CN109180652B - 一种检测Cys的苯并吡喃腈类荧光探针分子的制备工艺 - Google Patents

一种检测Cys的苯并吡喃腈类荧光探针分子的制备工艺 Download PDF

Info

Publication number
CN109180652B
CN109180652B CN201811187598.4A CN201811187598A CN109180652B CN 109180652 B CN109180652 B CN 109180652B CN 201811187598 A CN201811187598 A CN 201811187598A CN 109180652 B CN109180652 B CN 109180652B
Authority
CN
China
Prior art keywords
dcm
benzopyran
cys
fluorescent probe
probe molecule
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201811187598.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109180652A (zh
Inventor
段玉莲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qujing Normal University
Original Assignee
Qujing Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qujing Normal University filed Critical Qujing Normal University
Priority to CN201811187598.4A priority Critical patent/CN109180652B/zh
Publication of CN109180652A publication Critical patent/CN109180652A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109180652B publication Critical patent/CN109180652B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/06—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1029—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing one nitrogen atom as the heteroatom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1088—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing oxygen as the only heteroatom

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明公开了一种选择性检测Cys的苯并吡喃腈类荧光探针分子的制备工艺，其制备工艺特征如下：在氮气条件下，准确称取化合物I（48mg，0.14mmol）溶解于除水的二氯甲烷（10mL）中，再取三氟甲磺酸甲酯（92mg，0.56mmol）于混合溶液中，在室温下搅拌不少于12小时。反应结束后过滤沉淀，用无水乙醇和乙醚洗涤，得到粗产物红色粉末，柱层析分离提纯，洗脱剂：二氯甲烷/甲醇=20/1，得到橙红色粉末DCM‑q（36mg，50%）。本发明所述产品DCM‑q较易得，该探针分子主要用于选择性检测生物硫醇中的半胱氨酸（Cys）。

