CN109276589B - 一种车轴草提取物在制备改善睡眠药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种车轴草提取物在制备改善睡眠药物中的应用，所述车轴草提取物经乙醇水溶液浸提和精制纯化后得到。本发明试验发现车轴草具有一定的镇静、安眠效果，据此提供了一种车轴草提取物在制备改善睡眠药物中的新用途，为开发改善睡眠功效的药物或功能食品奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及中药提取技术领域，尤其涉及一种车轴草提取物在制备改善睡眠药物中的应用。
背景技术
自古以来就有“宁可食无肉，不可睡不寐”的说法。良好的睡眠对人类的生长发育、新陈代谢、学习记忆、生存适应、维持免疫功能、恢复体力与精力等来说，有着至关重要的生理作用。
长期的失眠将会给身体及心理带来诸多损害。失眠可能引起人体的免疫力下降，进而削弱机体的抗感染和免疫监视能力；使高血压、糖尿病、心血管疾病甚至哮喘等慢性疾病的发病风险升高；使人过早衰老，缩短寿命。另外，失眠还会影响大脑的认知功能，使人们在学习工作时记忆力下降、注意力不集中、思维能力下降、效率低下，还会导致植物神经功能紊乱，从而产生紧张、焦虑、抑郁等情绪，严重时甚至会产生自杀倾向。
2017年，人民网发布的《2017年中国网民失眠地图》显示参与调查的中国网民中大约有80％的人经历过失眠，情况最严重的地区分别为上海和广州。基于此，部分研究把失眠视为当前威胁人类健康的潜在因素之一。
目前，关于改善睡眠药物制备的研究已有不少，例如：
授权公告号为CN103933080B的发明专利文献提供了一种能够改善小鼠睡眠质量的微生态制剂，该制剂由25％枯草芽孢杆菌BS01发酵灵芝孢子粉、25％玉米淀粉、9％微晶纤维素、3.4％甘露醇、3.6％柠檬酸、24％麦芽糊精、9.5％低聚果糖和0.5％甜味素组成。
授权公告号为CN103976351B的发明专利文献提供了一种增强免疫力改善睡眠的保健食品及其二步发酵制备方法，该方法包括蜜环菌固体发酵：以含有增强免疫力功能的天然组分为药性培养基质，接种蜜环菌液体菌种进行双向固体发酵制备具有增强免疫力功能的药性菌质；乳酸菌液体深层发酵：以药性菌质为原料，粉碎后添加酵母粉、谷氨酸钠、水制成发酵培养基，接种乳酸菌进行液体深层发酵生产改善睡眠的γ-氨基丁酸，制备同时具有增强免疫力和改善睡眠功能的发酵液；采用发酵液，制备成不同剂型的增强免疫力改善睡眠的保健食品。
车轴草在世界各地均有分布，我国包括13种，其中白车轴草与红车轴草最为常见，在中国，主要分布于华北、华中、华南及西南地区，虽然我国具有丰富的车轴草资源，但资源利用率不高，主要将其作为家畜的喂养饲料。该属植物主要含有黄酮类，皂苷类及挥发芳香性成分，据《中药大辞典》记载，我国民间以车轴草全草入药，具有清热凉血，祛痰止咳，镇静止痛的功效，主治癫痫，痔疮出血，硬结肿块。
目前，关于车轴草提取物制备方法及其用途的研究已有报道，例如：
授权公告号为CN1272332C的发明专利文献公开了红车轴草总黄酮高含量提取物与制备及其在制药用组合物中的应用，该提取物的制备，是在常规含水醇溶媒提取方法基础上，增加了吸附材料吸附的柱层析分离。即将含水的醇溶媒提取的红车轴草提取液，回收溶媒至4～6倍药材体积，含醇浓度10％～60％，上柱，待上完柱后，再用吸附剂体积14～16倍量20％～70％醇溶液洗脱，回收洗脱液，得沉淀物，将沉淀用含醇10％～80％的C1-4脂肪醇或丙酮分级处理，得沉淀，干燥后得总异黄酮含量50％～90％，提取物中刺芒柄花素含量为25％～70％，鹰嘴豆芽素含量为5％～25％的红车轴草提取物。提取物与常规用辅料混合加工制成用于妇女更年期综合症、雌激素低下以及男性前列腺肥大的口服制剂。
