的影响因素分析及效果评价”，称乳杆菌细胞对 3 种塑化剂DEP、DBP 或 DEHP 具有不同的吸附效果，其中 DBP 的吸附效果最好，为 43.32%；而且菌株在塑化剂吸附效果上存在差异性，菌株NCFM 表现出较高的吸附效果。初步的研究证实乳杆菌细胞具有吸附介质中塑化剂的能力，为有效去除食品中的塑化剂提供可能性和理论上的指导。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种去除植物来源黄酮类提取物中塑化剂的方法，是根据乳杆菌具有吸附介质中塑化剂的能力，利用乳杆菌发酵并将其附载于活性炭上制成的生物吸附载体，从而高效截留吸附塑化剂的方法。
本发明提供了一种去除植物来源黄酮类提取物中塑化剂的方法，包括如下步骤：
S1：将活化后的乳酸菌于发酵培养基中扩大培养24~48h，得发酵液再于4℃，4000~6000rpm离心3~5min沉淀，收集沉淀细胞；
S2：用已灭菌的pH为6.0~7.0的磷酸缓冲液或生理盐水重新悬浮步骤S1中细胞，搅拌均匀后于4℃，4000~6000rpm离心3~5min沉淀，去上清液，反复2~3次，以去除包裹在菌体细胞表面的杂质；
S3：将步骤S2中沉淀细胞进行预处理后，4000~6000 r/min转速下离心5~10 min，取沉淀再用无菌水洗涤2~3次，得菌体细胞；热、盐或酸处理会在一定程度上改变细胞壁上的蛋白质性质，促使肽或蛋白质与多糖之间发生美拉德反应，从而使细胞的肽聚糖层减少交联，形成没有规律的细胞壁结构，增加了细胞孔径，提供了更多的吸附位点；
S4：将步骤S3中菌体细胞固定于活性炭载体上，制成生物吸附载体；
S5：将植物来源黄酮类提取物溶于10~100倍体积溶剂中，得稀释液；
S6：将步骤S5中稀释液于生物吸附载体中反复浸渍过滤3~5次，浸渍过滤的总时间为4~6h，收集滤液，40~60℃浓缩干燥，得去除塑化剂的植物来源黄酮类提取物。
进一步，所述乳酸菌为益生菌类的乳杆菌。
进一步，所述发酵培养基为MRS培养基，组分为：蛋白胨 10.0 g，牛肉膏 10.0 g，酵母膏 5.0 g，柠檬酸氢二铵2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐温80 1.0 mL，乙酸钠5.0 g，磷酸氢二钾 2.0 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰 0.25 g，水 1000 mL，pH为 6.2~6.6。
进一步，所述预处理是酸处理，热处理，氯化钠处理中的一种或一种以上。
进一步，所述酸处理是在2~4 mol/L的盐酸溶液中处理60~90 min。
进一步，所述热处理是在100℃水浴10~15min。
进一步，所述氯化钠处理是在1~5mol/L氯化钠溶液中，500~1000W超声处理5~10min。
进一步，所述S5中溶剂为无菌水或40%乙醇溶液。
进一步，所述塑化剂为DEP，DBP，DEHP，DOP或BBP。
相对于现有技术，本发明具有如下的优点及效果：
利用本发明方法去除率高，成本低，工艺简单，适合大规模生产应用。方法过程中无有害物质参与，保障产物的安全性。制备的产品属于物理吸附，能最大程度的保留植物提取物的活性。同时环保，无二次污染。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
实施例中所使用的培养基的配制：
a活化培养基：胨化乳15g，酵母浸粉5g，磷酸二氢钾2g，葡萄糖10g，番茄浸出粉2.5，吐温80 1mL，调节pH为6.8，灭菌备用。
b发酵培养基：蛋白胨 10.0 g，牛肉膏 10.0 g，酵母膏 5.0 g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0 g，吐温80 1.0 mL，乙酸钠5.0 g，磷酸氢二钾 2.0 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，水 1000 mL，pH为 6.2~6.6，灭菌备用。
本发明采用以上黄酮类提取物作为处理对象，但类似的黄酮类提取物均可采用此方法。以下实施例中所使用的银杏黄酮提取物的制备：
银杏叶洗净干燥，粉碎机打粉过100目，加入 20 倍（V/W）的 75%乙醇，用 40%NaOH调节乙醇溶液 pH至9.5，80℃回流提取2次，每次2h。趁热过滤，合并2次的滤液。（趁热用布氏漏斗真空减压抽滤，滤液收集。第一次得到的滤渣再用相同工艺提取抽滤一次）用浓盐酸调节提取液PH至3.5。静置48h，过滤，取沉淀，用适量水洗至洗出液呈中性，60℃真空减压干燥得干膏。干膏用粉碎机粉碎（过100目）得银杏叶提取物干膏粉。合并两次滤液，用浓盐酸调节提取液 pH 至 3.5。静置 48h，过滤，取沉淀，水洗至洗出液至中性，减压浓缩，60℃真空减压干燥得干膏。干膏用粉碎机粉碎（过100目）得银杏黄酮提取物。
实施例1：
一种去除植物来源黄酮类提取物中塑化剂的方法，包括如下步骤：
S1：将嗜酸乳杆菌接种于活化培养基，37℃培养24h，调制成浓度为106 CFU/ml的菌悬液；
S2：取步骤S1中菌悬液5mL接种于发酵培养基中，37℃摇床培养，其中摇床转速为200rpm，得发酵液；
