CN109248168A - 齐墩果酸在制备抗幽门螺杆菌的药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明实施例公开了齐墩果酸在制备抗幽门螺杆菌的药物中的用途、齐墩果酸和丹皮酚的组合物在制备抗幽门螺杆菌的药物中的用途、齐墩果酸在制备幽门螺杆菌引发的疾病的治疗或预防药物中的用途、齐墩果酸和丹皮酚的组合物在制备幽门螺杆菌引发的疾病的治疗或预防药物中的用途、幽门螺杆菌感染的治疗或预防药物。本发明实施例具有如下优点：为抗幽门螺杆菌提供了一种新的药物，可用于治疗或预防幽门螺杆菌导致的疾病，具有良好的应用前景。

Description

齐墩果酸在制备抗幽门螺杆菌的药物中的用途
技术领域
本发明涉及药学技术领域，具体涉及齐墩果酸在制备抗幽门螺杆菌 的药物中的用途。
背景技术
幽门螺杆菌可以生存于消化道(例如，口腔、胃、肠道)，是最常 见的细菌病原体之一。幽门螺杆菌感染包括由幽门螺杆菌感染引起的胃 炎、消化道溃疡、淋巴增生性胃淋巴瘤等，甚至胃癌。
慢性胃炎和消化道溃疡患者的普遍症状为：食后上腹部饱胀、不适 或疼痛，常伴有其他不良症状，如嗳气、腹胀、反酸和食欲减退等。有 些患者还可出现反复发作性剧烈腹痛、上消化道少量出血等。严重者可 以发展至胃癌。据统计，初次感染幽门螺杆菌年龄较早的人群萎缩性胃 炎及胃癌发生率高，幽门螺杆菌感染与胃癌死亡率的高低呈现平行关系。
如何有效的治疗或预防幽门螺杆菌，对预防和控制胃癌具有重大意 义。
—旦感染幽门螺杆菌后，由于幽门螺杆菌的耐药性，服用抗生素治 疗也很难彻底消除，多数人会终身带菌，因此开发新型的抗幽门螺杆菌 的药物具有重要意义。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供齐墩果酸在制备抗幽门螺杆菌的药物 中的用途，用以为幽门螺杆菌感染提供新的可选择药物，以解决现有技 术中幽门螺杆菌难以彻底消除的问题。
为实现上述目的，本发明实施例第一方面提供了齐墩果酸在制备抗 幽门螺杆菌的药物中的用途。
在一种可能的实现方式中，齐墩果酸为所述抗幽门螺杆菌的药物的 有效成分之一或唯一有效成分。
本发明实施例第二方面提供了齐墩果酸和丹皮酚的组合物在制备抗 幽门螺杆菌的药物中的用途。
在一种可能的实现方式中，所述齐墩果酸和丹皮酚的组合物中齐墩 果酸和丹皮酚的重量比为1:99-99:1。
在一种可能的实现方式中，所述齐墩果酸和丹皮酚的组合物中齐墩 果酸和丹皮酚的重量比为50:50。
本发明实施例第三方面提供了齐墩果酸在制备幽门螺杆菌引发的疾 病的治疗或预防药物中的用途。
在一种可能的实现方式中，所述幽门螺杆菌引发的疾病包括幽门螺 杆菌引发的消化道疾病。
在一种可能的实现方式中，所述幽门螺杆菌引发的消化道疾病包括 幽门螺杆菌引发的胃病。
本发明实施例第四方面提供了齐墩果酸和丹皮酚的组合物在制备幽 门螺杆菌引发的疾病的治疗或预防药物中的用途。
本发明实施例第五方面提供了一种幽门螺杆菌感染的治疗或预防药 物，包括有效量的齐墩果酸。
本发明实施例第六方面提供了一种幽门螺杆菌感染的治疗或预防药 物，包括有效量的齐墩果酸和有效量的丹皮酚。
本发明实施例具有如下优点：为抗幽门螺杆菌提供了一种新的药 物，可用于治疗或预防幽门螺杆菌导致的疾病，具有良好的应用前景。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人 士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法 均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、 分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术 在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等， CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley& Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego， 1998；METHODSIN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin (P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999； 和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