然而，却未见关于车轴草具有镇静、安眠效果的研究报道。
发明内容
基于上述研究背景，本发明试验发现车轴草具有一定的镇静、安眠效果，据此提供了一种车轴草提取物在制备改善睡眠药物中的新用途，为开发改善睡眠功效的药物或功能食品奠定了基础。
具体技术方案如下：
本发明提供了一种车轴草提取物在制备改善睡眠药物中的应用，所述车轴草提取物经乙醇水溶液浸提和精制纯化后得到。
进一步地，所述的车轴草为红车轴草。
试验发现，经乙醇水溶液浸提后得到的车轴草提取物，虽然也具有一定的改善小鼠睡眠的作用，但效果不够显著；为此，申请人对浸提液做了进一步的纯化精制，提高了车轴草提取物中的有效成分。
进一步地，所述车轴草提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)取车轴草，干燥、粉碎过筛后，得到车轴草粉末；
(2)将车轴草粉末溶于乙醇水溶液中，热回流提取多次后，合并提取液，提取液经浓缩，得到车轴草浸膏；
(3)先用水稀释车轴草浸膏，再对浸膏进行大孔树脂柱层析，依次采用水和体积浓度为30～95％的乙醇水溶液进行洗脱，获得洗脱组分，然后经减压浓缩和冷冻干燥，得到车轴草提取物。
作为优选，步骤(1)中，所述过筛的目数为10～200目；车轴草提取物的提取率随过筛目数的增大而增大，在过筛目数达到100目后，提取率达到最高值约为1.82mg/g，继续增大目数未见明显提高。
作为优选，步骤(2)中，所述乙醇水溶液的体积浓度为10～90％；在体积浓度为10～95％的范围内车轴草提取物的提取率随乙醇浓度的增大而增大，在乙醇浓度达到50％后，提取率达到最高值约为2.33mg/g，继续增大提取浓度提取率反而降低，而当乙醇浓度为70％时，提取率约为1.89mg/g，此时的睡眠改善效果最优。更优选，所述乙醇水溶液的体积浓度为70～90％。
作为优选，步骤(2)中，所述车轴草粉末与乙醇水溶液的料液比为1:3-6g/mL。料液比在1：3～6范围内车轴草提取物的提取率随料液比的增大而增大，在料液比达到1：5后，提取率达到最高值约为2.21mg/g，继续增大料液比提取率无明显改变，不同料液比得到的提取物对睡眠的改善效果影响不大。
作为优选，步骤(2)中，热回流提取的次数为两次；提取的温度为30-90℃，时间为1-5h。热回流次数越多，提取时间越长，提取率越高，但提取次数大于两次，提取时间大于2h后，提取率增加不显著；改善睡眠效果随第一次提取温度的改变而改变，当第一次提取的提取温度为70℃时，睡眠改善效果最优。
步骤(2)中，浸提后，通过旋转蒸发仪进行浸提液的浓缩，其中，浓缩的温度为40～70℃。提高浓缩温度，浓缩效率增加，但过高的浓缩温度会对提取物的成分有所影响，浓缩温度为55℃时，对成分影响较小且效率较高。
作为优选，步骤(3)中，车轴草浸膏经水稀释后的浓度为0.6-1.5g/mL。当稀释后浓度为1.2g/mL时，具有改善睡眠功效的溶液洗脱成分得率最高。
试验比较不同体积浓度的乙醇水溶液洗脱液，发现依次采用水以及体积浓度分别为30％、70％、95％的乙醇水溶液进行洗脱，得到的车轴草提取物具有最优的睡眠改善效果。
更优选，步骤(3)中，洗脱过程为：依次采用水和体积浓度分别为30％、70％、95％的乙醇水溶液进行洗脱，获得各洗脱组分的混合液；可更好地将提取物中的杂质清除，提高提取物中有效成分的纯度。