Description

一种检测Cys的苯并吡喃腈类荧光探针分子的制备工艺
技术领域
本发明涉及一种检测Cys的苯并吡喃腈类荧光探针分子的制备工艺。
背影技术
半胱氨酸（Cys）是含有巯基的氨基酸小分子之一，在许多生理和病理过程中起着至关重要的作用。在生物系统中，Cys主要由甲硫氨酸通过甲硫氨酸转移酶，腺苷高半胱氨酸酶，胱硫醚-β-合酶和胱硫醚-γ-裂解酶作用产生。对于Cys的消耗，除红细胞外，几乎所有哺乳动物细胞中都存在着“半胱氨酸双加氧酶催化半胱氨酸为半胱氨酸亚磺酸盐，并进一步通过天冬氨酸氨基转移酶酶促转化为β-磺基丙酮酸，最后分解为丙酮酸和SO2”的过程，这样就可以促进生理环境中HSO3 -和SO3 2-的平衡。正常水平的Cys（30-200μM）可以维持各种蛋白质和主要抗氧化剂谷胱甘肽（GSH）的合成，并作为人体新陈代谢中硫化物的来源。然而，过量的Cys与类风湿性关节炎、帕金森病、阿尔茨海默病等疾病有关。据报道，Cys的缺乏会产生生长缓慢，水肿，肝损伤，皮肤损伤和虚弱等病症。因此，内源性Cys的可视化代谢是至关重要的。另外，许多现有的硫醇荧光探针已被广泛应用，例如测定血清或蛋白质中的Cys浓度，以及细胞成像等。
最近，二氰基亚甲基-4H-吡喃作为NIR荧光团的报道越来越多。这主要是由于该类探针：（ⅰ）具有大的斯托克斯位移，（ⅱ）耐光性，（ⅲ）在近红外区域有发光波长等。由于二氰基亚甲基-4H-优异的光物理性质，所以基于吡喃的探针分子非常适用于生物系统。这样的探针具有：（i）产生较低的背景荧光，散射较少，（ii）较深的组织穿透力和（iii）对活细胞的损害较小等优点。在本发明中，申请人设计合成了DCM-q并应用于选择性检测生物硫醇中的半胱氨酸（Cys）。
发明内容
本发明的目的是提供一种选择性检测Cys的苯并吡喃腈类荧光探针分子的制备工艺，以解决吡喃的探针分子广泛应用需要。
技术方案
一种检测Cys的苯并吡喃腈类荧光探针分子的制备工艺，包括如下步骤：
在氮气条件下，准确称取化合物(E)-2-(2-(2-喹啉基)乙烯基)-4H-苯并吡喃-4-亚基)丙二腈（I）（48mg,0.14mmol）溶解于除水的二氯甲烷（10mL）中，再取三氟甲磺酸甲酯（92mg,0.56mmol）于混合溶液中，在室温下搅拌不少于12小时。反应结束后过滤沉淀，用无水乙醇和乙醚洗涤，得到粗产物红色粉末，再通过色谱柱分离提纯，洗脱剂：二氯甲烷/甲醇= 20/1，得到橙红色粉末目标化合物DCM-q（36mg，50%）。
在氮气条件下，将2-喹啉甲醛（100mg, 0.64mmol）和化合物2-(2-甲基-4H-吡喃-4-亚基)丙二腈(DCM)（134mg, 0.64mmol）溶解在10 mL的无水乙醇中，再加入六氢吡啶（6.3μL , 0.064mmol）作为催化剂，加热回流不少于3小时。反应结束后冷却到室温，抽滤，滤饼用无水乙醇和乙醚洗，得到橘红色的粗产物，进行色谱柱提纯，用二氯甲烷作为洗脱剂，得到橘色粉末固体(E)-2-(2-(2-喹啉基)乙烯基)-4H-苯并吡喃-4-亚基)丙二腈（I）（177mg，80%）。
取25 mL乙酸酐将化合物2-甲基-4H-吡喃-4-酮(2)（4.78 g，29.9 mmol）和丙二腈（2.40 g，36.2 mmol）溶解，接着将溶液在139 ℃的条件下回流16 小时后，减压除去乙酸酐。然后将80 mL去离子水倒入残留物中，继续回流30分钟。反应液冷却至室温后，用二氯甲烷萃取三次后，合并有机相并用无水硫酸钠干燥后，减压除去二氯甲烷后得到褐色油状物。柱色谱分离提纯后得到橘黄色絮状固体，接着用乙醇重结晶得到化合物2-(2-甲基-4H-吡喃-4-亚基)丙二腈(DCM)（1.13 g，27%）。
按上述给出的各组分重量计,得到的各组分分量关系或重量比关系取量,依照所述工艺，能制得对应重量的橙红色粉末目标化合物DCM-q，即苯并吡喃腈类荧光探针分子产品。
本发明的工艺步骤简单，产物易得。本发明的制备工艺获得的以新型结构苯并吡喃腈为荧光团、喹啉3位上双键为识别位点，在DMSO/HEPES体系中能够选择性识别Cys。
附图说明
图1化合物DCM-q的核磁供振1HNMR谱。
图2化合物DCM-q的核磁供振13CNMR谱。
图3化合物I的核磁供振1HNMR谱。
图4化合物DCM的核磁供振1HNMR谱。
图5化合物DCM-q、化合物DCM-q加入不同浓度的Cys之后紫外性质表征。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步说明。
实施例1
化合物DCM-q的制备工艺，如下：
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE002
