CN1938038A - 来自益生菌生物体的细胞保护性抗炎因子 - Google Patents

Abstract

本发明提供了来自益生菌生物体的细胞保护性抗炎因子。具体地，本发明提供了分离的细胞保护性抗炎化合物，该化合物可溶于水性流体，来自诸如VSL#3等益生菌培养物的条件培养基，诱导热激蛋白表达，并显示出抑制NF－κB激活的能力。所述化合物适合配制在药物组合物中和包装成试剂盒的形式，所述试剂盒附带用于本发明所述方法的说明书，所述方法包括预防、治疗或减缓具有炎症特征的诸如炎症性上皮疾病(例如炎性肠病)等炎性病症的症状。

Description

来自益生菌生物体的细胞保护性抗炎因子

根据国家卫生研究院的授权号DK47722、DK42086、T32 GM07019和K08 DK064840-01，政府拥有本发明中的权利。

技术领域

本发明主要涉及炎症领域。更具体地，本发明涉及炎性肠病，例如溃疡性结肠炎和克罗恩病。

背景技术

炎性肠病(IBD)是一类慢性疾病，例如溃疡性结肠炎和克罗恩病，该疾病引起消化道发炎或溃疡。遗传背景、与环境因素接触或某些激发性共生菌的集落化的不幸组合可以在易感个体中引起IBD的发展。

溃疡性结肠炎引起结肠和直肠的内层发炎和溃疡。除了与结肠的连接端(称为回肠末端)之外，溃疡性结肠炎很少累及小肠。溃疡性结肠炎还可以称为结肠炎或直肠炎。溃疡性结肠炎可以在任何年龄的人中发生，但是通常在15岁和30岁之间开始发生。溃疡性结肠炎同等影响男性和女性，而且似乎在一些家庭中流行。有很多关于什么引起了溃疡性结肠炎的理论，但是没有一种理论已经得到证明。一种流行的理论是身体的免疫系统通过在肠壁引起持续的炎症而应对病毒或细菌。

溃疡性结肠炎最常见的症状是腹痛和带血腹泻。患者也可能会疲乏、体重减轻、没有胃口、直肠出血、体液和营养损失。约半数患者会出现轻微的症状。其它患者则会出现经常性发烧、带血腹泻、恶心和剧烈腹部绞痛。溃疡性结肠炎还可能引起以下问题，例如关节炎、眼睛发炎、肝病(肝炎、肝硬变和原发性硬化性胆管炎)、骨质疏松症、皮疹和贫血。没有人确切知道为什么会在结肠外发生问题。科学家们认为，当免疫系统在身体的其它部分中引发炎症的时候，这些并发症就有可能发生。当治愈结肠炎后，部分问题就会消失。

炎性肠病中粘膜损伤的范围和严重性取决于两个对立过程(修复性和细胞保护性机制相对于炎症诱导的损伤)之间的失衡。

溃疡性结肠炎的治疗取决于该疾病的严重程度。大多数人采用药物治疗。在严重情况下，患者可能需要手术切除患病的结肠。在由某些食物引发症状的一些人中，可通过避免食用使他们的肠不适的食物来控制症状，所述食物例如调味重的食物、生水果和蔬菜或奶糖(乳糖)。有些人的症状消退持续长达数月或甚至数年。然而，对于大多数患者来说，其症状最终还会复发。

治疗的目的是诱导和维持症状消退，并改善溃疡性结肠炎患者的生活质量。目前可提供多种类型的药物。

氨基水杨酸盐类(aminosalicylate)药物，例如那些含有5-氨基水杨酸(5-ASA)的药物，有助于炎症的控制。柳氮磺吡啶是磺胺吡啶和5-ASA的组合，可用来诱导和维持症状消退。磺胺吡啶组分将抗炎性的5-ASA携带到肠。然而，磺胺吡啶可能会引起副作用，例如恶心、呕吐、胃灼热、腹泻和头痛。诸如奥沙拉秦、美沙拉秦和巴柳氮等其它5-ASA试剂具有不同的载体，副作用较小，可为不能服用柳氮磺吡啶的人使用。5-ASA可以经口服用、通过灌肠法或在栓剂中给用，这取决于结肠中发炎的位置。大多数轻度或中度溃疡性结肠炎患者首先采用这类药物来治疗。

诸如泼尼松和氢化可的松等皮质甾类也可以减少炎症。它们可为中度至严重的溃疡性结肠炎患者或者对5-ASA药物不起反应的人们使用。皮质甾类可通过口服、静脉内、灌肠法或在栓剂中给用。这些药物能引起副作用，例如体重增加、痤疮、面部毛发、高血压、情绪波动和感染危险性增加。由于这一原因，不推荐长期使用它们。

免疫调节剂，例如硫唑嘌呤和6-巯基嘌呤(6-MP)，可以通过影响免疫系统而减少炎症。它们用于对5-ASA或者皮质甾类不起反应的患者或者对皮质甾类依赖的患者。然而，免疫调节剂作用慢，而且可能需要达6个月才能完全见效。要监测服用这些药物的患者的并发症，包括胰腺炎和肝炎、白细胞计数减少和感染危险性增加。在对静脉内皮质甾类不起反应的人中，可以将环孢菌素A与6-MP或硫唑嘌呤一起使用以治疗活跃的严重溃疡性结肠炎。

除了以上所述以外，还可以提供其它药物来使患者放松，或者减轻疼痛、腹泻或感染。

大约25％～40％的溃疡性结肠炎患者由于结肠大出血、严重病患、破裂或患癌风险而必须最终切除他们的结肠。如果内科治疗失败或者如果皮质甾类或其它药物的副作用威胁到患者的健康，有时医生会建议切除结肠。

克罗恩病与溃疡性结肠炎不同之处在于，克罗恩病可以累及消化道的任何部分。它引起发炎和溃疡，这可能会侵害消化道的衬层的最深层。抗炎药物，例如5-氨基水杨酸盐类(例如，美沙拉秦)或皮质甾类通常开在处方中，但并非总是有效。用环孢菌素进行免疫抑制有时对抗皮质甾类或不耐受皮质甾类的患者是有利的。

然而，有90％的克罗恩病患者最终都需要手术治疗；50％被切除结肠(Leiper等，1998；Makowiec等，1998)。术后复发率高，50％在5年之内需要进一步手术(Leiper等，1998；Besnard等，1998)。

目前关于IBD发病原理的观念认为存在细胞保护和创伤愈合的过程以及促炎途径之间的失衡，其最终结果以促炎过度活化的状态并导致粘肠膜受到损伤而告终(Chang，1999；Podolsky，2002)。保护粘膜完整性的关键是保持上皮的屏障功能，这可以由以下事实得到证明：紧密连接结构的改变会造成屏障功能受损，据认为这是溃疡性结肠炎的临床后遗症的促成因素(Schmitz等，1999)。

正如由热激蛋白在氧化胁迫条件下保护上皮的屏障功能的能力所显示的那样，通过使用正义和反义转染实验已证明热激蛋白在为上皮细胞提供细胞保护中起关键作用(Ropeleski等，2003；Urayama等，1998)。诱导性热激蛋白(Hsp)属于高度保守的蛋白家族，该蛋白家族在保护细胞抗环境中的生理性和致病性的胁迫因子中起重要作用。在诸如热、接触重金属以及毒素、缺血/再灌注损伤或因发炎引起的氧化胁迫等胁迫条件下，Hsp诱导既快又强。由轻度“胁迫”诱导的热激蛋白为随后的创伤或者损伤提供保护，否则会导致细胞的死亡。这种充分描述的现象称为“胁迫耐受性”(Parsell和Lindquist，1993)。

在肠上皮细胞中，诱导性热激蛋白提供一定程度的细胞保护，以抵抗诸如来自炎症细胞的氧化剂等胁迫，并在不利的条件下保持肠上皮细胞屏障功能的完整性(Chang，1999；Musch等，1996；Musch等，1999)。

肠上皮细胞中热激蛋白的诱导延长了胁迫条件下的存活力(Musch等，1996)，并保持了经上皮阻力测定的紧密连接(Musch等，1999)。

促炎性NF-κB途径的激活被认为是涉及IBD的致病原理的关键分子事件(Neurath等，1998；Jobin和Sartor，2000；Schmid和Adler，2000；Boone等，2002)。在两种不同鼠科动物模型的结肠炎中，施用靶向NF-κB亚基p65的反义寡核苷酸比类固醇治疗更有效地减少炎症(Neurath等，1996)。

免疫组织化学研究已经表明，来自克罗恩病患者的结肠活检显示在炎症活动区域中的NF-κB亚基p65的表达水平升高(Neurath等，1998)。在非炎症状态中，NF-κB保持与抑制性蛋白IκB复合的非活性细胞溶质形式。一旦接受到活化NF-κB的信号，它的抑制子IκB就被磷酸化并导向通过泛素蛋白酶体途径的降解。NF-κB由抑制到释放并转运到细胞核中，导致很多细胞因子和趋化因子基因、细胞附着分子和免疫受体、炎症反应的所有重要介体的转录激活(Neurath等，1998；Jobin和Sartor，2000；Schmid和Adler，2000；Boone等，2002)。

对益生菌(probiotic)的使用日益感兴趣，益生菌被定义可消化的微生物，在包括炎性肠病(Gionchetti等，2000a)、肠易激综合征(Niedzielin等，2001)、肠炎(pouchitis)(Gionchetti等，2000b；Gionchetti等，2003)以及轮状病毒和抗生素有关的腹泻(Isolauri等，1991；Majamaa等，1995；Arvola等，1999)等在内的多种胃肠病的治疗中，除了内在营养价值外还具有健康益处。虽然几乎不知道益生菌的作用机制，但是它们似乎对肠粘膜具有保护、营养和抗炎作用。

针对益生菌所提出的可能作用机制包括抑制病原菌生长的氨、过氧化氢(Kullisaar等，2002；Annuk等，2003；Ocana等，1999)和细菌素(Cleveland等，2001；Paraje等，2000；Braude和Siemienski，1968)的产生、肠上皮细胞上的附着位点的竞争(Lee等，2000；Lee等，2003)以及免疫系统抗病原生物体的佐剂样刺激(Maassen等，2000)。然而，还不完全清楚益生菌防止肠炎症的确切作用机制。

益生菌VSL#3(包括嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和乳杆菌属(Lactobacillus)和双歧杆菌属(Bifidobacteria)的多个种)可以减轻患有小肠结肠炎的IL-10基因敲除小鼠模型中的肠炎症(Madsen等，2001)，而且已经表明可以改善临床实验中慢性肠炎症的临床结果(Gionchetti等，2000b)。在40位每年经受至少3次复发的复发性肠炎患者的随机、双盲和安慰剂对照试验中，那些指定接受安慰剂的患者在四个月之内全部复发，而指定采用益生菌治疗措施的患者只有15％(3/20)出现复发(Gionchetti等，2000b)。除了维持治疗外，在因溃疡性结肠炎而进行的结肠切除术后，VSL#3作为预防性治疗有助于防止在回肠袋-直肠吻合术后那年急性肠炎的发生(Gionchetti等，2003)。

正在广泛地研究用益生菌剂来改变IBD患者的消化道菌群作为治疗策略。然而，益生菌的作用机制还不清楚。而且，益生菌的临床功效高度依赖于细菌集落化的建立和维持，而且受到制剂的未受管理的组成和活性剂的顺势疗法输送的限制。因此，需要阐明益生菌活性的机制和发展用于炎性肠病的更有效疗法。

发明内容

在此公开的本发明通过提供至少一种来自益生菌VSL#3的可溶性因子来满足本领域中前述的至少一种需要，其中所述可溶性因子有利于治疗或预防炎症，例如炎性肠病。所述可溶性因子抑制例如肠上皮细胞中的蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性。在上皮细胞与含有所述可溶性因子的益生菌条件培养基接触之后，蛋白酶体的抑制作用发生得相对较快。此外，所述条件培养基已显示抑制促炎性NF-κB途径的能力，并且该能力是通过与已经被描述的III型分泌机制不同的机制实现。所述可溶性因子还诱导细胞保护性热激蛋白(Hsp，例如Hsp25和Hsp72)在肠上皮细胞中的表达。不期望受到理论的束缚，这些作用似乎由蛋白酶体的抑制作用的共同的统一机制介导。所产生的对NF-κB的抑制和Hsp25和/或Hsp72表达的上升与所述可溶性因子的抗炎和细胞保护作用相一致，并揭示解释微生物-上皮细胞相互作用的新机制。

本发明提供了由益生菌分泌的生物活性化合物或生物活性剂，所述益生菌可以减缓肠上皮细胞中TNF-α介导的对NF-κB活化的诱导，并诱导细胞保护性热激蛋白的表达，从而影响现有炎性肠病模型的至少一个(也许是两个)“方面(arm)”。这些有益于消化道粘膜的效果似乎源于由蛋白酶体的抑制作用介导的一种共同机制。本发明的化合物提供了用于治疗IBD的疗法的基础，所述疗法优于本领域现有疗法。

在本发明的一个方面，提供了一种组合物，该组合物包含分离的细胞保护性抗炎化合物。在一个实施方式中，所述化合物存在于益生菌条件培养基中。一种适当的益生菌条件培养基是由益生菌VSL#3调整的培养基。优选地，所述化合物存在于益生菌条件培养基的醚萃取组分中。

在一些实施方式中，所述化合物为有机酸。在其它的实施方式中，本发明提供了分离的细胞保护性抗炎化合物，该化合物包含在唾液链球菌嗜热亚种(Streptococcus salivarius subsp.thermophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricus)、长双歧杆菌(Bifidobacteria longum)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacteria infantis)和短双歧杆菌(Bifidobacteria breve)中的一种或多种调整的培养基中。在一些实施方式中，所述化合物存在于由植物乳杆菌调整的培养基中，而在其它的实施方式中，条件培养基是VSL#3条件培养基。