作为优选，所述大孔树脂的型号为AB-8、D-101或HPD-400。树脂的型号与洗脱成分密切相关，当使用的大孔吸附树脂为AB-8时，洗脱得到的成分睡眠改善效果最佳。
作为优选，步骤(3)中，各洗脱液的用量为1-5BV，流速1-3BV/h。洗脱成分的多少与洗脱液的流速及用量密切相关，同时也与最终产物的改善睡眠效果密切相关。当洗脱液用量为4BV，流速为1.8BV/h时，有效成分能完全洗脱。
作为优选，步骤(3)中，所述减压浓缩的温度为40～70℃。
作为优选，步骤(3)中，所述冷冻干燥的温度为-20℃～-55℃，时间为24～48h。
作为优选，步骤(3)中，减压浓缩后进行凝固，而冷冻干燥前需冷藏过夜；其中，凝固温度为-15℃～-25℃，冷藏过夜的温度为-80℃；可得到干燥疏松易复溶的车轴草提取物粉末，以期作为原料制备成药物。
进一步地，本发明所述的改善睡眠药物由车轴草提取物和药学上可接受的载体组成。
所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，如填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂等。
所述填充剂可采用淀粉、蔗糖或微晶纤维素；所述粘合剂可采用淀粉浆、羟丙纤维素、明胶或聚乙二醇；所述湿润剂可采用硬脂酸镁、微粉硅胶或聚乙二醇类；所述吸收促进剂可采用聚山梨脂或卵磷脂；所述表面活性剂可采用伯洛沙姆、脂肪酸山梨坦或聚山梨脂。另外，还可以加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
所属药物的剂型可以是片剂，丸剂，粉剂，分散片，小药囊剂，酏剂，混悬剂，乳剂，溶液剂，糖浆剂，气雾剂，软胶囊，硬胶囊，无菌注射液，搽剂或栓剂；可制成常规、速释、缓释或延迟释放制剂。
本发明所述的药物还可以通过各种途径给予，包括：口服、鼻腔、肌肉注射、皮下注射、静脉注射等。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明通过试验发现了车轴草提取物在制备改善睡眠药物中的新用途，为开发改善睡眠功效的药物或功能食品奠定了基础。
(2)本发明从车轴草中提取得到粗提物，并经纯化精制和功能学评价，得到具有很好的改善睡眠功效的提取成分。
(3)本发明通过直接睡眠试验、延长戊巴比妥钠睡眠时间试验、戊巴比妥钠阈下剂量催眠试验等三项试验研究表明，车轴草提取物虽然没有直接催眠的作用，但能使实验小鼠活动量减弱，能够显著延长戊巴比妥钠的睡眠时间，且具有剂量效应关系。
(4)本发明制备方法操作简单，易于产业化；采用的车轴草价格低廉，来源丰富。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。
实施例1
1、车轴草提取物的制备方法
具体步骤如下：
(1)取车轴草，干燥后，粉碎过100目筛网，得到车轴草粉末；
(2)将车轴草粉末按料液比1:5g/mL的比例溶于体积浓度为70％的乙醇水溶液中，热回流提取2次，合并提取液；
其中，第一次提取的温度为70℃，时间为2h；第二次提取的温度为70℃，时间为2h；再将提取液置于55℃下浓缩，得车轴草浸膏(即车轴草粗提物)；