在氮气条件下，准确称取化合物5（48mg，0.14mmol）溶解于除水的二氯甲烷（10mL）中，再取三氟甲磺酸甲酯（92mg，0.56mmol）于混合溶液中，在室温下搅拌过夜。反应结束后过滤沉淀，用无水乙醇和乙醚洗涤，得到粗参物红色粉末，再通过色谱柱分离提纯，洗脱剂：二氯甲烷：甲醇= 20：1，得到橙红色粉末DCM-q（36mg，50%）。1H NMR (500 MHz, d6-DMSO) δ9.29 (s, 1H), 8.78 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.68 (s, 1H), 8.54 (d, J = 8.6 Hz,1H), 8.45 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.29 (dd, J = 20.4, 12.2 Hz, 3H), 8.12 – 8.00(m, 2H), 7.96 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.71 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 7.42 (s, 1H),4.67 (s, 3H).13C NMR (126 MHz, DMSO) δ 155.14, 154.42, 152.81, 152.35,146.06, 139.89, 136.53, 136.26, 130.76, 130.44, 129.26, 127.70, 127.21,125.22, 122.43, 122.08, 120.13, 119.93, 119.87, 117.38, 116.84, 115.57,112.24, 65.06, 41.10.
1H NMR 谱见图1；13C NMR谱见图2。
实施例2
（1）化合物3-醛基-7-二乙胺基香豆素的合成，如下：
Figure RE-76820DEST_PATH_IMAGE002
在氮气条件下，将2-喹啉甲醛（100mg, 0.64mmol）和化合物DCM（134mg,0.64mmol）溶解在10 mL的无水乙醇中，再加入六氢吡啶（6.3μL , 0.064mmol）作为催化剂，加热回流3小时。反应结束后冷却到室温，抽滤，滤饼用无水乙醇和乙醚洗，得到橘红色的粗产物，进行色谱柱提纯，用二氯甲烷作为洗脱剂，得到橘色粉末固体I（177mg，80%）。1H NMR(500 MHz, CDCl3) δ 8.96 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 8.27 (s, 1H), 8.17 (s, 1H), 7.88(d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.80 (s, 2H), 7.72 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.63 (s, 2H),7.57 – 7.47 (m, 2H), 7.06 (s, 1H).
1H NMR谱见图3。
（2）化合物DCM的合成，如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
1）化合物1的合成：在500 mL的圆底烧瓶中，将邻羟基苯乙酮（10 g，73.5 mmol）溶于250 mL乙酸乙酯中，搅拌均匀后再将钠（8.0 g，0.33 mol）切碎后加入溶液中。在室温条件下剧烈搅拌8 小时后，过滤可得到黄色固体。然后用100 mL去离子水溶解所得到的黄色固体，接着用浓盐酸调节 pH至中性，过滤得到灰白色固体化合物1（8.0 g，62%），得到的粗品不需要提纯，可直接用于下一步反应。
2）化合物2的合成：在一个250 mL的圆底烧瓶中，取70 mL冰乙酸溶解化合物1（6.95 g，38.9 mmol），接着向乙酸溶液逐滴缓慢加入4.6 mL浓硫酸，滴加完毕后，在118 ℃的条件下，将混合溶液回流1 小时，然后将溶液冷却至室温后，倒入冰水中，用氢氧化钠把溶液 pH调节至中性，继续搅拌一段时间后，减压过滤得到灰白色固体化合物2（4.5g，85%），所得粗品不需要提纯，可直接用于下一步反应。
3）化合物DCM的合成：取25 mL乙酸酐将化合物2（4.78 g，29.9 mmol）和丙二腈（2.40 g，36.2 mmol）溶解，接着将溶液在139 ℃的条件下回流16 h后，减压除去乙酸酐。然后将80 mL去离子水倒入残留物中，继续回流30 分钟。反应液冷却至室温后，用二氯甲烷萃取三次后，合并有机相并用无水硫酸钠干燥后，减压除去二氯甲烷后得到褐色油状物。柱色谱分离提纯后得到橘黄色絮状固体，接着用乙醇重结晶得到化合物DCM（1.13 g，27%）。1HNMR (500 MHz, CDCl3) δ8.92 (d, 1H, J = 8.0Hz), 7.72 (t, 1H, J = 8.0 Hz),7.45(t, 2H, J = 8.0 Hz), 6.72 (s, 1H), 2.44 (s, 3H)。
1H NMR 谱见图4。
实施例3
化合物DCM-q、化合物DCM-q中加入不同浓度的Cys的DMSO/HEPES的体积比为2/8的混合溶液的配置及紫外性质分别表征。
将化合物DCM-q溶于DMSO/HEPES混合溶剂中，制备浓度为2X10-5 mol/L的溶液；将Cys溶于水中，制备浓度为0.2 mol/L的溶液。
向化合物DCM-q溶于DMSO/HEPES混合溶剂中，分别加入0～1.8当量的Cys的水溶液，对化合物DCM-q溶于DMSO/HEPES溶液及化合物DCM-q加Cys之后的紫外性质分别进行表征，见图5。
图5为探针DCM-q（2.0×10-5 M）在DMSO:HEPES= 2: 8（0.01M，pH=7.2）的溶液中，加入0～1.8当量的Cys（2.0×10-3 M）的紫外滴定图。