齐墩果酸(oleanolic acid)，也可以称为齐墩果酸水合物、土当归酸、 石竹素、土当归酸水合物；其分子式为C30H48O3，分子结构式如下：
丹皮酚(Paeonol)也称芍药醇、牡丹酚，化学名为 2'-Hydroxy-4'-methoxyacetopheone，中文化学名为2'-羟基-4‘-甲氧基苯乙 酮，化学式为C9H10O3，分子结构式如下：
本发明的发明人经过大量实验探索实验发现，齐墩果酸单独使用或 者联合丹皮酚使用，能够非常显著抑制幽门螺杆菌增殖和杀灭幽门螺杆 菌，从而可以用于治疗幽门螺杆菌感染，特别是用于幽门螺杆菌感染导 致的消化道疾病(例如，胃病)，在此基础上完成了该发明。
实施例1
在本实施例中进行齐墩果酸的体外抑菌实验和齐墩果酸联合丹皮酚 的体外抑菌实验。
将齐墩果酸称量于1.5ml离心管中，使用二甲基亚砜(DMSO)溶解 至2mg/ml，使用滤膜过滤除菌，得到齐墩果酸母液。
将齐墩果酸和丹皮酚按照重量比1:1混合，得到第一联合物。将第一 联合物称量于1.5ml离心管中，二甲基亚砜(DMSO)溶解至2mg/ml，使 用滤膜过滤除菌，得到第一联合物母液。
将齐墩果酸和丹皮酚按照重量比3:1混合，得到第二联合物。将第一 联合物称量于1.5ml离心管中，二甲基亚砜(DMSO)溶解至2mg/ml，使 用滤膜过滤除菌，得到第二联合物母液。
将齐墩果酸和丹皮酚按照重量比1:3混合，得到第三联合物。将第三 联合物称量于1.5ml离心管中，二甲基亚砜(DMSO)溶解至2mg/ml，使 用滤膜过滤除菌，得到第三联合物母液。
在96-微孔板上使用二甲基亚砜(DMSO)对齐墩果酸母液、化合物 联合母液分别进行2倍的梯度稀释，依次得到20、1、0.5、0.25、0.125、 0.0625、0.03125、0.0156mg/ml的工作液。
在50ml离心管中加入100微升上述工作液(一个离心管加一种工作 液)，然后加入25ml尚未凝结的50-55℃的MHA(Mueller Hinton Agar)加 血培养基，快速混匀后立即倒制平板，制得含齐墩果酸8μg/ml的平板、 含齐墩果酸4μg/ml的平板、含齐墩果酸2μg/ml的平板、含齐墩果酸1μg/ml 的平板、含齐墩果酸0.5μg/ml的平板、含齐墩果酸0.25μg/ml的平板、含齐 墩果酸0.125μg/ml的平板、含齐墩果酸0.0625μg/ml的平板，含第一联合物 8μg/ml的平板、含第一联合物4μg/ml的平板、含第一联合物2μg/ml的平板、 含第一联合物1μg/ml的平板、含第一联合物0.5μg/ml的平板、含第一联合 物0.25μg/ml的平板、含第一联合物0.125μg/ml的平板、含第一联合物 0.0625μg/ml的平板，含第二联合物8μg/ml的平板、含第二联合物4μg/ml 的平板、含第二联合物2μg/ml的平板、含第二联合物1μg/ml的平板、含第二联合物0.5μg/ml的平板、含第二联合物0.25μg/ml的平板、含第二联合物 0.125μg/ml的平板、含第二联合物0.0625μg/ml的平板，含第三联合物 8μg/ml的平板、含第三联合物4μg/ml的平板、含第三联合物2μg/ml的平板、 含第三联合物1μg/ml的平板、含第三联合物0.5μg/ml的平板、含第三联合 物0.25μg/ml的平板、含第三联合物0.125μg/ml的平板、含第三联合物 0.0625μg/ml的平板。
同时倒制1-3块仅含溶剂(二甲基亚砜)的MHA血平板。
下文为叙述方便，将上述含有齐墩果酸的平板、含有联合物的平板 以及仅含溶剂(二甲基亚砜)的MHA血平板统称为测试平板。
将-80℃冻存管内的幽门螺杆菌标准菌株(共使用了三种标准菌株， 分别为ATCC43504、ATCC700392、ATCC700824)涂布于MHA血平板(此 处倒制的MHA血平板并非上文的测试平板，而是常规使用的MHA血平 板)。将涂布有幽门螺杆菌标准菌株的MHA血平板置于封闭培养盒中，并 放置配套的微耗氧吸氧包使其产生稳定的微耗氧环境，将培养盒放于35 ±2℃的温度下培养5天。
5天后，收集MHA血平板上的细菌，并悬浮于pH缓冲的生理盐水中， 浊度调至0.45-0.6，此时，菌液含1.0×107-1.0×108CFU/ml。
取3微升制备好的菌液点于上述制备的测试平板上，由低浓度(或不 含化合物的平板)开始点至高浓度。此处的化合物是指上述联合物或齐 墩果酸。
待液滴微微风干后，将测试平板倒置于微耗氧培养盒中，放入配套 吸氧包，于35±2℃的温度下培养72小时。
需要说明的是，实验可以采用阿莫西林或克拉霉素作为阳性对照。
72小时后，读取最小抑菌浓度(MIC)，MIC为完全抑制幽门螺杆菌 在平板上生长的最低化合物浓度。如果MIC小于或等于制备的最低化合 物浓度(0.0625μg/ml)，则该菌株必须在不含药物的平板上显示生长，否 则对于该菌种的测试判断为失败，MIC结果不予采用，需重复试验。
