CN109182043A

CN109182043A - 发酵枸杞渣及增香枸杞酒的制备方法

Info

Publication number: CN109182043A
Application number: CN201811023642.8A
Authority: CN
Inventors: 张惠玲; 郝向峰; 张金宏; 姬宏礼; 陆文静
Original assignee: Bairuiyuan Wolfberry Co ltd
Current assignee: Bairuiyuan Wolfberry Co ltd
Priority date: 2018-09-04
Filing date: 2018-09-04
Publication date: 2019-01-11
Anticipated expiration: 2038-09-04
Also published as: CN109182043B

Abstract

本发明涉及一种发酵枸杞渣及增香枸杞酒的制备方法，属于枸杞深加工技术领域。所述制备方法，主要步骤为：在枸杞渣中添加4‑6％保藏编号为CCTCC NO：M2017524的库特氏杆菌(Kurthia sp)NXUGQ15，在35‑37℃、130r/min下半固态发酵10‑15小时，得发酵枸杞渣。可应用于饲料、化妆品、食品等多个领域，特别是应用于发酵枸杞酒能够显著提香。本发明诱变获得的库特氏杆菌菌株NXUGQ15，降解类胡萝卜素的能力强，且发酵产类胡萝卜素降解酶时间短，酶活高，粗酶液的酶活8.87U/mL，产酶较好。能够将枸杞渣变废为宝，并充分利用枸杞渣中的类胡萝卜素，制备增香枸杞酒。

Description

发酵枸杞渣及增香枸杞酒的制备方法

技术领域

本发明涉及一种发酵枸杞渣的制备方法，并涉及应用该发酵枸杞渣制备增香枸杞酒的方法，属于枸杞深加工技术领域。

背景技术

众所周知，枸杞具有滋补肝肾，益精明目，治疗腰膝酸痛，眩晕耳鸣，内热消渴，血虚萎黄的功效，因此，人们将枸杞制成枸杞酒做为保健酒。目前枸杞酒制法有浸泡法和发酵法两种。浸泡法一般将整粒枸杞用白酒或黄酒泡制而成，酒度较高，且营养成分并不能充分溶出。发酵法枸杞酒因为不涉及高温加热过程，也较少有氧气参与，不但基本保持了枸杞中的天然营养的成分，而且经过发酵更加有利于人体吸收，是一种非常好的营养保健型果酒。但是，发酵型枸杞酒由于受到原料和加工工艺等因素的影响，质量参差不齐，产品的口感香气普遍不足，还有待于提高。

公开号:101323823的发明《枸杞酒的酿造方法》公开了一种枸杞酒的酿造方法，将破碎去籽的枸杞及熟化后的淀粉质原料中加入糖化发酵酒曲和酒母，在发酵罐中进行发酵；然后将发酵好的醪液进行压榨，酒汁经澄清、杀菌、陈酿、勾兑和过滤后装瓶。采用了淀粉质原料作为发酵的碳源，酿制纯发酵枸杞酒，主要解决的问题为：最大限度地降低生产成本。

公开号:1513970的发明《一种发酵枸杞葡萄酒及酿制方法》公开了一种发酵枸杞酒和发酵葡萄酒勾兑配制方法，这种方法以枸杞和葡萄为原料分开发酵，然后进行配制调配的工艺方法。是以鲜枸杞或干枸杞破碎制成果浆(果汁)发酵制成发酵枸杞酒；白葡萄或红葡萄经破碎制成果汁(果浆)发酵酿制成发酵葡萄酒。发酵枸杞酒与发酵葡萄酒按照(1％-99％)： (99％-1％)的比例勾兑配比后调成不同类型的糖度，经过热处理、冷处理、过滤、装瓶、杀菌，制成发酵枸杞葡萄酒。此方法酿制的发酵枸杞葡萄酒，枸杞葡萄香气和谐，口感丰满协调，枸杞味浓郁，典型性突出。

公开号:1104248的发明《一种枸杞酒的酿制方法》公开了一种枸杞酒的酿制方法，该方法包括原料经精选、压榨、发酵、过滤、灭菌，其特征在于鲜枸杞经精选、压榨成枸杞汁后，加入亚硫酸钠硫化后，再加入酵母，加葡萄糖至糖度为22°BX后，投入压力罐内密封发酵，其发酵温度为(20-25)℃，时间为5-8天后，再次添加葡萄糖至糖度为18°BX，再次进行密封发酵，其发酵温度为(15-20)℃，当发酵至罐底沉淀有果渣及酵母、酒液初步澄清，糖度为5°BX以下后，对罐内枸杞液果渣、酵母混合物进行搅拌、加热后，再进行冷却，将枸杞混合物过滤，在过滤所得的枸杞液中加入适量的亚硫酸钠再加入蜂蜜澄清，再次过滤，将过滤液贮于桶内，在温度为10℃左右下贮存2-3个月换桶一次后进行灌装巴氏灭菌，即酿制成枸杞酒，将上述酿制的枸杞液投入一定量的枸杞浸泡液，配制成不同酒度的枸杞酒。

