CN109280682A - 增强血管内皮细胞表达p选择素的方法 - Google Patents

增强血管内皮细胞表达p选择素的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109280682A
CN109280682A CN201811007661.1A CN201811007661A CN109280682A CN 109280682 A CN109280682 A CN 109280682A CN 201811007661 A CN201811007661 A CN 201811007661A CN 109280682 A CN109280682 A CN 109280682A
Authority
CN
China
Prior art keywords
selectin
endothelial cell
vascular endothelial
expression
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811007661.1A
Other languages
English (en)
Inventor
华子昂
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wan Junxing
Original Assignee
Wan Junxing
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wan Junxing filed Critical Wan Junxing
Priority to CN201811007661.1A priority Critical patent/CN109280682A/zh
Publication of CN109280682A publication Critical patent/CN109280682A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Abstract

本发明提供了一种增强血管内皮细胞表达P选择素的方法，其中，包括以下步骤：(1)设置冲击波设备作用模式及作用参数包括：压强、频率、频次；(2)准备继代培养的血管内皮细胞或实验小鼠体内血管内皮细胞，离心后，用10％的完全培养液重悬移植到培养皿中，再利用探头对细胞进行冲击波处理；(3)完成冲击波处理后，继续培养60小时，再分离血管内皮细胞利用荧光定量PCR方法检测P‑选择素基因表达量，以GAPDH基因为参考内标。本发明通过冲击波增强血管内皮细胞的P选择素表达，不需要其他药物或化学品刺激，操作简便、效果显著，尤其是在活体内的血管内皮P选择素表达上有绝对优势，是未来干细胞归巢及干细胞相关技术的发展基础。