(3)用水将车轴草浸膏稀释至1.5g/mL后，使用AB-8型大孔吸附树脂进行大孔树脂柱层析，依次采用3BV的水洗脱液、4BV的体积浓度30％的乙醇水洗脱液、4BV的体积浓度70％的乙醇水洗脱液、4BV的体积浓度95％的乙醇水洗脱液，以1.8BV/h的流速进行洗脱，得水洗脱部位、30％乙醇水洗脱部位、70％乙醇水洗脱部位、95％乙醇水洗脱部位，各洗脱部位于55℃减压浓缩后，于-18℃凝固，-80℃过夜后，进行冷冻干燥，冷冻干燥温度为-25℃，冷冻干燥时间为24h，收集冻干粉，即得车轴草提取物。
2、总黄酮及皂苷含量测定
标准曲线制作：
(1)精密吸取芦丁标准溶液0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00ml置于10ml的比色管中，往每只比色管中加入5％的亚硝酸钠溶液0.3ml，摇匀放置6分钟，再加入10％的硝酸铝溶液0.30ml,摇匀，放置6min接着加入4％的氢氧化钠4ml,加入60％的乙醇溶液至刻度线定容，摇匀，放置15min.最后在波长510nm处测定吸光度。
(2)精密称取人参皂苷Rg1标准品4.3毫克，置于10毫升的容量瓶中，加甲醇溶解至刻度线摇匀，制成每毫升含0.43毫克的溶液，将得到对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5毫升摇匀，配成不同浓度的溶液，挥干，精密加入0.2毫升5％香草醛-冰醋酸和0.8的高氯酸，60摄氏度水浴15分钟，冰水浴3分钟，再加入5毫升无水乙酸，摇匀，在550nm处测定吸光度。绘制标准曲线
样品测定：取样品按标准品测定步骤进行检测吸光度，按相应标准曲线，计算相应成分含量。
3、动物实验
3.1实验材料
(1)实验动物与药物：ICR雄性小鼠(18-22g)；戊巴比妥钠，浙江中医药大学动物实验研究中心提供；车轴草提取物(Trifolium pretense extract,TPE)由实施例1制备方法中的各步骤而得。
(2)动物分组：每个试验均选取90只小鼠，随机分成15组，分别为14个试验组和1个对照组：
TPE-粗提物低组：车轴草粗提物的低剂量组；
TPE-粗提物高组：车轴草粗提物的高剂量组；
TPE-水低组：车轴草提取物浸膏使用3BV水洗脱成分的低剂量组；
TPE-水高组：车轴草提取物浸膏使用3BV水洗脱成分的高剂量组；
TPE-30％醇低组：车轴草提取物浸膏依次使用3BV水、4BV30％乙醇洗脱后收集的30％醇洗脱成分低剂量组；
TPE-30％醇高组：车轴草提取物浸膏依次使用3BV水、4BV30％乙醇洗脱后收集的30％醇洗脱成分的高剂量组；
TPE-70％醇低组：车轴草提取物浸膏依次使用3BV水、4BV30％乙醇、4BV70％乙醇洗脱后收集的70％醇洗脱成分的低剂量组；
TPE-70％醇高组：车轴草提取物浸膏依次使用3BV水、4BV30％乙醇、4BV70％乙醇洗脱后收集的70％醇洗脱成分的高剂量组；
TPE-95％醇低组：车轴草提取物浸膏依次使用3BV水、4BV30％乙醇、4BV70％乙醇、4BV95％乙醇洗脱后收集的95％醇洗脱成分的低剂量组；
TPE-95％醇高组：车轴草提取物浸膏依次使用3BV水、4BV30％乙醇、4BV70％乙醇、4BV95％乙醇洗脱后收集的95％醇洗脱成分的高剂量组；
TPE-全水洗脱低组：车轴草提取物浸膏使用15BV水洗脱的成分的低剂量组；
TPE-全水洗脱高组：车轴草提取物浸膏使用15BV水洗脱的成分的高剂量组；
TPE-全乙醇洗脱低组：车轴草提取物浸膏使用15BV 95％乙醇洗脱的成分的低剂量组；
TPE-全乙醇洗脱高组：车轴草提取物浸膏使用15BV95％乙醇洗脱的成分的高剂量组；
对照组(简称Nor组)：蒸馏水组。