公开号:1782060的发明《一种枸杞酒的酿制方法》公开的枸杞酒的酿制方法：鲜枸杞或干枸杞经分选、清洗，若是干枸杞还要用2-5倍于其重量的水浸泡12-24小时，然后破碎成枸杞浆，用95％(v/v)的脱臭酒精调整酒精度至20-25％(v/v)，浸泡10-20天，浸泡期间每天打循环1-4次，完毕后分离出浸泡酒；分离后的鲜枸杞果渣加0.5-2倍鲜枸杞重量的软水；干枸杞果渣加2-5倍干枸杞重量的软水，用蔗糖调整糖度至210-230g/L，用柠檬酸或酒石酸调整总酸至6.0-8.0g/L，调SO₂至80-100mg/L，加果胶酶0.2-0.5g/L，添加干酵母0.15-0.3g/L，控制温度在18-30℃发酵，时间5-7天，当比重降至1000g/L以下时，分析残糖＜4g/L分离出发酵酒；将浸泡酒和发酵酒混合，再经陈酿、调配、下胶、过滤、除菌、装瓶、包装即为成品。

公开号:1265420的发明《一种枸杞酒的酿制方法》公开的枸杞酒的酿制方法：将分选好的枸杞置入柠檬酸及亚硫酸钠混合液中热烫，热烫后的枸杞先经破碎后，再加入软水浸泡，枸杞和软水以7:3(体积比)装罐，用二氧化硫和果胶酶处理，调整成份后静置，接种发酵，经前发酵和后发酵后，分离出发酵酒贮存待用，经分选破碎的枸杞置入95％脱臭食用酒精中浸泡30天左右分离，制得浸泡酒，将浸泡酒和发酵酒按1:4(体积比)勾兑调配，贮存一段时间后，经下胶过滤，除菌过滤后装瓶。

公开号:1077744的发明《枸杞发酵酒制备方法》公开的枸杞发酵酒的制备方法：将枸杞经去杂冲洗，热浸提，破碎，过滤，加辅料，灭菌，冷却，前期发酵，净化处理，过滤，陈酿，制坛，调配，过滤等工序而制得枸杞发酵酒，具体工艺为：a：将枸杞果去杂冲洗，用 65℃-75℃热水浸提1.5-2.5小时，粉碎过滤后将其剩余物再次放入65℃-75℃热水中，浸提 0.8-1.2小时后进行第二次过滤，b：将a项二次过滤后的剩余物粉碎，经再次过滤后弃其滤渣，c：在b项的滤液中加入20％白糖辅料，d：将c项制得的溶液在95℃-100℃温度下灭菌 20-25秒，冷却到65℃-70℃，放入酒坛，继续冷却到30℃-32℃，e：在28℃-30℃条件下将 d项制得的溶液进行前期发酵6-8天，再在室温条件下进行后期发酵9-11天，f：将e项制得的溶液进行净化处理，加入明胶(按10mL溶液0.008g明胶的比例加入)，下胶14-16天过滤， g：将f项制得的溶液陈酿3-5个月，倒坛，在50℃-60℃条件下放置10-20天，在零下2℃-4 4℃条件下放置5-7天，过滤，滤液存放1个月，h：将g项制得的滤液加入调味剂及滋补药进行调配，i：将h项制得的溶液过滤，灭菌，即为成品。

虽然枸杞中类胡萝卜素含量非常丰富，但是传统工艺经过微生物发酵后，枸杞酒中类胡萝卜素含量并不高，主要由于类胡萝卜素不溶于水，很大一部分在发酵结束果渣分离时被除去，另一部分在酿造过程中被降解而损失。

宁夏枸杞历史悠久的传统品牌、文化优势历史己有数百年，中宁县是国务院命名的“中国枸杞之乡”，宁夏枸杞被《中国药典》列为药食品同源食品，这是其他任何省区都无法比拟的。

2017年国家1号文件明确提出，“加强新食品原料、药食同源食品开发和应用”“加强现代生物和营养强化技术研究，挖掘开发具有保健的功能的食品”，为了响应国家号召，开发功能保健食品，发展宁夏优势特色枸杞资源，提升枸杞保健酒的品质，找到一种发酵枸杞渣的制备方法，是本发明所要解决的技术问题。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种发酵枸杞渣的制备方法，采用分离得到的一株类胡萝卜素降解菌，处理枸杞酒制作过程中过滤除去的果渣，利用类胡萝卜素不稳定，受光、氧、热、生物酶等易降解产生降异戊二烯类香气化合物的特性，使其产生大量的C₉-、C₁₀-、C₁₃- 和C₁₅-降异戊二烯类化合物(norisoprenoids)，这些物质是具有挥发性的芳香化合物，这些化合物因为感官阈值较低，对食品具有积极的贡献。枸杞富含的类胡萝卜素主要包括β-胡萝卜素、玉米黄素、玉米黄素双棕榈酸酯，且其中以玉米黄素双棕榈酸酯最多，约为类胡萝卜素总量的77.5％。但是在酿造酒时，由于不溶于水，大部分流失于枸杞渣中，造成很大的浪费。本发明采用微生物降解，对枸杞渣进行利用，使所含大量不溶于水的类胡萝卜素降解，降解后的发酵枸杞渣再放回发酵的枸杞酒中，起到增加酒香气的作用，提高枸杞酒的品质。

