CN109295161A - 一种溶菌酶抑菌活力的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种药物抑菌活性的检测方法，具体涉及一种溶菌酶的抑菌活力检测方法，本发明还包括相关的试剂和试剂盒。本发明在检测体系中发挥溶菌酶的最大抗菌活力，采用缓冲液代替无菌水配制溶解液和稀释液，并优化检测试剂和样品的加入时间，该检测方法简单易行，可以大批量进行试验，使用设备和容器具简单、常用，不需要特别的设备，而且能够有效的体现溶菌酶的抗菌活力。

Description

一种溶菌酶抑菌活力的检测方法
技术领域
本发明属生物医药技术领域，涉及药物抑菌活性测试，具体一种药物抑菌活性的检测方法，尤其涉及一种溶菌酶的抑菌活力检测方法，本发明还包括相关的试剂和试剂盒。
背景技术
现有技术公开了用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验，通过抑菌实验，可以测定某药物的最低抑菌浓度，用以评价该药物的抑菌性能，这是抗菌药物的最基本的药效学数据。目前，主要的抑菌试验方法有进行定性测定的扩散法(如抑菌斑试验)和进行定量测定的稀释法(如最低抑菌浓度实验)。常用的方法有：常量肉汤稀释法、微量肉汤稀释法、琼脂稀释法、纸片扩散法、E试验。
根据美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory StandardsInstitute，NCCLS)推荐，一般采用肉汤稀释法和琼脂稀释法。培养基NCCLS推荐使用Mueller-Hinton(MH)肉汤，pH7.2～7.4。需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。接种物的制备通常有2种方法，一是细菌生长方法，用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个，接种于4-5ml的水解酪溶菌酶(MH)肉汤中，35℃孵育2-6h。增菌后的对数生长期菌液用无菌水校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含1～2×108CFU/ml。二是直接菌落悬液配制法，对某些苛养菌，如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和链球菌及甲氧西林耐药的葡萄球菌等菌株，推荐直接取培养18～24h的菌落调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。用MH肉汤将上述菌悬液进行1∶100稀释后备用。
有研究公开了采用稀释抗菌药物的制备及菌液接种取无菌试管(13×100mm)13支，排成一排，除第1管加入1.6mlMH肉汤外，其余每管加入MH肉汤1ml，在第1管加入抗菌药物原液(如1280μg/ml)0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1ml弃去，第12管为不含药物的生长对照，此时各管药物浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。然后在每管内加入上述制备好的接种物各1ml，使每管最终菌液浓度约为5×105CFU/ml，第1管至第11管药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125μg/ml；
孵育即将接种好的稀释管塞好塞子，置35℃普通空气孵箱中孵育16～20h；嗜血杆菌和链球菌在普通空气孵箱中孵育20～24h；对可能的耐甲氧西林葡萄球菌和耐万古霉素肠球菌持续孵育满24h；
结果判断与解释：在读取和报告所测试菌株的MIC前，检查生长对照管的细菌生长情况是否良好，同时检查接种物的传代培养情况以确定其是否污染，质控菌株的MIC值是否处于质控范围。以肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌的MIC。
据资料公开，除了抗生素产品，还有大量的抗菌物质具有体外和体内杀菌、抑菌的能力。这类物质多数没有标准品，以及没有国家规定的检测方法，若干企业根据自身情况提出各自适用的方法，以及“借鉴”成熟的抗生素效价检测方法建立标准，用于检测某类物质的活性，以求科学和客观。迄今为止，尚未见有关采用磷酸缓冲液用于抑菌检测的报道。
发明内容
本发明的目的在于基于现有技术的现状，提供一种溶菌酶抑菌活力的检测方法，尤其是一种人源溶菌酶抑菌试验的检测方法，该方法快速简便，能有效的体现溶菌酶的抗菌活力。
