CN109295131A - 一种石斛活性寡糖的受体定位固相酶解制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种石斛活性寡糖的受体定位固相酶解制备方法，具体包括如下步骤：(1)磁珠预处理(2)多糖受体蛋白亲和结合，形成多糖蛋白偶联液(3)多糖受体蛋白偶联物的定位固相酶解(4)活性寡糖的制备，磁珠受体寡糖偶联物经裂解、磁珠分离、凝胶柱纯化、超滤浓缩，得石斛活性寡糖。本发明可以对多糖进行定向酶解制备活性寡糖，工艺路线高效且环境友好，是一种制备长度、结构和活性均稳定的寡糖产品的有效方法。
Description
技术领域
本发明属于寡糖制备技术领域，具体涉及一种石斛活性寡糖的受体定位固相酶解制备方法。
技术背景
寡糖，也称寡糖素，通常是指由2～10个相同或不同单糖通过特定的糖苷键聚合而成的低聚糖。寡糖具有多种生物活性，广泛用于农业、林业、饲料、食品、医药等领域。作为植物外源性信号分子，寡糖在农业、林业等植物生产领域既可用于调节植物的生长发育，又可用于诱导植物对环境微生物、干旱、低温、高温、盐碱等逆境的响应，增强植物对这些逆境的抗性；作为益生元，寡糖用于食品配料或动物饲料中，可改善人体及动物体内微生态环境，促进肠道内有益菌的增生，抑制有害菌的生长和肠内腐败物质形成，调节胃肠消化功能，防治便秘，同时具有降糖降脂减肥等功效。此外，寡糖作为免疫调节剂，通过对机体免疫功能的调节，表现出抗炎、抗病菌感染、抗肿瘤等药理功效，可以提高人和动物机体的健康状态。可见，探索和发展寡糖的制备方法在生产应用上具有重要的现实意义。
目前，寡糖的生产主要有5种方法，包括第一从植物、动物、微生物等天然材料中直接提取；第二人工化学合成；第三多糖的物理降解；第四多糖的化学降解；第五多糖的酶法降解。寡糖的活性与其组成的单糖种类和糖苷键链接方式等结构特征相关，结构不同则寡糖的生物活性不同或没有活性。方法五是借助糖苷酶降解多糖的专一性特点，运用特异性糖苷酶降解多糖制备寡糖，其制备工艺的核心是在多糖溶液中添加合适的糖苷酶，在适合的条件下经一定时间的酶解反应后，对酶解液中的寡糖进行分离提取。由于多糖中通常存在多个酶解位点，且不同酶解位点之间的单糖组成和糖苷键链接方式不同，所以多糖经酶降解后生成的寡糖仍然是由不同结构、不同长度和不同活性的降解片段所组成的混合物，后续精制十分困难且产品质量不稳定。
因此，研究和建立一种对多糖中的活性片段进行定位降解制备寡糖的方法，利用受体蛋白标记并保护多糖中的活性片段，定位酶解，以保证所制备的寡糖在结构、长度和活性方面保持稳定，无疑对提升寡糖制备的技术水平、促进寡糖产业的创新发展具有重要的科技意义。
发明内容
为了实现对多糖中的活性片段进行定位降解制备寡糖，以保证所制备的寡糖在活性、结构和长度方面的均一稳定性，本发明提供一种铁皮石斛活性寡糖的受体定位固相酶解制备方法。
一种石斛活性寡糖的受体定位固相酶解制备方法操作步骤如下：
(1)磁珠预处理
在40～80μl磁珠中加入160～320μl磷酸盐缓冲液，涡旋混合，使磁珠吸附在一侧，弃上清液，再加入500～1000μl洗涤缓冲液，重复洗涤2～3次，即得到40～80μl预处理磁珠；
所述磁珠的粒径为1～10μm，其表面带有NTA-Ni基团或IDA-Co基团；
(2)多糖受体蛋白偶联液的制备
将50～100μl组氨酸标签的TLR-4受体蛋白溶液和450～900μl的石斛多糖溶液经37～40℃恒温摇床上孵育1～2h，使组氨酸标签的TLR-4受体蛋白与石斛多糖亲和结合，形成石斛多糖蛋白偶联液；
所述组氨酸标签的TLR-4受体蛋白溶液是由磷酸盐缓冲液配成浓度100μg/mL的组氨酸标签的TLR-4受体蛋白溶液；
所述石斛多糖溶液是由磷酸盐缓冲液配置成浓度0.5～1.0mg/mL的石斛多糖溶液；
(3)磁珠多糖受体蛋白偶联物的定位固相酶解
将50～100μl酶活力100U/ml纤维素酶液和10～30μl酶活力600U/ml甘露聚糖酶液加入到500～1000μl石斛多糖蛋白偶联液中混匀，用0.05M乙酸钠缓冲液调节pH值至5.5～6.0，37～40℃摇床定位酶解1～2h，得到混合液；再用0.1M氢氧化钠溶液调节混合液的pH值至8.0，加入40～80μl预处理磁珠，涡旋，摇床混合30～60min充分偶联，磁力分离，移除上清液，得磁珠寡糖受体蛋白偶联物；
(4)活性寡糖的制备
在步骤(3)得到的磁珠寡糖受体蛋白偶联物中加入500～1000μl裂解缓冲液，经摇床上缓慢洗涤3～5min，磁力架分离1～2min，保留上清液，立即加入500～1000μl中和缓冲液，经聚丙烯酰胺凝胶柱(Bio-Gel柱)去离子水洗脱，收集洗脱液，超滤浓缩，冷冻干燥得到石斛活性寡糖，石斛活性寡糖为乳白色粉末状，组分均一，分子量约为1237.37Da；
所述石斛活性寡糖的化学结构为：
上式中：上式中：G为葡萄糖，M为甘露糖，O为氧，Ac为乙酰基。
进一步限定的技术方案如下：
步骤(1)中，所述磷酸盐缓冲液由7.89g氯化钠、0.2g氯化钾、0.2g磷酸二氢钾和1.39g磷酸氢二钾溶于200ml蒸馏水中，再加蒸馏水定容至1L，pH为7.2；
所述洗涤缓冲液由7.89g氯化钠、0.2g氯化钾、0.2g磷酸二氢钾和1.39g磷酸氢二钾，2.04g咪唑，溶于200ml蒸馏水中，再加蒸馏水定容至1L，pH为8.0。
步骤(2)中，摇床转速为100～150r/min；所述磷酸盐缓冲液由7.89g氯化钠、0.2g氯化钾、0.2g磷酸二氢钾和1.39g磷酸氢二钾溶于200ml蒸馏水中，再加蒸馏水定容至1L，pH为7.2。
步骤(2)中，所述石斛多糖是用铁皮石斛茎，经水提醇沉法、脱蛋白、透析和冷冻干燥提取出的石斛粗多糖，石斛粗多糖进一步经DEAE-Cellulose阴离子交换层析和SephadexG-100凝胶柱分离纯化得到均一组分的石斛多糖。
步骤(3)中，所述纤维素酶为内切-1,4-β-D葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)；所述甘露聚糖酶为内切-1,4-β-D甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)。
步骤(4)中，所述去离子水洗脱速度为1～2ml/min。
步骤(4)中，所述裂解缓冲液由15.01g甘氨酸溶于800ml蒸馏水中，用盐酸调节pH值至2.2～2.8，再加蒸馏水定容至1L；所述中和液由121.1g Tris溶解于800mL蒸馏水中，用盐酸调节pH值至8.0，再加蒸馏水定容至1L。
步骤(4)中，所述聚丙烯酰胺凝胶柱(Bio-Gel柱)为Bio-Gel P2柱或Bio-Gel P4柱。
本发明的有益技术效果体现在以下方面：
1.本发明克服了现有技术随机降解多糖制备寡糖的不足等问题，石斛多糖中活性片段与受体专一结合，用受体标记并保护多糖中的活性片段，定位酶解，磁场分离，避免了化学有机溶剂残留等问题，促进石斛寡糖在食品、药品等领域的应用，制备的石斛活性寡糖结构稳定且长度均一。
2.本发明方法获得的石斛活性寡糖靶向结合TLR-4受体，从而激活其下游信号通路，最终引起NF-κB、MAPKs、ERK、p38和JNK的活化，诱导炎症因子的产生从而发挥其免疫效应。
附图说明
图1为铁皮石斛活性寡糖的高效液相色谱图；
图2为铁皮石斛活性寡糖的分子离子峰图；
图3为单糖标准品和PMP铁皮石斛活性寡糖水解产物的高效液相色谱图；
图4铁皮石斛活性寡糖的化学结构图。
具体实施方式
下面结合附图及具体的实施例，对本发明作进一步地说明。本发明的特点和优点将随着描述而更清楚，但这些实施例仅仅用来说明本发明，并不对本发明的创新点和应用范围构成任何限制。
以下实施例所用原料的来源说明如下：磁珠购于美国Thermo公司；组氨酸标签的TLR4受体蛋白购于美国R&D system公司；铁皮石斛购于霍山县天下泽雨生物科技发展有限公司；纤维素酶、甘露聚糖酶均购于爱尔兰Megazyme公司；其它化学试剂为国产分析纯。
实施例1
铁皮石斛活性寡糖的受体定位固相酶解制备操作步骤如下：
步骤(1)：先将40μl粒径为1μm的磁珠置于1.5ml离心管中，加入160μl磷酸盐缓冲液，涡旋混合10s，将离心管放入磁力架中，磁珠吸附在离心管的一侧，取出并丢弃上清液，再加入500μl洗涤缓冲液重复洗涤2次，即得到40μl预处理磁珠；
所述磁珠表面带有NTA-Ni基团；
所述磷酸盐缓冲液由7.89g氯化钠、0.2g氯化钾、0.2g磷酸二氢钾和1.39g磷酸氢二钾溶于200ml蒸馏水中，再加蒸馏水定容至1L，pH为7.2；
所述洗涤缓冲液由7.89g氯化钠、0.2g氯化钾、0.2g磷酸二氢钾和1.39g磷酸氢二钾，2.04g咪唑，溶于200ml蒸馏水中，再加蒸馏水定容至1L，pH为8.0。
步骤(2)：将50μl组氨酸标签的TLR-4受体蛋白溶液和450μl的铁皮石斛多糖溶液置于1.5ml离心管中，经37℃恒温摇床上孵育1h，摇床转速为100r/min，使组氨酸标签的TLR-4受体蛋白与石斛多糖亲和结合，形成铁皮石斛多糖蛋白偶联液；
所述TLR-4受体蛋白溶液是将50μg TLR-4蛋白加入500μl磷酸盐缓冲液配成浓度为100μg/mL的TLR-4蛋白受体蛋白溶液；
所述磷酸盐缓冲液由7.89g氯化钠、0.2g氯化钾、0.2g磷酸二氢钾和1.39g磷酸氢二钾溶于200ml蒸馏水中，再加蒸馏水定容至1L，pH为7.2；
所述铁皮石斛多糖是用铁皮石斛茎，经水提醇沉法、脱蛋白、透析和冷冻干燥提取出石斛粗多糖，石斛粗多糖进一步经DEAE-Cellulose阴离子交换层析和Sephadex G-100凝胶柱分离纯化得到均一组分的石斛多糖；
所述铁皮石斛多糖溶液是将10mg铁皮石斛多糖加入20ml磷酸盐缓冲液配成浓度为0.5mg/mL的铁皮石斛多糖溶液。
步骤(3)：将50μl酶活力100U/ml纤维素酶液和10μl酶活力600U/ml甘露聚糖酶液加入500μl铁皮石斛多糖蛋白偶联液中混匀，用0.05M乙酸钠缓冲液调节偶联液pH值至5.5，置于37℃恒温摇床上，摇床转速为100r/min，定位酶解多糖偶联受体蛋白1h，此时得到TLR-4受体蛋白亲和结合的活性寡糖偶联物，寡糖，多糖，纤维素酶和甘露聚糖酶的混合液。再用0.1M氢氧化钠溶液调节混合液pH值至8.0，接着加入40μl预处理磁珠，涡旋10s，在摇床上混合30min，使磁珠与TLR-4受体蛋白亲和结合的活性寡糖充分偶联，置于磁力架分离1min，移除上清液，得到铁皮石斛磁珠活性寡糖受体蛋白偶联物；
所述纤维素酶为内切-1,4-β-D葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)；
所述甘露聚糖酶为内切-1,4-β-D甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)。
步骤(4)：在步骤(3)得到的磁珠寡糖受体蛋白偶联物中加入500μl的裂解缓冲液，经摇床上缓慢洗涤3min，置于磁力架分离1min，保留寡糖和受体蛋白混合上清液，立即加入500μl的中和缓冲液调整pH值至中性，再将中性寡糖受体蛋白混合液经Bio-Gel P2柱洗脱，用1ml/min去离子水洗脱，通过苯酚硫酸法检测收集液中糖含量，经超滤浓缩，冷冻干燥得到石斛活性寡糖。石斛活性寡糖为乳白色粉末状，石斛活性寡糖均一组分，为寡糖纯品，参见图1；分子量约为1237.37Da，见图2；单糖组成分析表明，石斛活性寡糖由甘露糖和葡萄糖组成，摩尔为2.51:1，见图3；糖苷键连接方式β-1,4-D-manp和β-1,4-D-glup组成，鉴定石斛活性寡糖的化学结构为：
见图4；上式中：G为葡萄糖，M为甘露糖，O为氧，Ac为乙酰基；
所述裂解缓冲液由15.01g甘氨酸溶于800ml蒸馏水中，用盐酸调节pH值至2.2～2.8，再加蒸馏水定容至1L；
所述中和液由121.1g Tris溶解于800mL蒸馏水中，用盐酸调节pH值至8.0，再加蒸馏水定容至1L制得。
实施例2
铁皮石斛活性寡糖的受体定位固相酶解制备操作步骤如下：
步骤(1)：先将60μl粒径为5μm的磁珠置于1.5ml离心管中，加入240μl磷酸盐缓冲液，涡旋混合15s，将离心管放入磁力架中，磁珠吸附在离心管的一侧，取出并丢弃上清液，再加入750μl洗涤缓冲液重复洗涤3次，即得到60μl预处理磁珠；
所述磁珠表面带有NTA-Ni基团；
所述磷酸盐缓冲液由7.89g氯化钠、0.2g氯化钾、0.2g磷酸二氢钾和1.39g磷酸氢二钾溶于200ml蒸馏水中，再加蒸馏水定容至1L，pH为7.2；
所述洗涤缓冲液由7.89g氯化钠、0.2g氯化钾、0.2g磷酸二氢钾和1.39g磷酸氢二钾，2.04g咪唑，溶于200ml蒸馏水中，再加蒸馏水定容至1L，pH为8.0。
步骤(2)：将75μl组氨酸标签的TLR-4受体蛋白溶液和675μl的铁皮石斛多糖溶液置于1.5ml离心管中，经38℃恒温摇床上孵育1.5h，摇床转速为125r/min，使组氨酸标签的TLR-4受体蛋白与石斛多糖亲和结合，形成铁皮石斛多糖蛋白偶联液；
所述TLR-4受体蛋白溶液是将50μg TLR-4蛋白加入500μl磷酸盐缓冲液配成浓度为100μg/mL的TLR-4蛋白受体蛋白溶液；
所述磷酸盐缓冲液由7.89g氯化钠、0.2g氯化钾、0.2g磷酸二氢钾和1.39g磷酸氢二钾溶于200ml蒸馏水中，再加蒸馏水定容至1L，pH为7.2；
所述铁皮石斛多糖是用铁皮石斛茎，经水提醇沉法、脱蛋白、透析和冷冻干燥提取出石斛粗多糖，石斛粗多糖进一步经DEAE-Cellulose阴离子交换层析和Sephadex G-100凝胶柱分离纯化得到均一组分的石斛多糖；
所述铁皮石斛多糖溶液是将10mg铁皮石斛多糖加入15ml磷酸盐缓冲液配成浓度为0.67mg/mL的铁皮石斛多糖溶液。
步骤(3)：将75μl酶活力100U/ml纤维素酶液和20μl酶活力600U/ml甘露聚糖酶液加入750μl铁皮石斛多糖蛋白偶联液中混匀，用0.05M乙酸钠缓冲液调节偶联液pH值至5.8，置于38℃恒温摇床上，摇床转速为120r/min，定位酶解多糖偶联受体蛋白1.5h，此时得到TLR-4受体蛋白亲和结合的活性寡糖偶联物，寡糖，多糖，纤维素酶和甘露聚糖酶的混合液。再用0.1M氢氧化钠溶液调节混合液pH值至8.0，接着加入60μl预处理磁珠，涡旋15s，在摇床上混合45min，使磁珠与TLR-4受体蛋白亲和结合的活性寡糖充分偶联，置于磁力架分离1min，移除上清液，得到铁皮石斛磁珠活性寡糖受体蛋白偶联物；
所述纤维素酶为内切-1,4-β-D葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)；
所述甘露聚糖酶为内切-1,4-β-D甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)。
步骤(4)：在步骤(3)得到的磁珠寡糖受体蛋白偶联物中加入750μl的裂解缓冲液，经摇床上缓慢洗涤4min，置于磁力架分离1min，保留寡糖和受体蛋白混合上清液，立即加入750μl的中和缓冲液调整pH值至中性，再将中性寡糖受体蛋白混合液经Bio-Gel P2柱洗脱，用1ml/min去离子水洗脱，通过苯酚硫酸法检测收集液中糖含量，经超滤浓缩，冷冻干燥得到石斛活性寡糖。石斛活性寡糖为乳白色粉末状，石斛活性寡糖均一组分，为寡糖纯品，参见图1；分子量约为1237.37Da，见图2；单糖组成分析表明，石斛活性寡糖由甘露糖和葡萄糖组成，摩尔为2.51:1，见图3；糖苷键连接方式β-1,4-D-manp和β-1,4-D-glup组成，鉴定石斛活性寡糖的化学结构为：
见图4；上式中：G为葡萄糖，M为甘露糖，O为氧，Ac为乙酰基；
所述裂解缓冲液由15.01g甘氨酸溶于800ml蒸馏水中，用盐酸调节pH值至2.2～2.8，再加蒸馏水定容至1L；
所述中和液由121.1g Tris溶解于800mL蒸馏水中，用盐酸调节pH值至8.0，再加蒸馏水定容至1L制得。
实施例3
铁皮石斛活性寡糖的受体定位固相酶解制备操作步骤如下：
步骤(1)：先将80μl粒径为10μm的磁珠置于1.5ml离心管中，加入320μl磷酸盐缓冲液，涡旋混合20s，将离心管放入磁力架中，磁珠吸附在离心管的一侧，取出并丢弃上清液，再加入1000μl洗涤缓冲液重复洗涤3次，即得到80μl预处理磁珠；
所述磁珠表面带有IDA-Co基团；
所述磷酸盐缓冲液由7.89g氯化钠、0.2g氯化钾、0.2g磷酸二氢钾和1.39g磷酸氢二钾溶于200ml蒸馏水中，再加蒸馏水定容至1L，pH为7.2；
所述洗涤缓冲液由7.89g氯化钠、0.2g氯化钾、0.2g磷酸二氢钾和1.39g磷酸氢二钾，2.04g咪唑，溶于200ml蒸馏水中，再加蒸馏水定容至1L，pH为8.0。
步骤(2)：将100μl组氨酸标签的TLR-4受体蛋白溶液和900μl的铁皮石斛多糖溶液置于1.5ml离心管中，经40℃恒温摇床上孵育2h，摇床转速为150r/min，使组氨酸标签的TLR-4受体蛋白与石斛多糖亲和结合，形成铁皮石斛多糖蛋白偶联液。
所述TLR-4受体蛋白溶液是将50μg TLR-4蛋白加入500μl磷酸盐缓冲液配成浓度为100μg/mL的TLR-4蛋白受体蛋白溶液；
所述磷酸盐缓冲液由7.89g氯化钠、0.2g氯化钾、0.2g磷酸二氢钾和1.39g磷酸氢二钾溶于200ml蒸馏水中，再加蒸馏水定容至1L，pH为7.2；
所述铁皮石斛多糖是用铁皮石斛茎，经水提醇沉法、脱蛋白、透析和冷冻干燥提取出石斛粗多糖，石斛粗多糖进一步经DEAE-Cellulose阴离子交换层析和Sephadex G-100凝胶柱分离纯化得到均一组分的石斛多糖；
所述铁皮石斛多糖溶液是将10mg铁皮石斛多糖加入10ml磷酸盐缓冲液配成浓度为1mg/mL的铁皮石斛多糖溶液。