传统的发酵工艺，由于枸杞中类胡萝卜素不溶于水，大量的类胡萝卜素被枸杞渣带走，本发明利用分离得到的一株类胡萝卜素降解菌，发酵枸杞渣，降解枸杞渣中不溶于水的类胡萝卜素，使产生降异戊二烯类香气物质，能够提高酒香，从而制得增香枸杞酒。该制备方法改善了枸杞酒香气，提高了枸杞酒品质，创新了枸杞酒酿造工艺。

降异戊二烯类化合物(norisoprenoids)是一类由类胡萝卜素降解产生的具有特殊香气的物质，并且该类物质具有较低的嗅觉阈值，因而少量存在就可对食品的风味产生较大的感官影响。食品中含有9、10、11和13个碳原子的降异戊二烯类化合物大多由类胡萝卜素降解产生，如β-大马酮、β-紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯等，均具有良好的风味。降异戊二烯类化合物是葡萄等新鲜果蔬的主要呈香物质之一，也是影响果酒香气品质的重要化合物。果酒香气成分中已探明的降异戊二烯类化合物有：β-紫罗兰酮、异佛尔酮、柠檬烯、藏红花醛、香叶基丙酮、二氢-β-紫罗兰酮、β-大马酮、二氢猕猴桃内酯、甲基庚烯酮、β-环柠檬醛、 2-庚烯醛、二氢茉莉酮、α-环柠檬醛、异香叶醇、2,5,6-三甲基-4-庚烯-3-酮、2,4-壬二烯醛、3-癸酮、2-壬烯醛、2,2,6-三甲基环烯酮等19种降戊二烯类化合物，香气特征见表3。

本发明对枸杞渣进行充分利用，利用类胡萝卜素的降解，增加枸杞渣中的风味物质，将本发明方法制备的枸杞渣用于枸杞酒酿造，经过检测增加了枸杞酒中降异戊二烯类化合物含量以及种类，它们主要是β-紫罗兰酮、2，2，6-三甲基环己酮(TCH)、异佛尔酮，香叶基丙酮、二氢-β-紫罗兰酮、香叶醇、藏红花醛、β-环柠檬醛、柠檬烯、假紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯。以及壬醛、戊酸戊酯、葵酸乙酯。这些物质的味阈值低，为枸杞酒感官评价起到了很好的作用。

该枸杞酒羰基化合物含量增多，相对峰面积占总成分的5.78％，高于旧工艺的4.23％；其中含量较高的是3-十一酮、β-大马酮、β-紫罗兰酮、β-环柠檬醛、藏红花醛和二氢-β- 紫罗兰酮，相对含量较高的β-紫罗兰酮3.136％，β-环柠檬醛3.615％，它们具有特殊水果香气。

酯类化合物相对峰面积为14.08％，高于现有工艺的11.03％，是枸杞酒中含量较多的芳香物质。占总成分的13.68％，高于现有工艺的10.73％，对枸杞酒香气贡献较大，葵酸乙酯和戊酸戊酯也是重要的降解产物，具有梨香和香蕉的香味；二氢猕猴桃内酯、丙酮香叶酯是类胡萝卜素降解的中间产物，也是含量较高的酯类之一，水果和花香味突出。

一种发酵枸杞渣的制备方法，包括如下步骤：将库特氏杆菌(Kurthia sp)扩大培养，得库特氏杆菌菌液；

鲜枸杞打浆、榨汁、过滤，得枸杞汁和枸杞渣；

枸杞渣中添加库特氏杆菌菌液，发酵得发酵枸杞渣；

将发酵枸杞渣回放枸杞酒中，浸渍，使降解产物降异戊二烯化合物溶入酒中，过滤取酒，再经低温陈酿，能够显著提高发酵型枸杞酒的香气；

优选的，所述库特氏杆菌为NXUGQ15(Kurthia sp)，保藏编号为CCTCC NO：M2017524；

所述发酵枸杞渣的制备方法，包括如下步骤：

将扩培好的库特氏杆菌菌液，按照4-6％质量百分比的接种量接入枸杞渣中，在35-37℃、 130r/min下半固态发酵10-15小时，每隔2小时搅拌一次，得发酵枸杞渣，其富含降异戊二烯类化合物；

所述库特氏杆菌菌液的制备方法包括如下步骤：

(1)培养基制备

液体培养基(g/L)：硝酸钠3、磷酸氢二钾1、硫酸镁0.5、氯化钾0.5、硫酸铁0.01、蔗糖30、YNB合成培养基(无氨基酵母氮源培养基)6.7、β-胡萝卜素15；pH＝3.2。

(2)扩大培养

取斜面试管库特氏杆菌(Kurthia sp)NXUGQ15 1环→10mL液体培养基35-37℃、130r/min 下培养10-12h→100mL液体培养基35-37℃、130r/min下培养10-12h→3000mL液体培养基35-37℃、130r/min下培养10-12h→菌液浓度达到10⁶cfu/ml→得库特氏杆菌菌液；

本发明同时保护所述发酵枸杞渣的应用，所述发酵枸杞渣可应用于饲料、化妆品、食品等多个领域，例如可用于提高发酵型枸杞酒的香气；例如将发酵枸杞渣放入枸杞酒中，浸渍，使降解产物降异戊二烯化合物溶入酒中，过滤取酒，再经低温陈酿，能够显著提高发酵型枸杞酒的香气，得增香枸杞酒。