在试验组给予低剂量(100mg/kg.bw)和高剂量(500mg/kg.bw)的试验样品，对照组给予等量的蒸馏水。
3.2实验方法
(1)直接睡眠试验：连续灌胃7d，观察各组小鼠的睡眠发生率。睡眠以翻正反射消失为判断指标，当小鼠置于背卧位时，1min内不能翻正，即认为翻正反射消失，进入睡眠。翻正反射恢复即为动物觉醒，翻正反射消失至恢复这段时间为动物睡眠时间。
(2)延长戊巴比妥钠睡眠时间试验：连续灌胃7d，最后一次给样或蒸馏水15min后，各组小鼠腹腔注射50mg/kg.bw戊巴比妥钠，注射量为0.1mL/10g.bw，以翻正反射消失为指标，观察睡眠时间。
(3)戊巴比妥钠阈下催眠剂量试验：连续灌胃7d，最后一次给样或蒸馏水15min后，各组小鼠腹腔注射35mg/kg.bw戊巴比妥钠最大阈下催眠剂量，观察30min内入睡小鼠数(翻正反射消失1min以上者)。
(4)数据处理及统计分析：数据用SPSS 18.0软件进行方差分析，测定差异显著性。
3.3实验结果
(1)提取率与总黄酮、总皂苷含量结果
表1车轴草提取物提取率与总黄酮，总皂苷含量结果对比
(2)直接睡眠试验结果
小鼠给予样品后，观察60min内小鼠的活动情况，在此期间样品组小鼠活动量与对照组相比明显减弱，但样品组与对照组均无睡眠现象发生，说明车轴草提取物没有直接催眠的功能。
(3)延长戊巴比妥钠睡眠时间试验结果
车轴草提取物对延长戊巴比妥钠睡眠时间的影响如表2所示。
表2车轴草提取物对延长戊巴比妥钠睡眠时间的影响(
n＝6)
与对照组(Nor)相比，*P<0.05，**P<0.01。
由表2所示，低剂量和高剂量车轴草提取物均能明显延长小鼠睡眠时间，与对照组对比差异显著。高剂量组(P<0.01)对小鼠睡眠的改善效果要明显优于低剂量组(P<0.05)，95％乙醇洗脱成分比其他组分具有更好的改善睡眠效果。
(4)戊巴比妥钠阈下催眠剂量试验结果
车轴草提取物对戊巴比妥钠阈下催眠剂量试验的影响如表3所示。
表3车轴草提取物对戊巴比妥钠阈下催眠剂量试验的影响(
n＝6)
与对照组(Nor)相比，*P<0.05。
如表3所示，由于各组内小鼠沉醒时间和睡眠时间有较大个体差异，故与对照组相比，低剂量车轴草提取物并不能对戊巴比妥钠阈下催眠剂量试验有显著影响；而高剂量组可显著改善小鼠的戊巴比妥钠阈下催眠剂量试验结果，延长觉醒时间(P<0.05)和睡眠时间(P<0.05)。并且，经95％醇洗脱液洗脱的车轴草提取物具有最佳的睡眠改善效果。
实施例2
本实施例对实施例1车轴草提取物制备方法中浸提液(乙醇水溶液)的体积浓度做了梯度试验，分别为：10％乙醇、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇。除乙醇浓度不同，其余条件与实施例1相同。
车轴草提取物的提取率、成分组成和延长小鼠戊巴比妥钠睡眠时间实验的结果如下：
表4车轴草提取物提取率、成分含量及对延长小鼠戊巴比妥钠睡眠时间的影响
如表4所示，当使用70％乙醇做提取溶剂时，总黄酮，与总皂苷含量最高，且使用高剂量(500mg/kg.bw)提取物对小鼠进行延长巴比妥钠睡眠时间实验时，发现70％乙醇提取物具有最好效果。
实施例3
本实施例对实施例1车轴草提取物制备方法步骤(2)中的第一次热回流提取的提取温度进行了梯度试验，分别为：30℃、50℃、70℃、90℃。除第一次提取温度不同，其余条件与实施例1相同。
车轴草提取物的提取率、成分组成和延长小鼠戊巴比妥钠睡眠时间实验的结果如下：
表5车轴草提取物提取率、成分含量及对延长小鼠戊巴比妥钠睡眠时间的影响
如表5所示，当第一次提取使用70℃时，提取率、总黄酮和总皂苷含量都最高，且使用高剂量(500mg/kg.bw)提取物对小鼠进行延长巴比妥钠睡眠时间实验时，发现该温度下的提取物具有最好效果。
实施例4
本实施例对实施例1车轴草提取物制备方法中纯化使用的大孔树脂进行了筛选，分别为AB-8型、D-101型、HPD-400型大孔树脂，比较了95％乙醇洗脱组分对小鼠戊巴比妥钠睡眠时间的延长作用。其余条件与实施例1相同。
车轴草提取物的提取率、成分组成和延长小鼠戊巴比妥钠睡眠时间实验的结果如下：
表6车轴草提取物提取率、成分含量及对延长小鼠戊巴比妥钠睡眠时间的影响
如表6所示，使用AB-8型大孔树脂较其他2种树脂对有效成分纯化程度高，且使用高剂量(500mg/kg.bw)提取物对小鼠进行延长巴比妥钠睡眠时间实验时，发现该树脂纯化的提取物具有最好效果。
综上可见，通过直接睡眠试验、延长戊巴比妥钠睡眠时间试验、戊巴比妥钠阈下剂量催眠试验等三项试验研究表明，车轴草提取物虽然没有直接催眠的作用，但能使实验小鼠活动量减弱，能够显著延长戊巴比妥钠的睡眠时间，且具有剂量效应关系。同时，高剂量车轴草提取物协同戊巴比妥钠阈下剂量催眠作用。因此，车轴草提取物具有良好的改善睡眠、安神镇静的作用。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (4)
1.一种车轴草提取物在制备改善睡眠药物中的应用，其特征在于，所述车轴草提取物经乙醇水溶液浸提和精制纯化后得到；
所述车轴草提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)取车轴草，干燥、粉碎过筛后，得到车轴草粉末；
(2)将车轴草粉末溶于乙醇水溶液中，热回流提取多次后，合并提取液，提取液经浓缩，得到车轴草浸膏；
(3)先用水稀释车轴草浸膏，再对浸膏进行大孔树脂柱层析，依次采用水和体积浓度为30～95％的乙醇水溶液进行洗脱，获得洗脱组分，然后经减压浓缩和冷冻干燥，得到车轴草提取物；
所述大孔树脂的型号为AB-8型、D-101型、或HPD-400型；
洗脱过程为：依次采用水以及体积浓度分别为30％、70％、95％的乙醇水溶液进行洗脱，获得各洗脱组分的混合液；洗脱液的用量为1-5BV，流速为1-3BV/h；
步骤(2)中，所述乙醇水溶液的体积浓度为10～90％；热回流提取的次数为两次；提取的温度为30-90℃，时间为1-5h。
2.如权利要求1所述的车轴草提取物在制备改善睡眠药物中的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述车轴草粉末与乙醇水溶液的料液比为1:3-6g/mL。
3.如权利要求1所述的车轴草提取物在制备改善睡眠药物中的应用，其特征在于，步骤(3)中，车轴草浸膏经水稀释后的浓度为0.6-1.5g/mL。
4.如权利要求1所述的车轴草提取物在制备改善睡眠药物中的应用，其特征在于，步骤(3)中，所述减压浓缩的温度为40～70℃；所述冷冻干燥的温度为-20℃～-55℃，时间为24～48h。
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| 三叶草功能性饮料制备工艺研究;朱成凯等;《中国食物与营养》;20130928;第19卷(第09期);第58页左栏第一段、1.3.1总体工艺 * |
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