鉴于NCCLS推荐采用肉汤稀释法和琼脂稀释法是适用于抗生素的最低抑菌浓度检测；而重组人溶菌酶是一种大分子溶菌酶质，分子量14000D，其抗菌、抑菌作用机理与常用抗生素相比完全不同，因此，实践证实不能简单用抗生素的检测方法来测定溶菌酶的MIC；Mueller-Hinton(MH)肉汤培养基中含有可溶性淀粉，阻碍溶菌酶和受试菌的接触，并且溶菌酶的抗菌活力需要在一定的离子条件和金属离子的参与下，才能被激活，发挥最大的抗菌效力，肉汤稀释法中不含这些条件，无法体现溶菌酶的抗菌活力；因此在这类检测方法中，溶菌酶常被认为抗菌效果不佳。
本发明提供了一种溶菌酶抑菌活力的检测方法，尤其是一种溶菌酶样品的抑菌活力检测方法，其中采用磷酸缓冲液代替无菌水作为溶剂配制样品。
本发明在检测体系中发挥溶菌酶的最大抗菌活力，采用缓冲液代替无菌水配制溶解液和稀释液，并优化检测试剂和样品的加入时间，该检测方法简单易行，而且能够有效的体现溶菌酶的抗菌活力。
本发明中，采用的磷酸缓冲液可以是浓度为10-60mM(即毫摩尔每升)磷酸盐缓冲液(pH5.8-8.0，室温)；较好的，采用30-60mM磷酸盐缓冲液(pH6.0-7.4，20-28℃)。
本发明中，溶菌酶和菌液先进行反应，待溶菌酶将受试菌杀灭后，再加入肉汤培养基中或者琼脂平板上，恒温培养。
更具体的，本发明的检测方法包括以下步骤：
(1)以磷酸盐缓冲液为溶剂，溶解含有溶菌酶的待测样品；
(2)细菌分散悬浮在磷酸盐缓冲液中，制备细菌悬浮液；
(3)混合溶菌酶样品溶液与细菌悬浮液混匀；
(4)将(3)获得的混合液恒温培养。
其中，步骤(1)磷酸缓冲液可以是浓度为10-60mM磷酸盐缓冲液，pH＝5.8-8.0；
其中，步骤(2)中细菌经过研磨后，均匀分散于磷酸盐缓冲液中；
其中，步骤(3)中混匀时间为16-18小时；
其中，步骤(4)中所述的恒温培养dd的时间不少于12小时；
受试菌取对数生长期菌液，并用无菌水校正到适当浓度；
样品可以以磷酸缓冲液为溶媒，配制成不同浓度梯度。
本发明中，可以将样品溶液用磷酸盐缓冲液倍比稀释。例如，取无菌试管(13×100mm)若干支，第1管加入5ml溶菌酶含量为8000mg/L的溶液和5ml60mM磷酸盐缓冲液(pH6.2)，然后吸取5ml至第2管再加入5ml60mM磷酸盐缓冲液，混匀后再吸取5ml至第3管再加入5ml的60mM磷酸盐缓冲液，如此连续倍比稀释。此时各管中受试溶菌酶依次为4000mg/L、2000mg/L、1000mg/L、500mg/L、250mg/L、125mg/L的不同浓度。
本发明还提供了一种溶菌酶样品的抑菌活力检测试剂盒，包括浓度为10-60mmol/L磷酸盐缓冲液，pH值的范围是5.8-8.0的磷酸缓冲液。
较好的，该试剂盒还包括细菌干粉和溶菌酶标准品。
该试剂盒还可以包括肉汤培养基浓缩粉或者琼脂浓缩粉。
上述试剂盒还可以含有抑菌对照卡、说明书或者接种环等物品。
本发明中，配制工作液时，可以将配制好的样品溶液与菌液混合，例如，从每管中各取1ml不同浓度的酶液，加入准备好的菌悬液各1ml，使每管最终菌液浓度约为1×105CFU/ml。各管中药物浓度分别为2000mg/L、1000mg/L、500mg/L、250mg/L、125mg/L、62.5mg/L；
然后通过适当的方法检测细菌的增殖生长状况，例如，本发明的实施例中，利用肉汤培养基，在37℃条件下培养16-18小时后用接种环取培养液，在灭菌的LB琼脂平板上划线，再置于37℃培养16-18小时后取出，观察结果。
本发明提供了一种抑菌试验的检测方法，在检测过程中，稀释抗菌药物、菌液及MH肉汤不是同时加入反应体系。而是溶菌酶和菌液先进行反应，待溶菌酶将受试菌杀灭后，再加入肉汤培养基恒温培养，观察结果。
本发明的溶菌酶的抑菌活力检测方法，采用缓冲液代替无菌水配制溶解液和稀释液，并优化检测试剂和样品的加入时间，在检测体系中能发挥溶菌酶的最大抗菌活力，该检测方法简单易行，可以大批量进行试验，使用设备和容器具简单、常用，不需要特别的设备，能够有效的体现溶菌酶的抗菌活力。
本发明的优点有：
1、与纸片扩散法、E试验相比操作方便，可以大批量进行试验；
2、使用设备和容器具简单、常用，如锥形瓶、培养皿、试管、洁净工作台等，不需要特别的设备；
3、在30mM磷酸盐缓冲液系统中，人源溶菌酶可以发挥最大抗菌活力；
4、能避免肉汤培养基对溶菌酶作用机理的影响。
具体实施方式
本发明的实施例中所用设备为：洁净工作台、500ml锥形瓶、培养皿、具塞试管、5ml移液器、1ml移液器、0.2ml移液器、接种环、酒精灯；
所用材料为：磷酸盐(磷酸氢二钾和磷酸二氢钾购于国药集团上海化学试剂公司)，MH肉汤培养基(购于青岛海博生物技术有限公司)。
实施例1配制30mM磷酸盐缓冲液(pH6.2)
磷酸缓冲液即磷酸盐缓冲液(PB，Phosphate Buffer)，是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液，通常使用的有磷酸钠缓冲液(NaH2PO4&Na2HPO4)和磷酸钾缓冲液(K2HPO4&KH2PO4)，由于它们有二级解离，缓冲的pH值范围较广；
磷酸缓冲液的优点：(1)易配制各种浓度的缓冲液；(2)适用的pH值范围宽，可配置各种pH值的缓冲液；(3)pH受温度影响较小；(4)缓冲能力强，缓冲液被稀释后pH变化小。
本实施例中，进行了25℃下0.1mol/l磷酸钠缓冲液配制：
NaH2PO4·2H2O：Mr＝178.05,0.2mol/L溶液为35.61g/L；
NaHPO4·12H2O：Mr＝358.22,0.2mol/L溶液为71.64g/L；
NaH2PO4·2H2O：Mr＝156.03,0.2mol/L溶液为31.21g/L；
NaH2PO4·H2O：Mr＝138.01,0.2mol/L溶液为27.6g/L。
表1磷酸钠缓冲液的配方
实施例2
采用改良肉汤培养基二倍稀释法测定人源溶菌酶对试验菌株的最低抑菌浓度
样品：不含其它辅料的人源溶菌酶冻干粉(上海复华兴生物技术有限公司)。
检测菌种溶壁微球菌。
将人源溶菌酶用灭菌后的60mM磷酸盐缓冲液(pH6.2)溶解，适当稀释。配制溶菌酶含量为8000mg/L的溶液。4000mg/L、2000mg/L、1000mg/L、500mg/L、250mg/L、125mg/L、62.5mg/L的不同浓度。
MH肉汤培养基按厂家说明书要求，称取21g溶解于1000ml的纯水中，经121℃、30分钟高压蒸汽灭菌。
受试细菌生长方法，用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个，接种于30ml的水解酪溶菌酶(MH)肉汤中，35℃孵育12-18h。增菌后的对数生长期菌液用无菌水校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含1-2×108CFU/ml。
用MH肉汤将上述菌悬液按1∶100进行稀释后备用。
受试溶菌酶液的配制，取无菌试管(13×100mm)若干支，第1管加入5ml溶菌酶含量为8000mg/L的溶液和5ml60mM磷酸盐缓冲液(pH6.2)，然后吸取5ml至第2管再加入5ml60mM磷酸盐缓冲液，混匀后再吸取5ml至第3管再加入5ml60mM磷酸盐缓冲液，如此连续倍比稀释。此时各管中受试溶菌酶依次为4000mg/L、2000mg/L、1000mg/L、500mg/L、250mg/L、125mg/L的不同浓度。
从每管中各取1ml不同浓度的酶液，加入准备好的菌悬液各1ml，使每管最终菌液浓度约为1×105CFU/ml。各管中药物浓度分别为2000mg/L、1000mg/L、500mg/L、250mg/L、125mg/L、62.5mg/L。
在37℃条件下培养16-18小时后用接种环取培养液，在灭菌的LB琼脂平板上划线。
再置于37℃培养16-18小时后取出，观察结果。
以无细菌生长平皿内所含最低药物浓度为该菌的最低抑菌浓度。
结果显示，从改良肉汤培养基二倍稀释法检测发现30mM磷酸盐缓冲液系统中人源溶菌酶的活力高而且最稳定，在MH肉汤培养基中人源溶菌酶较低，纯水中人源溶菌酶几乎体现不出生物活性。
实施例3用微球菌法测定人源溶菌酶在不同稀释液条件下的活力情况检测样品：人溶菌酶原液。
现有技术的标准的溶菌酶活力检测方法的效价测定方法为：
(1)供试品溶液的制备
取本品约25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加磷酸盐缓冲液[取磷酸二氢钠10.4g与磷酸氢二钠7.86g及乙二胺四乙酸二钠0.37g，加水溶解1000ml,调节pH值至6.2]适量使溶解,并稀释成每1ml中含溶菌酶50μg的溶液；
(2)底物悬浮液的制备
称取溶壁微球菌15～20mg，加磷酸盐缓冲液(pH6.2)0.5～1ml,在研钵内研磨3分钟，再加磷酸盐缓冲液(pH6.2)适量，使总体积约为50ml，使悬浮液于25±0.1℃时，在450nm的波长处测得的吸收度为0.70±0.05(临用前配制)；
(3)测定法
精密量取25±0.1℃的底物悬浮液3ml，置1cm比色池中，在450nm的波长处测定吸收度，作为零秒的读数A<[0]>，然后精密量取25±0.1℃的供试品溶液0.15ml(相当于溶菌酶7.5μg)，加到上述比色池中，迅速混匀，用秒表计时,至60秒时再测定吸收度A；同时精密量取磷酸盐缓冲液(pH6.2)0.15ml，同法操作，做为空白试验，测得零秒的读数A'<[0]>及60秒的读数A'；