所述库特氏杆菌菌株的分离及获得

从枸杞汁中分离得到可以降解类胡萝卜素的菌种，并经紫外诱变筛选出库特氏杆菌菌株 NXUGQ15(Kurthia sp)，利用该株菌产生的类胡萝卜素降解酶，降解枸杞浆中的类胡萝卜素，改进枸杞酒酿造工艺，提高枸杞酒品质。该菌出发菌株由张惠玲从宁夏百瑞源枸杞股份有限公司种植基地的枸杞汁中分离得到。

库特氏杆菌菌株NXUGQ15(Kurthia sp)，保藏编号CCTCC NO：M2017524，于2017年9月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉)，地址：中国.武汉.武汉大学。该菌能够降解β-胡萝卜素，最佳生长温度为35-37℃，pH＝2-3；该菌所产生的降解酶耐受温度为70-90℃，最佳酶反应pH＝1-3。该菌产类胡萝卜素降解酶时间短，酶活高，粗酶液的酶活8.87U/m L，优于出发菌GQ-16。

所述库特氏杆菌菌株的鉴定

初步鉴定：于液体培养基培养48h后，利用显微镜进行镜检，在油镜下观察其形态。结果表明菌株NXUGQ15为革兰氏阳性杆状细菌，无芽孢。

分子生物学鉴定：采用16S-23S rDNA ISR多态性与序列分析，构建其系统进化树见附图 2。由系统进化树可知，基于16rDNA区序列系统发育树，菌株NXUGQ15(Kurthia sp)与佐氏库特氏菌聚在一起，说明菌株NXUGQ15(Kurthia sp)与佐氏库特氏菌为同一物种，即菌株NXUGQ15(Kurthia sp)为库特氏菌。

库特氏杆菌对类胡萝卜素的降解

将菌株NXUGQ15(Kurthia sp)分别接种到玉米黄素为唯一碳源的液体培养基、β-胡萝卜素为唯一碳源的液体培养基、玉米黄素双棕榈酸酯为唯一碳源的液体培养基中，进行繁殖代谢。48h后取5ml发酵液于20ml顶空瓶，进行固相顶空微萃取及GC-MS测定。测定条件为：

样品的固相微萃取

取样品枸杞酒8ml于20ml顶空瓶中，加入2.0g氯化钠，并加入8μL 2-辛醇溶液，恒温磁力搅拌器上40℃平衡10min，插入CAR/DVB/PDMS纤维头40℃吸附15min，GC解吸5min，用于GC-MS分析。

气相色谱质谱工作条件

色谱条件为：色谱柱为DB-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)，载气为He，体积流量为1mL/min，进样口温度为250℃。程序升温：40℃保持3min，以5℃/min的升温速度升至120℃，再以8℃/min的升温速度升至230℃，保持10min。灯丝流量为0.20mA。质谱条件为：EI电离源，电子能量为70eV，检测器电压为350V。扫描范围为20～450AMU，离子源温度为200℃。

本发明同时提供一种增香枸杞酒的制备方法，包括如下步骤：

枸杞酒+发酵枸杞渣→浸渍0.5-1小时→过滤除渣→10-16度低温陈酿→增香枸杞酒；浸渍时间不宜过久，否则酒香会粗糙。

所述枸杞酒的制备方法包括如下步骤：

枸杞打浆破碎后，皮渣分离，取清汁加入40-60ml/L果胶酶,加入40-60ml/L，浓度为 6％的液体亚硫酸，用白砂糖调整糖度为20-25％，pH为3.3-3.5，接种2-3％酵母活化液在22-25℃下发酵至残糖小于4g/L，发酵结束，获得枸杞酒(新酒)；发酵时间一般为15天。

所述增香枸杞酒的制备方法还可以包括测定风味物质以及感官品评。

所述酵母活化液制备方法包括如下步骤：

斜面试管枸杞酵母取一环→10mL麦芽汁液体培养基25-28℃培养24-48h→50mL50％麦芽汁+50％枸杞汁质量百分比的液体培养基，25-28℃培养24-48h→取10mL接种在100mL枸杞汁中25-28℃下培养24-48h→全部倒入1000mL枸杞汁中22-25℃下培养24-48h→获得菌液浓度达到10⁷cfu/ml的菌液，即得酵母活化液→待用。

所述发酵枸杞渣制备方法同前。有益效果

本发明诱变获得能够降解枸杞类胡萝卜素的降解菌库特氏杆菌菌株NXUGQ15(Kurthia sp)(保藏号CCTCC NO：M2017524)。相比出发菌提高了降解类胡萝卜素的能力，且发酵产类胡萝卜素降解酶时间短，酶活高，粗酶液的酶活8.87U/mL，产酶较好。