在本发明的另一方面，所述化合物诱导至少一种热激蛋白的表达。在一个特定的实施方式中，所述热激蛋白为Hsp25和Hsp72中的至少一种。在另外的一个实施方式中，所述化合物为例如通过抑制NF-κB途径的NF-κB活化抑制剂。优选地，所述化合物通过使IκB(例如通过使未磷酸化的IκB和/或磷酸化的IκB稳定)稳定而抑制NF-κB途径。在其它实施方式中，所述化合物既是热激蛋白表达的诱导剂又是NF-κB途径的抑制剂。

在本发明的另一方面，所述化合物为蛋白酶体抑制剂。该化合物可以是蛋白酶体的选择性抑制剂。该蛋白酶体抑制剂的选择性可能与蛋白酶体的蛋白酶活性和/或细胞(所述化合物在该细胞中抑制蛋白体酶)的类型有关。在本发明这一方面的一个实施方式中，所述化合物选择性地抑制蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性。在其它的实施方式中，所述化合物没有明显地抑制蛋白酶体的胰蛋白酶样活性。在本发明另外的其它方面，所述化合物轻微地抑制蛋白酶体的胱冬酶样活性，其中“轻微地抑制”是指相当于10μM乳胱素所引起的抑制水平。在另外的其它实施方式中，所述化合物选择性地抑制上皮细胞中的蛋白酶体。优选地，所述化合物选择性地抑制肠或消化道的上皮细胞中的蛋白酶体。

本发明的另一方面涉及一种药物组合物，该药物组合物包含分离的细胞保护性抗炎化合物和至少一种药用赋形剂，所述化合物来自益生菌条件培养基。一种示例性的药物组合物包含分离的细胞保护性抗炎化合物，该化合物来自于条件培养基(例如VSL#3条件培养基)的醚萃取组分。在一些实施方式中，所述化合物为有机酸。在一些实施方式中，所述化合物诱导至少一种热激蛋白(例如Hsp25和/或Hsp72)的表达。在一个说明性的实施方式中，所述化合物为NF-κB活化的抑制剂，该抑制剂例如通过使IκB稳定来进行抑制，而不管IκB是磷酸化的IκB还是未磷酸化的IκB。在其它的实施方式中，所述化合物为蛋白酶体抑制剂，例如是蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性的选择性抑制剂。示例性的蛋白酶体为上皮细胞蛋白酶体，例如肠上皮细胞蛋白酶体。

本发明的另一方面是治疗炎性病症患者的方法，该方法包括对所述患者施用有效量的分离的细胞保护性抗炎化合物，该化合物来自益生菌条件培养基(probiotic-conditioned medium)。典型地，所述化合物以有效地延缓、阻止或者逆转炎病病症(例如炎性疾病或疾患)的发展的量施用；然而，还可以考虑的是如本文所述的化合物是以有效地减缓炎性病症有关症状的量施用。炎性病症有关症状(例如发红、发胀、发热和疼痛)在本领域中是已知用作测定或评价所述症状以确定该症状是否已经得到缓解的方法。炎性病症可以是自身免疫疾病。依照本发明可以治疗的自身免疫疾病的例子包括类风湿性关节炎、少年类风湿性关节炎、骨关节炎、牛皮癣性关节炎、特应性皮炎、湿疹性皮炎、牛皮癣、斯耶格伦综合征、克罗恩病、口疮性溃疡、虹膜炎、结膜炎、角膜结膜炎、溃疡性结肠炎、哮喘、变应性哮喘、皮肤红斑狼疮、硬皮病、阴道炎、麻风逆行反应(leprosyreversal reactions)、麻风性结节性红斑、自身免疫性葡萄膜炎、多软骨炎、史-约综合征、扁平苔癣、结节病、原发性胆汁性肝硬变、后葡萄膜炎或间质性肺纤维化。

在本发明这方面的一个优选实施方式中，所述炎性病症是炎性肠病。在本发明的一个方面，所述炎性肠病是克罗恩病。在一些实施方式中，所述炎性肠病是溃疡性结肠炎。一种用于本发明这方面的优选益生菌条件培养基是VSL#3条件培养基。在本发明这方面的一些实施方式中，所述化合物来自所述培养基的醚萃取组分(即，用醚从所述培养基中萃取所述化合物)。考虑在所述方法的实践中有用的所述化合物包括有机酸和酸稳定的蛋白质或肽。在一些实施方式中，所述化合物诱导至少一种热激蛋白(例如Hsp25和/或Hsp72)的表达。所述化合物可以抑制NF-κB的活化(例如，通过使磷酸化形式的IκB或未磷酸化形式的IκB稳定)而无需诱导或优选诱导至少一种热激蛋白。在一些实施方式中，用于所述方法的化合物为蛋白酶活性的抑制剂，例如蛋白酶体的蛋白酶活性的抑制剂。例如，用于所述方法的化合物可以选择性地抑制蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性，所述蛋白酶体例如为上皮细胞的蛋白酶体，如肠上皮细胞的蛋白酶体。根据本发明这方面的实施方式包括治疗炎性病症患者的方法，其中，所述细胞保护性抗炎化合物不改变接触该化合物的上皮细胞中易于泛素化的至少一种蛋白的泛素化水平。

本发明的一个相关方面涉及预防炎性病症的方法，该方法包括施用有效量的细胞保护性抗炎化合物，该化合物来自益生菌条件培养基。本发明这方面包括与上述治疗方法的实施方式类似的实施方式，该实施方式对那些治疗方法的实施方式进行明显改变以使根据本发明的所述化合物适合于炎性病症患者的预防而不是治疗的预防性用途。

本发明的又一方面涉及用于治疗(包括减缓其症状)或者预防炎性病症的试剂盒，该试剂盒包含上述药物组合物和用于该组合物的施用以治疗或者预防所述病症的说明书。

本发明的另一方面提供制备分离的细胞保护性抗炎化合物的方法，该方法包括获得VSL#3条件培养基；和从所述VSL#3条件培养基中分离细胞保护性抗炎化合物，从而制备分离的细胞保护性抗炎化合物。在一些实施方式中，所述方法进一步包括表征所述细胞保护性抗炎化合物。更优选地，所述方法进一步包括鉴定所述细胞保护性抗炎化合物。在一些实施方式中，所述方法进一步包括获得更抗炎的细胞保护性化合物。在特定的实施方式中，所述更抗炎的细胞保护性化合物是从VSL#3中分离获得。在其它的实施方式中，所述更抗炎的细胞保护性化合物是通过化学合成获得。在另外的其它实施方式中，所述方法进一步包括将所述更抗炎的细胞保护性化合物置于药物组合物中。在一个优选的实施方式中，所述方法进一步包括将所述药物组合物施用于受试者。优选所述受试者是人。也优选所述受试者是炎性病症患者。更优选所述炎性病症是炎性肠病。在一些实施方式中，所述炎性肠病是克罗恩病。在其它的实施方式中，所述炎性肠病是溃疡性结肠炎。

本发明的另一个方面涉及筛选单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)释放的调节剂的方法，该方法包括：(a)将候选调节剂、益生菌条件培养基和上皮细胞组合(combine)；(b)测量所述细胞释放的MCP-1；和(c)比较在候选调节剂存在和不存在的情况下的MCP-1释放，其中MCP-1释放的差异鉴定出所述候选调节剂是MCP-1释放的调节剂。

在一个相关方面，本发明提供筛查热激蛋白表达的调节剂的方法，该方法包括(a)将候选调节剂、益生菌条件培养基和上皮细胞组合；(b)测量所述细胞中热激蛋白的表达；和(c)比较在所述候选调节剂存在和不存在的情况下的热激蛋白表达，其中所述热激蛋白表达的差异鉴定出所述候选调节剂是热激蛋白表达的调节剂。在一些实施方式中，所述方法将鉴定Hsp25和/或Hsp72的表达的调节剂。还考虑的是其中所述调节剂改变了热激转录因子-1(HSF-1)的活性的筛查方法。

在考虑本发明的下列详细描述后，本领域的那些技术人员将清楚本发明的许多其它方面和优点，以下描述了本发明目前优选的实施方式。

附图说明

下列附图构成本说明书的一部分，并包括在本说明书中，以进一步说明本发明的特定方面。通过参考一幅或多幅所述附图并结合本文提供的具体实施方式的详细描述，可以更好地理解本发明。

图1：益生菌条件培养基抑制对NF-κB的TNF-α刺激。用NF-κB萤光素酶报告基因转染YAMC(年轻的成年小鼠的结肠)细胞，并用VSL#3条件培养基(VSL#3-CM)对所述细胞处理16小时，然后用TNF-α(50ng/ml，在收获之前6小时)进行刺激。实验条件如以下各图柱所示，图柱“ctrl”为未处理对照，即，在TNF-α刺激之前YAMC细胞中的NF-κB活性的基线水平。每个实验条件的转染均进行3个重复。所显示的是来自这些实验(n＝8)之一的代表图。活性以任意发光单位表示。结果以TK-Renilla报告基因内标进行标准化，所述TK-Renilla报告基因内标在每个实验中与NF-κB萤光素酶报告基因进行共转染。

图2：益生菌条件培养基使IκBα稳定并防止IκBα的降解。IκBα和磷酸化形式的IκBα的免疫印迹，20μg蛋白/泳道。以VSL#3条件培养基对YAMC细胞进行16小时的处理，然后以TNF-α(50ng/ml)进行刺激，并在所示的时间进行收获。如上方两组所示，TNF-α刺激了IκBα的瞬时磷酸化(5分钟)，并与随着IκBα被导向分解的总IκBα降低(5分钟～30分钟)有关联。在下方组中，用VSL#3条件培养基对YAMC细胞进行预处理而抑制了TNF-α对IκBα和磷酸化IκBα的作用，防止它们的降解。注意IκBα的磷酸化形式的持久性(下方组)。

图3：总体泛素化没有被VSL#3条件培养基所抑制。来自VSL#3-CM处理16小时后的YAMC细胞的泛素化蛋白的免疫印迹分析表明，当用VSL#3-CM处理细胞时，并没有发生泛素化的总体阻断。如热胁迫(HS)和未处理的对照细胞(C)一样，还显示了已知抑制蛋白酶体功能并增加泛素化蛋白的积累的化合物MG132。在VSL#3-CM处理之后观察到泛素化蛋白的模式与热胁迫所见到的模式最为相似。右侧为分子量标记(kDa)。

图4：益生菌条件培养基抑制蛋白酶体的活性。以VSL#3条件培养基处理YAMC细胞16小时，然后收获用于蛋白酶体分析，该分析采用荧光底物SLLVY-AMC，测量蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性。萤光以相对于时间的任意单位表示。显示了未处理的对照细胞(-□-)、用DH5α-CM处理的细胞(-○-)、用VSL#3-CM处理的细胞(-■-)和用MG132处理的细胞(-▲-)。以MG132作为抑制剂阳性对照，其使用浓度为25μM。实验条件如所示那样，数据表示为平均值，误差条线表示为平均值的标准误差(n＝6)。

图5：Hsp25和Hsp72的表达被益生菌所诱导，不涉及细胞壁成分，并对上皮细胞类型具有特异性。图5A显示Hsp25和Hsp72在YAMC细胞与VSL#3细菌接触所示时间后的水平的免疫印迹分析，该分析表明诱导性Hsp表达的时间依赖性增强。最后两条泳道：48h＝在48h(小时)收获的未处理对照，HS＝热激细胞(阳性对照)。Hsc73(热激同源物73)，用作上样对照。

图5B显示在YAMC细胞与所示细菌浓度(cfu/ml)的VSL#3条件培养基或超声处理的生物体接触后，YAMC细胞中的Hsp25和Hsp72水平的免疫印迹分析。细菌培养物分为VSL#3条件培养基组分(CM)和超声处理的沉淀(沉淀)。在与VSL#3条件培养基接触后可以看到Hsp表达的浓度依赖性增强，这在超声处理的沉淀中并没有看到，表明由所述细菌产生的活性因子被分泌到条件培养基中而不是细胞壁成分中。未处理细胞表示为(-)，最左边泳道，而HS＝热激细胞(阳性对照)显示在最右边泳道上。Hsc73用作上样对照。

图5C显示Hsp72的免疫印迹分析，该分析比较了与VSL#3条件培养基接触16小时后的不同细胞系，20μg蛋白/泳道。VSL#3条件培养基诱导Hsp72在结肠(YAMC)和小肠的(MSIE)上皮细胞中的显著应答，但在3T3成纤维细胞并没有看到，表明益生菌作用对上皮细胞具有特异性。未处理细胞表示为(-)，热胁迫(HS)作为阳性对照。

图6：益生菌化合物通过顶端(腔的)膜特异过程诱导肠上皮的热激蛋白。来自顶端(腔的)侧的与VSL#3条件培养基接触的YAMC肠上皮细胞显示出强的Hsp25和Hsp72蛋白表达。相反，来自基底外侧的与VSL#3条件培养基接触的细胞没有被刺激表达Hsp25和Hsp72蛋白。当被同时加到顶端侧和基底外侧时，VSL#3-CM具有当其仅被加顶端侧所见到的类似的作用。以组成型热激同源物Hsc73作为对照。

图7：蛋白酶体抑制剂MG132的Hsp诱导时程类似于由VSL#3条件培养基所产生的Hsp诱导时程。在与蛋白酶体抑制剂MG132(25μM)接触所示时间后YAMC细胞中的Hsp25和Hsp72水平的免疫印迹分析(20μg蛋白质/泳道)表明，Hsp表达的时间依赖性增强与以VSL#3处理的细胞所见到的相仿。前两条泳道：C＝在0小时收获的未处理对照细胞，V＝在14小时收获的DMSO载体处理对照。HS＝热激细胞(阳性对照)。对于Hsp25的诱导，MG132甚至比热激更有效。