步骤(3)：将100μl酶活力100U/ml纤维素酶液和30μl酶活力600U/ml甘露聚糖酶液加入1000μl铁皮石斛多糖蛋白偶联液中混匀，用0.05M乙酸钠缓冲液调节偶联液pH值至6.0，置于40℃恒温摇床上，摇床转速为150r/min，定位酶解多糖偶联受体蛋白2h，此时得到TLR-4受体蛋白亲和结合的活性寡糖偶联物，寡糖，多糖，纤维素酶和甘露聚糖酶的混合液。再用0.1M氢氧化钠溶液调节混合液pH值至8.0，接着加入80μl预处理磁珠，涡旋20s，在摇床上混合60min，使磁珠与TLR-4受体蛋白亲和结合的活性寡糖充分偶联，置于磁力架分离2min，移除上清液，得到铁皮石斛磁珠活性寡糖受体蛋白偶联物；
所述纤维素酶为内切-1,4-β-D葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)；
所述甘露聚糖酶为内切-1,4-β-D甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)。
步骤(4)：在步骤(3)得到的磁珠寡糖受体蛋白偶联物中加入1000μl的裂解缓冲液，经摇床上缓慢洗涤5min，置于磁力架分离2min，保留寡糖和受体蛋白混合上清液，立即加入1000μl的中和缓冲液调整pH值至中性，再将中性寡糖受体蛋白混合液经Bio-Gel P4柱洗脱，用2ml/min去离子水洗脱，通过苯酚硫酸法检测收集液中糖含量，经超滤浓缩，冷冻干燥得到石斛活性寡糖。石斛活性寡糖为乳白色粉末状，石斛活性寡糖均一组分，为寡糖纯品，参见图1；分子量约为1237.37Da，见图2；单糖组成分析表明，石斛活性寡糖由甘露糖和葡萄糖组成，摩尔为2.51:1，见图3；糖苷键连接方式β-1,4-D-manp和β-1,4-D-glup组成，鉴定石斛活性寡糖的化学结构为：
见图4；上式中：G为葡萄糖，M为甘露糖，O为氧，Ac为乙酰基；
所述裂解缓冲液由15.01g甘氨酸溶于800ml蒸馏水中，用盐酸调节pH值至2.2～2.8，再加蒸馏水定容至1L；
所述中和液由121.1g Tris溶解于800mL蒸馏水中，用盐酸调节pH值至8.0，再加蒸馏水定容至1L制得。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，可有效制备活性寡糖，三个实施例均可得到同一片段的石斛活性寡糖结构，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (8)
1.一种石斛活性寡糖的受体定位固相酶解制备方法，其特征在于操作步骤如下：
(1)磁珠预处理
在40～80μl磁珠中加入160～320μl磷酸盐缓冲液，涡旋混合，使磁珠吸附在一侧，弃上清液，再加入500～1000μl洗涤缓冲液，重复洗涤2～3次，即得到40～80μl预处理磁珠；
所述磁珠的粒径为1～10μm，其表面带有NTA-Ni基团或IDA-Co基团；
(2)多糖受体蛋白偶联液的制备
将50～100μl组氨酸标签的TLR-4受体蛋白溶液和450～900μl的石斛多糖溶液经37～40℃摇床上孵育1～2h，使组氨酸标签的TLR-4受体蛋白与石斛多糖亲和结合，形成石斛多糖蛋白偶联液；
所述组氨酸标签的TLR-4受体蛋白溶液是由磷酸盐缓冲液配成浓度100μg/mL的组氨酸标签的TLR-4受体蛋白溶液；
所述石斛多糖溶液是由磷酸盐缓冲液配置成浓度0.5～1.0mg/mL的石斛多糖溶液；
(3)磁珠多糖受体蛋白偶联物的定位固相酶解
将50～100μl酶活力100U/ml纤维素酶液和10～30μl酶活力600U/ml甘露聚糖酶液加入到500～1000μl石斛多糖蛋白偶联液中混匀，用0.05M乙酸钠缓冲液调节pH值至5.5～6.0，37～40℃摇床定位酶解1～2h，得到混合液；再用0.1M氢氧化钠溶液调节混合液的pH值至8.0，加入40～80μl预处理磁珠，涡旋，摇床混合30～60min充分偶联，磁力分离，移除上清液，得磁珠寡糖受体蛋白偶联物；
(4)活性寡糖的制备
在步骤(3)得到的磁珠寡糖受体蛋白偶联物中加入500～1000μl裂解缓冲液，经摇床上缓慢洗涤3～5min，磁力架分离1～2min，保留上清液，立即加入500～1000μl中和缓冲液，经聚丙烯酰胺凝胶柱(Bio-Gel柱)去离子水洗脱，收集洗脱液，超滤浓缩，冷冻干燥得到石斛活性寡糖，石斛活性寡糖为乳白色粉末状，组分均一，分子量约为1237.37Da；
所述石斛活性寡糖的化学结构为：
上式中：G为葡萄糖，M为甘露糖，O为氧，Ac为乙酰基。
2.根据权利要求1所述的一种石斛活性寡糖的受体定位固相酶解制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述磷酸盐缓冲液由7.89g氯化钠、0.2g氯化钾、0.2g磷酸二氢钾和1.39g磷酸氢二钾溶于200ml蒸馏水中，再加蒸馏水定容至1L，pH为7.2；
所述洗涤缓冲液由7.89g氯化钠、0.2g氯化钾、0.2g磷酸二氢钾和1.39g磷酸氢二钾，2.04g咪唑，溶于200ml蒸馏水中，再加蒸馏水定容至1L，pH为8.0。
3.根据权利要求1所述的一种石斛活性寡糖的受体定位固相酶解制备方法，其特征在于：步骤(2)中，摇床转速为100～150r/min；所述磷酸盐缓冲液由7.89g氯化钠、0.2g氯化钾、0.2g磷酸二氢钾和1.39g磷酸氢二钾溶于200ml蒸馏水中，再加蒸馏水定容至1L，pH为7.2。
4.根据权利要求1所述的一种石斛活性寡糖的受体定位固相酶解制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述石斛多糖是用铁皮石斛茎，经水提醇沉法、脱蛋白、透析和冷冻干燥提取出的石斛粗多糖，石斛粗多糖进一步经DEAE-Cellulose阴离子交换层析和Sephadex G-100凝胶柱分离纯化得到均一组分的石斛多糖。
5.根据权利要求1所述的一种石斛活性寡糖的受体定位固相酶解制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述纤维素酶为内切-1,4-β-D葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)；所述甘露聚糖酶为内切-1,4-β-D甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)。
6.根据权利要求1所述的一种石斛活性寡糖的受体定位固相酶解制备方法，其特征在于：步骤(4)中，所述去离子水洗脱速度为1～2ml/min。
7.根据权利要求1所述的一种石斛活性寡糖的受体定位固相酶解制备方法，其特征在于：步骤(4)中，所述裂解缓冲液由15.01g甘氨酸溶于800ml蒸馏水中，用盐酸调节pH值至2.2～2.8，再加蒸馏水定容至1L；所述中和液由121.1g Tris溶解于800mL蒸馏水中，用盐酸调节pH值至8.0，再加蒸馏水定容至1L。
8.根据权利要求1所述的一种石斛活性寡糖的受体定位固相酶解制备方法，其特征在于：步骤(4)中，所述聚丙烯酰胺凝胶柱(Bio-Gel柱)为Bio-Gel P2柱或Bio-Gel P4柱。
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