S3：取步骤S2中发酵液1000mL于4℃，6000rpm离心3min沉淀，收集沉淀细胞；
S4：用已灭菌的pH为6.0~7.0的磷酸缓冲液重新悬浮步骤S3中细胞，搅拌均匀后于4℃，6000rpm离心3min沉淀，弃上清液，去除反复3次；
S5：沉淀细胞预处理，即将细胞于2mol/L的盐酸溶液中处理90 min 后，，6 000 r/min，于4℃离心5 min，取沉淀再用无菌水洗涤2次；
S6：将步骤S5中预处理后的沉淀细胞固定于活性炭载体上，制成生物吸附载体；
S7：将银杏黄酮提取物2g添加1mgDEP，1mgDOP，1mgDEHP后溶于100mL的无菌水中，得稀释液；
S8：将步骤S7中稀释液于生物吸附载体中反复过滤5次，过滤时间为6h，收集滤液，60℃蒸发浓缩干燥，得去除塑化剂的银杏黄酮提取物。
S9：利用高效液相色谱法对去除塑化剂前后银杏黄酮提取物中塑化剂含量进行定量检测，计算去除率。具体见表1。
表1
实施例2
一种去除植物来源黄酮类提取物中塑化剂的方法，包括如下步骤：
S1：将乳双歧杆菌接种于活化培养基，37℃培养24h，调制成浓度为106 CFU/ml的菌悬液；
S2：取步骤S1中菌悬液5mL接种于发酵培养基中，37℃摇床培养，其中摇床转速为200rpm，得发酵液；
S3：取步骤S2中发酵液1000mL于4℃，6000rpm离心5min沉淀，收集沉淀细胞；
S4：取用已灭菌的pH为6.0~7.0的磷酸缓冲液重新悬浮步骤S3中细胞，搅拌均匀后于4℃，6000rpm离心5min沉淀，弃上清液，去除反复3次；
S5：沉淀细胞预处理，即将细胞于100℃水浴热处理15min；
S6：将步骤S5中预处理后的沉淀细胞固定于活性炭载体上，制成生物吸附载体；
S7：将银杏黄酮提取物2g添加1mgDEP，1mgDOP，1mgDEHP后溶于100mL的无菌水中，得稀释液；
S8：将步骤S7中稀释液于生物吸附载体中反复过滤5次，过滤时间为6h，收集滤液，60℃蒸发浓缩干燥，得去除塑化剂的银杏黄酮提取物。
S9：利用高效液相色谱法对去除塑化剂前后银杏黄酮提取物中塑化剂含量进行定量检测，计算去除率。具体见表2。
表2

Claims (9)

1.一种去除植物来源黄酮类提取物中塑化剂的方法，其特征在于，所述方法包含如下步骤：
S1：将活化后的乳酸菌于发酵培养基中扩大培养24~48h，得发酵液再于4℃，4000~6000rpm离心3~5min沉淀，收集沉淀细胞；
S2：用已灭菌的pH为6.0~7.0的磷酸缓冲液或生理盐水重新悬浮步骤S1中沉淀细胞，搅拌均匀后于4℃，4000~6000rpm离心3~5min沉淀，去上清液，反复2~3次；
S3：将步骤S2中沉淀细胞进行预处理后，4000~6000 r/min转速下离心5~10 min，取沉淀再用无菌水洗涤2~3次，得菌体细胞；所述预处理是酸处理，热处理，氯化钠处理中的一种或几种；
S4：将步骤S3中菌体细胞固定于活性炭载体上，制成生物吸附载体；
S5：将植物来源黄酮类提取物溶于10~100倍体积溶剂中，得稀释液；
S6：将步骤S5中稀释液于生物吸附载体中反复浸渍过滤3~5次，浸渍过滤的总时间为4~6h，收集滤液，40~60℃浓缩干燥，得去除塑化剂的植物来源黄酮类提取物。
2.根据权利要求1所述去除植物来源黄酮类提取物中塑化剂的方法，其特征在于，所述扩大培养是将活化后的乳酸菌制成浓度为104～106 CFU/ml的菌悬液，取5~10mL接种于发酵培养基中，30~40℃摇床培养，其中摇床的转速为100~200rpm，得发酵液。
3.根据权利要求1所述去除植物来源黄酮类提取物中塑化剂的方法，其特征在于，所述乳酸菌为益生菌类的乳杆菌。
4.根据权利要求1所述去除植物来源黄酮类提取物中塑化剂的方法，其特征在于，所述发酵培养基为MRS培养基，组分为：蛋白胨 10.0 g，牛肉膏 10.0 g，酵母膏 5.0 g，柠檬酸氢二铵2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐温80 1.0 mL，乙酸钠5.0 g，磷酸氢二钾 2.0 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰 0.25 g，水 1000 mL，pH为 6.2~6.6。
5.根据权利要求1所述去除植物来源黄酮类提取物中塑化剂的方法，其特征在于，所述酸处理是在2~4 mol/L的盐酸溶液中处理60~90 min 。
6.根据权利要求1所述去除植物来源黄酮类提取物中塑化剂的方法，其特征在于，所述热处理是在100℃水浴10~15min。
7.根据权利要求1所述去除植物来源黄酮类提取物中塑化剂的方法，其特征在于，所述氯化钠处理是在1~5mol/L氯化钠溶液中，500~1000W超声处理5~10min。
8.根据权利要求1所述去除植物来源黄酮类提取物中塑化剂的方法，其特征在于，所述S5中溶剂为无菌水或40%乙醇溶液。
9.根据权利要求1所述去除植物来源黄酮类提取物中塑化剂的方法，其特征在于，所述塑化剂为DEP，DBP，DEHP，DOP或BBP。
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