CN109295222A - Pik3ca基因e545k突变数字pcr检测体系的优化方法及检测产品 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种PIK3CA基因E545K突变数字PCR检测体系的优化方法,检测体系包括上游引物、下游引物、野生型探针、突变型探针、野生型模板和突变型模板;野生型模板是酶切后的正常人体gDNA,突变型模板是酶切后的插入PIK3CA基因E545K突变片段的突变质粒;将突变型模板和野生型模板按一定的拷贝数比例配制成标准品,采用数字PCR以中突变频率标准品为模板进行反应,根据反应数据制作数据统计图,选定野生型的荧光区域和突变型的荧光区域。采用数字PCR以野生型模板为模板进行反应,确定背景阈值。通过本发明的PIK3CA基因E545K突变数字PCR检测体系的优化方法优化后的检测产品准确度更高。
Description
技术领域
本发明涉及检测人类PIK3CA基因E545K突变的数字PCR检测产品及其优化方法,属于生物技术领域。
背景技术
磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3Ks)是一种脂质激酶,参与细胞存活、运动、黏附和凋亡等多种细胞生理功能的调节。PIK3是由调节亚基p85和催化亚基p110组成的异源二聚体,PI3Ks的p110α催化亚基由PIK3CA基因编码,定位于3q26.3,长34kb。PI3Ks受到生长因子受体酪氨酸激酶如表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)、胰岛素受体等激活,充当细胞内部的一个信号传递者。活化后的PI3Ks催化磷脂酰肌醇4磷酸(PI-4-P)和磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PI-4,5-P2)磷酸化成磷脂酰肌醇3,4二磷酸(PI-3,4-P2)和磷脂酰肌醇3,4,5三磷酸(PI-3,4,5-P3,Ptd InsP3)。从而活化一系列蛋白,包括调节细胞增殖、存活和细胞周期调控等。PIK3CA基因发生突变,会导致激酶活性增强,激活PI3K通路的下游AKT通路,减少细胞增值对于生长因子的依赖,增加肿瘤细胞的浸润和转移。当PIK3CA基因因突变而激活时,通过PI3K-AKT途径可使AKT过度激活,无限制的促进细胞生长和繁殖,并抑制细胞凋亡,最终导致肿瘤发生。在多种癌症中发现PIK3CA基因突变的存在,其中在肝癌36%、乳腺癌中突变率为26%、结直肠癌中突变率为25%、肺癌中突变率为2%。PIK3CA基因约4/5的突变发生在9外显子(E542K、E545D、E545K突变位点)和20外显子(H1047R、H1047L)这两个热点区域。具有上述突变的患者对EGFR、HER2靶向药物治疗存在耐药性。例如,PIK3CA基因突变的乳癌患者对ErbB1/ErbB2双重酪氨酸激酶受体抑制剂拉帕替尼(TYKERB,商品名Tykerb)在内的常规HER2靶向治疗耐药。PIK3CA基因突变乳腺癌患者对Her2靶向药物注射用曲妥珠单抗耐药,PIK3CA基因突变结直肠癌患者对以EGFR为靶点的单克隆抗体西妥昔单抗产生耐药。因此,在癌症治疗过程中,对癌症患者进行PIK3CA基因的特定突变进行检测,是做到精准用药的关键,也可防止药物勿用带来的经济损失与治疗时间延误。
传统的针对对基因特定位点的突变检测常用的方法有一代测序和qPCR,但其灵敏度较低,因此需要具备高突变比例的组织标本进行检测,不适合实时检测监控。血浆游离DNA(cfDNA)是存在于血浆中的一种小片段DNA,平均长度在180bp,由体细胞产生释放进入血液。ctDNA是由肿瘤细胞释放进入血液的片段化DNA,因此,可通过检测ctDNA中的突变信息反应肿瘤细胞的突变信息。对cfDNA中的ctDNA的检测成为检测肿瘤突变的一种途径。cfDNA用于肿瘤突变检测优势在于操作无创,可实现实时检测和动态监测,克服肿瘤组织的异质性。然而,ctDNA所占cfDNA的含量极低,低于百分之一,传统检测方法无灵敏且准确的检测出血浆游离DNA中所包含突变信息。