在本实施例中，各测试平板上都有菌生长，没有读取到MIC。
实施例2
在本实施例中再次进行齐墩果酸的体外抑菌实验和齐墩果酸联合丹 皮酚的体外抑菌实验。
将齐墩果酸称量于1.5ml离心管中，使用二甲基亚砜(DMSO)溶解 至2mg/ml，使用滤膜过滤除菌，得到齐墩果酸母液。
将齐墩果酸和丹皮酚按照重量比1:1混合，得到第一联合物。将第一 联合物称量于1.5ml离心管中，二甲基亚砜(DMSO)溶解至400mg/ml， 使用滤膜过滤除菌，得到第一联合物母液。
将齐墩果酸和丹皮酚按照重量比3:1混合，得到第二联合物。将第一 联合物称量于1.5ml离心管中，二甲基亚砜(DMSO)溶解至400mg/ml， 使用滤膜过滤除菌，得到第二联合物母液。
将齐墩果酸和丹皮酚按照重量比1:3混合，得到第三联合物。将第三 联合物称量于1.5ml离心管中，二甲基亚砜(DMSO)溶解至400mg/ml， 使用滤膜过滤除菌，得到第三联合物母液。
在96-微孔板上使用二甲基亚砜(DMSO)对齐墩果酸母液、化合物 联合母液分别进行2倍的梯度稀释，依次得到400、200、100、50、25、 12.5、6.25、3.15mg/ml的工作液。
在50ml离心管中加入100微升上述工作液(一个离心管加一种工作 液)，然后加入25ml尚未凝结的50-55℃的MHA(Mueller Hinton Agar)加 血培养基，快速混匀后立即倒制平板，制得含齐墩果酸160μg/ml的平板、 含齐墩果酸80μg/ml的平板、含齐墩果酸40μg/ml的平板、含齐墩果酸 20μg/ml的平板、含齐墩果酸10μg/ml的平板、含齐墩果酸5μg/ml的平板、 含齐墩果酸2.5μg/ml的平板、含齐墩果酸1.25μg/ml的平板，含第一联合物 160μg/ml的平板、含第一联合物80μg/ml的平板、含第一联合物40μg/ml 的平板、含第一联合物20μg/ml的平板、含第一联合物10μg/ml的平板、含 第一联合物5μg/ml的平板、含第一联合物2.5μg/ml的平板、第一联合物 1.25μg/ml的平板，含第二联合物160μg/ml的平板、含第二联合物80μg/ml 的平板、含第二联合物40μg/ml的平板、含第二联合物20μg/ml的平板、含 第二联合物10μg/ml的平板、含第二联合物5μg/ml的平板、含第二联合物 2.5μg/ml的平板、第二联合物1.25μg/ml的平板，含第三联合物160μg/ml 的平板、含第三联合物80μg/ml的平板、含第三联合物40μg/ml的平板、含 第三联合物20μg/ml的平板、含第三联合物10μg/ml的平板、含第三联合物 5μg/ml的平板、含第三联合物2.5μg/ml的平板、第三联合物1.25μg/ml的 平板。
同时倒制1-3块仅含溶剂(二甲基亚砜)的MHA血平板。
下文为叙述方便，将上述含有齐墩果酸的平板、含有联合物的平板 以及仅含溶剂(二甲基亚砜)的MHA血平板统称为测试平板。
将-80℃冻存管内的幽门螺杆菌标准菌株(共使用了三种标准菌株， 分别为ATCC43504、ATCC700392、ATCC700824)涂布于MHA血平板(此 处倒制的MHA血平板并非上文的测试平板，而是常规使用的MHA血平 板)。将涂布有幽门螺杆菌标准菌株的MHA血平板置于封闭培养盒中，并 放置配套的微耗氧吸氧包使其产生稳定的微耗氧环境，将培养盒放于35 ±2℃的温度下培养5天。
5天后，收集MHA血平板上的细菌，并悬浮于pH缓冲的生理盐水中， 浊度调至0.45-0.6，此时，菌液含1.0×107-1.0×108CFU/ml。
取3微升制备好的菌液点于上述制备的测试平板上，由低浓度(或不 含化合物的平板)开始点至高浓度。此处的化合物是指上述联合物或齐 墩果酸。
待液滴微微风干后，将测试平板倒置于微耗氧培养盒中，放入配套 吸氧包，于35±2℃的温度下培养72小时。
需要说明的是，实验可以采用阿莫西林或克拉霉素作为阳性对照。
72小时后，读取最小抑菌浓度(MIC)，MIC为完全抑制幽门螺杆菌 在平板上生长的最低化合物浓度。如果MIC小于或等于制备的最低化合 物浓度(0.0625μg/ml)，则该菌株必须在不含药物的平板上显示生长，否 则对于该菌种的测试判断为失败，MIC结果不予采用，需重复试验。
在本实施例中，含齐墩果酸160μg/ml的平板、含第一联合物160μg/ml 的平板、含第二联合物160μg/ml的平板、含第三160μg/ml的平板均没有菌 生长，可知，齐墩果酸、第一联合物、第二联合物、第三联合物的MIC 均为16mg/100ml。
实施例3