(4)效价单位定义
在室温25℃、pH值6.2时，在波长450nm处，每分钟引起吸收度下降0.001为一个酶活力单位。按下式计算：(A<[0]>－A)－(A'<[0]>－A')
效价单位数(u/mg)＝───────────────10<6>W
式中W为测定液中供试品的重量，μg。
表2显示了微球菌法测定人源溶菌酶活力的结果。
表2
注：
A.以30mM磷酸盐缓冲液(pH6.2)为基准(100％)，
B.LB培养基，1％酵母粉+0.5％溶菌酶胨+0.5％NaCl，
C.酶平行检测的单位是活力单位(U)，
D.检测菌种为溶壁微球菌(Micrococcus Lysodeikticus)；
结果显示，从微球菌法的活力检测发现30mM磷酸盐缓冲液(pH6.2)系统中人源溶菌酶的活力高而且最稳定，纯水中人源溶菌酶几乎体现不出生物活性，在MH肉汤培养基中人源溶菌酶也很低，没有发挥出应该有的作用。
实施例4琼脂稀释法测定人源溶菌酶的活力情况
使用MH琼脂，按商品说明书进行配制，pH7.2～7.4。链球菌使用含5％(V/V)绵羊血的MH琼脂。
将人源溶菌酶用灭菌后的60mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)溶解，适当稀释。配制溶菌酶含量为8000mg/L、4000mg/L、2000mg/L、1000mg/L、500mg/L、250mg/L、125mg/L、62.5mg/L的不同浓度；
将已倍比稀释的不同浓度的抗菌药物分别加入已加热溶解，并在40～45℃水浴中平衡的MH琼脂中，充分混匀倾倒灭菌平皿，琼脂厚度3～4mm。通常按1∶9比例配制药物琼脂平板，根据需要来选择药物浓度范围。配制好的含药琼脂平板应装入密封塑料袋中，置2～8℃冰箱可贮存5天；
制备浓度相当于0.5麦氏标准比浊管的菌悬液，再1∶10稀释，以多点接种器吸取制备好菌液(约1～2μl)接种于琼脂平板表面，每点菌数约为104CFU，形成直径为5～8mm的菌斑。接种好后置35℃孵育16～20h，观察结果；
将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。在含甲氧苄胺嘧啶或磺胺琼脂平板上可见轻微细菌生长，与生长对照比较抑制80％以上细菌生长的最低药物浓度作为终点浓；
如果出现有2个以上菌落生长于含药浓度高于终点水平的琼脂平板上，或低浓度药物琼脂平板上不长而高浓度药物琼脂平板上生长现象，则应检查培养物纯度或重复试验；
结果显示，从琼脂稀释法的活力检测发现60mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)系统中人源溶菌酶的活力高而且稳定,纯水中和普通琼脂中溶菌酶活力很低，其中，采用纯水配制的溶菌酶系统，活力不到磷酸盐缓冲液中活力的8.6％。
实施例5
使用Tris-HCl缓冲液系统的琼脂二倍稀释法，
试验方法，体外抗菌活性(MIC)测定采用琼脂二倍稀释法测定受试药物对试验菌株的最低抑菌浓度(MIC)，
Tris-HCl琼脂培养基在Tris-HCl缓冲液中加入琼脂糖116℃无菌后使用；
M-H培养基中国药品生物制品检定所产品，M-H肉汤培养基称取25g加1000ml蒸馏水，加热溶解，分装，高压灭菌，116℃20分钟。M-H固体培养基称取36g，加1000ml蒸馏水，高压灭菌，116℃20分钟，用于革兰阳性、阴性需氧菌的药敏试验；
质控菌株金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单孢菌ATCC27853，Tris-HCl缓冲液、0.1M Tris 100ml、0.1M HCl 70ml、纯化水800ml，测PH值，用HCl溶液调至PH7.2，加纯化水至1000ml；
将受试药物用灭菌蒸馏水溶解，适当稀释，分别取1ml药液加9ml融化的Tris-HCl琼脂糖固体培养基混匀，以二倍稀释，制备系列含药平皿；
每皿所含药物终浓度分别为4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03……0.001mg/ml；将稀释至105CFU/ml的试验菌液接种于各含药平皿表面，置于37℃培养8-10小时，取出分别吸取6ml融化的M-H培养基(50℃)覆盖上述系列平皿表面，再置于37℃培养10小时取出，观察结果，以无细菌生长平皿内所含最低药物浓度为该菌的最低抑菌浓度(MIC)。
本发明的上述实施例检测结果表明，本发明方法在检测体系中发挥溶菌酶的最大抗菌活力，采用缓冲液代替无菌水配制溶解液和稀释液，并优化检测试剂和样品的加入时间，本检测方法简单易行，可以大批量进行试验，使用设备和容器具简单、常用，不需要特别的设备，而且能够有效的体现溶菌酶的抗菌活力。