数字PCR(dPCR)的出现革新了传统PCR检测的发展,极大的提高了检测的灵敏度。通过统计大量的单拷贝反应微滴,大大的提高了准确度和精密度。由于dPCR统计的是单个分子总数,理论上能做到每个反应单位为单拷贝模板。因此,数字PCR可以达到绝对定量。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种可以使得数字PCR反应体系检测的准确度有更高的PIK3CA基因E545K突变数字PCR检测体系的优化方法,以及通过该优化方法优化后的检测产品。
本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是:一种PIK3CA基因E545K突变数字PCR检测体系的优化方法,所述检测体系包括上游引物、下游引物、野生型探针、突变型探针、野生型模板和突变型模板;所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示,所述野生型探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,所述突变型探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示;所述野生型模板是酶切后的正常人体gDNA,所述突变型模板是酶切后的插入PIK3CA基因E545K突变片段的突变质粒;
将突变型模板和野生型模板按1:50至1:200的拷贝数比例配制成中突变频率标准品,采用数字PCR以中突变频率标准品为模板进行反应,根据反应数据制作数据统计图,选定野生型的荧光区域和突变型的荧光区域,突变型的荧光区域与野生型的荧光区域中荧光信号拷贝数的比值与中突变频率标准品中突变型模板和野生型模板的拷贝数比例相同;
采用数字PCR以野生型模板为模板进行反应,突变型的荧光区域中出现的荧光信号拷贝数即为该检测体系的背景阈值。
将突变型模板和野生型模板按1:1至1:10的拷贝数比例配制成高突变频率标准品,采用实时荧光定量PCR以低突变频率标准品为模板进行反应,根据反应终点荧光值和初始荧光值与探针使用浓度的关系,优化野生型探针和突变型探针的使用浓度。
所述反应终点荧光值和初始荧光值与探针使用浓度的关系是反应终点荧光值与初始荧光值的比值越大,且反应终点荧光值与初始荧光值的差值越大,则野生型探针和突变型探针的使用浓度越好。
将突变型模板和野生型模板按1:1000至1:10000的拷贝数比例配制成低突变频率标准品,采用数字PCR以低突变频率标准品为模板进行反应,若突变型的荧光区域中出现的荧光信号拷贝数大于所述背景阈值的2.5倍,则该检测体系的灵敏度达到低突变频率标准品的拷贝数比例相同的值。
所述野生型探针和突变型探针是MGB探针,所述野生型探针和突变型探针的3’端均为NFQ基团。
所述野生型探针的5’端为VIC基团,所述突变型探针的5’端为FAM基团。
本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是:采用上述的优化方法优化后的PIK3CA基因E545K突变数字PCR检测产品。
所述上游引物和下游引物在反应体系中的终浓度为900nM,所述野生型探针和突变型探针在反应体系中的终浓度为200nM。
所述野生型探针和突变型探针是MGB探针,所述野生型探针和突变型探针的3’端均为NFQ基团;所述野生型探针的5’端为VIC基团,所述突变型探针的5’端为FAM基团。
本发明具有积极的效果:
(1)本发明的PIK3CA基因E545K突变检测体系,采用的标准品是用酶切后的正常人体gDNA和酶切后的插入PIK3CA基因E545K突变片段的突变质粒按拷贝数比例配制而成,不同突变频率标准品起到不同的作用。标准品采用gDNA和质粒可以最大程度的还原检测样本的特征,给体系的优化提供了很多的基础,在体系优化中起到决定性的作用。
(2)本发明的PIK3CA基因E545K突变检测体系通过中突变频率标准品的数字PCR检测结果确定野生型的荧光区域和突变型的荧光区域,使得数据统计的结果更加准确。本发明的PIK3CA基因E545K突变检测体系通过野生型模板的数字PCR检测结果确定检测体系的背景阈值,检测样本的突变拷贝数时,突变拷贝数等于检测结果减去背景阈值,可以使得结果更加准确。
(3)本发明的PIK3CA基因E545K突变检测体系通过低突变频率标准品的数字PCR检测结果,可以确定检测体系的灵敏度。
(4)本发明的PIK3CA基因E545K突变检测体系通过高突变频率标准品的传统实时荧光PCR检测结果进行探针浓度优化,根据反应前荧光强度(F0)与反应后荧光强度(Fn)差值和比值较大的反应体系为标准,选择合适的探针浓度,该方法结果准确,成本较低。
(5)本发明的PIK3CA基因E545K突变检测体系的引物探针为自行设计,探针为MGB探针,探针序列更短,特异性好。引物探针经过多重组合优化选定,扩增效率高,灵敏度高。
(6)本发明的优化后的PIK3CA基因E545K突变检测体系快速,高效,成本较低,准确度高可根据血浆中微量的E545K突变ctDNA快速准确的监测出肿瘤患者PIK3CA基因的E545K突变,是将数字PCR平台用于ctDNA的检测,能及时监测患者新的基因突变的发生,为临床治疗方案的制定和调整提供依据。
附图说明
图1为实施例1的试剂盒检测全野生型模板的反应数据结果图;
图2为实施例1的试剂盒检测突变野生比为0.01的模板的反应数据结果图;
图3为实施例1的试剂盒检测突变野生比为0.0001的模板的反应数据结果图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述,有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明,不能理解为对本发明保护范围的限制,该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中,若非特意表明,所用的试剂均为分析纯,所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件,或按照制造商所建议的条件。除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
主要试剂:
所有试剂购买自正规厂家,主要试剂包括:TaqMan GenotypingMaster Mix(2×)(Applied Biosystems)、25×Droplet stabilizer(RainDance)、AfaI内切酶(TAKARA,1116A)、10×T Buffer(TAKARA,1116A)与0.1%BSA(TAKARA,1116A)、质粒小量提取试剂盒(D1100,北京索莱宝科技有限公司)、AxyPrep Multisource Genomic DNA Miniprep Kit(AP-MN-MS-GDNA-50G,康宁生命科学有限公司)等。
主要仪器:
PCR仪(厂家:EXcell Bio)、3.0荧光定量仪、高速离心机、漩涡震荡仪、冰箱、灭菌锅、移液枪、RainDropSource(RainDance Technologies)、RainDropSense(RainDance Technologies)等。
实施例1
本实施例的PIK3CA基因E545K突变数字PCR检测试剂盒包括上游引物(PIK3CA-E545K-F)、下游引物(PIK3CA-E545K-R)、野生型探针(PIK3CA-E545K-wt)和突变型探针(PIK3CA-E545K-mt)、酶切后的正常人体gDNA和酶切后的突变质粒。
引物和探针为自行设计,经过多重组合优化,引物探针中包括突变质粒中所插入的突变片段的同源区域。引物探针均由上海百力格生物技术有限公司合成,引物和探针的核苷酸序列如表1所示。
表1引物探针序列表
名称 | Sequence(5’—3’) | Seq No. |
PIK3CA-E545K-F | TCAAAGCAATTTCTACACGAGATCCT | 1 |
PIK3CA-E545K-R | GCACTTACCTGTGACTCCATAGAAA | 2 |
PIK3CA-E545K-wt | CTCTCTGAAATCACTGAGCAG | 3 |
PIK3CA-E545K-mt | CTCTGAAATCACTAAGCAG | 4 |
野生型探针(PIK3CA-E545K-wt)的5’端为VIC荧光基团,野生型探针(PIK3CA-E545K-wt)的3’端为NFQ基团。突变型探针(PIK3CA-E545K-mt)的5’端为FAM荧光基团,野生型探针(PIK3CA-E545K-wt)的3’端为NFQ基团。
本实施例采用酶切后的正常人体gDNA作为野生型模板,酶切后的含有E545K突变插入片段的质粒作为突变模板,突变质粒中所插入片段为人源的PIK3CA基因,片段大小为200bp。
