CN109270204B - 一种口用型无烟气烟草制品烟碱口腔释放研究方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种口用型无烟气烟草制品烟碱口腔释放的研究方法，属于口用型无烟气烟草制品分析技术领域。该方法包括口用型无烟气烟草制品的筛选、模拟溶出参数的确定、体内实验烟碱口腔释放情况的测定、体外试验模拟等步骤。本发明利用体内实验进行体外研究参数确定，体外采用全仿真模拟咀嚼机对样品进行测试，所用装置能完全模拟人体口腔吸食无烟气烟草制品的状态，在咀嚼力度、咀嚼频率、唾液流量、口腔温度均可调控，且可控性强稳定性高，操作简单。本发明研究方法可以很好的避免传统人工品尝带来的主观和客观因素的影响，避免了大量人群实验的伦理道德制约，同时节约实验费用的同时还减少了因人体实验对健康带来的危害，适用于样品的批量研究。

Description

一种口用型无烟气烟草制品烟碱口腔释放研究方法

技术领域

本发明属于口用型无烟气烟草制品分析技术领域，具体涉及一种口用型无烟气烟草制品烟碱口腔释放研究方法，通过该方法可以研究分析口用型无烟气烟草制品烟碱溶出情况。

背景技术

无烟气烟草制品（Smokeless Tobacco products, 简称STPs）是指不经燃烧，直接通过口腔或鼻腔吸食的烟草制品，与传统卷烟相比其有害成分少，危害性较小；同时它不产生二手烟气，能在一定程度上缓解公共场所禁烟和吸烟的矛盾，并在一定程度上满足烟民的生理需要。无烟气烟草制品有袋装口含烟、鼻烟和嚼烟等多种多样的形式，其中消费主体是口用型无烟气烟草制品，主要包括袋装口含烟、胶基型嚼烟和含化烟。袋装口含烟是具有一定颗粒度的烟草粉末混合适量的香味物质、矫味剂、水、保润剂和酸碱调节剂经热处理加工制成的，用无纺布小袋包装，置于唇齿之间消费。胶基型无烟气烟草制品(Tobaccochewing gum)由瑞典火柴公司(Swedish Match)于2003年首先研发成功并试投放市场。它又称为新型嚼烟、胶基型无烟气烟草、烟草口香糖、胶基烟，是一种烟草和/或烟草提取物为效用组分，以可食用胶基为载体，通过咀嚼方式向人体递送烟碱的新型烟草制品。2016年，全球STPs销售额为120亿美元，其中袋装口含烟销售额增加40%以上，嚼烟增加10%左右。STPs覆盖全球70个国家，占总人口的73%。通过STPs形式进行消费时，烟草不经燃烧，不会产生卷烟烟气中特有的一些有害成分，更重要的是不会产生令人讨厌的“二手烟”，是禁烟环境下烟草消费的重要补充形式。受到当前世界控烟运动的影响，这一类的烟草制品正成为国际烟草领域的重要发展趋势。

烟草中生物碱约有50种，其中，烟碱是其重要的组成部分，约占其95%以上。同时也是STPs中重要成分之一，主要通过口腔或鼻腔粘膜吸收，作用于人体神经系统使吸食者产生满足感。烟碱的释放量是STPs制品质量安全的重要指标，其在人体中的吸收主要受含量、时间、和溶出等因素的影响。为了提供口用型无烟气烟草制品持续的生理满足感，烟碱在口腔中溶出率是关键因素，为了对该类产品的烟碱进行体外溶出量规律研究及质量评价，通常采用的方法是进行人群实验采集体内溶出唾液。但人群实验受到伦理、社会等诸多因素的限制，且主体因素影响较大，较难推广。STPs模拟口腔溶出国内也有一些学者进行过相关方面的研究。但都是以固定的唾液流速来探究不同影响因素的影响，而没有探究压力因素（袋装口含烟的使用方式一般是放入牙龈与嘴唇间）和唾液流速（口腔受到刺激时不同时间唾液释放速率不同）对烟碱释放的影响。没有真实有效地模拟人体口腔吸食无烟气烟草制品时的状态。因此如何克服现有技术的不足是目前口用型无烟气烟草制品分析技术领域亟需解决的问题。

发明内容

本发明针对目前已有的烟碱体外模拟溶出方法的不足，提供了一种口用型无烟气烟草制品烟碱口腔释放研究方法，该方法是一种更为接近人体口腔条件的试验方法，利用该方法可以更加准确的研究口用型无烟气烟草制品在人体口腔的释放情况，为该类产品的加工制作及质量控制提供技术支撑和理论依据。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种口用型无烟气烟草制品烟碱口腔释放的研究方法，包括如下步骤：

步骤（1），口用型无烟气烟草制品的筛选：对待研究的某种口用型无烟气烟草制品选取多颗进行重量检测，计算该制品单颗重量平均值和方差；之后，选择重量范围在平均值±（1-3）倍方差范围内的制品作为试样进行后续测定；

步骤（2），模拟溶出参数的确定：选择多位身体健康的自愿者在自然状态下吸食步骤（1）筛选出的试样，并在事先确定的时间点收集残留样品和各自愿者唾液，每个时间点使用一颗样品；

步骤（3），体内实验烟碱口腔释放情况的测定：利用反相超高效液相色谱分别对待研究口用型无烟气烟草制品、残留样品和自愿者唾液进行测试，以确定各时间段自愿者吸食样品的烟碱溶出量；

步骤（4），体外试验模拟：采用全仿真模拟咀嚼机模拟吸食该待研究口用型无烟气烟草制品，并根据步骤（3）得到的自愿者吸食样品的烟碱溶出量和唾液量，设置全仿真模拟咀嚼机的压合力、唾液流速、唾液量和口腔温度参数；

步骤（5），反相超高效液相色谱分析：利用反相超高效液相色谱分别对待研究口用型无烟气烟草制品、残留样品和全仿真模拟咀嚼机中的人工唾液进行测试，用此测试结果来表征待研究口用型无烟气烟草制品的烟碱口腔释放情况；

步骤（6），烟碱口腔释放规律研究：采用上述全仿真模拟咀嚼机及设定的参数对同种口用型无烟气烟草制品整个咀嚼过程中的不同时间点进行测试，绘制烟碱释放曲线，进行烟碱口腔释放规律研究。

进一步，优选的是，步骤（1）中，选择至少50颗待研究的某种口用型无烟气烟草制品进行重量检测。

进一步，优选的是，步骤（1）中，所述的口用型无烟气烟草制品的种类包括口含烟、嚼烟、含化烟、膏状含烟、牙粉和可溶解烟草，其中，所述的口含烟的种类包括袋装口含烟、烟草口香糖、含片和硬质糖。

进一步，优选的是，步骤（2）中，所述自愿者为年龄为18-55周岁。

进一步，优选的是，步骤（2）中，所述残留样品和自愿者唾液的收集时间点为实验开始后0-60min内任意一点。

进一步，优选的是，体外试验模拟时，所采用的人工唾液为无机盐类人工唾液或蛋白酶类人工唾液。

进一步，优选的是，设置全仿真模拟咀嚼机的唾液量和唾液流速的具体参数如下：

测试0.5min烟碱口腔释放情况时，唾液加入量1ml，唾液流速2ml/min；

测试1min烟碱口腔释放情况时，唾液加入量1.4ml，唾液流速1.4ml/min；

测试2min烟碱口腔释放情况时，唾液加入量2ml，唾液流速1ml/min；

测试5min烟碱口腔释放情况时，唾液加入量5ml，唾液流速1ml/min；

测试10min烟碱口腔释放情况时，唾液加入量11ml，唾液流速1.1ml/min；

测试15min烟碱口腔释放情况时，唾液加入量14ml，唾液流速0.93ml/min；

测试20min烟碱口腔释放情况时，唾液加入量18ml，唾液流速0.9ml/min。

进一步，优选的是，所述制品或残留样品中的烟碱含量分析方法为：测试时取1颗制品或残留样品，去包装剪碎后放入容器中，加入20 mL磷酸盐缓冲液和2 mL 0.25 mol/mL盐酸水溶液，先超声20~60分钟，然后再在震荡器上振荡30~60 min，静置，过滤萃取液，最后使用0.45 μm的滤膜过滤，之后使用反相超高效液相色谱定量分析。

本发明对于剪碎后的大小没有特殊限制。

进一步，优选的是，所述反相超高效液相色谱参数为：色谱柱：150mm×4.6mm×5μm的Agilent Eclipse Plus C18色谱柱；流动相：甲醇和10 mmol/L、pH=6.80的磷酸盐缓冲溶液，体积为65:35；流速：0.6mL/min；进样量：5µL；柱温：35℃；检测器：UV；检测波长：259nm。

目前，人工唾液大体分为两类，一类为无机盐类人工唾液，另一类为蛋白酶类人工唾液；蛋白酶类人工唾液处理包括无机盐外，还包括蛋白、酶。

无机盐类人工唾液可如表1和表2所示，但不限于此。

蛋白酶类人工唾液可如表3所示，但不限于此。

表1 人工唾液配方一

表2 人工唾液配方二

组成	用量	组成	用量
				KCl	0.400g	尿素	1.000g
NaCl	0.400g	Na<sub>2</sub>S·2H<sub>2</sub>O	0.005g
				CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O	0.795g	NaOH	调节pH至6.9
NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O	0.780g	蒸馏水	加至1000mL

表3 人工唾液配方三（mmol/L）

注：*单位为units/mL

本发明中测试过程中：烟碱溶出量=总烟碱含量-残留样品烟碱含量。

本发明采用的全仿真模拟咀嚼机可以为ZL 201610554134.7所示产品，但不限于此。全仿真模拟咀嚼机中所采用的部件可以如ZL 201610555175.8、ZL 201610555228.6、ZL201620743278.2和ZL 201620742852.2所示，但不限于此。

本发明设计了一种口用型无烟气烟草制品烟碱口腔释放的研究方法：通过自愿者体内实验对口用型无烟气烟草制品烟碱口腔释放的体外研究参数进行确定；确定压合力、唾液流速、唾液量和口腔温度等模拟溶出参数；利用全仿真模拟咀嚼机对口用型无烟气烟草制品的烟碱释放率、释放量等释放规律进行研究。本发明方法可控性强稳定性高，操作简单，可以很好的避免传统人工品尝带来的主观和客观因素的影响，避免了大量人群实验的伦理道德制约，同时节约实验费用的同时还减少了因人体实验对健康带来的危害，适用于样品的批量研究。

同时，第一，本发明采用重量检测的方法对样品进行筛选，优化了筛选范围，超过本发明的筛选范围会使得结果产生较大的偏差，降低了定量的准确性；

第二，本发明基于筛选出来的样品，以体内试验参数为基准来设置体外实验参数，避免了现有技术中体外试验参数设置问题而导致的研究偏差。

第三，本发明通过对同一种类制品的体内试验设置的体外试验参数，在后续过程中，同种类制品无需重复体内实验，可直接采用已经设置好的体外试验参数进行测试，对烟碱口腔释放规律进行研究，准确性优异。

第四，本发明优化了烟碱含量分析方法，使烟碱尽可能的萃取出，避免了因分析方法上的不足而导致的研究上出现的偏差；

第五，本发明在设置体外试验参数时，研究人体的吸食情况，设置不同的压合力、咀嚼频率，并针对不同的时间点设置不同的唾液加入量和唾液流速，更真是的模拟制品在口腔中的消费条件，大大提高了结果的准确性；

第六，在色谱分析时，优化了色谱参数，使得烟碱峰分离情况更好，且避免了其它物质对烟碱峰的干扰，提高了结果的准确性。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

本发明利用体内实验进行体外研究参数确定，体外采用全仿真模拟咀嚼机对样品进行测试，所用装置能完全模拟人体口腔吸食无烟气烟草制品的状态，在压合力、唾液流速、唾液量和口腔温度参数上均可调控，且可控性强稳定性高，操作简单。

本发明口用型无烟气烟草制品烟碱口腔释放的研究方法可以很好的避免传统人工品尝带来的主观和客观因素的影响，避免了大量人群实验的伦理道德制约，同时节约实验费用的同时还减少了因人体实验对健康带来的危害，适用于样品的批量研究，为该类产品的配方开发、加工制作及质量控制提供技术支撑和理论依据。

附图说明

图1为袋装口含烟的烟碱色谱图；其中A为标准品；B为测试样品；

图2为袋装口含烟的烟碱体内和体外溶出趋势图；

图3为实例1种四种袋装口含烟体外模拟溶出趋势图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

实施例1

一种口用型无烟气烟草制品烟碱口腔释放的研究方法，包括如下步骤：

步骤（1），口用型无烟气烟草制品的筛选：对待研究的某种口用型无烟气烟草制品选取60颗进行重量检测，计算该制品单颗重量平均值和方差；之后，选择重量范围在平均值±（1-3）倍方差范围内的制品作为试样进行后续测定；

步骤（2），模拟溶出参数的确定：选择多位身体健康的自愿者在自然状态下吸食步骤（1）筛选出的试样，并在事先确定的时间点收集残留样品和各自愿者唾液，每个时间点使用一颗样品；

步骤（3），体内实验烟碱口腔释放情况的测定：利用反相超高效液相色谱分别对待研究口用型无烟气烟草制品、残留样品和自愿者唾液进行测试，以确定各时间段自愿者吸食样品的烟碱溶出量；

步骤（4），体外试验模拟：采用全仿真模拟咀嚼机模拟吸食该待研究口用型无烟气烟草制品，并根据步骤（3）得到的自愿者吸食样品的烟碱溶出量和唾液量，设置全仿真模拟咀嚼机的压合力、唾液流速、唾液量和口腔温度参数；

步骤（5），反相超高效液相色谱分析：利用反相超高效液相色谱分别对待研究口用型无烟气烟草制品、残留样品和全仿真模拟咀嚼机中的人工唾液进行测试，用此测试结果来表征待研究口用型无烟气烟草制品的烟碱口腔释放情况；

步骤（6），烟碱口腔释放规律研究：采用上述全仿真模拟咀嚼机及设定的参数对同种口用型无烟气烟草制品整个咀嚼过程中的不同时间点进行测试，绘制烟碱释放曲线，进行烟碱口腔释放规律研究。

实施例2

一种口用型无烟气烟草制品烟碱口腔释放的研究方法，包括如下步骤：

步骤（1），口用型无烟气烟草制品的筛选：对待研究的某种口用型无烟气烟草制品选取120颗进行重量检测，计算该制品单颗重量平均值和方差；之后，选择重量范围在平均值±1倍方差范围内的制品作为试样进行后续测定；

步骤（2），模拟溶出参数的确定：选择多位年龄为18-55周岁身体健康的自愿者在自然状态下吸食步骤（1）筛选出的试样，并在事先确定的时间点收集残留样品和各自愿者唾液，每个时间点使用一颗样品；

所述残留样品和自愿者唾液的收集时间点为实验开始后0-60min内任意一点；

步骤（3），体内实验烟碱口腔释放情况的测定：利用反相超高效液相色谱分别对待研究口用型无烟气烟草制品、残留样品和自愿者唾液进行测试，以确定各时间段自愿者吸食样品的烟碱溶出量；

步骤（4），体外试验模拟：采用全仿真模拟咀嚼机模拟吸食该待研究口用型无烟气烟草制品，并根据步骤（3）得到的自愿者吸食样品的烟碱溶出量和唾液量，设置全仿真模拟咀嚼机的压合力、唾液流速、唾液量和口腔温度参数；所采用的人工唾液为无机盐类人工唾液；

步骤（5），反相超高效液相色谱分析：利用反相超高效液相色谱分别对待研究口用型无烟气烟草制品、残留样品和全仿真模拟咀嚼机中的人工唾液进行测试，用此测试结果来表征待研究口用型无烟气烟草制品的烟碱口腔释放情况；

步骤（6），烟碱口腔释放规律研究：采用上述全仿真模拟咀嚼机及设定的参数对同种口用型无烟气烟草制品整个咀嚼过程中的不同时间点进行测试，绘制烟碱释放曲线，进行烟碱口腔释放规律研究。

所述制品或残留样品中的烟碱含量分析方法为：测试时取1颗制品或残留样品，去包装剪碎后放入容器中，加入20 mL磷酸盐缓冲液和2 mL 0.25 mol/mL盐酸水溶液，先超声20分钟，然后再在震荡器上振荡30 min，静置，过滤萃取液，最后使用0.45 μm的滤膜过滤，之后使用反相超高效液相色谱定量分析。

所述反相超高效液相色谱参数为：色谱柱：150mm×4.6mm×5μm的AgilentEclipse Plus C18色谱柱；流动相：甲醇和10 mmol/L、pH=6.80的磷酸盐缓冲溶液，体积为65:35；流速：0.6mL/min；进样量：5µL；柱温：35℃；检测器：UV；检测波长：259nm。

实施例3

一种口用型无烟气烟草制品烟碱口腔释放的研究方法，包括如下步骤：

步骤（1），口用型无烟气烟草制品的筛选：对待研究的某种口用型无烟气烟草制品选取80颗进行重量检测，计算该制品单颗重量平均值和方差；之后，选择重量范围在平均值±3倍方差范围内的制品作为试样进行后续测定；

步骤（2），模拟溶出参数的确定：选择多位年龄为18-55周岁身体健康的自愿者在自然状态下吸食步骤（1）筛选出的试样，并在事先确定的时间点收集残留样品和各自愿者唾液，每个时间点使用一颗样品；

所述残留样品和自愿者唾液的收集时间点为实验开始后0-60min内任意一点；

步骤（3），体内实验烟碱口腔释放情况的测定：利用反相超高效液相色谱分别对待研究口用型无烟气烟草制品、残留样品和自愿者唾液进行测试，以确定各时间段自愿者吸食样品的烟碱溶出量；

步骤（4），体外试验模拟：采用全仿真模拟咀嚼机模拟吸食该待研究口用型无烟气烟草制品，并根据步骤（3）得到的自愿者吸食样品的烟碱溶出量和唾液量，设置全仿真模拟咀嚼机的压合力、唾液流速、唾液量和口腔温度参数；所采用的人工唾液为无机盐类人工唾液；

步骤（5），反相超高效液相色谱分析：利用反相超高效液相色谱分别对待研究口用型无烟气烟草制品、残留样品和全仿真模拟咀嚼机中的人工唾液进行测试，用此测试结果来表征待研究口用型无烟气烟草制品的烟碱口腔释放情况；

步骤（6），烟碱口腔释放规律研究：采用上述全仿真模拟咀嚼机及设定的参数对同种口用型无烟气烟草制品整个咀嚼过程中的不同时间点进行测试，绘制烟碱释放曲线，进行烟碱口腔释放规律研究。

所述制品或残留样品中的烟碱含量分析方法为：测试时取1颗制品或残留样品，去包装剪碎后放入容器中，加入20 mL磷酸盐缓冲液和2 mL 0.25 mol/mL盐酸水溶液，先超声60分钟，然后再在震荡器上振荡60 min，静置，过滤萃取液，最后使用0.45 μm的滤膜过滤，之后使用反相超高效液相色谱定量分析。

所述反相超高效液相色谱参数为：色谱柱：150mm×4.6mm×5μm的AgilentEclipse Plus C18色谱柱；流动相：甲醇和10 mmol/L、pH=6.80的磷酸盐缓冲溶液，体积为65:35；流速：0.6mL/min；进样量：5µL；柱温：35℃；检测器：UV；检测波长：259nm。

实施例4

一种口用型无烟气烟草制品烟碱口腔释放的研究方法，包括如下步骤：

步骤（1），口用型无烟气烟草制品的筛选：对待研究的某种口用型无烟气烟草制品选取100颗进行重量检测，计算该制品单颗重量平均值和方差；之后，选择重量范围在平均值±2倍方差范围内的制品作为试样进行后续测定；

步骤（2），模拟溶出参数的确定：选择多位年龄为18-55周岁身体健康的自愿者在自然状态下吸食步骤（1）筛选出的试样，并在事先确定的时间点收集残留样品和各自愿者唾液，每个时间点使用一颗样品；

所述残留样品和自愿者唾液的收集时间点为实验开始后0.5、1、2、5、10、15、20min内任意一点；

步骤（3），体内实验烟碱口腔释放情况的测定：利用反相超高效液相色谱分别对待研究口用型无烟气烟草制品、残留样品和自愿者唾液进行测试，以确定各时间段自愿者吸食样品的烟碱溶出量；

步骤（4），体外试验模拟：采用全仿真模拟咀嚼机模拟吸食该待研究口用型无烟气烟草制品，并根据步骤（3）得到的自愿者吸食样品的烟碱溶出量和唾液量，设置全仿真模拟咀嚼机的压合力、唾液流速、唾液量和口腔温度参数；所采用的人工唾液为蛋白酶类人工唾液；

步骤（5），反相超高效液相色谱分析：利用反相超高效液相色谱分别对待研究口用型无烟气烟草制品、残留样品和全仿真模拟咀嚼机中的人工唾液进行测试，用此测试结果来表征待研究口用型无烟气烟草制品的烟碱口腔释放情况；

步骤（6），烟碱口腔释放规律研究：采用上述全仿真模拟咀嚼机及设定的参数对同种口用型无烟气烟草制品整个咀嚼过程中的不同时间点进行测试，绘制烟碱释放曲线，进行烟碱口腔释放规律研究。

所述制品或残留样品中的烟碱含量分析方法为：测试时取1颗制品或残留样品，去包装剪碎后放入容器中，加入20 mL磷酸盐缓冲液和2 mL 0.25 mol/mL盐酸水溶液，先超声50分钟，然后再在震荡器上振荡40 min，静置，过滤萃取液，最后使用0.45 μm的滤膜过滤，之后使用反相超高效液相色谱定量分析。

所述反相超高效液相色谱参数为：色谱柱：150mm×4.6mm×5μm的AgilentEclipse Plus C18色谱柱；流动相：甲醇和10 mmol/L、pH=6.80的磷酸盐缓冲溶液，体积为65:35；流速：0.6mL/min；进样量：5µL；柱温：35℃；检测器：UV；检测波长：259nm。

设置全仿真模拟咀嚼机的唾液量和唾液流速的具体参数如下：

测试0.5min烟碱口腔释放情况时，唾液加入量1ml，唾液流速2ml/min；

测试1min烟碱口腔释放情况时，唾液加入量1.4ml，唾液流速1.4ml/min；

测试2min烟碱口腔释放情况时，唾液加入量2ml，唾液流速1ml/min；

测试5min烟碱口腔释放情况时，唾液加入量5ml，唾液流速1ml/min；

测试10min烟碱口腔释放情况时，唾液加入量11ml，唾液流速1.1ml/min；

测试15min烟碱口腔释放情况时，唾液加入量14ml，唾液流速0.93ml/min；

测试20min烟碱口腔释放情况时，唾液加入量18ml，唾液流速0.9ml/min。

对比试验1

考察超声时间，超声时间分别为5min、100min，其余都与实施例4相同相同。结果与实施例4相比，显示出超声时间为5min时，色谱上烟碱峰很小，应该是萃取不充分；当超声时间为100min时，检测结果与实施例4无明显差异。

对比试验2

考察超声时间，振荡时间分别为5min、100min，其余都与实施例4相同相同。结果与实施例4相比，显示出振荡时间为5min时，色谱上烟碱峰很小，应该是萃取不充分；当振荡时间为100min时，检测结果与实施例4无明显差异。

对比试验3

考察萃取方式，萃取方式选择浸提、超声、振荡、超声+振荡，其余都与实施例4相同相同。结果与实施例4相比，显示出浸提、超声、振荡，色谱上烟碱峰均很小，应该是萃取不充分；超声+振荡萃取方式最优。

对比试验4

考察萃取溶剂，与现有技术中加入20 mL 乙醇与5 % NaOH 溶液的混合溶液（9:1）相比，本发明萃取效果远远优于现有技术中的效果。

对比试验4

考察流动相，与体积比为23：77的甲醇和20 mmol的磷酸盐缓冲溶液的混合液（流动相中添加三乙胺，质量含量为0.2%，磷酸盐缓冲液的pH=6.0）相比，体积为65:35甲醇和10mmol/L、pH=6.80的磷酸盐缓冲溶液的混合液的分离效果更好，在不添加三乙胺的前提下，不产生拖尾情况，峰形优异。

应用实例1

选取市售口含烟——袋装口含烟(ETTAN，购于瑞典)，按照步骤（1）的方法筛选试样，以0~0.5、0~1、0~2、0~5、0~10、0~15 和0~20min为实验点进行自愿者实验，以确定模拟溶出基准参数，利用全仿真模拟咀嚼机，以咀嚼机械齿为人体牙齿，以模拟口腔为唇，确定该装置的压合力、唾液流速、唾液量和口腔温度参数，模拟人体消费行为。具体参数如表1所示。

表1.模拟溶出参数

烟碱的标准品和样品的色谱图如图1所示。袋装口含烟的烟碱体内和体外溶出趋势图如图2。由图2可以看出，烟碱的体内体外溶出曲线趋势基本一致，说明该方法能很好地模仿袋装口含烟中烟碱的体内溶出规律。