将枸杞渣变废为宝，并充分利用枸杞渣中的类胡萝卜素

本发明创新了枸杞渣的发酵工艺，利用保藏菌种处理枸杞渣，对枸杞渣中的类胡萝卜素进行降解，将枸杞渣变废为宝，并充分利用枸杞渣中的类胡萝卜素，使类胡萝卜素降解，增加了枸杞渣中的香气物质，可应用于饲料、化妆品、食品等多个领域，特别是将其用于发酵枸杞酒，能够增加枸杞酒中的挥发香气成分，能够改善枸杞酒的品质，提高了枸杞酒的市场竞争力。同时减少了发酵枸杞酒产生的废弃物，减少浪费，降低了后续处理的难度，节能环保，具有很高的推广价值。

附图说明

图1-本发明发酵枸杞渣的制备方法以及将本发明发酵枸杞渣用于枸杞酒提香工艺流程图；

图2-本发明库特氏杆菌系统进化树图；

图3-三种提香方法增香枸杞酒的感官品评结果图；

图中：酒样1为将本发明发酵枸杞渣放回枸杞酒中所得增香枸杞酒；酒样2为采用高压降解枸杞渣放回枸杞酒中所得增香枸杞酒；酒样3为利用库特氏杆菌产的类胡萝卜素酶辅助降解制备的增香枸杞酒。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例1

库特氏杆菌菌株的分离及获得

库特氏杆菌菌株的选育

(1)发明人于2016年1月从枸杞汁中分离并鉴定，得到了1株可以降解类胡萝卜素的菌种，为库特氏杆菌菌株GQ-16。为了提高其降解类胡萝卜素的降解能力，对该菌进行了诱变，详见如下：

(2)诱变库特氏菌GQ-16

以库特氏菌GQ-16作为出发菌株，进行诱变选育，目的提高产酶活性缩短发酵时间。

实验如下：

紫外诱变：

取出发菌株一环，接入到液体培养基中，35℃条件下培养5-6h，至对数期中期。将菌悬液稀释至浓度为10⁵CFU/m L。通过预实验以致死率80％为条件，获得最佳照射时间与照射距离。将菌悬液均匀涂布于液体培养基上，放置于30W的紫外灯下距离25cm，照射5min，辐照处理后，用黑布包裹培养基在35℃-37℃条件下，培养8-12h，筛选生长快而且菌落形态好的菌株20株，然后经过发酵性能测试实验，筛选性能优良的菌株5株，分别命名为NXUGQ15、 NXUGQ46、NXUGQ7、NXUGQ18、NXUGQ39，分别提取各个酶进行枸杞酒发酵，通过测定发酵时间来鉴定其发酵性能高低。发酵时间越短，表示发酵性能越好结果见表1。

微波诱变：

取5m L菌悬液于直径9cm的培养皿内，通过预实验以致死率80％为条件，选用最大功率700W、脉冲功率2450MHz家用微波炉进行照射5s，在冰上快速冷却5s，重复此步骤，取上述处理液0.5m L均匀涂布于固体培养基上，用黑布包裹培养基在35℃-37℃条件下，培养8-12h。筛选生长快而且菌落形态好的菌株20株，然后经过发酵性能测试实验，筛选性能优良的菌株5株，分别命名为W-NXUGQ-5、W-NXUGQ-26、W-NXUGQ-1、W-NXUGQ-18、W-NXUGQ-35，分别提取各个酶进行枸杞酒发酵，通过测定发酵时间来鉴定其发酵性能高低。发酵时间越短，表示发酵性能越好结果见表2。

酶活定义：1g酶粉或1m L酶液在50℃、p H 3.5条件下，1h分解类胡萝卜素的量为一个酶活单位(U)。粗酶液的酶活计算公式如下：

式中：Y为酶作用降解类胡萝卜素的质量.mg；N为样品稀释倍数；2为测定酶活力时取了反应液的1/2；t为反应所用时间.h。

紫外诱变处理以及微波诱变处理对菌株产酶(类胡萝卜素降解酶)的影响结果分别见表1及表2。

表1紫外诱变处理

编号

NXUGQ 15

NXUGQ46

NXUGQ 7

NXUGQ 18

NXUGQ39

出发菌GQ-16

酶活U/mL

8.87

7.90

8.46

8.84

8.12

6.32

发酵时间

8h

13h

10h

12h

11h

10h

表2微波诱变处理

编号

W-NXUGQ-5

W-NXUGQ-26

W-NXUGQ-1

W-NXUGQ-18

W-NXUGQ-35

出发菌GQ-16

酶活U/mL

7.87

7.89

7.46

8.05

8.12

6.32

发酵时间

11h

8h

10h

14h

10h

由以上两表可以看出，紫外诱变处理的5株菌中NXUGQ 15最好，微波诱变处理5株菌中 W-NXUGQ-5最好，

分别用两株菌进行稳定性试验15次，通过比较发现NXUGQ 15比较稳定，相比出发菌提高了降解类胡萝卜素的能力，且发酵产类胡萝卜素降解酶时间短，酶活高，粗酶液的酶活8.87U/mL，产酶较好。选择该菌种，最终命名为NXUGQ15，即库特氏杆菌菌株NXUGQ15(Kurthia sp)，并进行菌种保藏。

