CN109232771A - 一种鸡冠中透明质酸的提取及纯化方法 - Google Patents

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    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates

Abstract

本发明公开了一种鸡冠中透明质酸的提取及纯化方法，涉及透明质酸提取技术领域。本发明包括如下方法，通过丙酮液对鸡冠进行硬化，并粉碎，进而通过乙醇以及氯仿和正丁醇溶液的混合液体进行透明质酸的提取，多次过滤除杂的粗质，之后使用乙酸酸化以及碱化并加入链蛋白酶进行分解细胞中的核酸，进一步纯化透明质酸的纯度。本发明通过漫液桶对该液体进行水相分离，简单方便快速，进而缩短鸡冠中透明质酸提取流程。

Description

一种鸡冠中透明质酸的提取及纯化方法
技术领域
本发明属于透明质酸提取技术领域，特别是涉及一种鸡冠中透明质酸的提取及纯化方法。
背景技术
透明质酸时一种酸性粘多糖，广泛用于眼科手术和换装品，用给蒸馏提取、氯仿去蛋白、乙醇沉淀和纯化都可以从鸡冠中获取透明质酸，而现有通过氯仿去蛋白、乙醇沉淀和纯化都可以从鸡冠中获取透明质酸方式在进行水相吸取时，通过虹吸的方式进行，在进行上层水相进行吸取时及其容易在吸取时出现过量吸取或者吸取不完全，进而使得透明质酸纯度低下或者产量低下。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鸡冠中透明质酸的提取及纯化方法，通过漫液桶对该液体进行水相分离，简单方便快速，进而缩短鸡冠中透明质酸提取流程。
为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明为一种鸡冠中透明质酸的提取及纯化方法，包括如下步骤：步骤一，将预处理的新鲜鸡冠，浸入丙酮至鸡冠硬化，之后取出硬化鸡冠干燥；步骤二，粉碎硬化鸡冠，加入6～7倍去离子水，静置并取出滤液，之后收集残渣再次加入去离子水，静置得提取液，并重复三至四次；步骤三，将步骤二中，提取液体加入乙醇以及与提取液和乙醇等体积的氯仿和正丁醇溶液的混合液体，搅拌并静置；步骤四，使用漫液桶溢出上层水相，进行相液分离；步骤五，对步骤四中水相添加2～3倍体积的乙醇，静置后再次重复步骤四，对二次水相进行过滤，对该沉淀物进行干燥，制得粗品；步骤六，将粗品酸化加入氯仿和正丁醇溶液的混合液体，静置，并溢出上层水相，重复2～3次；步骤七，将步骤六中溶液使用氢氧化钠溶液进行碱性调节，加入链蛋白酶，并进行除杂；步骤八，将步骤七中溶液，加入氯仿和正丁醇溶液的混合液体，重复水相分离，2～3次；步骤九，将步骤八中上层水相加入十六烷基溴化铵溶液中，过滤沉淀，并将该沉淀物加入氯化钠溶液搅拌分离，得离心液；步骤十，将上述离心液，加入乙醇进行水相分离，收集下层沉淀物，并对该沉淀物进行干燥。
优选地，所述漫液桶包括内桶和外筒，所述内桶中安装有一滚珠丝杠，该滚珠丝杠的螺母周侧与内桶的表壁之间设有若干“八”字型连接件，所述外筒上设有若干出液槽。
优选地，所述出液槽的高度为外筒的1/3～2/3长。
优选地，所述氯仿和正丁醇溶液按照1:3.5～4.3进行配比。
优选地，如步骤六中该酸化溶液使用乙酸调节至PH为4.7～5.3，并且该酸化溶液温度与13-17℃。
优选地，如步骤七中所述氢氧化钠溶液浓度为5～8％，调节至PH为7.2～7.6，加热温度为30～38℃。
本发明具有以下有益效果：
本发明通过丙酮硬化，能够有效的防止硫酸软骨素的混入，便于下一步的纯化，并且在纯化的过程中添加链蛋白酶分溶液中的细胞质和核酸等杂质，漫液桶对该液体进行水相分离，简单方便快速，通过控制外筒的旋转上升或下降，使得漫液桶内的液体从出液槽内流出，精准快速，进而缩短鸡冠中透明质酸提取流程。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明鸡冠中透明质酸的提取及纯化方法流程图。
图2为本发明漫液桶的结构示意图。
附图中，各标号所代表的部件列表如下：
1-漫液桶，2-出液槽，3-“八”字型连接件，4-螺母，5-内桶，6-外筒，7-滚珠丝杠。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-2所示，本发明为一种鸡冠中透明质酸的提取及纯化方法，包括如下步骤步骤一，将预处理的新鲜鸡冠，浸入丙酮至鸡冠硬化，之后取出硬化鸡冠干燥；
步骤二，粉碎硬化鸡冠，加入6～7倍去离子水，静置并取出滤液，之后收集残渣再次加入去离子水，静置得提取液，并重复三至四次；
步骤三，将步骤二中，提取液体加入乙醇以及与提取液和乙醇等体积的氯仿和正丁醇溶液的混合液体，搅拌并静置；
步骤四，使用漫液桶1溢出上层水相，进行相液分离；
步骤五，对步骤四中水相添加2～3倍体积的乙醇，静置后再次重复步骤四，对二次水相进行过滤，对该沉淀物进行干燥，制得粗品；
步骤六，将粗品酸化加入氯仿和正丁醇溶液的混合液体，静置，并溢出上层水相，重复2～3次；
步骤七，将步骤六中溶液使用氢氧化钠溶液进行碱性调节，加入链蛋白酶，并进行除杂；
步骤八，将步骤七中溶液，加入氯仿和正丁醇溶液的混合液体，重复水相分离，2～3次；