Description

增强血管内皮细胞表达P选择素的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种增强血管内皮细胞表达P选择素的方法。
背景技术
干细胞在医学界被称为“万用细胞”，它可以分化成多种功能细胞或组织器官。干细胞移植治疗是把健康的干细胞移植到患者体内，以达到修复或替换受损细胞或组织，从而达到治愈的目的。干细胞移植治疗范围很广，一般能治疗神经系统疾病、免疫系统疾病、还有其他的一些内外科疾病。但是干细胞移植治疗的许多技术环节没有攻克，从而明显影响了治疗的成功率，比较典型的问题是干细胞不能有效的归巢到受损部位。已经有许多研究结果表明：受损部位细胞的P-选择素(P-Selectin)是诱导干细胞归巢的关键因素之一，缺少P-选择素，干细胞无法在血管内皮细胞上定位粘附。要增强干细胞在目标靶部位的富集，必须有效增强P-选择素的表达，但是对于怎样简单有效的调控目的细胞的P选择素基因表达，还比较缺乏相应的技术。
发明内容
一种增强血管内皮细胞表达P选择素的方法，其中，包括以下步骤：
步骤(1)：设置冲击波设备作用模式及作用参数包括：压强、频率、频次；
步骤(2)：准备继代培养的血管内皮细胞或实验小鼠体内血管内皮细胞，离心后，用10％的完全培养液重悬移植到培养皿中，再利用探头对细胞进行冲击波处理；
步骤(3)：完成冲击波处理后，继续培养60小时，再分离血管内皮细胞利用荧光定量PCR方法检测P-选择素基因表达量，以GAPDH基因为参考内标。
优选的是，步骤(2)中，所述的继代培养的血管内皮细胞制备方法为：从液氮中取出原代人心脏微血管内皮细胞冻存管，37℃水浴箱融化，传至已左旋多聚赖氨酸包被的培养瓶中，放入一定适量的内皮细胞培养基，在37℃、5％二氧化碳培养箱中培养，2～3d换液，4～5d传代1次，用胰酶消化细胞，实验采用第5代细胞。
优选的是，所述原代人心脏微血管内皮细胞能够选用活体内的血管内皮细胞。
在上述任一方案中优选的是，步骤(1)中，所述的冲击波参数范围为压力1.5-3.0bar、频率8-12Hz、频次为200次。
在上述任一方案中优选的是，步骤(3)中，采用相对定量的方法对选择素基因表达水平进行计算，采用目的基因与内参基因之间Ct值之间的差异来确定目的基因的表达量，以GAPDH作为内参基因，每个RNA样品的定量PCR进行三个重复以消除系统误差。
在上述任一方案中优选的是，步骤(3)中，采用的荧光定量PCR方法检测为：用HighPure RNA Isolation Kit提取总RNA，采用TaqMan Reverse Transcription Rengents试剂盒将总RNA反转录为cDNA，取反转录产物cDNA模板2.5μL，按照TaqMan Gene ExpressionMaster Mix说明书进行定量PCR检测。
在上述任一方案中优选的是，步骤(3)中，所述继续培养的时间为60小时。
在上述任一方案中优选的是，所述增强血管内皮细胞表达P选择素的方法不局限于表达P选择素。
本发明通过冲击波增强血管内皮细胞的P选择素表达，不需要其他药物或化学品刺激，操作简便、效果显著，尤其是在活体内的血管内皮P选择素表达上有绝对优势，是未来干细胞归巢及干细胞相关技术的发展基础。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明优选实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1)从液氮中取出原代人心脏微血管内皮细胞(HCMEC)冻存管，37℃水浴箱迅速融化，传至已左旋多聚赖氨酸包被的培养瓶中，放入一定适量的内皮细胞培养基，37℃、5％二氧化碳培养箱中培养，2～3d换液，4～5d传代1次，用胰酶消化细胞，实验采用第5代细胞。
2)取第5代的HCMEC细胞消化离心后，用10％的完全培养液重悬移植到培养皿中；把冲击波探头进行消毒处理，设定参数为2.5bar、10Hz，用冲击波作用细胞200次，对照组为没有进行冲击波处理的第5代HCMEC细胞，冲击波探头选用瑞士EMS公司的产品。
3)对经过冲击波处理的细胞培养60小时进行RNA分离，利用荧光定量实时PCR技术对P选择素和E选择素进行基因表达量的检测。
4)用相对定量的方法对选择素基因表达水平进行计算，采用目的基因与内参基因之间Ct值之间的差异来确定目的基因的表达量，本发明中，以GAPDH作为内参基因，每个RNA样品的定量PCR进行三个重复以消除系统误差。具体操作如下：
用High Pure RNA Isolation Kit提取总RNA，采用TaqMan ReverseTranscription Rengents试剂盒将总RNA反转录为cDNA(25μL体系)，取反转录产物cDNA模板2.5μL，按照TaqMan Gene Expression Master Mix说明书进行定量PCR检测，引物信息如表1所示。扩增程序为：95℃10min，95℃30S，55℃30s，72℃延伸30s共40个循环，定量PCR仪为Roche 480Ⅱ，引物信息如表1所示。从RNA水平看P选择素基因经冲击波处理后的表达水平约为处理前的24倍，
表1：选择素定量PCR引物信息
实施例2
1)从液氮中取出原代人心脏微血管内皮细胞(HCMEC)冻存管，37℃水浴箱迅速融化，传至已左旋多聚赖氨酸包被的培养瓶中，放入一定适量的内皮细胞培养基，37℃、5％二氧化碳培养箱中培养，2～3d换液，4～5d传代1次，用胰酶消化细胞；实验采用第5代细胞。
2)取第5代的HCMEC细胞消化离心后，用10％的完全培养液重悬移植到培养皿中；把冲击波探头进行消毒处理，设定参数为1.5bar、10Hz，用冲击波作用细胞200次，对照组为没有进行冲击波处理的第5代HCMEC细胞。
3)对经过冲击波处理的细胞培养60小时进行RNA分离，利用荧光定量实时PCR技术对P选择素和E选择素进行基因表达量的检测。
4)用相对定量的方法对选择素基因表达水平进行计算，采用目的基因与内参基因之间Ct值之间的差异来确定目的基因的表达量，本发明中，以GAPDH作为内参基因，每个RNA样品的定量PCR进行三个重复以消除系统误差，从RNA水平看P选择素基因经冲击波处理后的表达水平约为处理前的15倍。
实施例3
1)从液氮中取出原代人心脏微血管内皮细胞(HCMEC)冻存管，37℃水浴箱迅速融化，传至已左旋多聚赖氨酸包被的培养瓶中，放入一定适量的内皮细胞培养基，37℃、5％二氧化碳培养箱中培养，2～3d换液，4～5d传代1次，用胰酶消化细胞；实验采用第5代细胞。
2)取第5代的HCMEC细胞消化离心后，用10％的完全培养液重悬移植到培养皿中；把冲击波探头进行消毒处理，设定参数为2.0bar、10Hz，用冲击波作用细胞200次，对照组为没有进行冲击波处理的第5代HCMEC细胞。
3)对经过冲击波处理的细胞培养60小时进行RNA分离，利用荧光定量实时PCR技术对P选择素和E选择素进行基因表达量的检测。
4)用相对定量的方法对选择素基因表达水平进行计算，采用目的基因与内参基因之间Ct值之间的差异来确定目的基因的表达量，本发明中，以GAPDH作为内参基因，每个RNA样品的定量PCR进行三个重复以消除系统误差，从RNA水平看P选择素基因经冲击波处理后的表达水平约为处理前的20倍。
实施例4
1)从液氮中取出原代人心脏微血管内皮细胞(HCMEC)冻存管，37℃水浴箱迅速融化，传至已左旋多聚赖氨酸包被的培养瓶中，放入一定适量的内皮细胞培养基，37℃、5％二氧化碳培养箱中培养，2～3d换液，4～5d传代1次，用胰酶消化细胞；实验采用第5代细胞。
2)取第5代的HCMEC细胞消化离心后，用10％的完全培养液重悬移植到培养皿中；把冲击波探头进行消毒处理，设定参数为3.0bar、10Hz，用冲击波作用细胞200次，对照组为没有进行冲击波处理的第5代HCMEC细胞。
3)对经过冲击波处理的细胞培养60小时进行RNA分离，利用荧光定量实时PCR技术对P选择素和E选择素进行基因表达量的检测。
4)用相对定量的方法对选择素基因表达水平进行计算，采用目的基因与内参基因之间Ct值之间的差异来确定目的基因的表达量，本发明中，以GAPDH作为内参基因，每个RNA样品的定量PCR进行三个重复以消除系统误差，从RNA水平看P选择素基因经冲击波处理后的表达水平约为处理前的17倍。
实施例5
1)从液氮中取出原代人心脏微血管内皮细胞(HCMEC)冻存管，37℃水浴箱迅速融化，传至已左旋多聚赖氨酸包被的培养瓶中，放入一定适量的内皮细胞培养基，37℃、5％二氧化碳培养箱中培养，2～3d换液，4～5d传代1次，用胰酶消化细胞；实验采用第5代细胞。
2)取第5代的HCMEC细胞消化离心后，用10％的完全培养液重悬移植到培养皿中；把冲击波探头进行消毒处理，设定参数为2.5bar、12Hz，用冲击波作用细胞200次，对照组为没有进行冲击波处理的第5代HCMEC细胞。
3)对经过冲击波处理的细胞培养60小时进行RNA分离，利用荧光定量实时PCR技术对P选择素和E选择素进行基因表达量的检测。
4)用相对定量的方法对选择素基因表达水平进行计算，采用目的基因与内参基因之间Ct值之间的差异来确定目的基因的表达量，本发明中，以GAPDH作为内参基因，每个RNA样品的定量PCR进行三个重复以消除系统误差，从RNA水平看P选择素基因经冲击波处理后的表达水平约为处理前的21倍。
实施例6
1)从液氮中取出原代人心脏微血管内皮细胞(HCMEC)冻存管，37℃水浴箱迅速融化，传至已左旋多聚赖氨酸包被的培养瓶中，放入一定适量的内皮细胞培养基，37℃、5％二氧化碳培养箱中培养，2～3d换液，4～5d传代1次，用胰酶消化细胞；实验采用第5代细胞。
2)取第5代的HCMEC细胞消化离心后，用10％的完全培养液重悬移植到培养皿中；把冲击波探头进行消毒处理，设定参数为2.0bar、8Hz，用冲击波作用细胞200次，对照组为没有进行冲击波处理的第5代HCMEC细胞。
3)对经过冲击波处理的细胞培养60小时进行RNA分离，利用荧光定量实时PCR技术对P选择素和E选择素进行基因表达量的检测。
4)用相对定量的方法对选择素基因表达水平进行计算，采用目的基因与内参基因之间Ct值之间的差异来确定目的基因的表达量，本发明中，以GAPDH作为内参基因，每个RNA样品的定量PCR进行三个重复以消除系统误差，从RNA水平看P选择素基因经冲击波处理后的表达水平约为处理前的18倍。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims (8)