在本实施例中研究齐墩果酸、齐墩果酸联合丹皮酚对感染了幽门螺 杆菌的小鼠的影响。
取22-24g雄性C57BL/6小鼠70只，其中，60只进行灌胃造模，具 体为每天灌胃H.Pylori，持续5天。再过28天后处死10只小鼠，检测 H.Pylori的感染率，感染率≥90％时造模成功，可分组进行试验。本次实 验用于确认H.pylori造模是否成功的10只小鼠均为H.pylori感染阳性， 感染率为100％，表明本次用于造模的小鼠可用于实验。
将用于造模的其余50只小鼠随机平均分成5组，分别为：A阳性对 照组、B齐墩果酸组、C第一联合组、D第二联合组、E第三联合组。 未进行造模的小鼠，即未感染幽门螺杆菌的小鼠作为F阴性对照组。
小鼠给药前禁食，不禁水，给药量方法如下：
B齐墩果酸组，每只小鼠灌胃给与0.2mg齐墩果酸，每天早上、傍 晚各给药1次，连续给药7天；
C第一联合组，每只小鼠灌胃给与0.2mg齐墩果酸和丹皮酚的第一 联合物(丹皮酚和齐墩果酸的重量比为1:1)，每天早上、傍晚各给药1 次，连续给药7天；
D第二联合组，每只小鼠灌胃给与0.2mg齐墩果酸和丹皮酚的第二 混合物(齐墩果酸和丹皮酚的重量比为3:1)，每天早上、傍晚各给药1 次，连续给药7天；
E第三联合组，每只小鼠灌胃给与0.2mg齐墩果酸和丹皮酚的第三 混合物(齐墩果酸和丹皮酚的重量比为1:3)，每天早上、傍晚各给药1 次，连续给药7天；
A阳性对照组、F阴性对照组灌胃给与等量的蒸馏水。
停药后28天杀死小鼠，检测H.pylori在小鼠胃中的的定植情况，检 测指标为组织培养、快速尿素酶试验和Real-time PCR检测。组织培养阳 性，或者组织培养阴性但快速尿素酶试验与Real-timePCR检测结果均为 阳性时，确认H.pylori感染阳性。
实验结果如表1所示。
分组 小鼠总数量 H.pylori感染阳性小鼠数量
A阳性对照组 10 10
B齐墩果酸组 10 1
C第一联合组 10 0
D第二联合组 10 1
E第三联合组 10 1
F阴性对照组 10 0
从表1可知，齐墩果酸的单独使用、齐墩果酸联合丹皮酚使用均能 有效治疗幽门螺杆菌感染，治愈率在90％以上，特别是当联合使用的齐 墩果酸和丹皮酚的重量比为1:1时，治愈率达到100％。
本实施例具有如下优点：为抗幽门螺杆菌提供了一种新的药物，可 用于治疗或预防幽门螺杆菌导致的疾病，具有良好的应用前景。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的 描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技 术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的 这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.齐墩果酸在制备抗幽门螺杆菌的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，齐墩果酸为所述抗幽门螺杆菌的药物的有效成分之一或唯一有效成分。
3.齐墩果酸和丹皮酚的组合物在制备抗幽门螺杆菌的药物中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述齐墩果酸和丹皮酚的组合物中齐墩果酸和丹皮酚的重量比为1:99-99:1。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述齐墩果酸和丹皮酚的组合物中齐墩果酸和丹皮酚的重量比为50:50。
6.齐墩果酸在制备幽门螺杆菌引发的疾病的治疗或预防药物中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述幽门螺杆菌引发的疾病包括幽门螺杆菌引发的消化道疾病。
8.齐墩果酸和丹皮酚的组合物在制备幽门螺杆菌引发的疾病的治疗或预防药物中的用途。
9.一种幽门螺杆菌感染的治疗或预防药物，其特征在于，包括有效量的齐墩果酸。
10.一种幽门螺杆菌感染的治疗或预防药物，其特征在于，包括有效量的齐墩果酸和有效量的丹皮酚。
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CN1124653A (zh) * 1995-04-05 1996-06-19 雷学军 抗幽门螺杆菌的天然药物
CN108290922A (zh) * 2015-09-23 2018-07-17 里亚塔医药公司 用于抑制il-17和其它用途的c4-改性的齐墩果酸衍生物

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