实施例2

一种发酵枸杞渣的制备方法，包括如下步骤：

将库特氏杆菌NXUGQ15(Kurthia sp)，保藏编号为CCTCC NO：M2017524，扩大培养，得库特氏杆菌菌液；

鲜枸杞打浆、榨汁、过滤，得枸杞汁和枸杞渣；

将扩培好的库特氏杆菌菌液，按照5％的接种量接入枸杞渣中，在35-37℃、130r/min下半固态发酵12小时，每隔2小时搅拌一次，得发酵枸杞渣；

所述库特氏杆菌菌液的制备方法包括如下步骤：

(1)培养基制备

(2)扩大培养

取斜面试管库特氏杆菌(Kurthia sp)NXUGQ15 1环→10mL液体培养基35-37℃、130r/min 下培养11h→100mL液体培养基35-37℃、130r/min下培养11h→3000mL液体培养基35-37℃、 130r/min下培养11h→菌液浓度达到10⁶cfu/ml→得库特氏杆菌菌液；

将发酵枸杞渣回放枸杞酒中，浸渍1h，使降解产物降异戊二烯化合物溶入酒中，过滤取酒，再经低温陈酿，能够显著提高发酵型枸杞酒的香气，得增香枸杞酒；

枸杞酒+发酵枸杞渣→浸渍1小时→过滤除渣→10-16度低温陈酿→增香枸杞酒；

所述枸杞酒的制备方法包括如下步骤：

枸杞打浆破碎后，皮渣分离，取清汁加入50ml/L果胶酶,加入50ml/L，浓度为6％的液体亚硫酸，用白砂糖调整糖度为23％，pH为3.3-3.5，接种3％酵母活化液在22-25℃下发酵至残糖小于4g/L，发酵结束，获得枸杞酒(新酒)；

所述增香枸杞酒的制备方法还包括测定风味物质以及感官品评。

所述酵母活化液制备方法包括如下步骤：

斜面试管枸杞酵母取一环→10mL麦芽汁液体培养基25-28℃培养36h→50mL50％麦芽汁 +50％枸杞汁质量百分比的液体培养基，25-28℃培养36h→取10mL接种在100mL枸杞汁中 25-28℃下培养36h→全部倒入1000mL枸杞汁中22-25℃下培养36h→获得菌液浓度达到10⁷cfu/ml的菌液，即得酵母活化液；

测定风味物质以及感官品评，结果见表3、表4及附图3。

实施例3

一种发酵枸杞渣的制备方法，包括如下步骤：

鲜枸杞打浆、榨汁、过滤，得枸杞汁和枸杞渣；

将扩培好的库特氏杆菌菌液，按照4％的接种量接入枸杞渣中，在35-37℃、130r/min下半固态发酵10小时，每隔2小时搅拌一次，得发酵枸杞渣；

所述库特氏杆菌菌液的制备方法包括如下步骤：

(1)培养基制备

(2)扩大培养

取斜面试管库特氏杆菌(Kurthia sp)NXUGQ15 1环→10mL液体培养基35-37℃、130r/min 下培养10h→100mL液体培养基35-37℃、130r/min下培养10h→3000mL液体培养基35-37℃、 130r/min下培养10h→菌液浓度达到10⁶cfu/ml→得库特氏杆菌菌液。

枸杞酒+发酵枸杞渣→浸渍0.5小时→过滤除渣→10-16度低温陈酿→增香枸杞酒；

所述枸杞酒的制备方法包括如下步骤：

枸杞打浆破碎后，皮渣分离，取清汁加入40ml/L果胶酶,加入40ml/L，浓度为6％的液体亚硫酸，用白砂糖调整糖度为20％，pH为3.3-3.5，接种2％酵母活化液在22-25℃下发酵至残糖小于4g/L，发酵结束，获得枸杞酒(新酒)；

所述酵母活化液制备方法包括如下步骤：

斜面试管枸杞酵母取一环→10mL麦芽汁液体培养基25-28℃培养24h→50mL50％麦芽汁 +50％枸杞汁质量百分比的液体培养基，25-28℃培养24h→取10mL接种在100mL枸杞汁中 25-28℃下培养24h→全部倒入1000mL枸杞汁中22-25℃下培养24h→获得菌液浓度达到 10⁷cfu/ml的菌液，即得酵母活化液。

实施例4

一种发酵枸杞渣的制备方法，包括如下步骤：

鲜枸杞打浆、榨汁、过滤，得枸杞汁和枸杞渣；

将扩培好的库特氏杆菌菌液，按照6％的接种量接入枸杞渣中，在35-37℃、130r/min下半固态发酵15小时，每隔2小时搅拌一次，得发酵枸杞渣；

所述库特氏杆菌菌液的制备方法包括如下步骤：

(1)培养基制备

(2)扩大培养

取斜面试管库特氏杆菌(Kurthia sp)NXUGQ15 1环→10mL液体培养基35-37℃、130r/min 下培养12h→100mL液体培养基35-37℃、130r/min下培养12h→3000mL液体培养基35-37℃、 130r/min下培养12h→菌液浓度达到10⁶cfu/ml→得库特氏杆菌菌液。

所述枸杞酒的制备方法包括如下步骤：

枸杞打浆破碎后，皮渣分离，取清汁加入60ml/L果胶酶,加入60ml/L，浓度为6％的液体亚硫酸，用白砂糖调整糖度为20-25％，pH为3.3-3.5，接种3％酵母活化液在22-25℃下发酵至残糖小于4g/L，发酵结束，获得枸杞酒(新酒)；