1.一种增强血管内皮细胞表达P选择素的方法，包括以下步骤：
步骤(1)：设置冲击波设备作用模式及作用参数，包括：压强、频率、频次；
步骤(2)：准备继代培养的血管内皮细胞或实验小鼠体内血管内皮细胞，离心后，用10％的完全培养液重悬移植到培养皿中，再利用探头对细胞进行冲击波处理；
步骤(3)：完成冲击波处理后，继续培养，再分离血管内皮细胞利用荧光定量PCR方法检测P-选择素基因表达量，以GAPDH基因为参考内标。
2.根据权利要求1所述的增强血管内皮细胞表达P选择素的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的继代培养的血管内皮细胞制备方法为：从液氮中取出原代人心脏微血管内皮细胞冻存管，37℃水浴箱融化，传至已左旋多聚赖氨酸包被的培养瓶中，放入一定适量的内皮细胞培养基，在37℃、5％二氧化碳培养箱中培养，2～3d换液，4～5d传代1次，用胰酶消化细胞，实验采用第5代细胞。
3.根据权利要求2所述的增强血管内皮细胞表达P选择素的方法，其特征在于，所述原代人心脏微血管内皮细胞能够选用活体内的血管内皮细胞。
4.根据权利要求1所述的增强血管内皮细胞表达P选择素的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的冲击波参数范围为压力1.5-3.0bar、频率8-12Hz、频次为200次。
5.根据权利要求1所述的增强血管内皮细胞表达P选择素的方法，其特征在于，步骤(3)中，采用相对定量的方法对选择素基因表达水平进行计算，采用目的基因与内参基因之间Ct值之间的差异来确定目的基因的表达量，以GAPDH作为内参基因，每个RNA样品的定量PCR进行三个重复以消除系统误差。
6.根据权利要求1所述的增强血管内皮细胞表达P选择素的方法，其特征在于，步骤(3)中，采用的荧光定量PCR方法检测为：用High Pure RNAIsolation Kit提取总RNA，采用TaqMan Reverse Transcription Rengents试剂盒将总RNA反转录为cDNA，取反转录产物cDNA模板2.5μL，按照TaqMan Gene Expression MasterMix说明书进行定量PCR检测。
7.根据权利要求1所述的增强血管内皮细胞表达P选择素的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述继续培养的时间为60小时。
8.根据权利要求1所述的增强血管内皮细胞表达P选择素的方法，其特征在于，所述增强血管内皮细胞表达P选择素的方法不局限于表达P选择素。
CN201811007661.1A 2018-08-31 2018-08-31 增强血管内皮细胞表达p选择素的方法 Pending CN109280682A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811007661.1A CN109280682A (zh) 2018-08-31 2018-08-31 增强血管内皮细胞表达p选择素的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811007661.1A CN109280682A (zh) 2018-08-31 2018-08-31 增强血管内皮细胞表达p选择素的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109280682A true CN109280682A (zh) 2019-01-29