本实施例将野生型模板和突变型模板按不同的拷贝数比例配制成理论突变频率的模板,制备方法如下:
1.样本抽提。
采用试剂盒(AxyPrep Multisource Genomic DNA Miniprep Kit)提取一名无PIK3CA突变的健康人的血细胞DNA,具体的操作参见试剂盒产品说明书。
采用试剂盒(质粒小量提取试剂盒)提取人工构建的成功导入具PIK3CA突变E545K突变与野生型核酸片段的质粒工程菌,具体的操作参见试剂盒产品说明书。
2.gDNA和突变质粒的浓度测定。
采用3.0对抽提后的DNA浓度测定,具体步骤如下:
1)向样本管加入1μl Qubit dsDNA HS Reagent和199μl Qubit dsDNA HSbuffer,漩涡混匀4s;
2)向已添加工作液的样品管内吸取1μl工作液,加入1μl的DNA样本,漩涡混匀4s,每管的最终体积是200μl;
3)所有管在室温避光孵育2分钟;
4)在3.0主屏上点击“DNA”键,然后选择dsDNA High Sensitivity分析模式;
5)把样本管放入3.0中,盖上盖子,点击read;
6)选择Calculate Initial初始浓度,然后选择Volume of Sample Used:1μl,此时显示的结果为样本初始浓度,单位ng/μl;
7)读取下一个样本:取出Qubit3.0荧光光度计中样本;
8)用同样的方法测定突变质粒的浓度。
3.标准品的制备。
1)DNA模板酶切片段化。
gDNA和突变质粒分别进行酶切反应。gDNA的酶切反应体系如表2所示。
表2 gDNA酶切反应体系表
成分 | 用量 |
试剂名称10×T Buffer | 5μl |
AfaI | 0.5μl |
0.1%BSA | 5μl |
血细胞gDNA | 39.5μl |
突变质粒的酶切反应体系如表3所示。
表3突变质粒的酶切反应体系表
成分 | 用量 |
10x SEBuffer | 5μl |
BSA | 5μl |
EcoRⅠ | 0.5μl |
质粒DNA | 39.5μl |
酶切后磁珠法回收:
a.将50μl的酶切产物转移到1.5ml的EP管中,向EP管中加入90μl的AmPure XPReagent磁珠,吹打混匀,静置5min。
b.将EP管至于磁力架上,至磁珠分离,弃溶液。
c.200μl的浓度为80%的乙醇水溶液清洗2遍,晾干。
d.52μl的dH2O洗脱磁珠,至于磁力架,待磁珠分离。
e.转移50μl的DNA溶液至于一新EP管,加入50μl磁珠,静置5min。
f.置于磁力架,待磁珠分离,用200μl的80%浓度为80%的乙醇水溶液洗涤2次,晾干。
g.用12μl的dH2O洗脱磁珠,转移9.4μl的溶液置于一新的PCR管中,用于接下来的实验。取1μl进行3.0定量。
2)标准品的配制。
①酶切后的gDNA根据每纳克300拷贝进行计算,逐级稀释到2.0×106copies/μl。
②酶切后的突变质粒拷贝数浓度按如下公式:9.12×108×质粒浓度(ng/μl)÷质粒长度;逐级稀释到2.0×106copies/μl、2.0×104copies/μl、2.0×102copies/μl。
③配制体系优化用标准品:分别取等量的浓度为2.0×104copies/μl的酶切后的gDNA与酶切后的突变质粒混匀,得到突变野生比为1:1的高突变频率标准品模板。取10μl的浓度为2.0×106copies/μl的酶切后的gDNA,加入10μl浓度为2.0×104copies/μl的酶切后的突变质粒得到突变野生比为0.01的中突变频率标准品模板。取10μl的浓度为2.0×106copies/μl的酶切后的gDNA,加入10μl浓度为2.0×102copies/μl的酶切后的突变质粒得到突变野生比为0.0001的低突变频率标准品模板。
本实施例采用实时荧光定量(qPCR)反应进行探针浓度的优化。
根据试验条件固定上游引物和下游引物在反应体系中的终浓度为900nM,探针浓度按如下方案进行优化实验:
先将野生型探针(PIK3CA-E545K-wt)和突变型探针(PIK3CA-E545K-mt)的终浓度按表4所示的浓度,分成9个试验组。
表4探针浓度分组表
根据表5所示的qPCR反应体系组分表,配制qPCR反应体系,模板采用突变野生比为1:1的高突变频率标准品模板。
表5 qPCR反应体系组分表
根据表6所示的qPCR反应程序进行qPCR反应。
表6 qPCR反应程序表
对qPCR反应结果进行数据分析,qPCR反应结果如表7所示。根据Fn/Fn0值越大且Fn-Fn0差值越大,检测体系的信噪比越高、准确度越高,挑选2-2组,也即野生型探针和突变型探针反应的终浓度为200nM时,反应体系最适合后续的数字PCR反应。
表7 qPCR反应结果
本实施例的PIK3CA基因E545K突变数字PCR检测试剂盒,检测样本一般为血液,也可以为能提取核酸的任意形式的样品,包括但不限于:全血、血清、血浆和组织样品;组织样品包括但不限于:石蜡包埋组织、新鲜组织和冰冻切片。
本实施例的PIK3CA基因E545K突变数字PCR检测试剂盒,在使用时,根据表8所示的dPCR反应体系组分表,配制dPCR反应体系,模板采用突变野生比为0.01的中突变频率标准品模板。
表8 dPCR反应体系组分表
进行dPCR反应,dPCR反应程序如表9所示。
表9 dPCR反应程序表
设置循环扩增从95℃变性到58℃退火,降温梯度为0.4℃每秒。
3)数据读取与分析
Raindance sense进行数据的读取,对原始数据的分析采用RainDropAnalyst Ⅱ(V1.0.0)软件进行分析,步骤如下:
a.打开RainDropAnalyst Ⅱ,点击“Add sample”将原始fcs数据文件导入软件;
b.首先选定突变野生比为0.01样本的原始数据进行分析;
c.分别选定阴性点集合、野生点集合和突变点集合,点解“Apply spectralcompensation”按钮,将纵坐标设置成Fam荧光信号值,将横坐标设置成Vic设置成信号值。软件即可自动根据将阴性点集合、野生性点集合和突变性点集合荧光强度调整三种集合的位置区域;
d.采用“Elliptical Gate”框选并调整聚集点的区域,尽可能使阳性突变点数比阴性点数为0.01;
e.选定其他样本数据,将突变野生比为0.01的样本数据分析方法与参数应用于所有样本,得出其他样本分析结果。
数据分析时,根据反应数据制作数据统计图,如图2所示,选定野生型的荧光区域(图中左侧的两个圈)和突变型的荧光区域(图中右侧的一个圈),野生型的荧光区域与突变型的荧光区域中荧光信号拷贝数的比值为1:100。使用本实施例的试剂盒时,需要首先用突变野生比为0.01的中突变频率标准品为模板,确定野生型的荧光区域和突变型的荧光区域的位置,该位置适用于后续反应。
采用上述一样的反应体系和反应程序,模板采用全野生型模板,得到数据,进行分析,根据反应数据制作数据统计图,如图1所示,野生型的荧光区域和突变型的荧光区域与图2中的位置一致。理论上,突变型的荧光区域应该没有荧光信号,但是实际使用时,试剂盒即使模板采用全野生型模板,也会有一定的背景阈值,此处的背景阈值为1个拷贝数。
采用上述一样的反应体系和反应程序,模板采用低突变频率标准品,得到数据,进行分析,根据反应数据制作数据统计图,如图3所示,野生型的荧光区域和突变型的荧光区域与图2中的位置一致。突变型的荧光区域出现了5个拷贝数的荧光信号,大于所述背景阈值1个拷贝数的2.5倍,所以该试剂盒的灵敏度可达到万分之一,特异性较好、信噪比高。
采用上述一样的反应体系和反应程序,模板采用患者的血液,得到数据,进行分析,根据反应数据制作数据统计图,野生型的荧光区域和突变型的荧光区域与图2中的位置一致,突变型的荧光区域中的荧光信号拷贝数减去背景阈值1个拷贝数得到最终的突变拷贝数。
上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例,而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
序列表
<110> 上海赛安生物医药科技股份有限公司
<120> PIK3CA基因E545K突变数字PCR检测体系的优化方法及检测产品
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 1
tcaaagcaat ttctacacga gatcct 26
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 2