所述酵母活化液制备方法包括如下步骤：

斜面试管枸杞酵母取一环→10mL麦芽汁液体培养基25-28℃培养48h→50mL50％麦芽汁 +50％枸杞汁质量百分比的液体培养基，25-28℃培养48h→取10mL接种在100mL枸杞汁中 25-28℃下培养48h→全部倒入1000mL枸杞汁中22-25℃下培养48h→获得菌液浓度达到 10⁷cfu/ml的菌液，即得酵母活化液。

试验例

风味物质测定

降异戊二烯类化合物的萃取：利用顶空固相微萃取(HS-SPME)法进行香气富集，取一个 20mL顶空瓶，用无菌移液管加8mL待分析的枸杞汁或枸杞酒样和2.0g NaCl，于40℃恒温磁力搅拌器上平衡10min，插入CAR/DVB/PDMS纤维头40℃吸附15min，GC解吸5min，用于GC-MS分析。

气相色谱质谱工作条件

色谱条件为：色谱柱为DB-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)，程序升温：40℃保持3min，以5℃/min的升温速度升至120℃，再以8℃/min的升温速度升至230℃，保持10min。载气为He，体积流量为1mL/min，进样口温度为250℃。质谱条件为：EI电离源，电子能量为70eV，灯丝流量为0.20mA。检测器电压为350V。扫描范围为20～450AMU，离子源温度为200℃。

分析方法：

(1)类胡萝卜素的分析方法

分别由标准曲线计算出处理前和各单因素处理后的类胡萝卜素的含量。代入下式中计算出各类胡萝卜素的降解率。

降解率(％)＝[(处理前含量-处理后含量)/处理前含量]×100％

(2)降异戊二烯化合物的分析方法

根据化合物的结构特征，与NIST谱库中标准化合物的图谱进行比较，根据离子流图确定出其相对含量。

将本发明发酵枸杞渣用于发酵枸杞酒提香与另两种方法制备的枸杞酒挥发香气成分比较，以传统工艺发酵的枸杞酒为对照：

方法Ⅰ：本发明方法采用NXUGQ15(Kurthia sp)菌直接发酵枸杞渣，使类胡萝卜素降解，将渣回放枸杞酒中，使降解产物降异戊二烯化合物溶入酒中，过滤取酒。

方法Ⅱ：采用NXUGQ15(Kurthia sp)菌，经过发酵培养菌液，收集该菌产生的类胡萝卜素降解酶，将降解酶加入枸杞浆中进行酶解，然后发酵制备枸杞酒，使降解产物降异戊二烯化合物溶入酒中，过滤取酒。

方法Ⅲ：对枸杞渣采用在121℃灭菌20min高压处理，使枸杞渣中类胡萝卜素降解，然后再将其浸于枸杞酒中0.5-1h，使降异戊二烯化合物溶解酒中，过滤取酒。

以传统工艺发酵的枸杞酒为对照，分别采用方法Ⅰ、方法Ⅱ、方法Ⅲ进行枸杞酒的增香，制得的枸杞酒主要挥发香气成分及相对含量比较结果见表3：

表3不同工艺枸杞酒中主要挥发香气成分及相对含量

注：“nd”表示未检出。

由上表可以得出结论：用本发明方法制备的发酵枸杞渣增香后的枸杞酒，主要挥发香气成分均远高于传统工艺制备的枸杞酒，并增加了九种类胡萝卜素香气物质。

三种方法制备的枸杞酒中降异戊二烯类化合物含量比较

以传统工艺发酵的枸杞酒为对照，分别采用方法Ⅰ、方法Ⅱ、方法Ⅲ进行枸杞酒的增香，制得的枸杞酒中降异戊二烯类化合物进行比较，结果见表4

表4不同工艺制备的枸杞酒中降异戊二烯类化合物比较(峰面积)

由表4可以得到如下结论：本发明制备的发酵枸杞渣加入枸杞酒中浸渍后，降异戊二烯类化合物含量远高于传统工艺制备的枸杞酒，也高于高压处理工艺制备的枸杞酒。

香气对照参照表：

表5枸杞酒中部分降异戊二烯类化合物的香气特征

按照下表的感官品评方法，对本发明方法Ⅱ、方法Ⅰ、方法Ⅲ三种不同方法制备的枸杞酒进行感官品评，品评结果绘制感官品评风玫瑰图，见附图3

表6枸杞发酵酒感官评分表

通过对三种酒样中降戊二烯类化合物的测定并结合感官品评，发现本发明制备的发酵枸杞渣用于枸杞酒提香，香气和口感均较佳。采用库特氏菌发酵枸杞渣，首先一方面不仅可以提高类胡萝卜素的降解率，从而产生更多的降戊二烯香气成分。其次，发酵温度低，避免了因高温加热而对酒体造成不良风味。

本发明在枸杞酒酿造的过程中，将枸杞渣采用库特氏菌进行降解处理，能够改进枸杞酒的酿造工艺，提高枸杞酒香气。并且可以适度的进行高压灭菌，或者采用库特氏菌产生的类胡萝卜素酶辅助处理枸杞浆，从而几种提香方法进行组合，均可以显著提高发酵枸杞酒的香气。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，上述各实施方式还可以做出组合和改进，当然也可以将本发明公开的几种制备方法进行重新组合，以及工艺步骤的增减、重组，这些都属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种发酵枸杞渣的制备方法，包括如下步骤：