Family

ID=65183260

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811007661.1A Pending CN109280682A (zh) 2018-08-31 2018-08-31 增强血管内皮细胞表达p选择素的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109280682A (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106687582A (zh) * 2014-08-04 2017-05-17 堪萨斯大学 哺乳动物多能干细胞、其产生方法及其用途

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106687582A (zh) * 2014-08-04 2017-05-17 堪萨斯大学 哺乳动物多能干细胞、其产生方法及其用途

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. HOFMANN ET AL: "The effect of shock wave therapy on gene expression in human osteoblasts isolated from hypertrophic fracture non-unions", 《SHOCK WAVES》 *
STEPHEN FÔN HUGHES等: "A Pilot Study to Evaluate Haemostatic Function, following Shock Wave Lithotripsy (SWL) for the Treatment of Solitary Kidney Stones", 《PLOS ONE 》 *
邢更彦主编: "《骨肌疾病体外冲击波疗法》", 31 December 2015 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Elseberg et al. Bioreactor expansion of human mesenchymal stem cells according to GMP requirements
CN107604058A (zh) piRNA‑514核苷酸类似物及其反义核苷酸的应用和应用其的产品
Li et al. Degenerative musculoskeletal diseases: pathology and treatments
CN107303296A (zh) Bk通道开放剂在用于建立血管平滑肌细胞钙化模型中的用途
CN109280682A (zh) 增强血管内皮细胞表达p选择素的方法
CN102373175A (zh) 雷洛昔芬在间充质干细胞体外成骨分化中的应用
US8936766B2 (en) Device and method for delivering mechanically released cells from liposuction aspirates
CN108531483A (zh) 一种与椎间盘髓核相关的环状rna及应用
CN105233280A (zh) 基于dc的神经胶质瘤全肿瘤抗原疫苗及其制备方法
CN107574241B (zh) 抑郁症家族基因ska1-3的检测方法
CN107519489A (zh) miR‑375抑制剂在制备抗血管衰老药物中的应用
CN111057750A (zh) 检测间充质干细胞成脂潜力的检测方法
CN109097431A (zh) 一种筛选促骨细胞生成的间充质干细胞的方法
CN107188957A (zh) 抗原肽t790m‑1及其在制备治疗非小细胞肺癌的药物中的应用
CN107325171A (zh) 抗原肽t790m‑7及其在制备治疗非小细胞肺癌的药物中的应用
CN115961025B (zh) 一种环状rna在制备与心肌肥厚相关的产品中的应用
CN116920069B (zh) 一种中药提取液及其在促进脐带干细胞分泌vegf中的应用
CN108337893A (zh) 一种sgRNA及其构建的慢病毒载体和应用
CN111840327B (zh) 治疗糖尿病足的间质干细胞制剂及其应用
Kısaoğlu et al. Facial artery and lingual artery originating from a common trunk: a case report.
US20220152119A1 (en) Compositions derived from human amnion cells & related methods
Ward Factors influencing future progress in neurosurgery
STADNYK et al. SERUM CREATINE PHOSPHOKINASE ACTIVITY IN RABBITS DURING REGENERATION OF EXPERIMENTALLY DAMAGED MUSCLE TISSUE AND AFTER ITS STIMULATION BY TRANSPLANTED MSC.
Chi et al. Surgery for spinal stenosis in older patients: what's the problem?
CN115120725A (zh) Sdc1作为骨质破坏疾病药物治疗靶点的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination