CN109266611A - 一种ht-29细胞炎症模型的建立方法及应用 - Google Patents

一种ht-29细胞炎症模型的建立方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109266611A
CN109266611A CN201811064975.5A CN201811064975A CN109266611A CN 109266611 A CN109266611 A CN 109266611A CN 201811064975 A CN201811064975 A CN 201811064975A CN 109266611 A CN109266611 A CN 109266611A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
building
cellular inflammation
inflammation model
added
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811064975.5A
Other languages
English (en)
Inventor
杜艳
郭翀
晋臻
何增品
段勇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
First Affiliated Hospital of Kunming Medical University
Original Assignee
First Affiliated Hospital of Kunming Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by First Affiliated Hospital of Kunming Medical University filed Critical First Affiliated Hospital of Kunming Medical University
Priority to CN201811064975.5A priority Critical patent/CN109266611A/zh
Publication of CN109266611A publication Critical patent/CN109266611A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5038—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects involving detection of metabolites per se
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/24—Interferons [IFN]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/90—Polysaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种HT‑29细胞炎症模型的建立方法及应用。本发明包括两个步骤，细胞处理和结果检测；所述细胞处理步骤为：将HT‑29细胞接种于24孔板，过夜培养，待细胞贴壁生长后，更换培养基，并加入人源TNF‑α，终浓度为20mg/ml，共培养12小时后，在培养基中加入LPS，终度为1μg/ml，培养15小时；所述结果检测包括对处理后的HT‑29细胞的TLR4、NF‑κB、TNF‑α和IL‑1β的mRNA和蛋白质的表达量检测。本发明建立了HT‑29细胞炎症模型，提供了对溃疡性结肠炎有治疗或症状缓解的药物细胞水平的筛选方法，为对动物溃疡性结肠炎模型有治疗效果的药物的治疗机制研究提供方法步骤。

Description

一种HT-29细胞炎症模型的建立方法及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种HT-29细胞炎症模型的建立方法及应用。
背景技术
溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)，是一种慢性非特异性结肠炎症，属于炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)的一种，主要表现为腹痛、腹泻、便血等。病变多自结肠远段向近段发展，严重者可累及全结肠和回肠末段。溃疡性结肠炎目前尚无法完全治愈，结肠炎症的反复发作严重影响了患者的生活质量，它可以进一步发展成结肠癌。UC的病因及发病机制不清楚，它涉及至少三个相互作用的元素：包括遗传易感性、免疫调节异常和肠道微生物改变等。此外,环境、饮食、心理健康等因素也是重要诱因。随着UC发病率的升高，寻找治疗或者缓解UC的药物成为研究热点，以筛选有效药物和研究药物作用机制为目的的细胞炎症模型急需建立。
消化道上皮细胞，是抵御致病菌、有毒化学物质、过敏原等外来有害物质侵袭的第一道防线，肠粘膜屏障功能受损可加速炎症性肠病的进展。当肠道受到外界刺激时，肠道黏膜会发生炎症反应，这是一种正常的防御性反应，对维持肠黏膜的屏障功能至关重要。炎症发生时，细胞分泌大量炎症相关因子，如内毒素(LPS)的主要受体TLR4、调控参与免疫反应的早期和炎症反应各阶段的许多分子的NF-κB、促进炎症反应的TNF-α(肿瘤坏死因子)和致炎因子IL-1β(白介素1β)等。UC患者免疫调节功能紊乱，导致肠道炎症持续而难以自愈。
在研究溃疡性结肠炎的发病机制中，建立炎症细胞模型是必不可少的。因分离培养原代肠黏膜上皮细胞比较困难，目前主要使用结肠癌细胞株进行研究。根据肠上皮细胞株对LPS的应答能力以及TLR的表达情况，可将结肠癌细胞株分为以下三大类：一类是TLR4蛋白表达水平较低且对LPS反应性低，经IFN-γ刺激后仍然对LPS的反应较低，此类细胞包括HCT-116、Caco-2；第二类是在未受刺激时便表达TLR4蛋白且对LPS呈高反应状态，与单核细胞相似，SW480细胞即属于此类；第三类细胞TLR4蛋白表达水平较低且对LPS呈低反应状态，但是经过IFN-γ刺激后，TLR4表达上调，且对LPS的反应性增强，此类细胞包括HT-29和Colo-205。有研究发现，经过TNF-α刺激后，HT-29细胞TLR4蛋白的表达上调，同时可增强HT-29细胞对LPS的反应性。目前，对结肠炎研究时多采用与正常原代肠黏膜上皮细胞的炎症反应相似的HT-29结肠癌细胞株进行体外细胞水平的研究。
研究表明，UC患者普遍存在着肠道黏膜菌群失调，因此调控肠道菌群以减少病变肠壁的炎症反应是未来的治疗方向。益生菌即是符合这样要求的一种制剂，目前临床上研究比较多的益生菌剂是VSL#3，它是一种冻干细菌合剂，包括4株乳酸杆菌、3株双歧杆菌、1株链球菌唾液嗜热亚种。已有大量的动物模型实验表明益生菌剂VSL#3可以缓解DSS(葡聚糖硫酸钠)诱导的大鼠溃疡性结肠炎，但具体的作用机制还有待研究。仅通过动物实验进行机制的研究不仅耗费时间长而且使用动物数量多，运用细胞模型进行研究更为方便，省时。
目前模拟溃疡性结肠炎的动物模型已建立许多，如DSS诱导的溃疡性结肠炎大鼠模型，但是用于体外研究的肠道黏膜细胞炎症模型并未建立，体外细胞模型可用于药物筛选和机制研究。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种HT-29细胞炎症模型的建立方法及应用，该模型先利用TNF-α刺激HT-29细胞，再用LPS处理细胞，从而模拟细胞受到细菌感染后发生的炎症反应。该模型对原发性炎症反应还原性高，应用于对溃疡性结肠炎有治疗或症状缓解的药物筛选实验及机制研究。
一种HT-29细胞炎症模型的建立方法，包括细胞处理和结果检测；
所述细胞处理为：将HT-29细胞接种于24孔板，过夜培养，待细胞贴壁生长后，更换培养基，并加入人源TNF-α，终浓度为20mg/ml，共培养12小时后，在培养基中加入LPS，终度为1μg/ml，培养15小时；
所述结果检测是对处理后的HT-29细胞的TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-1β的mRNA和蛋白质的表达量检测。
进一步，所述细胞处理过程中所用的HT-29细胞的培养基配制方法为：无菌配制，DMEM高糖培养基中加入10％FBS(胎牛血清)。
进一步，所述结果检测中对mRNA表达量的检测方法为实时定量荧光PCR；对蛋白质表达量的检测方法为蛋白质印迹法。
本发明同时提供了HT-29细胞炎症模型的建立方法在研究治疗溃疡性结肠炎药物作用机制上的应用。
进一步，所述HT-29细胞炎症模型的建立方法用于研究益生菌剂VSL#3缓解溃疡性结肠炎症状的作用机制。
进一步，所述益生菌剂VSL#3可以降低炎症状态下HT-29细胞的TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-1β的表达量。
本发明同时提供了HT-29细胞炎症模型的建立方法在筛选治疗溃疡性结肠炎药物的应用。
有益效果：在生物制药研究过程中，虽然将某种药物应用于相应疾病的动物模型时其具有良好的治疗效果，但是其中的药理病理作用机制仍然要通过体外一系列实验研究清楚明了。随着生物技术的发展，细胞实验在药物作用机制研究上有越来越重要的作用，通过给予细胞一定的刺激或是特定的培养条件模拟病理状态下的机体细胞是现今较常用的生物研究手段。对于溃疡性结肠炎，其在体动物模型已建立许多，通过动物疾病模型筛选出许多具有治疗效果的前景药物，但是很多前景药物作用机制不明确，并不能实际应用，利用HT-29细胞炎症模型可在细胞水平上探究药物作用机制。益生菌剂VSL#3在动物模型上已被证实可以缓解溃疡性结肠炎的症状，本发明证明了益生菌剂VSL#3可降低炎症状态的HT-29细胞的TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-1β等炎症相关因子的表达，其缓解UC症状的作用机制与其可以降低炎症相关因子的表达相关。
由于动物模型具有耗时长、结果检测繁琐等缺点，许多研究人员在筛选有效药物时会先进行体外细胞实验，即选用功能形态相近的相应癌细胞株进行实验，模拟病理状态下细胞环境，检测前景药物作用效果，当药物在细胞模型中有所需效果时，再进行相应的动物实验，这样不仅节约动物资源，也更为清楚的解释前景药物在体内的作用效果。开发溃疡性结肠炎的治疗药物是当前研究的热点，但是动物模型前的细胞筛选模型并未建立。本发明建立一种HT-29细胞的炎症模型，填补了此方面的空白，具有良好的应用前景。
附图说明
图1是HT-29细胞放大200倍的显微镜观察图；
图2是western-blot显色图(1-5分别表示TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β和β-actin的显色结果；a、b、c分别表示正常组、模型组和益生菌组，每组三个重复)。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：
一种HT-29细胞炎症模型的建立方法
1.细胞培养
HT-29细胞培养基：DMEM高糖培养基加入10％FBS；培养条件：二氧化碳浓度为5％、温度为37℃。
2.细胞处理
将HT-29细胞接种于24孔板，过夜培养，待细胞贴壁生长后，更换培养基，并加入人源TNF-α(20mg/ml)，共培养12小时后，在培养基中加入LPS(1μg/ml)，培养15小时。
3.结果检测
3.1实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测HT-29细胞的TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-1βmRNA的表达量
3.1.1细胞总RNA的提取
(1)用胰蛋白酶消化细胞后，将细胞悬液一起转移到无核酸酶的离心管中，500g，4℃离心5分钟，弃去上清液，收集沉淀细胞；
(2)向细胞中加入RNA裂解液，用移液枪打散沉淀，混匀，并将裂解物转移至1.5ml无核酸酶离心管中；
(3)将300μl RNA稀释液加入到300μl裂解物中，充分混匀，为提高RNA得率，可将混合物置70℃水浴孵育3分钟；
(4)14000g离心5分钟，吸取上清液到新的1.5ml无核酸酶离心管中，加入无水乙醇(0.5倍上清体积)，用移液枪反复吹打3-4次以充分混匀；
(5)取出离心柱/收集管，将混合液转移到离心柱内，14000g离心1分钟。弃滤液，将离心柱重新放回到收集管中；
(6)将600μlRNA洗液(已加入乙醇)加入到离心柱中央，14000g离心45秒，弃滤液；
(7)向离心柱中央加入50μl新鲜配制的DNA酶I孵育液，室温静置15分钟；
(8)向离心柱中加入600μlRNA洗液，14000g离心45秒，弃滤液；
(9)重复步骤(8)，然后将离心柱重新安置于收集管上，14000g离心2分钟；
(10)将离心柱转移至洗脱管上，在离心柱膜中央加入60μl无核酸酶水，室温静置2分钟，14000g离心1分钟，将RNA溶液保存在-70℃。
3.1.2单链cDNA的合成
按照逆转录试剂盒说明书合成cDNA单链。
3.1.3qRT-PCR反应
引物设计序列如表1所示：
表1 qRT-PCR引物序列及长度
设计96孔板上样顺序，每个样品做三个重复孔，用水为模板作阴性对照(NTC)；实验在Real Time PCR扩增仪上进行，将试剂颠倒混匀，然后使用离心机轻微离心收集后使用，Real-time反应体系如表2所示：
表2 qRT-PCR反应体系
PCR扩增程序：95℃预变性10min；95℃变性15s；60℃退火60s；72℃延伸30s；共40个循环60℃终末延伸60s。反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量分析。
3.2蛋白免疫印迹法(Western-blot)检测HT-29细胞TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-1β的蛋白表达量
3.2.1细胞蛋白的提取
(1)RIPA裂解液充分融解、混匀，使用前数分钟于裂解液加入PMSF，PMSF终浓度为1mM；
(2)对于贴壁细胞：弃去培养液后使用PBS清洗，按照6孔板每孔加入150ul裂解液的比例加入裂解液。用移液器枪吹打使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞1-2秒后，细胞就会被裂解；
(3)充分裂解后，14000g离心5分钟，取上清，分装(每管50ul)。取其中一管加入5×SDS蛋白上样缓冲液，放于沸水中煮10min后做好标记放于-80℃保存。
3.2.2BCA法测定样品中蛋白含量
(1)取1.2ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(30mg BSA)中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液；
(2)将25mg/ml蛋白标准稀释至0.5mg/ml，0.5mg/ml的蛋白标准品置于-20℃保存备用；
(3)配制BCA工作液：根据蛋白标准品和样品数量，按照BCA试剂A：BCA试剂B＝50:1的比例配制适量BCA工作液，充分混匀。室温下稳定24小时；
(4)将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μl；
(5)分别将样品稀释10倍、20倍的比例加入到96孔板中，补足稀释液到20μl；
(6)向各个孔中分别加入200μBCA工作液，移液枪吹打混匀；
(7)37℃温浴30min，冷却至室温，使用酶标仪在562nm波长处测定各孔的吸光度；
(8)制作标准曲线，从标准曲线中求出蛋白浓度。
3.2.3SDS-PAGE电泳
(1)配制8％蛋白电泳胶；
(2)加样：计算好蛋白的上样体积，将5×蛋白上样缓冲液稀释为1×，蛋白与缓冲液充分混匀后于100℃沸水中加热10min；
(3)电泳：浓缩胶部分用100V电压使样品浓缩成一条窄带，到分离胶选择120V，直至溴酚蓝到达底部停止电泳。
3.2.4转膜
(1)取下胶板，置于转膜液中，轻柔的将分离胶与玻板分离。切除浓缩胶部分，根据蛋白分子量大小，参照Marker切下所需部分；
(2)准备两张滤纸和一张PVDF膜，大小与切下的胶块大小一致；
(3)将PVDF膜、滤纸、海绵垫提前浸泡在转膜缓冲液中备用；
(4)制作三明治结构：根据膜(PVDF膜)正胶负的原则用海绵、滤纸、胶及膜在转印架黑色板块做三明治结构，注意赶干净气泡；
(5)将转膜夹放入转膜槽中，加满转膜缓冲液，将转膜槽置于冰浴中，100V恒压电转移约60min(Bio-rad湿转)。取出转膜夹，PVDF膜浸泡于丽春红染液后去除冲洗，观察蛋白是否转移到PVDF膜上；
(6)将PVDF膜放入TBST中清洗2次，每次5min。
3.2.5抗体孵育
(1)封闭：5％脱脂牛奶封闭，室温下，摇床2.5小时；
(2)一抗孵育：按分子量大小切开膜，使用5％脱脂牛奶稀释一抗，按1:3000稀释兔抗鼠NF-κB p65抗体，按1:1000稀释兔抗鼠TLR4抗体，1:3000稀释兔抗鼠β-actin抗体。膜与抗体于4℃冰箱孵育过夜；
(3)第二天早上将膜从冰箱取出，摇床半小时；
(4)洗涤：用TBST缓冲液漂洗3次，每次10min；
(5)二抗孵育：使用5％脱脂奶粉，按照1：5000的比稀释二抗(标记了辣根过氧化物酶的山羊抗兔IgG)；
(6)洗涤：使用TBST缓冲液漂洗3次，每次10min。
3.2.6显色
(1)ECL发光底物A、B等量混合；
(2)将薄膜手套铺于暗盒内，使用滤纸轻轻吸去PVDF膜上多余的缓冲液，然后将膜平铺于薄膜手套上，正面朝上；
(3)将混合的ECL发光底物加到膜上，将膜完全覆盖；
(4)用薄膜手套盖住膜，注意不要产生气泡；
(5)在暗室内曝光1-3min甚至更长时间；
(6)打开ImageLab软件进行曝光照相并保存。
3.3数据分析
使用IBM spss 24统计学软件包进行数据分析，实验数据采用均值±标准差(Mean±SD)表示。组间差异比较用方差t检验，p<0.05，即认为差异有统计学意义。
本发明通过TNF-α刺激HT-29细胞表达TLR4，因为TLR4是LPS的配体，加入LPS后引发下游信号通路从而模拟炎症反应。本实施例建立HT-29细胞炎症模型的同时提供了检测方法，通过qRT-PCR和western-blot检测模型构建后的细胞信号通路相关蛋白，验证模型是否成功并为药物加入后的作用检测提供参考方法。
实施例二：
益生菌剂VSL#3对HT-29细胞炎症模型作用
1.实施步骤
细胞铺板于T-25瓶中，待细胞贴壁后按照如下分组进行处理：
A组：空白对照组：90％DMEM高糖培养基+10％FBS培养24小时；
B组：模型对照组：给予Human TNF-α(20mg/ml)孵育12h后，再给予LPS(1ug/ml)孵育15小时；
C组：VSL#3治疗组：与模型组相同处理后，加入益生菌剂VSL#3(1×105cfu/ml)共同孵育7天。
2.检测结果
按照实施例一检测步骤进行,分别提取HT-29细胞的mRNA和蛋白质，检测并比较细胞的TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-1β的表达量。结果如下所示：
表3 mRNA相对差异表达倍数
注：p值是益生菌VSL#3组与造模组的比较。
表3表示的是各组TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-1β的mRNA的相对于对照的差异表达倍数，对照为GAPDH，数值越高mRNA含量越高。模型组TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β四种基因的mRNA的表达水平均高于正常组(P＜0.05)，说明炎性细胞模型造模成功。炎性细胞模型经过益生菌VSL#3(1×105cfu/ml)处理7天后，与模型组相比，四种基因的mRNA的表达水平均出现了不同程度的下调，且差异具有统计学意义(p＜0.05)。
表4 Western-blot灰度统计结果
利用Western-blot检测各组细胞中TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β蛋白的表达水平，附图2是Western-blot后的显色结果图，其中1-5分别表示TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β和β-actin的显色结果，a、b、c分别表示正常组、模型组和益生菌组，每组三个重复。表4表示的是附图2经过软件处理得到相对灰度，数值越高检测到的蛋白含量越高，如表4所示，益生菌组相对于模型组各检测的蛋白表达量下调，但差异不具有统计学意义(p＞0.05)。
现有的许多研究表明，益生菌剂VSL#3对结肠炎有良好的缓解症状的效果，对于小鼠的DSS诱导的溃疡性结肠炎模型有治疗效果。将HT-29细胞炎症模型应用于益生菌剂VSL#3对感染后的肠道的免疫调节功能的研究发现，该益生菌剂能在炎症发生的情况下降低HT-29细胞的TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-1β等促炎因子的表达，从而起到缓解炎症的作用。利用该HT-29细胞炎症模型，从细胞水平解释并验证益生菌剂VSL#3具有缓解结肠炎症状，调节肠道免疫的功能。按照此应用模式，该模型可以用于评估其他具有肠道免疫调节、抑制肠道炎症反应的潜力药物。

Claims (7)

1.一种HT-29细胞炎症模型的建立方法，其特征为：包括细胞处理和结果检测；
所述细胞处理步骤为：将HT-29细胞接种于24孔板，过夜培养，待细胞贴壁生长后，更换培养基，并加入人源TNF-α，终浓度为20mg/ml，共培养12小时后，在培养基中加入LPS，终度为1μg/ml，培养15小时；
所述结果检测为对处理后的HT-29细胞的TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-1β的mRNA和蛋白质的表达量检测。
2.根据权利要求1所述的一种HT-29细胞炎症模型的建立方法，其特征为：所述细胞处理过程中所用的HT-29细胞的培养基配制方法为：无菌配制，DMEM高糖培养基中加入10％FBS。
3.根据权利要求1所述的一种HT-29细胞炎症模型的建立方法，其特征为：所述结果检测中对mRNA表达量的检测方法为实时定量荧光PCR；所述结果检测中对蛋白质表达量的检测方法为蛋白质印迹法。
4.根据权利要求1-3任一所述的一种HT-29细胞炎症模型的建立方法在研究治疗溃疡性结肠炎药物作用机制上的应用。
5.根据权利要求4所述HT-29细胞炎症模型的建立方法在研究治疗溃疡性结肠炎药物作用机制上的应用，包括益生菌剂VSL#3缓解溃疡性结肠炎症状的作用机制。
6.根据权利要求5所述益生菌剂VSL#3，其特征为：在HT-29细胞炎症模型中，降低炎症状态下HT-29细胞的TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-1β的表达量。
7.根据权利要求1-3任一所述的一种HT-29细胞炎症模型的建立方法在筛选治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。
CN201811064975.5A 2018-09-13 2018-09-13 一种ht-29细胞炎症模型的建立方法及应用 Pending CN109266611A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811064975.5A CN109266611A (zh) 2018-09-13 2018-09-13 一种ht-29细胞炎症模型的建立方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811064975.5A CN109266611A (zh) 2018-09-13 2018-09-13 一种ht-29细胞炎症模型的建立方法及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109266611A true CN109266611A (zh) 2019-01-25

Family

ID=65188131

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811064975.5A Pending CN109266611A (zh) 2018-09-13 2018-09-13 一种ht-29细胞炎症模型的建立方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109266611A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114410570A (zh) * 2022-01-25 2022-04-29 广东海洋大学 TNF-α与LPS联用在构建肠道氧化应激细胞模型中的应用
CN115820538A (zh) * 2022-12-05 2023-03-21 甘肃农业大学 一种肠炎细胞模型的建立方法及应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1938038A (zh) * 2004-02-06 2007-03-28 芝加哥大学 来自益生菌生物体的细胞保护性抗炎因子
CN104046592A (zh) * 2014-05-16 2014-09-17 浙江大学 C-bf保护小鼠及人结肠癌上皮细胞系溃疡性结肠炎综合模型
CN104726393A (zh) * 2013-12-24 2015-06-24 江苏省农业科学院 TNF-α诱导的人脐静脉内皮细胞HUVEC炎症反应模型的制备方法
CN108486056A (zh) * 2018-04-27 2018-09-04 吉林大学 一种lps诱导raw264.7细胞炎症模型的建立方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1938038A (zh) * 2004-02-06 2007-03-28 芝加哥大学 来自益生菌生物体的细胞保护性抗炎因子
CN104726393A (zh) * 2013-12-24 2015-06-24 江苏省农业科学院 TNF-α诱导的人脐静脉内皮细胞HUVEC炎症反应模型的制备方法
CN104046592A (zh) * 2014-05-16 2014-09-17 浙江大学 C-bf保护小鼠及人结肠癌上皮细胞系溃疡性结肠炎综合模型
CN108486056A (zh) * 2018-04-27 2018-09-04 吉林大学 一种lps诱导raw264.7细胞炎症模型的建立方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARIA T. ABREU ET AL.: "Decreased Expression of Toll-Like Receptor-4 and MD-2 Correlates with Intestinal Epithelial Cell Protection Against Dysregulated Proinflammatory Gene Expression in Response to Bacterial Lipopolysaccharide", 《THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY》 *
赵青春 等: "清肠化湿方对HT-29细胞IL-6/JAK2/STAT3的影响", 《中国药理学通报》 *
陈曦: "Toll样受体4与β防御素2在结肠炎上皮表达及调控的研究", 《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114410570A (zh) * 2022-01-25 2022-04-29 广东海洋大学 TNF-α与LPS联用在构建肠道氧化应激细胞模型中的应用
CN115820538A (zh) * 2022-12-05 2023-03-21 甘肃农业大学 一种肠炎细胞模型的建立方法及应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Dupont et al. Can dynamic in vitro digestion systems mimic the physiological reality?
Blottière et al. Human intestinal metagenomics: state of the art and future
CN106546737A (zh) 一种体外检测活动性结核的方法
CN105296620A (zh) 肠道宏基因组特征作为2型糖尿病阿卡波糖疗效筛选标志
CN109266611A (zh) 一种ht-29细胞炎症模型的建立方法及应用
CN108179134A (zh) 基于EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片及其制备方法和应用
Wang et al. Advances in reconstructing intestinal functionalities in vitro: from two/three dimensional-cell culture platforms to human intestine-on-a-chip
CN112176021A (zh) 一种体外构建的精准预测癌症患者用药的方法
CN110488025A (zh) 一种化学发光定量检测粪便钙卫蛋白及其检测方法和其在肠道健康检测的用途
SEAMAN Some aspects of phagotrophy in Tetrahymena
CN108823169A (zh) 一种从哺乳动物癌组织制备的类癌组织、方法及用途
CN109182569A (zh) 高毒力株幽门螺杆菌的环介导等温扩增检测方法和试剂盒
CN109749999A (zh) 肿瘤体外培养方法及临床化疗药物筛选方法
CN111096962A (zh) 脂肪酸氧化抑制剂在制备治疗结直肠癌药物中的应用
Xin et al. Guidelines for in vitro simulated digestion and absorption of food
RU2469324C1 (ru) Способ оценки состояния слизистой оболочки желудка у детей
CN109730028A (zh) 一种利用小鼠建立非酒精性脂肪性肝病模型的方法
CN109370986A (zh) 一种犬脂肪干细胞的提取方法及其制剂和应用
He et al. Influence of colonic dialysis using Chinese medicine on creatinine decomposition by intestinal bacteria in uremia rats
US20210115406A1 (en) Host-biome interactions
CN102090373A (zh) 模拟人克隆氏病的小鼠结肠炎模型及其制备方法和用途
CN110141566A (zh) Sglt2抑制剂在调控炎症中的应用
CN112553316A (zh) 纤毛相关疾病的诊断标志物
Butler Non-invasive tests in animal models and humans: a new paradigm for assessing efficacy of biologics including prebiotics and probiotics
CN105785008A (zh) 一种食物不耐受检测试剂盒及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190125