图8：不同于MG132，以VSL#3条件培养基对上皮细胞所进行的处理没有引起主要毒性。以VSL#3-CM(左下方组)、DH5α-CM(右下方组)或25μM的MG132(右上方组)处理16小时的YAMC细胞以及未处理对照细胞(左上方组)的相差照片。注意以MG132处理的细胞在形态和细胞存活力的损失方面的显著变化。这些变化在以VSL#3-CM或DH5α-CM处理的细胞中并没有见到，以VSL#3-CM或DH5α-CM处理的细胞的外观看上去与未处理对照的外观相似。在左上方组所示的条线等于10微米。

图9：VSL#3-CM的主要生物活性似乎存在于低于10kDa的组分中。Hsp25和Hsp72蛋白的表达受到VSL#3-CM成分的刺激，该成分存在于通过分子量截留值为10kDa的Centricon过滤器制备的组分中。用组成型热激同源物Hsc73作为对照。对照(C)、VSL#3-CM(CM)、通过10kDa过滤器(＜10kDa)的VSL#3-CM和热激(HS)。

图10：VSL#3生物活性具有pH依赖性。由VSL#3-CM(CM)所致的Hsp25和Hsp72的诱导受到培养基在其被加入YAMC单层的腔流体之前的pH的影响。图中所示的pH值显示CM在其被加入到YAMC细胞之前的pH。典型地，培养基在被细菌调整后的pH为4.0。在腔缓冲液中以1∶10稀释后的最终pH为6.5～7.0，该pH值为肠上皮细胞原位酸性微环境的近似pH。

图11：VSL#3-CM的醚萃取化合物抑制TNF-α刺激的NF-κB活性。采用NF-κB ELISA测定(酶联免疫吸附测定)检测醚萃取化合物(EEC)和MG132对NF-κB活性的效果(活性基元)。仅用TNF-α刺激(30ng/ml)导致NF-κB激活的显著增加(左边第2图柱)。MG132和EEC均显著抑制TNF刺激的NF-κB活性(左边第三和第四图柱)。相反，醚组分分离后剩余的水性相没有活性(最右边图柱)。

图12：VSL#3-CM的醚萃取化合物直接抑制蛋白酶体的功能。为确定EEC是否直接抑制蛋白酶体的功能，在来自VSL#3和大肠杆菌(DH5α)的EEC存在或不存在的情况下，测试了由市购蛋白酶体分析物(Calbiochem)提供的20S蛋白酶体成分(barrel)的体外活性。蛋白酶体的功能没有受到来自DH5α的EEC的影响(比较斜率)。相反，蛋白酶体的体外活性受到来自VSL#3和MG132的EEC的显著抑制。

图13：益生菌条件培养基显示出不同的蛋白酶体活性抑制。用VSL#3条件培养基处理YAMC细胞16小时，然后收获该细胞，以使用荧光底物Bz-val-gly-arg-AMC(图13A)或Z-leu-leu-glu-AMC(图13B)进行蛋白酶体测定。荧光以相对于时间的任意单位表示。示出了未处理对照细胞(-□-)、用VSL#3-CM处理的细胞(-◆-)和用乳胱素处理的细胞(

)。数据表示为平均值，而误差条线表示为所述平均值的标准误差(n＝3)。

图14：图1益生菌条件培养基抑制对NF-κB的TNF-α刺激。用NF-κB萤光素酶报告基因转染YAMC细胞并用VSL#3条件培养基处理16小时，然后用TNF-α(50ng/ml，收获前6小时)刺激。实验条件如各图柱下所示。除了显示为仅用VSL处理的图柱之外，每个实验条件(n＝8)的转染都进行3个重复，其中数据搜集自3个独立的实验，而且每个实验也都设3个重复。数据被表示成平均值±SE(^*p＜0.05，与TNF-α处理样品相比)。活性以任意发光单位表示，用TK-Renilla内标进行标准化。

图15：益生菌条件培养基抑制MCP-1的释放。用VSL#3条件培养基(VSL-CM)处理YAMC细胞16小时，然后在收获之前用TNF-α(50ng/ml)刺激6小时，并与未处理对照(No Tx)、TNF-α单独处理(单独的TNF-α)或在TNF-α存在或不存在的情况下用来自大肠杆菌的DH5α菌株的条件培养基预处理的细胞进行比较。采用ELISA(如本文所述)测定上清液的趋化因子MCP-1的释放。实验条件如各图柱下所示。与对照相比，用VSL-CM预处理的YAMC细胞在对TNF-α刺激的反应中显示MCP-1的释放量减少(3个独立实验的平均值±SE，在每个实验中每一组均设3个重复，与对照相比^*p＜0.05)。

图16：益生菌条件培养基使IκBα稳定并防止IκBα的降解。用VSL#3条件培养基处理YAMC细胞16小时，然后用TNF-α(50ng/ml)刺激并在所示时间收获。如上方组所示，TNF-α刺激IκBα的瞬时磷酸化(5分钟)，并与随着IκBα被导向降解的总IκBα下降有关(5～15分钟)。在下方组中，用VSL#3条件培养基预处理YAMC细胞抑制了TNF-α刺激IκBα降解的能力。

注意IκBα的磷酸化形式的持久性。

图17：益生菌条件培养基调节蛋白酶体的活性。VSL对蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性具有显著的抑制效果，对胰蛋白酶样活性没有抑制效果，对胱冬酶样活性具有部分抑制效果。A组：用VSL#3条件培养基处理YAMC细胞16小时，然后分析胰凝乳蛋白酶样蛋白酶体活性。萤光以相对于时间的任意单位表示。如本文所述，使用浓度为25μM的抑制剂阳性对照MG132。实验条件如所指出的那样，数据表示为平均值，误差条线表示为所述平均值的标准误差(n＝6)。对于胰蛋白酶样活性(B组)和胱冬酶样活性(C组)，用VSL#3条件培养基处理YAMC细胞16小时，然后如所述那样进行分析，但是使用10μM(由于细胞毒性而限制使用更高浓度的乳胱素)的蛋白酶体抑制剂乳胱素来代替MG132。数据表示为3个独立实验的平均值，误差条线表示为所述平均值的标准误差。

图18：益生菌条件培养对蛋白酶体的抑制是早期事件。VSL#3-CM处理的时程显示，VSL#3-CM对蛋白酶体的抑制是早期事件，在上皮细胞与益生菌条件培养基接触之后几乎立刻发生。对YAMC细胞处理30分钟、60分钟和6小时，然后收获并测定它们抑制蛋白酶体的CTL样活性的能力。在每个时间点测定每次分析的斜率并对时间进行作图，所述斜率代表蛋白酶体活性的程度。最显著的蛋白酶体抑制发生在用VSL#3-CM处理后的早期，大部分的抑制发生在最初30分钟内。所显示的是3个独立实验的代表图。

图19：Hsp25和Hsp72的表达受到益生菌的诱导，不涉及细胞壁成分，并且对上皮细胞类型具有特异性。A组：在YAMC细胞与VSL#3细菌接触所示时间后YAMC细胞中Hsp25和Hsp72的水平的免疫印迹分析，表明Hsp表达的时间依赖性增强。最后两条泳道：48h＝在48小时收获的未处理对照，HS＝热激细胞(阳性对照)。Hsc73(热激同源物73)，用作上样对照。B组：在与所示细菌浓度(cfu/ml)的VSL#3条件培养基或超声处理的生物体接触后，YAMC细胞中的Hsp25和Hsp72水平的免疫印迹分析。细菌的生长如本文所述，然后分为条件培养基组分(CM)或超声处理的沉淀组分(沉淀)。在与VSL#3条件培养基接触之后可以看到Hsp表达的浓度依赖性增强，而这在超声处理的沉淀中并没有见到，表明由所述细菌产生的活性因子或活性剂被分泌到到条件培养基中而不是细胞壁成分。以Hsc73作为上样对照。C组：Hsp72的免疫印迹分析比较了在与VSL#3条件培养基(CM)接触16小时之后不同的细胞系，20μg蛋白/泳道。VSL#3条件培养基在结肠(YAMC)和小肠(MSIE)的上皮细胞中均诱导了强的Hsp72反应，这在3T3成纤维细胞中并没有见到，表明益生菌作用对上皮细胞具有特异性。以热胁迫(HS)作为阳性对照。

图20：益生菌的Hsp诱导至少部分地为转录性的并且涉及HSF-1。A组：电泳迁移率变动分析(EMSA)显示由VSL#3-CM对Hsp表达所致的诱导实质上是转录性的。用VSL#3-CM处理YAMC细胞所示时间，然后收获，按照本文所述进行EMSA。VSL#3-CM诱导热激转录因子HSF的结合，在接触后4或5小时左右达到最大信号，然后在6小时后逐渐减少，表明由VSL#3-CM所致的Hsp诱导在本质上至少部分地为转录性的。B组：通过使用抗转录因子HSF-1和HSF-2的抗体进行的EMSA显示所述结合的特异性(B组)。参与由VSL#3-CM所致的Hsp诱导的主要转录因子是HSF-1；HSF-2似乎不在所述Hsp诱导中发挥作用。

图21：益生菌条件培养基保护上皮细胞对抗氧化剂胁迫。A组：铬释放分析证明VSL#3-CM防止YAMC细胞受到氧化剂损伤。用VSL#3-CM处理YAMC细胞16小时。用⁵¹Cr对细胞标记60分钟，然后用一氯胺(NH₂Cl，0.6mM)刺激60分钟，并测定释放的⁵¹Cr与胞内的⁵¹Cr的比例(3个独立实验的平均值±SE，每个实验的每一组均设3个重复，与对照相比^*p＜0.05，)。B组：VSL#3-CM防止了氧化剂诱导的由F-肌动蛋白到G-肌动蛋白形式的肌动蛋白的解聚。用VSL#3-CM处理YAMC细胞16小时，在适当的时候，然后用氧化剂一氯胺(0.6mM，60分钟)处理所述YAMC细胞和未处理对照(Con)细胞。处理细胞以获得球状(G)肌动蛋白和丝状(F)肌动蛋白。所显示的是3个独立实验的代表图。

具体实施方式

炎性肠病(IBD)是侵害易感个体的消化道的一类慢性疾病。在IBD中粘膜损伤的范围和严重性取决于炎症诱导损伤相对于修复性和细胞保护性机制之间的失衡。在最近的体外和体内研究中，已表明各种益生菌有效地防止或减缓与实验性结肠炎有关的肠粘膜炎症(Masen等，2001；Gionchetti等，2000b；Campierei等，2000)。此外，益生菌似乎在慢性炎症的环境中可以减少结肠粘膜恶性转化的速度(Wollowski等，2001)。很多初步临床实验已表明，益生菌在肠炎和IBD的治疗中是有效的。也正在进行数个多中心临床实验以确定这些试剂的效力和在IBD患者中的优化剂量。然而，益生菌的作用机制仍未清楚。随之而来，对于诸如未精炼的益生菌条件培养基等粗制益生菌材料的有益效果归因于一种或多种不同化合物，并由所述化合物来实现，这在本领域中并没有进行评估。而且，内容物未表征化的粗制条件培养基的治疗用途表现出相当大的健康方面的担忧。

本文公开的是益生菌VSL#3，该益生菌VSL#3产生具有抗炎和细胞保护特性的可溶性因子。更具体地，这些因子抑制促炎性NF-κB途径并诱导细胞保护性热激蛋白在肠上皮细胞中的表达。而且，这些效果似乎通过蛋白酶体抑制的共同的统一机制来介导，尽管本发明没有考虑要限于所述解释性理论。为了有助于更彻底地理解本发明，提供了下列术语的定义。

在此处公开的描述本发明的上下文中的“分离的”是指给定物质与至少一种与其通常天然存在的其它物质是分开的。作为例子，“分离”自条件培养基的生物活性剂与相应粗制条件培养基中的至少一种其它成分是分开的。

在蛋白酶体的蛋白酶功能的选择性抑制的上下文中的“选择性抑制”是指蛋白酶体的非全部(优选为一种)的蛋白酶功能被降低到相当于在至多为10μM的乳胱素存在下所测定的蛋白酶的水平。例如，蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性减少到在不超过10μM乳胱素存在下所见到的水平，但胰蛋白酶样活性或者胱冬酶样蛋白酶体活性中的至少一种没有随之减少，这是选择性抑制的示例性说明。

“抗炎”具有本领域熟知的一般含义，即减少炎症的物质或者方法，所述炎症为通常以发热、发红、发胀和疼痛为特征的生理学过程。“抗炎”在此具有其一般含义。

“炎性病症”是指本领域已知的以出现炎症为特征的任何疾病、不适或疾患。该术语包括上皮细胞的疾病、不适和疾患，所述上皮细胞的具体例子为肠(即，消化道)上皮细胞。

“细胞保护性”具有本领域熟知的一般含义，即保护至少一个细胞或者一种细胞类型的物质或者方法，并且这是整个本申请中为该术语所给出的所述一般含义。

“益生菌条件培养基”是指已经与活细胞接触的细胞培养基。适当的培养基包括本领域已知适合于培养和/或维持易于在体外维持或培养的细胞的所有培养基，并且包括有利于维持或培养各种原核细胞或真核细胞的多种培养基。

“多种培养基”和“培养基”具有它们的一般含义，即含有维持和/或培养至少一种细胞类型所必需的化合物的组合物。例如，如本领域应该知道的那样，培养基可以含有能量来源、营养物和生长因子等。这些术语在整个本申请中使用时与数量不严格相关，因此，可以用作同义词，根据具体叙述的上下文，这对于本领域技术人员来说应该是显而易见的。

“VSL#3”具有其在本领域内所获得的含义，即总称为益生菌并作为益生菌销售的一类革兰氏阳性细菌类型。

本文使用的“热激蛋白”是指在本领域中已知的在接触热胁迫后在至少一种细胞类型中表现出可检测的活性增强，典型地为反映为表达增强的一组蛋白的任意一种。

“使IκB稳定”是指在生理上相当长的时间段保持IκB蛋白的作用，该作用与被稳定的蛋白是否经过修饰(例如被磷酸化)无关。

“NF-κB激活”是指如本领域所已知的，胞内NF-κB表现出该蛋白特征性的至少一种活性水平的增加。所述激活可能起因于对NF-κB的破坏速度的下降，NF-κB的产生(例如表达)速度的上升，或者它们的组合。

“胰凝乳蛋白酶样”蛋白酶体活性是指如本领域已知的，表现出至少一种与胰凝乳蛋白酶相同特征的蛋白酶活性，例如相同识别切割位点或者结构相关的切割位点。

“药用赋形剂”是具有其一般含义的词语，即可与药物剂或者生物活性剂混合作为提供适合药物施用的稠度或形式的载体的基本上为惰性的物质。所述载体在施用于人时通常不产生过敏性反应或者类似的不利反应。

“MCP-1释放”是指如本领域已知的，单核细胞趋化蛋白-1从已产生或者含有该蛋白的细胞中例如通过分泌而分离出来。

“调节剂”是指影响可检测的活性(例如蛋白的活性)或过程(例如生理学过程，如MCP-1释放)的物质，而不管效果是促进(例如提高)还是抑制。

根据这些定义，应该理解，本发明的化合物提供了治疗诸如IBD等炎性病症的疗法，该疗法优于本领域现有的那些疗法。在一个实施方式中，本发明提供一种组合物，该组合物含有分离的细胞保护性抗炎化合物，该化合物来自益生菌条件培养基。此外，本发明提供用于治疗炎性病症患者的方法，该方法包括对所述患者施用分离的细胞保护性抗炎化合物，该化合物来自益生菌条件培养基。在其它方面，本发明提供用于分离和表征来自益生菌条件培养基的至少一种化合物，该化合物具有抗炎和/或细胞保护性质，优选具有两种类型的所述性质。

本发明提供鉴别和表征来自细胞培养物(例如细菌培养物)的化合物的方法，所述化合物具有抗炎和细胞保护性质。本发明提供分离的细胞保护性抗炎化合物，该化合物来自益生菌生物体。本发明还提供有利于治疗和/或预防炎性疾病尤其是上皮炎性疾病的组合物和方法。

I.细胞保护性抗炎化合物的分离

任何细菌菌株或益生菌制剂均可以用于细胞保护性抗炎化合物的筛选。优选地，所述细菌为非病原性的肠细菌。在本文公开的具体实施方式中，使用了益生菌制剂VSL#3(VSL Pharmaceuticals，Gaithersburg，MD)。所述制剂含有唾液链球菌嗜热亚种、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和短双歧杆菌。

细菌细胞的培养方法对于本领域技术人员是熟知的。在一个优选的方法中，将VSL#3培养在哺乳动物组织培养基中。VSL#3在有氧条件下易于生长在哺乳动物组织培养基(例如RPMI 1640或DMEM)中。在组织培养基的生长使得分离所分泌的因子比如果使用复合肉汤要简单得多。

本发明的细胞保护性抗炎化合物是来自细胞条件培养基(例如VSL#3条件培养基)的可溶性因子。为了方便鉴定和表征这些化合物，优选将细菌细胞从培养基除去。本领域技术人员应该熟悉将细胞与培养基中的可溶性因子分离的方法。例如，细胞可以通过离心、过滤或者两者的结合除去。在一个优选的实施方式中，制备在组织培养基(例如RPMI 1640)中在37℃生长的VSL#3过夜培养物，然后以10,000g在4℃离心5分钟。然后取出所述培养基并通过0.2μm醋酸纤维素过滤器过滤排除所有活的完整细菌。然后将这一“条件培养基”作为所要鉴定的细胞保护性抗炎化合物的来源。

A.有机萃取法

通过有机溶剂萃取可以从条件培养基中进一步分离细胞保护性抗炎化合物。通过有机萃取法可以将有机化合物和水性化合物分离。对本领域技术人员来说，萃取法和适当的有机溶剂是已知的。在一个优选的实施方式中，采用醚来进行有机萃取。醚萃取法通常可以移除有机酸和它们的衍生物以及脂类和磷脂分子，但是无机盐、亲水肽、亲水蛋白、碳水化合物和多糖则倾向于保留在水性相中。

本发明的细胞保护性抗炎化合物存在于醚萃取组分中，并且多数(如果不是所有)具有小于10kDa的分子量。预期本发明的抗炎的细胞保护性化合物是有机酸。

B.薄层层析

有机酸的纯化方法对于本领域技术人员来说是熟知的。例如，可以使用薄层层析(TLC)从条件培养基的醚萃取组分中纯化出本发明的化合物，薄层层析是有利于分离有机化合物(例如有机酸和它们的衍生物)的层析技术。

在一个优选的实施方式中，在硅胶G TLC板上对VSL#3条件培养基的醚萃取物进行薄层层析(TLC)，所述硅胶G TLC板已经在150℃活化了6小时。所述板将按如下方法展开：对于第一方向，使用体积比为50∶8∶6的乙醇/氨/水；对于第二方向，使用比率为45∶8∶4的苯/甲醇/醋酸。由于它们在液体流动相和固定相间的分配行为的差异，醚萃取混合物中的不同成分将以不同的速率迁移，从而能使它们分开。然后在碘蒸汽下可逆地使层析图显色，所述碘蒸汽结合到碳双键上，并使醚萃取混合物的单一成分可视化。采用刮刀将经可视化的斑点刮下而将经分开的各成分单独分离，使碘蒸汽蒸发，然后再次用醚进行反萃取。然后测试每个组分的活性。为了确保醚萃取法本身不影响到生物活性，用以上相同方式来处理来自大肠杆菌的DH5α实验室菌株的条件培养基，并将其用作醚萃取法的阴性对照。

C.其它的分离技术

在本发明中，也可以采用本领域技术人员已知的其它分离技术来对条件培养基进行分离。高效液相色谱(HPLC)的特征在于分离速度极快，并具有优异的峰分辨率。这通过使用极细颗粒和高压而维持足够的流速来实现。在大约数分钟或最多1小时内即可完成分离。而且，因为颗粒如此之小，填充如此之紧密，以至于空体积占床体积的极小部分，因此只需要非常小体积的样品。同时，由于条带如此之狭窄，以至于对样品的稀释非常小，因此不需要很高的样品浓度。

凝胶层析或分子筛层析是基于分子大小的特殊类型的分配层析。凝胶层析的理论在于，以包含小孔隙的惰性物质的极小颗粒来制备层析柱，并根据大分子和小分子的大小，当大分子和小分子通过所述孔隙或通过所述孔隙周围时使大分子和小分子分离。只要制备颗粒所用的材料不吸附分子，决定流速的唯一因素就是大小。因此，只要形状相对恒定，分子以尺寸递减的方式从色谱柱中洗脱。因为分离不依赖于所有其它的因素，例如pH、离子强度和温度等，所以凝胶层析最适合于分离具有不同尺寸的分子。而且实际上没有吸附，区带扩散少，并且洗脱体积只简单地与分子量有关。

也可以使用基于电荷的分离技术。一种所述技术是离子交换层析。通过离子交换层析，样品可逆地结合到带电基质上。通常使用含有二乙基氨基乙基(DEAE)和羧甲基(CM)纤维素的基质。然后通过增加盐浓度或改变流动相的pH来引起脱吸附。本领域技术人员已知的用于基于电荷而分离化合物的另一种技术是IEF(等电聚焦)。

另外，所述条件培养基可以通过具有特定分子量截留值的过滤器。例如，本发明的一些组分可以通过具有10kDa分子量截留值的Centricon过滤器来分离分析。

在纯化或分离的过程中，可能需要对各个组分进行分析，以便监测保留有抗炎活性和细胞保护活性的那些组分。例如，可以筛选培养基或组分诱导细胞保护性热激蛋白、抑制NF-κB活性和抑制肠上皮培养细胞的蛋白酶体功能的能力。将在下面对这些分析进行更详细的描述。具有生物活性的制备物可以等分冷冻，以在以后用于抗炎的细胞保护性化合物的鉴定、纯化以及进一步制备。

D.化学合成

除了从益生菌条件培养基中分离本发明的细胞保护性抗炎化合物以外，还可以设想通过化学合成来产生这些化合物。化学合成方法对于本领域技术人员来说是熟知的。

II.细胞保护性抗炎化合物的鉴定

可以通过本领域技术人员已知的方法来鉴定本发明的细胞保护性抗炎化合物。鉴定本发明的化合物的两种优选方法是制备TLC(类似于上述分析TLC，只是规模更大)和HPLC(高效液相色谱)。

HPLC将使用具有磷酸钾缓冲剂(pH2.8)/甲醇(95∶5)的C8反相(RP)柱来进行，而对各化合物进行分离。通过与固定相(C8柱)的疏水相互作用产生成分的分离，然后由水性酸性溶液然后是有机溶剂组成的流动相可用于洗脱混合物中的单个成分。各化合物将会保留在柱上直到合适浓度的有机溶剂将其从C8固定相上移走。然后收集各分开的峰，并采用本领域已知的适当技术(例如核磁共振成像(NMR)和红外光谱(IR))对洗脱下来的化合物进行鉴定。

作为使用HPLC的一般技术对化合物进行鉴定的例子，可以使用C18反相(RP)分析柱(3.9mm×300mm)对VSL#3条件培养基进行RP-HPLC分离。流动相包含缓冲剂A(0.1％三氟乙酸，即，10mM TFA)和缓冲剂B(在0.1％TFA中的60％乙腈)，并在使用前对缓冲剂进行过滤和脱气。注入体积为200μl的条件培养基上清液，流速为1.0毫升/分钟，并在室温进行色谱法。洗脱方案为：5％缓冲剂B，5分钟；5％缓冲剂B到100％缓冲剂B，60分钟；100％缓冲剂B，10分钟；以及100％缓冲剂B到5％缓冲剂B，5分钟。在214nm和280nm(紫外线)检测，并收集各馏分，在-80℃冷冻并冻干。如本领域应该知道的那样，将冻干后的各馏分随后溶解在适当的溶剂(例如与细胞存活力相容的缓冲液)中。用表现出生物活性的馏分来鉴定生物活性剂。如本领域应该认识的那样，RP-HPLC尤其适合用于生物活性剂的鉴定和/或分离，所述生物活性剂为有机酸或者其它相对非极性的化合物。

在一些实施方式中，本发明的化合物可以使用质谱来鉴定。质谱通过使分子在真空中离子化并通过挥发使它们“飞起来”而提供一种“称重”单个分子的方法。在电场和磁场的组合影响下，离子依据它们的单个质量(m)和电荷(z)而遵循抛射物轨迹。质谱法对于本领域技术人员来说是熟知的，并且通常用于分析和表征各种分子。

III.细胞保护性抗炎化合物的表征

可以分析来自益生菌条件培养基的化合物(例如实际来自益生菌条件培养基的化合物)诱导细胞保护性热激蛋白、抑制NF-κB活性和抑制细胞(例如肠上皮细胞)的蛋白酶体功能的能力。

A.热激蛋白

热激蛋白是保护细胞以抗环境胁迫因子的蛋白家族。VSL#3条件培养基诱导热激蛋白的表达，尤其是诱导Hsp72和Hsp25的表达。Hsp72结合到关键的细胞蛋白并使该蛋白稳定，从而防止它们变性。它还通过保护线粒体的完整性、抑制细胞色素C渗漏和阻断胱冬酶8活性而具有抗凋亡的作用(Liu等，2003)。Hsp25/27是肌动蛋白稳定剂和保持细胞骨架和紧密连接功能。

分析对热激蛋白的诱导的方法对于本领域技术人员来说是已知的。例如，对Hsp72和Hsp25的诱导可以采用特异识别并结合到特异性Hsp同种型(Stressgen)的单克隆抗体通过标准Western印迹分析来进行。可以进行组成型热激同源物Hsp60和Hsc73的免疫印迹来检测应答的特异性并确保泳道中的等量上样(这些蛋白的表达通常保持恒定)。此外，可以使用抗体通过免疫荧光和ELISA来检测热激蛋白的表达。

分析对热激蛋白的诱导的其它方法包括使用例如RT-PCR、基因组微阵列和实时PCR来分析Hsp mRNA的水平。分析对热激蛋白的诱导的另一个方法是采用电泳迁移率变动分析来例如观测转录因子HSF-1的结合。此外，可以采用HSE-萤光素酶报告子分析来检测转录因子HSF-1的活性。

B.NF-κB途径

对于本领域技术人员来说，用于对NF-κB激活的抑制(例如NF-κB途径的抑制)进行评价的很多方法是已知的。例如，可以进行使用³²p标记的寡核苷酸的电泳迁移率变动分析(EMSA或凝胶迁移)以测定NF-κB的激活。NF-κB的激活和从抑制剂IκB上的释放会导致与这一模拟物的结合，这在聚丙烯酰胺凝胶上可以容易地加以检测。至少有两种另外的手段可以用来证实NF-κB的激活。首先，经激活的NF-κB转运到细胞核中，因此，通过对细胞核组分进行免疫荧光或免疫印迹在细胞核中检测到NF-κB将会强有力地支持NF-κB激活。其次，可以用NF-κB敏感性报告子构建体(例如具有克隆在萤火虫萤光素酶报告子之前的5个拷贝的NF-κB应答性启动子元件的构建体)进行瞬时转染。而且，来自3种测定(EMSA、细胞核NF-κB转运和NF-κB报告子)的数据可以有助于鉴定本发明化合物调节(例如抑制)NF-κB活性的独特步骤。

用于检测NF-κB激活的基于ELISA的分析在本领域中也是已知的。例如，可从Vinci-Biochem(Vinci，意大利)商购获得基于NF-κB ELISA的分析试剂盒。

NF-κB调节各式各样的基因，例如编码细胞因子、细胞因子受体、细胞粘着分子、凝结有关的蛋白和细胞生长有关的蛋白的基因。因此，研究NF-κB途径的另外一个方法是通过分析已知被NF-κB所调节的基因的表达。本领域技术人员应该熟悉用于分析基因表达的各种技术。例如，可以测定mRNA和/或蛋白水平的变化。可以通过很多方法来检测mRNA水平的变化，这些方法包括但不限于实时PCR和基因组微阵列。可以通过本领域已知的各种免疫检测方法来分析蛋白水平的变化。

监测NF-κB调节剂IκB的变化也是值得的。由于预期本发明化合物影响不止一种形式的IκB的活性，所以抗天然形式的IκB和磷酸化形式的IκB的抗体都是有用的，并可以用于Western印迹分析和免疫组织化学定位。

C.蛋白酶体

最后，可以通过评价本发明的化合物对细胞蛋白酶体功能的影响来筛选该化合物。蛋白酶体是大的复合物，其包含具有不同特异性的数种蛋白酶活性。它以两种类型存在，即20S复合物和26S复合物。细胞蛋白酶体在降解细胞蛋白和提供用于负载MHC I分子的病毒性和内源性肽片段中起着重要的作用，所述MHC I分子用于抗原呈递。

蛋白酶体抑制剂阻断了许多细胞蛋白的降解。蛋白酶体抑制剂大致分为两组：合成类似物和天然产物。合成抑制剂为具有不同药效团的基于肽的化合物。这些化合物包括肽苯甲酰胺、肽α-酮酰胺、肽醛、肽α-酮醛、肽乙烯基砜和肽硼酸。已知的天然产物蛋白酶体抑制剂包括线性肽环氧酮、肽大环、γ-内酰胺硫醇酯和表聚硫代二氧哌嗪毒素。蛋白酶体抑制剂的一些具体例子包括MG132、ALLN、E64d、LLM、奎纳克林、氯喹、氯碘羟喹、(R)-(-)-3-羟基丁酸酯、多巴胺、L-DOPA、PR39、胶霉毒素和绿茶(EGCG)。蛋白酶体抑制剂的另外例子公开在Kisselev和Goldberg(2001)以及Myung等(2001)的文章中，在此将两者作为整体而引入到本文中作为参考。

由VSL#3条件培养基所致的对蛋白酶体功能的抑制提供了用于抑制NF-κB和诱导细胞保护性热激蛋白的潜在统一机制。这种作用与本文所公开的磷-IκB和泛素化IκB的积累是一致的。此外，已表明对蛋白酶体功能的抑制是热激蛋白应答的极强的刺激因素，这有可能是由于未降解蛋白累积的缘故(Lee和Goldberg，1998)。尽管不期望受到理论的束缚，本文公开的数据表明，VSL#3条件培养基抑制NF-κB途径并诱导Hsp表达的主要作用机制似乎是直接抑制蛋白酶体的功能。这代表新的益生菌作用机制，不同于Neish等所报道的通过非病原性沙门氏菌生物体经III型分泌系统所致的对活化NK-κB的抑制，该抑制需要完整的细菌和细菌粘附。

本领域技术人员熟悉用于分析蛋白酶体功能的方法。在一个优选的方法中，采用荧光测定分析法进行蛋白酶体分析，该方法通过制备来自经VSL#3条件培养基处理的YAMC细胞的粗制细胞裂解物，然后添加蛋白酶体底物SLLVY-AMC，并测定该产物随着时间的水解(见图4)。所述底物是结合有荧光剂(4-氨基-7-甲基香豆素)的5个氨基酸的肽，在被蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性切割之后，该底物产生可以被检测并可对时间作图的荧光信号。蛋白酶体的活性由曲线的比率或斜率反映。在这一分析方法中，可对由候选分子所致的蛋白酶体活性的抑制与已知蛋白酶体抑制剂(例如MG132)所致的抑制进行比较。

分析蛋白酶体功能的另一种方法是采用识别活性蛋白酶体的抗体进行免疫荧光。例如，LMP2抗体特异地识别蛋白酶体β亚基。此外，蛋白酶分析试剂盒可从Biomol International LP商购获得。

D.动物模型

本发明化合物的表征可能涉及到各种动物模型的使用，所述动物模型包括已经改造而具有特定缺陷或携带有标记的转基因动物，所述标记可以用于检测候选物质在生物体中到达不同细胞并影响该细胞的能力。小鼠由于其大小、操作的容易性以及在它们生理学和遗传学组成的信息而成为优选的动物模型，尤其是用于转基因学的动物模型。然而，其它动物也同样适用，这些动物包括大鼠、兔子、仓鼠、豚鼠、沙鼠、土拨鼠、猫、狗、绵羊、山羊、猪、牛、马和猴(包括黑猩猩、长臂猿和狒狒)。可以使用来自上述任何一种动物的动物模型进行分析。

用于结肠炎的小鼠模型的一些例子包括DSS诱导的结肠炎模型、IL-10敲除小鼠、A20敲除小鼠、TNBS诱导的结肠炎模型、IL-2敲除小鼠、TCRα受体敲除小鼠和E-钙粘着蛋白敲除小鼠。

用测试化合物对动物所进行的处理包括将所述化合物以适当的形式施用于动物。本领域技术人员已知的炎性疾病的任何动物模型均可以用于本发明方法的实践中。通过可为临床目的或非临床目的所用的任何途径来施用。例如，所述化合物可以通过管饲法或直肠施用来输送。此外，可以通过在动物模型中诱导结肠炎之前施用化合物来分析化合物的预防效果。或者，可以通过在动物模型中诱导结肠炎之后施用化合物来分析化合物的治疗效果。

测定化合物的体内效力可以包括考虑多种不同的标准。本领域普通技术人员应该熟悉可获得的分析受试者中的炎症的大量方法，而不管所述受试者是动物还是人类受试者。例如，可以通过组织学评价和结肠炎严重性的分级来对炎症进行测定。用于分析受试者中的炎症的其它方法包括例如测量髓过氧化物酶(MPO)活性、转运活性、绒毛蛋白表达和跨皮电阻(TER)或跨上皮电阻(TEER)。

还可以使用评价细胞增殖的测试来分析化合物的效力。例如，通过测量5-溴-2′-脱氧尿苷(BrdU)的吸收来分析细胞增殖。测定化合物的效力的另外一个方法是评价细胞凋亡的程度。研究细胞凋亡的方法在本领域中是熟知的，并且包括例如TUNEL分析。

除此之外，毒性和剂量反应的测量可以在动物中进行，而不是在体内或胞内分析。

IV.药物组合物

本发明的组合物包含有效量的细胞保护性抗炎化合物，该化合物可以溶解和/或分散在药用赋形剂(例如载体和/或水性介质)中。

本发明的细胞保护性抗炎化合物可以通过本领域技术人员已知的的任何方法来输送(例如见“Remington′s Pharmaceutical Sciences”，第15版)。例如，所述药物组合物可以口服输送、直肠输送、肠胃外输送或局部输送。

包含本发明化合物的溶液可以在适当地混有表面活性剂的水中制备，所述表面活性剂例如为羟丙基纤维素或低平均分子量(低于8kDa)或高平均分子量(大于8kDa，优选大于15kDa)的聚乙二醇(PEG)。在储藏和使用的常规条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物的生长。适合于注射用途的药物形式包括无菌水性溶液或分散液和用于临时制备无菌水性溶液或分散液的无菌粉末。所述形式通常应该是无菌的并且必须是流动程度存在有效注射性。所述形式在制备和储藏条件下必须是稳定的，并且在保存时必须抗微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。

对于在水性溶液中的肠胃外施用，例如，该溶液如果需要可以进行适当的缓冲处理，并且液体稀释剂首先赋予与足够的盐水或葡萄糖的等渗。这些特别的水性溶液尤其适合于静脉内、肌肉内、皮下、肿瘤内和腹膜内施用。关于这一点，本领域技术人员根据本发明的公开将会知道可以采用的无菌水性介质。

也可以使用栓剂。栓剂为用于插入到直肠、阴道和/或尿道中的具有各种重量和/或形状的固体剂型。在插入后，栓剂在腔液中软化、融化和/或溶解。通常，用于栓剂的传统粘合剂和/或载体可以包括例如聚(亚烷基)二醇和/或甘油三酯；所述栓剂可以由含有0.5％～10％，优选为1％～2％的活性成分的混合物形成。本发明的药物组合物也可以通过灌肠法输送。

口服制剂包括那些通常采用的赋形剂，例如药物等级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素和/或碳酸镁等。这些组合物可采用以下形式：溶液剂、悬浮液剂、片剂、丸剂、胶囊剂、持续释放制剂和/或散剂。在一些特定的实施方式中，口服药物组合物包含惰性稀释剂和/或可同化的食用载体，和/或它们可以包封在硬壳和/或软壳明胶胶囊中，和/或它们可以压制成片剂，和/或它们可以直接与饮食食物合并。对于口服治疗性施用，活性化合物可以与赋形剂合并和/或以可消化的片剂、含片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、悬浮液剂、糖浆剂和/或包药薄饼剂(wafer)等形式使用。所述组合物和/或制剂应该包含至少0.1％的活性化合物。所述组合物和/或制剂的百分比当然可以变化，和/或可以方便地为每单位约2重量％～约75重量％，和/或优选为25重量％～60重量％。所述治疗上有用的组合物中的活性化合物的量使得可以获得适当的剂量。

片剂、锭剂、丸剂和/或胶囊剂等也可能包含下列材料：粘合剂，例如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉和/或明胶；赋形剂，例如磷酸二钙；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉和/或海藻酸等；润滑剂，例如硬脂酸镁；和/或甜味剂，例如可以添加蔗糖、乳糖和/或糖精，和/或调味剂，例如薄荷、冬青油和/或樱桃调味品。当剂量单位形式为胶囊时，除了上述类型的材料之外，它还可以含有液体载体。各种其它材料可以作为包衣存在和/或不然改变剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂和/或胶囊剂可以包衣有虫胶和/或糖。酏剂的糖浆可以包含活性化合物蔗糖作为甜味剂，对羟基苯甲酸甲酯和/或对羟基苯甲酸丙酯作为防腐剂，和染料和/或调味品，例如樱桃调调味品和/或橙调味品。

局部制剂包括含有活性化合物的乳膏剂、软膏剂、胶冻剂、凝胶剂和表皮溶液剂或悬浮液剂等。

对于人类施用，制剂应该符合FDA生物学办公室标准所要求的无菌性、热源性、一般安全性和纯度标准。

细胞保护性抗炎化合物的剂量和剂量方案在例如考虑到诸如受试者的体重和年龄、被治疗疾病的类型、疾病情况的严重性、先前或同时进行的治疗性干预和施用方式等因素后，可以根据受试者的不同而不同，这可以由本领域普通技术人员容易地加以确定。

可以采用与剂量制剂相容的方式并以治疗有效的量施用。所要施用的量取决于待治疗的受试者。需要施用的活性成分的精确量取决于从医人员的判断，这种判断可能涉及根据个案确定有效量的常规程序。

以下包括的实施例是为了说明本发明的优选实施方式。本领域技术人员应该理解，在以下实施例中公开的技术代表在本发明实践中起着良好作用而在此公开的技术。然而，本领域技术人员根据本公开，应该理解在没有脱离本发明的精神和范围内，在所公开的具体实施方式中可以作出很多改变并且仍然能够获得类似或相似的结果。简言之，下列实施例说明了本发明的各种实施方式：实施例1描述了用于在此公开的工作中的基本技术，包括组织培养和细胞裂解物的制备，NF-κB、⁵¹Cr、G/F肌动蛋白和蛋白酶体活性分析，电泳迁移率变动分析，蛋白的Western印迹分析，MCP-1分析和观察数据的统计分析；实施例2公开了益生菌条件培养基所致的NF-κB活性的抑制；实施例3描述了益生菌条件培养基所致的单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)释放的抑制；实施例4描述了益生菌条件培养基所致的IκB降解(包括磷酸化的IκB)的抑制；实施例5描述了益生菌条件培养基不能普遍地抑制蛋白质的泛素化；实施例6显示益生菌条件培养基抑制蛋白酶体活性，而且所述抑制比对蛋白表达的诱导更加迅速；实施例7说明了益生菌条件培养基所致的热激蛋白表达的诱导，包括所述诱导的时程，并且提供证据证实所述诱导由HSF-1的诱导所介导；实施例7描述了具有生物活性的益生菌剂(即，细胞保护性抗炎化合物)的性质；实施例8公开了益生菌条件培养基保护上皮细胞对抗氧化剂胁迫；实施例9公开了具有生物活性的益生菌化合物或益生菌剂的一些性质；和实施例10明确了益生菌剂对蛋白酶体活性的差异抑制。

实施例1

一般方法

益生菌培养和条件培养基的产生

益生菌制剂VSL#3(VSL Pharmaceuticals，Gaithersburg，MD)包含唾液链球菌嗜热亚种、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和短双歧杆菌，浓度为5×10¹¹冻干细菌/克。让VSL#3(批号2034-A2，VSL Pharmaceuticals，Gaithersburg，MD)在无酚红的RPMI 1640培养基中生长16小时直到浓度为约2×10¹⁴(如集落计数所测定)，然后在台式Sorvall离心机中低速离心(3000×g，4℃，10分钟)。然后将上清液(条件培养基)通过0.22微米低蛋白结合过滤器(Millipore，Bedford，MA)除去所有的细菌细胞和碎片。将条件培养基等分贮藏在-80℃的无菌微离心管中直到下次使用。

组织培养

YAMC(年轻成年小鼠的结肠)细胞是有条件永生化小鼠结肠上皮细胞系，该细胞系来自表达温度敏感型SV40大T抗原(tsA58)的转基因的永生化小鼠，所述表达受MHC第II类启动子的干扰素γ-敏感部分的控制(Whitehead等，1993)。在允许条件(33℃)下在RPMI 1640培养基中保持YAMC细胞，所述培养基含有5％(体积比)胎牛血清、5U/ml鼠IFN-γ(GibcoBRL，Grand Island，NY)、50μg/ml链霉素、50U/ml青霉素，并添加有ITS+Premix(BD Biosciences，Bedford，MA)。在非允许(非转化)条件下于37℃并在没有IFN-γ情况下，这些细胞发生分化并形成成熟的上皮细胞功能和性质，包括紧密连接的形成、极性、微绒毛顶端膜和转运功能。

以每60mm组织培养皿2×10⁵的密度将细胞铺板(用于Western印迹分析和蛋白酶体分析)，或以6孔板中每孔1×10⁵的密度铺板(用于NF-κB萤光素酶转染实验)。在33℃生长24小时使细胞附着后，用无IFN的培养基更换培养基，并将细胞转移到37℃(非允许条件)24小时，让分化的结肠细胞表型发育以用于所有实验。以VSL#3条件培养基(1∶10稀释)过夜处理细胞，然后在次日将所述细胞用在各种实验中。对于NF-κB萤光素酶报告子分析，此时将浓度为50ng/ml的鼠TNF-α(Peprotech，Rocky Hill，NJ)直接加到细胞中并在收获前放置6小时。热激对照置于42℃中23分钟并在收获前在37℃恢复2小时。对于MG132处理的对照细胞，除非另有说明，在收获前用25μM MG132(Biomol，Plymouth Mtg，PA)在37℃处理2小时。

其它两种细胞系，即MSIE(小肠YAMC对应细胞系)和3T3成纤维细胞，均用于本研究中，并如前所述(Kojima，2003)保持，在此将该文献引入以作参考。

细胞裂解物的制备

在冰冷的HBS(150mM NaCl、5mM KCl、10mM HEPES，pH7.4)中将细胞洗涤两次并刮下。沉淀细胞(14,000×g20秒，室温)，然后悬浮在冰冷的裂解缓冲液(10mM Tris，pH7.4，5mM MgCl₂，50U/ml DNAse和RNAse，加上完全的蛋白酶抑制剂混合液(Roche MolecularBiochemicals，Indianapolis，IN)中。用二辛可宁酸法测定蛋白的浓度(Smith，1985)。对于蛋白酶体分析，将样品立即储存在-80℃直到使用。对于Western印迹，在加入3×Laemmli终止缓冲液后，将样品加热到75℃(5分钟)，然后储存在-80℃直到使用。

Western印迹分析

如前所述(Kojima，2003)，将每泳道20μg蛋白解析在12.5％SDS-PAGE上，并在1×Towbin缓冲液(组成：25mM Tris，192mM甘氨酸，pH8.8，15％体积比甲醇)中转移到PVDF膜(Polyscreen，Perkin-ElmerNEN，Boston，MA)上，在此引入该文献作为参考。用在TBS-Tween(含有0.05％体积比的Tween 20的Tris缓冲盐水(150mM NaCl，5mM KCl，10mM Tris，pH7.4))中的5％(重量/体积)脱脂奶在室温封膜1小时。对于抗泛素印迹，在3％牛血清白蛋白(Fisher，Pittsburgh，PA)中封膜。将一抗加到TBS-Tween中并与特异性的抗Hsp25抗体(SPA801，Stressgen，Victoria，BC，加拿大)、抗Hsp72抗体(SPA810，Stressgen)、抗Hsc73抗体(SPA815，Stressgen)、抗IκB-α抗体(sc-1643，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)、抗磷-IκB-α抗体(sc-8404，Santa Cruz)或抗泛素抗体(PW 8810，AffinitiResearch Products Ltd，Exeter，英国)在4℃温育过夜。然后在与过氧化物酶偶联的二抗(Jackson Immunoresearch Labs，Inc.Fort Washington，PA)在室温温育1小时前在TBS-Tween中于室温洗涤5次，每次10分钟。然后在TBS-Tween中洗膜(5次，每次10分钟)，然后在TBS(没有Tween)中进行最后的洗涤。用加强型化学发光系统ECL试剂(Supersignal，Pierce，Rockford，IL)使印迹可视化，并依照生产商的说明书进行显色。

统计分析

萤光素酶分析按3个重复进行，对于蛋白酶体分析，每个实验重复两次。所有实验中的各实验均重复至少3到6次。除非另有说明，所有数值表示为平均值+/-平均值的标准误差。在进行多重比较时，采用以Bonferroni校正的ANOVA分析来评价各组间差异的显著性。P＜0.05被认为具有统计显著性。

实施例2

益生菌抑制肠上皮细胞中的NF-κB激活

为了测定VSL#3中的细菌是否分泌具有抗炎活性的因子，研究了VSL#3条件培养基(VSL#3-CM)对NF-κB途径的影响。使用NF-κB萤光素酶报告子测定法测试VSL#3-CM阻断TNF-α刺激的完整上皮细胞中的NF-κB转录活性的能力。

采用Promega Dual Luciferase Reporter 1000 Assay System(Promega，Madison，WI)进行NF-κB萤光素酶测定法，并用TransIT LT-1转染试剂(Mirus，Madison，WI)按照生产商的说明书来转染质粒。简言之，将2μgNF-κB应答元件驱动的萤火虫萤光素酶报告子质粒(Clontech，Palo Alto，CA)和0.2μg胸苷激酶(TK)启动子驱动的Renilla报告子质粒(Promega，Madison WI)与LT-1多胺转染试剂混合。形成复合物后，在33℃将该溶液加到YAMC细胞中并温育过夜。然后在37℃将细胞放到无IFN-γ的培养基中。除非另有说明，让细胞在非允许(非转化)条件下生长，然后以1∶10的稀释率将VSL#3条件培养基(VSL#3-CM)加到各孔中并放置过夜。在次日早晨添加50ng/ml的鼠TNF-α，并在6小时之后收获细胞。根据生产商的说明书进行NF-κB萤光素酶测定，并在Berthold Luminometer(Oakridge，TN)中测定发光。与TK-Renilla进行的共转染作为内部对照，所述TK-Renilla显示出组成型低水平活性，相对于所述内部对照使NF-κB萤光素酶数据标准化。实验按3个重复进行。

用报告基因瞬时转染的年轻的成年小鼠的结肠细胞表达出低水平的基线NF-κB活性，该活性在用TNF-α刺激后增加，这正如萤光素酶活性的增加(图1和图14)所反映的那样。与仅用TNF-α处理相比，VSL#3-CM预处理16小时导致上皮细胞中TNF-α诱导的NF-κB活性减弱了45％(图14，VSL#3-CM处理的细胞的1.80+/-0.41相对于仅用TNF-α处理的细胞的3.25+/-0.41，p＜0.05)。这一效果对VSL#3-CM具有特异性，因为用来自大肠杆菌DH5α菌株的条件培养基对上皮细胞进行的预处理不减弱TNF-α诱导的NF-κB激活(图1，图柱4；图14，图柱5)。虽然不期望受到任何解释VSL#3条件培养基影响TNF-α诱导的NF-κB激活机制研究的理论推断的束缚，但是电泳迁移率变动分析和ELISA分析均没有显示出VSL#3-CM对细胞核NF-κB(p65亚基)的结合的显著影响。

实施例3

益生菌条件培养基抑制MCP-1释放

益生菌降低了单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)在响应由TNF-α对NF-κB所进行的刺激中的释放。MCP-1是内源性免疫应答基因，该基因已经牵涉到许多炎性疾病(例如多发性硬化、类风湿性关节炎和IBD)的致病机理。如同IL-8，研究已表明MCP-1在克罗恩病的活性炎症区域中高度表达，而且它的表达依赖于NF-κB激活。

培养YAMC细胞，并用VSL#3-CM对该细胞进行处理，然后如本文所述，用TNF-α处理来刺激NF-κB激活。收获上清液，并用小鼠MCP-1ELISA试剂盒(Pierce Endogen，Rockford，IL)根据生产商的说明书测定MCP-1的生成量，以测量MCP-1从所述细胞的释放。用VSL#3-CM处理肠上皮细胞，减弱了MCP-1在响应由TNF-α对NF-κB所进行的刺激中的释放(图15，图柱4)。注意到VSL#3-CM单独处理的细胞与未处理对照细胞相比没有显著差异(比较图15的图柱1和3)。

与实施例2的结果一致的是，VSL#3-CM抑制MCP-1释放的证明，明确了可来自VSL#3-CM的分离的抗炎化合物在诸如IBD(如克罗恩病、溃疡性结肠炎)等炎性病症的预防和/或治疗中的作用。

实施例4

益生菌抑制肠上皮细胞中的NF-κB抑制剂IκB的降解

为了测定NF-κB激活途径中的哪个步骤是VSL#3-CM发挥其作用的步骤，研究了NF-κB抑制性分子IκBα的调节。检查了VSL#3-CM对用TNF-α处理的YAMC细胞中的总IκBα和磷酸化IκBα蛋白的影响。用VSL#3-CM预处理抑制了TNF-α处理细胞中的磷酸化形式的IκBα的降解(图16，下方两组或排)。在没有VSL#3处理的情况中，TNF-α在5分钟内刺激了IκBα的磷酸化，接着在15分钟和30分钟时IκBα快速降解(图16，上方两组或排)。因此，NF-κB刺激IκBα的表达，关闭NF-κB的进一步激活(图16，见上方组或排第60分钟时的泳道)。相反，当在TNF-α刺激之前用VSL#3-CM处理肠上皮细胞时，磷酸化的IκBα得以稳定并抗降解超过2小时(图16，下方较低组或排)。此外，IκBα总量在TNF-α刺激的整个过程中从未下降，因此表明VSL#3-CM抑制了通常与肠(消化道)上皮细胞的TNF-α刺激有关的IκBα降解途径。如图16(泳道1)所示，虽然VSL#3-CM对IκB磷酸化水平具有一些基础的但还不确定的调节作用，但是如图2(图柱3)所示，在没有TNF-α的情况下，看到单独的VSL#3-CM没有对YAMC细胞分泌或释放MCP-1产生影响。

该结果与VSL#3-CM通过保护IκBα(即，通过抑制它的降解)来抑制NF-κB激活的观点一致，但是目前所得的数据还没有确定唯一而完整的VSL#3-CM对NF-κB激活的影响的机制。然而，本发明不依赖于任何特定的作用机制，而且所附权利要求的范围不应该被所述机制的任何理论上的考虑所限制。

实施例5

益生菌没有抑制肠上皮细胞中的泛素化

在VSL#3-CM处理的细胞中缺乏响应TNF-α的IκBα降解表明，益生菌-CM干扰了一个或多个下游激活事件，即IκBα的泛素化和/或蛋白酶体降解的步骤。据报道，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的非病原性菌株通过阻断泛素化而抑制IκBα的降解(Neish，2000)。鼠伤寒沙门氏菌的这些作用可能代表胃肠菌群能够调节免疫系统并因此能够与真核宿主共生的方法。为了测试在VSL#3-CM所致的NF-κB抑制中是否涉及到相似的机制，使用抗泛素抗体对来自VSL#3-CM处理的肠上皮细胞的总细胞蛋白进行免疫印迹分析(图3)。与基于非病原性鼠伤寒沙门氏菌抑制上皮泛素连接酶的能力而所可能预期的相反，相对于未处理细胞，用VSL#3-CM处理上皮细胞并没有导致泛素化蛋白的减少。事实上，VSL#3-CM处理实际上造成了某些泛素化蛋白的累积。

可能发生这种情况的一个机制是通过蛋白酶体功能的抑制，所述抑制导致未降解的泛素化蛋白的累积(Voges，1999)。尽管没有象蛋白酶体抑制剂MG132的效果那样剧烈，但是泛素化蛋白因VSL#3-CM处理而增加的量和模式与热胁迫所见到的相似。

实施例6

益生菌抑制肠上皮细胞中的蛋白酶体活性

通过抑制IκBα降解而阻断NF-κB激活的蛋白酶体抑制剂已有描述(Gao，2000)。由于益生菌处理同时引起NF-κB活性的减弱和IκBα降解的抑制，因此研究了VSL#3-CM对蛋白酶体活性(如通过SLLVY-AMC底物的切割所检测)的影响(图17)。

使用20S蛋白酶体分析试剂盒(Calbiochem，San Diego，CA)测定来自细胞裂解物的蛋白酶体活性。简言之，将包含20μg蛋白的冰冷细胞裂解物加到以0.03％(重量/体积)SDS活化的蛋白酶体分析反应缓冲液(25mMHEPES，0.5mM EDTA，pH7.6)中。使样品达到室温，然后置于石英杯中，并加入10μM的底物suc-leu-leu-val-tyr-AMC(SLLVY-AMC)、Bz-val-gly-arg-AMC或Z-leu-leu-glu-AMC。SLLVY-AMC底物被蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性所切割，Bz-val-gly-arg-AMC底物被蛋白酶体的胰蛋白酶样活性所切割，而Z-leu-leu-glu-AMC底物被蛋白酶体的PGPH或胱冬酶样活性所切割。通过测量来自蛋白酶体底物的肽部分的AMC(7-氨基-4-甲基香豆素)的切割而产生的荧光信号来测定蛋白酶体活性。在HitachiF-2000萤光计(Hitachi，日本)中测量萤光(在380nm激发，在460nm发射)，在前10分钟每分钟测量一次，然后每15分钟测量一次。将用MG132(25μM)或乳胱素(10μM)处理的细胞作为抑制剂阳性对照。将用DMSO处理的未处理细胞作为MG132和乳胱素的载体对照。实验按3个重复进行。对于每个实验，所有时间点均按两个重复进行。

对来自用VSL#3-CM处理的细胞的提取物与来自未处理对照、用MG132(强蛋白酶体抑制剂)处理的细胞和DH5α(大肠杆菌)-CM进行蛋白酶体活性的比较。与未处理对照相比，用VSL#3-CM处理的上皮细胞显示出明显较低的蛋白酶体活性水平，而由VSL#3-CM所致的抑制几乎与由合成的蛋白酶体抑制剂MG132所见到的抑制一样显著。这一效果具有VSL#3特异性，因为DH5α-CM(大肠杆菌)对蛋白酶体功能并没有产生任何的抑制作用。

相对于响应已知的蛋白酶体抑制剂MG132的泛素化蛋白累积，VSL#3-CM处理所致的泛素化蛋白累积较低，这与VSL#3-CM毒性低于MG132的发现是一致的。因此预计与那些已知的蛋白酶体抑制剂(如MG132)相比，可来自VSL#3-CM的分离的抗炎化合物在治疗上更易接受。

a.蛋白酶体活性抑制的时程

为了测定VSL#3-CM能够引发上述蛋白酶体抑制的速度，进行VSL#3-CM处理的时程。对细胞处理30分钟、60分钟和6小时，然后收获并分析它们抑制蛋白酶体的CTL样活性的能力(图18)。发现最显著的蛋白酶体抑制发生在益生菌处理之后的早期，在前30分钟内产生的抑制超过50％，这与其它蛋白酶体抑制剂所报道的一致。这表明VSL#3-CM所致的蛋白酶体抑制是早期事件，几乎在上皮细胞与益生菌条件培养基接触之后立即发生。考虑到VSL#3-CM的毒性相对缺乏，这一发现表明可来自VSL#3-CM的分离的抗炎化合物对炎性病症(例如IBD)会是安全而作用快的(即有效的)预防剂/或治疗剂。

实施例7

益生菌对蛋白酶体活性显示出差异抑制

VSL#3-CM除了如本文所述影响蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性之外，还具有抗蛋白酶体的caspas样蛋白水解功能的稍微弱的抑制活性，但对胰蛋白酶样活性没有抑制作用。

以VSL#3条件培养基对YAMC细胞处理16小时，然后收获用于蛋白酶体分析。使用测量胰蛋白酶样的蛋白酶活性的荧光底物Bz-Val-Gly-Arg-AMC(图13A)，或者使用被蛋白酶体的PGPH或者胱冬酶样活性所切割的底物Z-Leu-Leu-Glu-AMC(图13B)，在细胞裂解物中测定蛋白酶体活性。作为抑制剂阳性对照，使用浓度为10μM的乳胱素。乳胱素抑制蛋白酶体的胰蛋白酶样活性和胰凝乳蛋白酶样活性，但它只是蛋白酶体的胱冬酶样活性的弱抑制剂。

该结果表明，VSL#3条件培养基对消化道上皮蛋白酶体的胰蛋白酶样活性没有抑制作用(图13A)，并对消化道上皮蛋白酶体的胱冬酶样活性只具有弱的抑制作用，该抑制作用约相当于10μM的乳胱素(图13B)。这表明VSL#3-CM不是普遍抑制蛋白酶体的所有蛋白水解功能，而是对某些功能显示出一定的特异性或亲和性。

上皮细胞对VSL#3-CM处理具有良好的耐受性，这与大多数的合成蛋白酶体抑制剂的情形不一样。VSL#3-CM的低毒性可能是由于它的差异亲和性的缘故，所述差异亲和性很可能允许在某些蛋白(例如IκB)的降解被阻断的时候让蛋白酶体继续发挥一些正常的作用。尽管不期望受到某些理论的束缚，但是这可以部分地解释了为什么在VSL#3处理的细胞中的累积泛素化蛋白的模式与由更强更毒的合成抑制剂(例如MG132)所观察到的模式不同。

实施例8

益生菌诱导肠上皮细胞中的热激蛋白

已表明消化道中的肠菌群(结肠的腔细菌)影响上皮热激蛋白的表达(Kojima；2003；Beck，1995)。蛋白酶体抑制剂是热激蛋白表达的强诱导物，所述诱导是通过热激转录因子HSF-1的激活进行的(Pirkkala，2000)。因此，为确定热激蛋白的表达是否与蛋白酶体的抑制同时发生的而进行了实验。

将YAMC细胞与益生菌VSL#3共培养以测试其诱导热激蛋白表达的能力。通过免疫印迹分析显示，VSL#3于6小时到12小时开始诱导YAMC细胞中Hsp25和Hsp72的表达(图19，A组)。组成型表达的热激蛋白Hsc73(用作上样对照)的表达并没有受到VSL#3的影响。置于培养物中48小时的未处理细胞并没有显示出Hsp应答，表明所述效果对益生菌处理具有特异性，并对培养物中生长的细胞不具有时间依赖特性。

进一步，如本文所述，用VSL#3-CM处理YAMC细胞(时间从15分钟到6小时)或者热激YAMC细胞。在裂解缓冲液(25％体积比的甘油、420mMNaCl、1.5mM MgCl₂、0.2mM EDTA、0.5mM DTT和20mM HEPES，pH7.4，含有完全蛋白酶抑制剂的混合液)中制备全细胞提取物，所述制备通过在干冰/醇浴中冷冻一次，在冰上解冻，用移液管头进行温和吸打，并以50,000×g于4℃离心5分钟。将含有10微克蛋白的细胞提取物与³²P标记的HSE寡核苷酸(含有4个串连的反向重复的热激元件(nGAAn)：CTAGAAGCTTCTAGAA GCTTCTAG(SEQ ID NO：1))和在结合反应缓冲液(终浓度，20mM Tris，pH7.4，100mM NaCl，1mM EDTA，10％体积比的甘油)中的0.5μg聚(dI-dC)混合。在25℃温育25分钟进行结合反应，然后在0.5×TBE缓冲液中进行电泳的4％非变性聚丙烯酰胺凝胶上分析。让凝胶变干并进行自动放射成像以检测DNA-蛋白质复合物。对于超变动实验，将YAMC细胞与VSL#3-CM在收获前温育6小时，并在HSE结合反应之前将1μg的抗HSF-1的特异抗体(SPA-950，Stressgen，Victoria，BC，加拿大)或抗HSF-2的特异抗体(sc-8062X，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)与细胞提取物于25℃预温育30分钟。在所述预温育后，根据以上所述进行结合反应和分析。

为了确定由VSL#3细菌产生的效果是否需要活细菌和直接物理接触(例如象III型分泌机制所必需的)或者是分泌产物，将VSL#3作为经过滤除菌的条件培养基或超声处理的细菌沉淀以浓度依赖方式加到YAMC细胞中(图19，B组)。虽然活的革兰氏阴性细菌和脂多糖(LPS，发现只存在于革兰氏阴性细菌中的细胞壁成分)可以诱导上皮细胞中Hsp的表达(Kojima，2003)，但是包含VSL#3的细菌全都是革兰氏阳性生物体，因此它们全都不包含LPS。因此辨别这些革兰氏阳性生物体的任何细胞壁成分是否具有Hsp诱导潜能是令人感兴趣的。由VSL#3所致的Hsp诱导可以用单独的条件培养基(“CM”)以剂量-应答方式引发，表明直接接触或活细菌都不是引发所述应答所必须的。超声处理的生物体(“沉淀”)不能够诱导热激应答，表明诱导因子是分泌产物，而不是细胞壁成分。

对其它两个细胞系进行的测定揭示，益生菌-CM诱导Hsp72表达的能力对上皮细胞具有特异性(图19，C组)。MSIE是鼠小肠上皮细胞系；这些细胞以与YAMC细胞相似的方式响应。相反，虽然3T3成纤维细胞能够对热胁迫显示出热激应答，但是它们不响应VSL#3-CM处理，表明VSL#3-CM的作用对上皮细胞类型具有特异性。使用大肠杆菌DH5α-CM在所有这些细胞系中进行诱导热激蛋白表达的尝试都没有成功。

除此之外，已确定益生菌化合物通过顶端(腔)膜特异性过程来诱导肠上皮热激蛋白(见图6)。当使YAMC肠上皮细胞生长在渗透性支持物上时，它们形成紧密连接并显示出高度的极性。与来自腔侧的条件培养基接触的细胞显示出强的Hsp25和Hsp72蛋白表达。底端外侧添加不能刺激反应。当同时加到顶端侧和底端外侧时，VSL#3-CM具有与只将其加到顶端侧时所见到的相似效果。这些数据表明存在益生菌衍生的生物活性因子或生物活性剂的特异性受体或者进入通路。

然后采用蛋白酶体抑制剂MG132来测定在上皮细胞中的蛋白酶体抑制之后Hsp诱导的时程是否会与因VSL#3-CM处理所致的诱导相仿。MG132处理导致比热激更显著的极强的Hsp25和Hsp72的诱导(图7)。图7与图19A的时程比较显示，通过7小时到14小时出现的信号与用VSL#3-CM所见到的信号更紧密相仿(与热胁迫通常观察到的信号相比，热胁迫在这一细胞系中通过两小时诱导Hsp表达(Kojima，2003))。预期通过蛋白酶体抑制机制作用的VSL#3-CM会显示出与已知的蛋白酶体抑制剂(例如MG132)相当的时程，而不是与仅仅是物理胁迫(例如热激)相当的时程。

即使在24小时的处理之后，VSL#3-CM与未处理对照细胞相比也没有引起存活力的任何变化，与此不同的是，延长YAMC细胞与MG132的接触会导致细胞死亡的显著增加，表明MG132比VSL#3-CM具有更显著的毒性(图8)。

a.热激蛋白表达诱导的时程

益生菌诱导肠上皮细胞中的热激蛋白。已显示消化道中的肠菌群(结肠的腔细菌)影响上皮热激蛋白的表达。蛋白酶体抑制剂是热激蛋白表达的强诱导物，所述诱导通过激活热激转录因子HSF-1进行。基于这些观察，通过测定是否发生热激蛋白表达的诱导来寻求证实以上发现。将YAMC细胞与益生菌VSL#3共培养以测试它诱导热激蛋白表达的能力。通过免疫印迹分析显示，VSL#3在于6小时到12小时开始诱导YAMC细胞中Hsp25和Hsp72的表达(图5，A组)。组成型表达的热激蛋白Hsc73(用作上样对照)的表达并没有受到VSL#3的影响。置于培养物中48小时的未处理细胞并没有显示出Hsp应答，表明所述效果对益生菌处理具有特异性，并对培养物中生长的细胞不具有时间依赖特性。

为了确定由VSL#3细菌产生的效果是否需要活细菌和直接物理接触(例如象III型分泌机制所必需的)或者是分泌的细菌产物，将VSL#3作为经过滤除菌的条件培养基或超声处理的细菌沉淀以浓度依赖方式加到YAMC细胞中(图5，B组)。虽然活的革兰氏阴性细菌和脂多糖(LPS，发现只存在于革兰氏阴性细菌中的细胞壁成分)可以诱导上皮细胞中Hsp的表达，但是包含VSL#3的细菌全都是革兰氏阳性生物体，因而缺乏LPS。因此辨别这些革兰氏阳性生物体的任何细胞壁成分是否具有Hsp诱导潜能是令人感兴趣的。由VSL#3所致的Hsp诱导可以用单独的条件培养基(“CM”)以剂量-应答方式引发，表明直接接触或活细菌的存在都不是引发所述应答所必须的。超声处理的生物体(“沉淀”)不能够诱导热激应答，因而预测诱导因子是分泌产物而不是细胞壁成分。对其它两个细胞系进行的测定揭示，益生菌-CM诱导Hsp72表达的能力对上皮细胞具有特异性(图5，C组)。MSIE是鼠小肠上皮细胞系；这些细胞以与YAMC细胞相似的方式响应。相反，虽然3T3成纤维细胞能够对热胁迫显示出热激应答，但是它们不响应VSL#3-CM处理。因此，预测VSL#3-CM的作用对上皮细胞类型具有特异性。使用大肠杆菌DH5α-CM在所有这些细胞系中进行诱导热激蛋白表达的尝试都没有成功。

所述数据证实，可来自VSL#3-CM的化合物除了显示出抗炎功能之外，还通过诱导热激蛋白的表达而显示出细胞保护功能。因此，本发明考虑到了可来自VSL#3-CM的分离的细胞保护性抗炎化合物、包含该化合物的诸如药物组合物等相关组合物和试剂盒、以及制备所述化合物的方法和使用所述化合物来预防或治疗诸如IBD等炎性病症或者减轻所述病症的症状的方法。

b.Hsp表达的诱导由HSF-1激活所介导

进行电泳迁移率变动分析以测定由VSL#3-CM所致的Hsp表达的诱导是否在本质上是转录性的。由图20可以看出，VSL#3-CM诱导热激转录因子HSF的结合，在接触后大约4小时或者5小时达到最大结合信号，然后在6小时之后逐渐减弱(A组)。使用抗转录因子HSF-1和HSF-2的抗体证实了所述结合的特异性(B组)，这表明参与由VSL#3-CM所致的Hsp诱导的主要转录因子是HSF-1；HSF-2似乎不发挥作用。由蛋白酶体抑制剂MG132所致的Hsp诱导的时程类似于由益生菌所产生的时程，但是MG132毒性更大。由于蛋白酶体时程数据表明VSL#3-CM与其它蛋白酶体抑制剂(例如MG132)一样作用迅速(见图18)，因此我们使用MG132来测定在上皮细胞中蛋白酶体抑制之后的Hsp诱导时程是否与由VSL#3-CM处理所观察到的相同动力学相仿。MG132处理导致极强的Hsp25和Hsp72诱导，并且该诱导比热胁迫所导致的诱导更强(图7)。图7与图19A的时程比较显示，通过7小时到14小时出现的信号与用VSL#3-CM所见到的信号更紧密相仿(与热胁迫通常观察到的信号相比，热胁迫在这一细胞系中通过两小时诱导Hsp表达)。如果VSL#3-CM通过蛋白酶体抑制机制发挥作用，它将会显示出与已知的蛋白酶体抑制剂(例如MG132)较多相似且与仅仅是物理胁迫(例如热激)较少相似的时程。即使在24小时的处理之后，VSL#3-CM与未处理对照细胞相比也没有引起存活力的任何变化，与此不同的是，延长YAMC细胞与MG132的接触会导致细胞死亡的显著增加，表明MG132比VSL#3-CM具有更显著的毒性。

实施例9

益生菌保护肠上皮细胞对抗氧化剂胁迫

为了测定VSL#3-CM是否防止消化道上皮细胞受到损伤，使用了氧化剂一氯胺(NH₂Cl)。一氯胺是病理生理学有关的氧化剂，该氧化剂在从发炎组织内固有的免疫细胞中释放的次氯酸与体内的氨反应时大量产生。一氯胺一旦形成，就会导致紧密连接屏障功能的损失、线粒体损伤、细胞骨架破坏、膜转运功能受损以及最终的细胞死亡。以VSL#3-CM过夜处理细胞，并在与一氯胺接触之后采用⁵¹Cr释放法评价细胞存活力(图21，A组)。

让YAMC细胞生长在24孔板中，并保持未处理(对照)或以VSL#3-CM过夜处理。用⁵¹Cr(50μCi/ml；Sigma Chemical Co.；在24孔板形式中250μl/孔或者12.5μCi/孔)装载细胞60分钟，洗涤并在培养基中与0.6mM氧化剂一氯胺温育以诱导细胞损伤。在60分钟之后收获培养基，并用1N HNO₃对留在细胞中的⁵¹Cr进行4小时的提取。通过液体闪烁光谱法对释放的⁵¹Cr和细胞组分中的⁵¹Cr进行计数。采用释放量除以(释放量与细胞残留量之和)来计算释放的⁵¹Cr。

在NH₂Cl为0.6mM时，VSL#3-CM预处理导致轻度但具有统计显著性的保护效果，在面临氧化剂损伤时，与仅以一氯胺处理的对照细胞相比，降低了NH₂Cl刺激的⁵¹Cr释放并提高了上皮细胞存活力大约三分之一(P＜0.05)。

作为另外一种功能性读出信息，采用F/G肌动蛋白分析测定了VSL#3-CM处理保护上皮细胞对抗氧化剂胁迫导致的细胞骨架损伤的能力。丝状肌动蛋白(F-肌动蛋白)执行重要的功能，该功能涉及细胞支架和形状的维持以及作为众多内在膜蛋白的锚定点。然而，肌动蛋白细胞骨架特别容易受到损伤，这种损伤可能会对细胞造成危害。一氯胺接触会引起丝状肌动蛋白的迅速解离。因此，我们测定了VSL#3-CM处理是否会在面临氧化剂胁迫时保护细胞骨架丝状肌动蛋白的完整性。

F/G肌动蛋白分析通过以下方法进行：首先在不含IFN-γ的培养基中将汇合YAMC细胞单层转移到37℃，然后用VSL#3-CM过夜处理。在评价之前，用鬼笔环肽(30μg/ml，2小时；Molecular probes，Eugene，OR)、细胞松弛素D(10μg/ml，15分钟)或氧化剂一氯胺(0.6mM，30分钟)处理细胞。在PBS中漂洗细胞，收获并离心(14,000×g，20秒，室温)，将沉淀重新悬浮在200μl的30℃的裂解缓冲液(1mM ATP，50mM PIPES，pH6.9，50mM NaCl，5mM MgCl₂，5mM EGTA，5％体积比的甘油，0.1％体积比的Nonidet P-40，Tween20和Triton X-100，含有完全蛋白酶抑制剂的混合液)中。通过上下温和吸打10次而使细胞均质化，并在30℃温育10分钟。在30℃以100,000×g将样品离心60分钟，取出上清液用于G肌动蛋白含量测定。将含有F-肌动蛋白的沉淀重新悬浮在200μl的4℃的含有1μM细胞松弛素D的蒸馏水中，并在冰上放置60分钟。然后，取出20μl各提取物，加入6μl的3×Laemmli终止液溶液，并将该样品加热至65℃(10分钟)。采用12.5％SDS-PAGE解析该样品，并立刻转移到PVDF膜上。转移后，使用多克隆的抗肌动蛋白抗血清通过Western印迹(Cytoskeleton，Denver，CO)进行肌动蛋白分析。由于F-肌动蛋白组分已经被解聚，在Western印迹上只观察到45kDa的单体形式。

仅用一氯胺处理(0.6mM)造成F-肌动蛋白丝的破坏，显示为F-肌动蛋白的减少和G-肌动蛋白的增加(图21，B组)。VSL#3-CM本身几乎不影响F/G肌动蛋白的分布。然而，在接触NH₂Cl之前以VSL#3-CM预处理的YAMC细胞显示，F/G肌动蛋白分布变化明显较小，再次表明所述益生菌提供一些抗氧化剂损伤的保护。作为阳性和阴性对照，采用鬼笔环肽(结合并稳定F-肌动蛋白丝的钝端，从而增加了F-肌动蛋白的量)和细胞松弛素D(F-肌动蛋白破坏剂，大幅增加球状(G)肌动蛋白的量)，(B组)。

在本实施例所公开的实验结果与VSL#3-CM相对于已知蛋白酶体抑制剂(例如MG132)显示毒性低是一致的，而且与本文所公开的在确定可来自VSL#3-CM的至少一种化合物的细胞保护作用中VSL#3-CM诱导上皮细胞中至少一种热激蛋白的表达也是一致的。

实施例10

具有生物活性的益生菌剂的性质

如图9所示，在VSL#3-CM中发现的或者来自于VSL#3-CM的主要生物活性似乎在于低于10kDa的组分中。通过具有特定分子量截留值的Centricon过滤器制备组分。

VSL#3-CM生物活性的另一种性质是它的pH敏感性(图10)。在加到YAMC细胞的顶端侧(引起1∶10的稀释)之前的条件培养基的pH是关键的。这最终影响了温育培养基的最终pH，将最终pH降低到6.5～7.0。因此，该数据表明任何活性益生菌蛋白因子在酸性微环境中更具有活性，所述酸性微环境存在于肠上皮细胞的腔膜上未搅动的水层中，其中pH范围为6.5～7.0。

此外，使用本领域已知的标准程序通过将VSL#3-CM与胃蛋白酶接触而对VSL#3-CM中的生物活性剂进行蛋白酶分析。结果显示胃蛋白并没有影响VSL#3-CM的生物活性，表明所述生物活性剂不是容易受到胃蛋白酶消化的肽或蛋白。预期所述生物活性剂为非蛋白化合物，例如有机酸等非极性化合物；当然，所述生物活性剂也可能是肽，例如难以被胃蛋白酶消化或者在与胃蛋白酶接触之后保留有活性肽片段等相对较小的肽。

VSL#3中的蛋白酶体抑制剂可能是小的有机分子。自然界中发现的一些蛋白酶体抑制剂是小分子量的有机酯或有机酸衍生物，例如绿茶中的那些物质。对VSL#3-CM进行醚萃取来测定生物活性因子是否可以被浓缩以产生更一致且更强烈的应答。如图11所示，使用NF-κB ELISA分析(活性基元)测定醚萃取化合物(EEC)和MG132对NF-κB活性的作用。仅以TNF-α刺激(30ng/ml)引起NF-κB激活的显著增强(左边第2图柱)。MG132和EEC均显著抑制TNF-α刺激的NF-κB活性(左边第3和第4图柱)。相反，与醚组分分离之后的残留水性相不具有活性(最右边图柱)。

为了测定EEC是否直接抑制蛋白酶体的功能，在来自VSL#3和大肠杆菌(DH5α)的EEC存在或不存在的情况下，测试了由市购蛋白酶体分析物(Calbiochem)提供的20S蛋白酶体成分(barrel)的体外活性。如图12所示，蛋白酶体的功能没有受到来自DH5α的EEC的影响(比较斜率)。相反，MG132和来自VSL#3的EEC显著抑制蛋白酶体的体外活性。这些数据支持了这样的预测：VSL#3 EEC通过特定的顶端膜过程进入到完整细胞中，随后直接作用于细胞蛋白酶体功能。

根据本公开内容，无需过多的实验也可以制备和实施本文所公开和要求保护的所有组合物和方法。尽管已经通过优选实施方式对本发明的组合物和方法进行了描述，但是在没有脱离本发明的概念、精神和范围的情况下，本领域技术人员显然可以改变本文所述的组合物和方法以及所述方法的步骤或所述方法的步骤顺序。更具体地，化学上和生理学上均相关的某些试剂显然可以取代本文所描述的的试剂，并获得相同或相似结果。对本领域技术人员来说显而易见的所有这些相似替代和修改被认为是处于所附权利要求所定义的本发明的精神、范围和概念之内。

                     序列表

<110>尢金·B·昌和伊莱恩·O·彼得罗夫

<120>来自益生菌生物体的细胞保护性抗炎因子

<130>FCI06US2168

<160>1

<170>PatentIn version3.3

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>1

ctagaagctt ctagaagctt  ctag

Claims (48)

1.一种组合物，该组合物包含分离的细胞保护性抗炎化合物。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述化合物存在于益生菌条件培养基的醚萃取组分中。

3.如权利要求2所述的组合物，其中所述化合物是有机酸。

4.如权利要求1所述的组合物，其中所述化合物诱导至少一种热激蛋白的表达。

5.如权利要求4所述的组合物，其中所述热激蛋白选自Hsp25和Hsp72。

6.如权利要求1所述的组合物，其中所述化合物是NF-κB激活的抑制剂。

7.如权利要求6所述的组合物，其中所述化合物通过使IκB稳定而抑制NF-κB激活。

8.如权利要求1所述的组合物，其中所述化合物是蛋白酶体抑制剂。

9.如权利要求8所述的组合物，其中所述蛋白酶体抑制剂选择性地抑制蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性。

10.如权利要求8所述的组合物，其中所述蛋白酶体抑制剂选择性地抑制上皮细胞中的蛋白酶体。

11.如权利要求10所述的组合物，其中所述上皮细胞是肠上皮细胞。

12.如权利要求1所述的组合物，其中所述益生菌条件培养基是VSL#3条件培养基。

13.一种治疗炎性病症患者的方法，该方法包括对所述患者施用有效量的分离的细胞保护性抗炎化合物，该化合物来自益生菌条件培养基。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述益生菌条件培养基是VSL#3条件培养基。

15.如权利要求13所述的方法，其中所述炎性病症是炎性肠病。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述炎性肠病是克罗恩病。

17.如权利要求15所述的方法，其中所述炎性肠病是溃疡性结肠炎。

18.如权利要求13所述的方法，其中所述化合物来自所述培养基的醚萃取组分。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述化合物是有机酸。

20.如权利要求13所述的方法，其中所述化合物诱导至少一种热激蛋白的表达。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述热激蛋白选自Hsp25和Hsp72。

22.如权利要求13所述的方法，其中所述化合物是NF-κB激活的抑制剂。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述NF-κB激活是通过使IκB稳定而被抑制的。

24.如权利要求13所述的方法，其中所述化合物是蛋白酶活性的抑制剂。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述抑制剂选择性地抑制上皮细胞中的蛋白酶体的蛋白酶活性。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述抑制剂选择性地抑制蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述上皮细胞是肠上皮细胞。

28.一种药物组合物，该药物组合物包含分离的细胞保护性抗炎化合物和至少一种药用赋形剂，所述细胞保护性抗炎化合物来自益生菌条件培养基。

29.如权利要求28所述的药物组合物，其中所述化合物来自所述培养基的醚萃取组分。

30.如权利要求29所述的药物组合物，其中所述化合物是有机酸。

31.如权利要求28所述的药物组合物，其中所述化合物诱导至少一种热激蛋白的表达。

32.如权利要求31所述的药物组合物，其中所述热激蛋白选自Hsp25和Hsp72。

33.如权利要求28所述的药物组合物，其中所述化合物是NF-κB激活的抑制剂。

34.如权利要求33所述的药物组合物，其中所述化合物通过使IκB稳定而抑制NF-κB激活。

35.如权利要求28所述的药物组合物，其中所述化合物是蛋白酶体抑制剂。

36.如权利要求35所述的药物组合物，其中所述蛋白酶体抑制剂选择性地抑制上皮细胞中的蛋白酶体的蛋白酶活性。

37.如权利要求35所述的药物组合物，其中所述蛋白酶体抑制剂选择性地抑制蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性。

38.如权利要求37所述的药物组合物，其中所述上皮细胞是肠上皮细胞。

39.如权利要求28所述的药物组合物，其中所述益生菌条件培养基是VSL#3条件培养基。

40.一种制备分离的细胞保护性抗炎化合物的方法，该方法包括：

获得VSL#3条件培养基；和

从所述VSL#3条件培养基中分离细胞保护性抗炎化合物，借此制备分离的细胞保护性抗炎化合物。

41.一种筛选单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)释放的调节剂的方法，该方法包括：

(a)将候选调节剂、益生菌条件培养基和上皮细胞组合；

(b)测量由所述细胞释放的MCP-1；和

(c)比较在所述候选调节剂存在和不存在的情况下的MCP-1释放，其中所述MCP-1释放的差异鉴定出所述候选调节剂是MCP-1释放的调节剂。

42.如权利要求7所述的组合物，其中所述被稳定的IκB是磷酸化IκBα。

43.如权利要求13所述的方法，其中所述的细胞保护性抗炎化合物不改变与所述化合物接触的上皮细胞中易于泛素化的至少一种蛋白的泛素化水平。

44.一种预防炎性病症的方法，该方法包括施用有效量的分离的细胞保护性抗炎化合物，该细胞保护性抗炎化合物来自益生菌条件培养基。

45.一种筛选热激蛋白表达的调节剂的方法，该方法包括：

(a)将候选调节剂、益生菌条件培养基和上皮细胞组合；

(b)测量所述细胞中的热激蛋白表达；和

(c)比较在所述候选调节剂存在和不存在的情况下的所述热激蛋白表达，其中所述热激蛋白的表达差异鉴定出所述候选调节剂是热激蛋白表达的调节剂。

46.如权利要求45所述的方法，其中所述热激蛋白选自Hsp25和Hsp72。

47.如权利要求45所述的方法，其中所述调节剂改变热激蛋白转录因子-1(HSF-1)的活性。

48.一种用于治疗或预防炎性病症的试剂盒，该试剂盒包含权利要求28所述的药物组合物和用于施用所述组合物以治疗或预防所述病症的说明书。

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