Claims (9)

1.一种溶菌酶抑菌活力的检测方法，其特征在于，该检测方法采用缓冲液代替无菌水作为样品溶剂；
所述的缓冲液是浓度为10-60mmol/L磷酸盐缓冲液或者Tris-HCl缓冲液，pH值的范围是5.8-8.0；
所述的检测方法包括步骤：
(1)以磷酸盐缓冲液为溶剂，溶解含有溶菌酶的待测样品；
(2)细菌分散悬浮在磷酸盐缓冲液中，制备细菌悬浮液；
(3)混合溶菌酶样品溶液与细菌悬浮液混匀；
(4)将(3)获得的混合液温培养。
2.如权利要求1所述的检测方法：其特征在于，该检测方法中，先进行溶菌酶和菌液反应步骤，待溶菌酶将受试菌杀灭后，再加入肉汤培养基或者接种于琼脂平板，恒温培养。
3.如权利要求1所述的检测方法：其特征在于，步骤(2)中细菌经过研磨后，均匀分散于缓冲液中。
4.如权利要求1所述的检测方法：其特征在于，步骤(3)中混匀时间为16-18小时。
5.如权利要求1所述的检测方法：其特征在于，步骤(4)中所述的恒温培养dd的时间不少于12小时。
6.一种溶菌酶抑菌活力的检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括浓度为10-60mmol/L缓冲液，pH值的范围是5.8-8.0。
7.如权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括细菌干粉和溶菌酶标准品。
8.如权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括肉汤培养基浓缩粉。
9.如权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的缓冲液是磷酸盐缓冲液或者Tris-HCl缓冲液。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1587994A (zh) * 2004-08-16 2005-03-02 上海市胸科医院 一种溶菌酶检测试剂及其制备方法
US20070264247A1 (en) * 2004-06-10 2007-11-15 Mi An Use of Human Lysozyme in Preparation of Medicine for Treating Acne
US20100021450A1 (en) * 2008-05-23 2010-01-28 Donovan David M Lys K Endolysin Is Synergistic with Lysostaphin Against MRSA
US20110177218A1 (en) * 2008-08-12 2011-07-21 Johannes Martinus Jacobus Visser Liquid nisin compositions
CN105586327A (zh) * 2014-10-21 2016-05-18 复旦大学 一种人源溶菌酶蛋白纯化方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070264247A1 (en) * 2004-06-10 2007-11-15 Mi An Use of Human Lysozyme in Preparation of Medicine for Treating Acne
CN1587994A (zh) * 2004-08-16 2005-03-02 上海市胸科医院 一种溶菌酶检测试剂及其制备方法
US20100021450A1 (en) * 2008-05-23 2010-01-28 Donovan David M Lys K Endolysin Is Synergistic with Lysostaphin Against MRSA
US20110177218A1 (en) * 2008-08-12 2011-07-21 Johannes Martinus Jacobus Visser Liquid nisin compositions
CN105586327A (zh) * 2014-10-21 2016-05-18 复旦大学 一种人源溶菌酶蛋白纯化方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
石军英;郭雄军;陈劲春;: "鸡蛋溶菌酶生产过程活力动态监控" *
郝杰,孙谧,张宝莲,郑家声: "海洋溶菌酶酶学性质及其在化妆品中的抑菌效果" *

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