之后分别取四种典型口含烟（产品1袋装口含烟(购于瑞典)；产品2散装口含烟(购于美国)；产品3内装烟碱复合盐型袋装口含烟(购于瑞典)；产品4自制袋装口含烟，产品信息如表2所示。

表2.样品信息

所有试剂和仪器如下：

试剂：烟碱(>98%，加拿大TRC试剂公司)；甲醇(色谱纯，默克股份有限公司)；氯化镁(AR，上海麦克林生化科技有限公司)；磷酸氢二钠(AR，天津市风船化学试剂科技有限公司)；碳酸氢钾(AR，国药集团化学试剂有限公司)；磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钙、一水合柠檬酸(AR，西陇化工股份有限公司)。

仪器：Waters 超高效色谱仪 (美国：Waters公司)；PHS-3C型pH计(上海精密科学仪器有限公司)；Milli-Q50超纯水仪(美国Millipore公司)；XP504 型电子天平(感量0.0001 g，瑞士Mettler Toledo公司)；13mm×0.45 μm水相针式滤器(上海安谱科学仪器有限公司)；HY-8调速振荡器(常州国华电器有限公司)；KQ-700DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）

烟碱含量的测定：

烟碱溶出液在酸性条件下存在比较稳定。测试时取1颗样品，准确称重，用剪刀剪开后放入锥形瓶，加入20 mL磷酸盐缓冲溶液和2ml盐酸水溶液（0.25mol/ml），先超声40分钟然后再震荡器上振荡30~60 min。取下锥形瓶，静置，过滤萃取液，最后使用0.45 μm的滤膜过滤，使用反相高效液相色谱(RP-HPLC)定量分析。色谱条件如下：

色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18色谱柱 (150 mm×4.6 mm i.d., 5 µm)；流动相：甲醇和磷酸盐缓冲溶液(10 mmol/L，pH=6.80)，其体积比例为65:35；流速：0.6 mL/min；进样量：5µL；柱温：35 ℃；检测器：UV；检测波长：259 nm。

选用表3的人工唾液配方进行配置以用于全仿真模拟咀嚼机的使用。

表3人工唾液配方（无机盐类人工唾液）

将表2样品按表1所确定的模拟溶出参数进行实验，各时间点残留样品烟碱含量测试方法为：取各时间点实验完成时残留样品，用剪刀剪开后放入锥形瓶，加入20 mL磷酸盐缓冲液和2 mL盐酸水溶液（0.25 mol/mL），先超声40分钟然后再在震荡器上振荡30~60min。取下锥形瓶，静置，过滤萃取液，最后使用0.45 μm的滤膜过滤，使用反相超高效液相色谱(RP-HPLC)定量分析。

烟碱溶出量=总烟碱含量-残留样品烟碱含量。

结果如图3所示：4种典型含烟的烟碱溶出呈现先快后慢的趋势，产品1和产品4烟碱溶出显著低于另外两款产品。在20min时所有产品烟碱溶出量都能达到60%，产品3烟碱溶出量最高为80%。对比产品1和产品2可知，在整个实验阶段产品1的烟碱溶出量都显著低于产品2，在20min时产品2的烟碱溶出率达到70%。造成这一现象的主要原因可能是产品2无无纺布包裹在进行实验时能立即与人工唾液接触，从而使样品中烟碱能快速释放，不存在无纺布的阻挡。而产品1在进行实验时人工唾液首先要透过无纺布才能与其中的烟草样品接触，延缓了其烟碱释放。对比产品1和产品2斜率发现，前者最快释放速率在5~10min阶段，后者的在1~5min阶段，这一现象的主要原因也是是否存在无纺布造成的。对比产品1和产品2可知无纺布能阻碍烟草制品中烟碱的释放。对比产品2和产品3可知，在0.5~5min阶段后者的烟碱溶出率显著低于前者。这一情况的主要原因可能是无纺布的阻碍效果，5min后情况相反。而就整体而后者的烟碱溶出率大于前者，这一情况的主要原因可能是与两者烟碱从产品到唾液中的方式不同，前者类似于萃取，唾液从烟草中萃取出烟碱，后者类似于溶解，产品直接溶解在唾液中。