步骤九，将步骤八中上层水相加入十六烷基溴化铵溶液中，过滤沉淀，并将该沉淀物加入氯化钠溶液搅拌分离，得离心液；
步骤十，将上述离心液，加入乙醇进行水相分离，收集下层沉淀物，并对该沉淀物进行干燥。
漫液桶1包括内桶5和外筒6，内桶5中安装有一滚珠丝杠7，该滚珠丝杠7的螺母4周侧与内桶5的表壁之间设有若干“八”字型连接件3，外筒6上设有若干出液槽2。
出液槽2的高度为外筒6的1/3～2/3长。
氯仿和正丁醇溶液按照1:3.5～4.3进行配比。
如步骤六中该酸化溶液使用乙酸调节至PH为4.7～5.3，并且该酸化溶液温度与13-17℃。
如步骤七中氢氧化钠溶液浓度为5～8％，调节至PH为7.2～7.6，加热温度为30～38℃。
实施例一：
将对新鲜鸡冠进行70℃水浴清洗，并去除其血凝块，取10kg预处理鸡冠，分成十分，浸入丙酮3～5h至鸡冠硬化，之后取出硬化鸡冠干燥，粉碎硬化鸡冠，加入6～7倍去离子水，静置并取出滤液，之后收集残渣再次加入去离子水，静置得提取液，并重复三至四次，将上述提取液体加入乙醇以及与提取液和乙醇等体积的氯仿和正丁醇溶液的混合液体，搅拌并静置，其中氯仿和正丁醇溶液按照1:3.8进行配比，通过虹吸的方法将上层水相取出，进行相液分离，取得上层水相，并对该上层水相添加2～3倍体积的乙醇，静置后再次体加入乙醇以及与提取液和乙醇等体积的氯仿和正丁醇溶液的混合液体，搅拌并静置，对二次水相进行过滤，对该沉淀物进行干燥，制得粗品，经粗品加入乙酸中，通过乙酸调节至PH为4.9，并且调节温度控制在14℃，将粗品酸化加入氯仿和正丁醇溶液的混合液体，静置，并溢出上层水相，重复2～3次，将溶液使用氢氧化钠溶液进行碱性调节，氢氧化钠溶液浓度为5％，调节至PH为7.4，加热温度为33℃，加入链蛋白酶，并进行除杂，中溶液，加入氯仿和正丁醇溶液的混合液体，重复水相分离，2～3次，之后将该上层水相加入十六烷基溴化铵溶液中，过滤沉淀，并将该沉淀物加入氯化钠溶液搅拌分离，得离心液；将上述离心液，加入乙醇进行水相分离，收集下层沉淀物，并对该沉淀物进行干燥，并对实验样品进行监测。
实施例二：
对新鲜鸡冠进行70℃水浴清洗，并去除其血凝块，取10kg预处理鸡冠，分成十分，浸入丙酮4.5h至鸡冠硬化，之后取出硬化鸡冠干燥，粉碎硬化鸡冠，加入6～7倍去离子水，静置并取出滤液，之后收集残渣再次加入去离子水，静置得提取液，并重复三至四次，将上述提取液体加入乙醇以及与提取液和乙醇等体积的氯仿和正丁醇溶液的混合液体，搅拌并静置，其中氯仿和正丁醇溶液按照1:4.3进行配比，通过虹吸的方法将上层水相取出，进行相液分离，取得上层水相，并对该上层水相添加2～3倍体积的乙醇，静置后再次体加入乙醇以及与提取液和乙醇等体积的氯仿和正丁醇溶液的混合液体，搅拌并静置，对二次水相进行过滤，对该沉淀物进行干燥，制得粗品，经粗品加入乙酸中，通过乙酸调节至PH为5.2，并且调节温度控制在14℃，将粗品酸化加入氯仿和正丁醇溶液的混合液体，静置，并溢出上层水相，重复2～3次，将溶液使用氢氧化钠溶液进行碱性调节，氢氧化钠溶液浓度为5％，调节至PH为7.4，加热温度为33℃，加入链蛋白酶，并进行除杂，中溶液，加入氯仿和正丁醇溶液的混合液体，重复水相分离，2～3次，之后将该上层水相加入十六烷基溴化铵溶液中，过滤沉淀，并将该沉淀物加入氯化钠溶液搅拌分离，得离心液；将上述离心液，加入乙醇进行水相分离，收集下层沉淀物，并对该沉淀物进行干燥，并对实验样品进行监测。
实施例三：
对新鲜鸡冠进行70℃水浴清洗，并去除其血凝块，取10kg预处理鸡冠，分成十分，浸入丙酮4.5h至鸡冠硬化，之后取出硬化鸡冠干燥，粉碎硬化鸡冠，加入6～7倍去离子水，静置并取出滤液，之后收集残渣再次加入去离子水，静置得提取液，并重复三至四次，将上述提取液体加入乙醇以及与提取液和乙醇等体积的氯仿和正丁醇溶液的混合液体，搅拌并静置，其中氯仿和正丁醇溶液按照1:4.3进行配比，通过漫液桶1进行水相分离，其中漫液桶1包括内桶5和外筒6，内桶5中安装有一滚珠丝杠7，该滚珠丝杠7的螺母4周侧与内桶5的表壁之间设有若干“八”字型连接件3，外筒6上设有四个出液槽2，出液槽2的高度为外筒6的1/2长，分离得上层水相，并对该上层水相添加2～3倍体积的乙醇，静置后再次体加入乙醇以及与提取液和乙醇等体积的氯仿和正丁醇溶液的混合液体，搅拌并静置，对二次水相进行过滤，对该沉淀物进行干燥，制得粗品，经粗品加入乙酸中，通过乙酸调节至PH为5.2，并且调节温度控制在14℃，将粗品酸化加入氯仿和正丁醇溶液的混合液体，静置，并溢出上层水相，重复2～3次，将溶液使用氢氧化钠溶液进行碱性调节，氢氧化钠溶液浓度为5％，调节至PH为7.4，加热温度为33℃，加入链蛋白酶，并进行除杂，中溶液，加入氯仿和正丁醇溶液的混合液体，重复水相分离，2～3次，之后将该上层水相加入十六烷基溴化铵溶液中，过滤沉淀，并将该沉淀物加入氯化钠溶液搅拌分离，得离心液；将上述离心液，加入乙醇进行水相分离，收集下层沉淀物，并对该沉淀物进行干燥，并对实验样品进行监测。
分别对上术述三种实施方式进行样品监测，并且每一中实施方式中去除最高质量样品和最低质量样品，并取平均的表一：
表一
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