gcacttacct gtgactccat agaaa 25
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 3
ctctctgaaa tcactgagca g 21
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 4
ctctgaaatc actaagcag 19
Claims (10)
1.一种PIK3CA基因E545K突变数字PCR检测体系的优化方法,其特征在于:所述检测体系包括上游引物、下游引物、野生型探针、突变型探针、野生型模板和突变型模板;所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示,所述野生型探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,所述突变型探针的核苷酸序列如SEQID No.4所示;所述野生型模板是酶切后的正常人体gDNA,所述突变型模板是酶切后的插入PIK3CA基因E545K突变片段的突变质粒;
将突变型模板和野生型模板按1:50至1:200的拷贝数比例配制成中突变频率标准品,采用数字PCR以中突变频率标准品为模板进行反应,根据反应数据制作数据统计图,选定野生型的荧光区域和突变型的荧光区域,突变型的荧光区域与野生型的荧光区域中荧光信号拷贝数的比值与中突变频率标准品中突变型模板和野生型模板的拷贝数比例相同;
采用数字PCR以野生型模板为模板进行反应,突变型的荧光区域中出现的荧光信号拷贝数即为该检测体系的背景阈值。
2.根据权利要求1所述的PIK3CA基因E545K突变数字PCR检测体系的优化方法,其特征在于:将突变型模板和野生型模板按1:1至1:10的拷贝数比例配制成高突变频率标准品,采用实时荧光定量PCR以低突变频率标准品为模板进行反应,根据反应终点荧光值和初始荧光值与探针使用浓度的关系,优化野生型探针和突变型探针的使用浓度。
3.根据权利要求2所述的PIK3CA基因E545K突变数字PCR检测体系的优化方法,其特征在于:所述反应终点荧光值和初始荧光值与探针使用浓度的关系是反应终点荧光值与初始荧光值的比值越大,且反应终点荧光值与初始荧光值的差值越大,则野生型探针和突变型探针的使用浓度越好。
4.根据权利要求1所述的PIK3CA基因E545K突变数字PCR检测体系的优化方法,其特征在于:将突变型模板和野生型模板按1:1000至1:10000的拷贝数比例配制成低突变频率标准品,采用数字PCR以低突变频率标准品为模板进行反应,若突变型的荧光区域中出现的荧光信号拷贝数大于所述背景阈值的2.5倍,则该检测体系的灵敏度达到低突变频率标准品的拷贝数比例相同的值。
5.根据权利要求1所述的PIK3CA基因E545K突变数字PCR检测体系的优化方法,其特征在于:所述野生型探针和突变型探针是MGB探针,所述野生型探针和突变型探针的3’端均为NFQ基团。
6.根据权利要求1所述的PIK3CA基因E545K突变数字PCR检测体系的优化方法,其特征在于:所述野生型探针的5’端为VIC基团,所述突变型探针的5’端为FAM基团。
7.一种采用如权利要求1所述的优化方法优化后的PIK3CA基因E545K突变数字PCR检测产品。
8.根据权利要求7所述的PIK3CA基因E545K突变数字PCR检测产品,其特征在于:所述上游引物和下游引物在反应体系中的终浓度为900nM,所述野生型探针和突变型探针在反应体系中的终浓度为200nM。
9.根据权利要求8所述的PIK3CA基因E545K突变数字PCR检测产品,其特征在于:所述野生型探针和突变型探针是MGB探针,所述野生型探针和突变型探针的3’端均为NFQ基团。
10.根据权利要求8所述的PIK3CA基因E545K突变数字PCR检测产品,其特征在于:所述野生型探针的5’端为VIC基团,所述突变型探针的5’端为FAM基团。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
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WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20190201 |