鲜枸杞打浆、榨汁、过滤，得枸杞渣；

枸杞渣中添加库特氏杆菌液，发酵得发酵枸杞渣；

所述库特氏杆菌液为将库特氏杆菌(Kurthia sp)扩大培养所得。

2.根据权利要求1所述发酵枸杞渣的制备方法，其特征在于，所述库特氏杆菌为(Kurthia sp)NXUGQ15，保藏编号为CCTCC NO：M2017524。

3.根据权利要求1或2所述发酵枸杞渣的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将扩培好的库特氏杆菌液，按照4-6％质量百分比的接种量接入枸杞渣中，在35-37℃、130r/min下半固态发酵10-15小时，每隔2小时搅拌一次，得发酵枸杞渣。

4.根据权利要求3所述发酵枸杞渣的制备方法，其特征在于，所述库特氏杆菌液的制备方法包括如下步骤：

(1)培养基制备

液体培养基(g/L)：硝酸钠3、磷酸氢二钾1、硫酸镁0.5、氯化钾0.5、硫酸铁0.01、蔗糖30、YNB合成培养基6.7、β-胡萝卜素15；pH＝3.2；

(2)扩大培养

取斜面试管库特氏杆菌(Kurthia sp)NXUGQ15 1环→10mL液体培养基35-37℃、130r/min下培养10-12h→100mL液体培养基35-37℃、130r/min下培养10-12h→3000mL液体培养基35-37℃、130r/min下培养10-12h→菌液浓度达到10⁶cfu/ml→得库特氏杆菌液。

5.根据权利要求4所述发酵枸杞渣的制备方法，包括如下步骤：

鲜枸杞打浆、榨汁、过滤，得枸杞汁和枸杞渣；

将扩培好的库特氏杆菌菌液，按照5％质量百分比的接种量接入枸杞渣中，在35-37℃、130r/min下半固态发酵12小时，每隔2小时搅拌一次，得发酵枸杞渣；

所述库特氏杆菌菌液的制备方法包括如下步骤：

(1)培养基制备

(2)扩大培养

取斜面试管库特氏杆菌(Kurthia sp)NXUGQ15 1环→10mL液体培养基35-37℃、130r/min下培养11h→100mL液体培养基35-37℃、130r/min下培养11h→3000mL液体培养基35-37℃、130r/min下培养11h→菌液浓度达到10⁶cfu/ml→得库特氏杆菌菌液。

6.根据权利要求4所述发酵枸杞渣的制备方法，包括如下步骤：

鲜枸杞打浆、榨汁、过滤，得枸杞汁和枸杞渣；

所述库特氏杆菌菌液的制备方法包括如下步骤：

(1)培养基制备

(2)扩大培养

取斜面试管库特氏杆菌(Kurthia sp)NXUGQ15 1环→10mL液体培养基35-37℃、130r/min下培养10h→100mL液体培养基35-37℃、130r/min下培养10h→3000mL液体培养基35-37℃、130r/min下培养10h→菌液浓度达到10⁶cfu/ml→得库特氏杆菌菌液。

7.根据权利要求4所述发酵枸杞渣的制备方法，包括如下步骤：

鲜枸杞打浆、榨汁、过滤，得枸杞汁和枸杞渣；

所述库特氏杆菌菌液的制备方法包括如下步骤：

(1)培养基制备

(2)扩大培养

取斜面试管库特氏杆菌(Kurthia sp)NXUGQ15 1环→10mL液体培养基35-37℃、130r/min下培养12h→100mL液体培养基35-37℃、130r/min下培养12h→3000mL液体培养基35-37℃、130r/min下培养12h→菌液浓度达到10⁶cfu/ml→得库特氏杆菌菌液。

8.一种增香枸杞酒的制备方法，包括如下步骤：枸杞酒+发酵枸杞渣→浸渍0.5-1小时→过滤除渣→10-16度低温陈酿→增香枸杞酒；其特征在于，所述发酵枸杞渣的制备方法如权利要求1-7。

9.根据权利要求8所述增香枸杞酒的制备方法，其特征在于，所述枸杞酒的制备方法包括如下步骤：

枸杞打浆破碎后，皮渣分离，取清汁加入40-60ml/L果胶酶,加入40-60ml/L，浓度为6％的液体亚硫酸，用白砂糖调整糖度为20-25％，pH为3.3-3.5，接种2-3％酵母活化液在22-25℃下发酵至残糖小于4g/L。

10.根据权利要求9所述增香枸杞酒的制备方法，其特征在于，所述酵母活化液制备方法包括如下步骤：

斜面试管枸杞酵母取一环→10mL麦芽汁液体培养基25-28℃培养24-48h→50mL50％麦芽汁+50％枸杞汁质量百分比的液体培养基，25-28℃培养24-48h→取10mL接种在100mL枸杞汁中25-28℃下培养24-48h→全部倒入1000mL枸杞汁中22-25℃下培养24-48h→获得菌液浓度达到10⁷cfu/ml的菌液，即得酵母活化液。