Claims (6)

1.一种鸡冠中透明质酸的提取及纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，将预处理的新鲜鸡冠，浸入丙酮至鸡冠硬化，之后取出硬化鸡冠干燥；
步骤二，粉碎硬化鸡冠，加入6～7倍去离子水，静置并取出滤液，之后收集残渣再次加入去离子水，静置得提取液，并重复三至四次；
步骤三，将步骤二中，提取液体加入乙醇以及与提取液和乙醇等体积的氯仿和正丁醇溶液的混合液体，搅拌并静置；
步骤四，使用漫液桶(1)溢出上层水相，进行相液分离；
步骤五，对步骤四中水相添加2～3倍体积的乙醇，静置后再次重复步骤四，对二次水相进行过滤，对该沉淀物进行干燥，制得粗品；
步骤六，将粗品酸化加入氯仿和正丁醇溶液的混合液体，静置，并溢出上层水相，重复2～3次；
步骤七，将步骤六中溶液使用氢氧化钠溶液进行碱性调节，加入链蛋白酶，并进行除杂；
步骤八，将步骤七中溶液，加入氯仿和正丁醇溶液的混合液体，重复水相分离，2～3次；
步骤九，将步骤八中上层水相加入十六烷基溴化铵溶液中，过滤沉淀，并将该沉淀物加入氯化钠溶液搅拌分离，得离心液；
步骤十，将上述离心液，加入乙醇进行水相分离，收集下层沉淀物，并对该沉淀物进行干燥。
2.根据权利要求1所述的一种鸡冠中透明质酸的提取及纯化方法，其特征在于，所述漫液桶(1)包括内桶(5)和外筒(6)，所述内桶(5)中安装有一滚珠丝杠(7)，该滚珠丝杠(7)的螺母(4)周侧与内桶(5)的表壁之间设有若干“八”字型连接件(3)，所述外筒(6)上设有若干出液槽(2)。
3.根据权利要求2所述的一种鸡冠中透明质酸的提取及纯化方法，其特征在于，所述出液槽(2)的高度为外筒(6)的1/3～2/3长。
4.根据权利要求1所述的一种鸡冠中透明质酸的提取及纯化方法，其特征在于，所述氯仿和正丁醇溶液按照1:3.5～4.3进行配比。
5.根据权利要求1所述的一种鸡冠中透明质酸的提取及纯化方法，其特征在于，如步骤六中该酸化溶液使用乙酸调节至PH为4.7～5.3，并且该酸化溶液温度与13-17℃。
6.根据权利要求1所述的一种鸡冠中透明质酸的提取及纯化方法，其特征在于，如步骤七中所述氢氧化钠溶液浓度为5～8％，调节至PH为7.2～7.6，加热温度为30～38℃。
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