同时，为了验证本发明方法的准确性，对上述四种产品采用体内试验（人群实验），结果发现与本发明的烟碱的体外溶出规律一致。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (5)

1.一种口用型无烟气烟草制品烟碱口腔释放的研究方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤（1），口用型无烟气烟草制品的筛选：对待研究的某种口用型无烟气烟草制品选取多颗进行重量检测，计算该制品单颗重量平均值和方差；之后，选择重量范围在平均值±（1-3）倍方差范围内的制品作为试样进行后续测定；

步骤（2），模拟溶出参数的确定：选择多位身体健康的自愿者在自然状态下吸食步骤（1）筛选出的试样，并在事先确定的时间点收集残留样品和各自愿者唾液，每个时间点使用一颗样品；

步骤（3），体内实验烟碱口腔释放情况的测定：利用反相超高效液相色谱分别对待研究口用型无烟气烟草制品、残留样品和自愿者唾液进行测试，以确定各时间段自愿者吸食样品的烟碱溶出量；

步骤（4），体外试验模拟：采用全仿真模拟咀嚼机模拟吸食该待研究口用型无烟气烟草制品，并根据步骤（3）得到的自愿者吸食样品的烟碱溶出量和唾液量，设置全仿真模拟咀嚼机的压合力、唾液流速、唾液量和口腔温度参数；

步骤（5），反相超高效液相色谱分析：利用反相超高效液相色谱分别对待研究口用型无烟气烟草制品、残留样品和全仿真模拟咀嚼机中的人工唾液进行测试，用此测试结果来表征待研究口用型无烟气烟草制品的烟碱口腔释放情况；

步骤（6），烟碱口腔释放规律研究：采用上述全仿真模拟咀嚼机及设定的参数对同种口用型无烟气烟草制品整个咀嚼过程中的不同时间点进行测试，绘制烟碱释放曲线，进行烟碱口腔释放规律研究；

设置全仿真模拟咀嚼机的唾液量和唾液流速的具体参数如下：

测试0.5min烟碱口腔释放情况时，唾液加入量1ml，唾液流速2ml/min；

测试1min烟碱口腔释放情况时，唾液加入量1.4ml，唾液流速1.4ml/min；

测试2min烟碱口腔释放情况时，唾液加入量2ml，唾液流速1ml/min；

测试5min烟碱口腔释放情况时，唾液加入量5ml，唾液流速1ml/min；

测试10min烟碱口腔释放情况时，唾液加入量11ml，唾液流速1.1ml/min；

测试15min烟碱口腔释放情况时，唾液加入量14ml，唾液流速0.93ml/min；

测试20min烟碱口腔释放情况时，唾液加入量18ml，唾液流速0.9ml/min；

所述反相超高效液相色谱参数为：色谱柱：150mm×4.6mm×5μm的Agilent EclipsePlus C18色谱柱；流动相：甲醇和10 mmol/L、pH=6.80的磷酸盐缓冲溶液，体积为65:35；流速：0.6mL/min；进样量：5µL；柱温：35℃；检测器：UV；检测波长：259nm；

步骤（1）中，选择至少50颗待研究的某种口用型无烟气烟草制品进行重量检测。

2.根据权利要求1所述的口用型无烟气烟草制品烟碱口腔释放的研究方法，其特征在于，步骤（2）中，所述自愿者为年龄为18-55周岁。

3.根据权利要求1所述的口用型无烟气烟草制品烟碱口腔释放的研究方法，其特征在于，步骤（2）中，所述残留样品和自愿者唾液的收集时间点为实验开始后0-60min内任意一点。

4.根据权利要求1所述的口用型无烟气烟草制品烟碱口腔释放的研究方法，其特征在于，体外试验模拟时，所采用的人工唾液为无机盐类人工唾液或蛋白酶类人工唾液。

5.根据权利要求1所述的口用型无烟气烟草制品烟碱口腔释放的研究方法，其特征在于，所述制品或残留样品中的烟碱含量分析方法为：测试时取1颗制品或残留样品，去包装剪碎后放入容器中，加入20 mL磷酸盐缓冲液和2 mL 0.25 mol/mL盐酸水溶液，先超声20~60分钟，然后再在震荡器上振荡30~60 min，静置，过滤萃取液，最后使用0.45 μm的滤膜过滤，之后使用反相超高效液相色谱定量分析。

Images