Claims (2)

1.一种选择性检测Cys的苯并吡喃腈类荧光探针分子DCM-q的制备工艺过程，其特征包括如下步骤：
在氮气条件下，准确称取的(E)-2-(2-(2-喹啉基)乙烯基)-4H-苯并吡喃-4-亚基)丙二腈（I）溶解于10mL的除水的二氯甲烷中，再取92mg，0.56mmol的三氟甲磺酸甲酯于混合溶液中，在室温下搅拌不少于12小时， 反应结束后过滤沉淀，用无水乙醇和乙醚洗涤，得到粗产物红色粉末，柱层析分离提纯，洗脱剂：二氯甲烷/甲醇= 20/1，
Figure 2647DEST_PATH_IMAGE002
得到36mg，分离产率为50%的橙红色粉末荧光探针分子DCM-q。
2. 根据权利要求1所述的一种选择性检测Cys的苯并吡喃腈类荧光探针分子的制备工艺，其特征在于所述的(E)-2-(2-(2-喹啉基)乙烯基)-4H-苯并吡喃-4-亚基)丙二腈（I）的合成：氮气条件下，将100mg, 0.64mmol的2-喹啉甲醛和134mg, 0.64mmol的2-(2-甲基-4H-吡喃-4-亚基)丙二腈DCM溶解在10 mL的无水乙醇中，再加入6.3μL , 0.064mmol的六氢吡啶作为催化剂，加热回流不少于3小时；反应结束后冷却到室温，抽滤，滤饼用无水乙醇和乙醚洗，得到橘红色的粗产物，进行色谱柱提纯，用二氯甲烷作为洗脱剂，得到177mg，分离产率为80%的橘色粉末固体(E)-2-(2-(2-喹啉基)乙烯基)-4H-苯并吡喃-4-亚基)丙二腈（I）。
CN201811187598.4A 2018-10-12 2018-10-12 一种检测Cys的苯并吡喃腈类荧光探针分子的制备工艺 Active CN109180652B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811187598.4A CN109180652B (zh) 2018-10-12 2018-10-12 一种检测Cys的苯并吡喃腈类荧光探针分子的制备工艺

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811187598.4A CN109180652B (zh) 2018-10-12 2018-10-12 一种检测Cys的苯并吡喃腈类荧光探针分子的制备工艺

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109180652A CN109180652A (zh) 2019-01-11
CN109180652B true CN109180652B (zh) 2021-12-14

Family

ID=64948124

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811187598.4A Active CN109180652B (zh) 2018-10-12 2018-10-12 一种检测Cys的苯并吡喃腈类荧光探针分子的制备工艺

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109180652B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103351335A (zh) * 2013-05-28 2013-10-16 中南大学 一种荧光增强检测含巯基氨基酸的荧光分子探针的合成及应用
CN108191848A (zh) * 2018-02-23 2018-06-22 银川高新区广煜科技有限公司 制备用于检测半胱氨酸的试剂盒的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103351335A (zh) * 2013-05-28 2013-10-16 中南大学 一种荧光增强检测含巯基氨基酸的荧光分子探针的合成及应用
CN108191848A (zh) * 2018-02-23 2018-06-22 银川高新区广煜科技有限公司 制备用于检测半胱氨酸的试剂盒的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Real-Time Monitoring of Endogenous Cysteine Levels In Vivo by near-Infrared Turn-on Fluorescent Probe with Large Stokes Shift;Yu Qi,等;《Anal. Chem.》;20171128;第1014-1020页 *
小分子生物硫醇荧光探针研究进展;王胜清，等;《有机化学》;20140507;第1717-1729页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN109180652A (zh) 2019-01-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111808109B (zh) 一种哒嗪并喹喔啉二胺席夫碱钴离子荧光探针及其制备方法
CN111217799A (zh) 一种吲哚盐-香豆素衍生物及其合成方法和应用
CN109467551A (zh) 选择性检测gsh的香豆素类荧光探针分子的制备工艺
CN111233804A (zh) 苯并吡喃氧鎓离子-香豆素衍生物及其合成方法和应用
CN112939918B (zh) 一种香豆素衍生物ctt及其合成方法和应用
CN114437013A (zh) 香豆素-苯并吡喃鎓盐衍生物mi-bp-cc及其合成方法和应用
CN108129435B (zh) 一种新型铁离子荧光探针及其制备方法
Das et al. Benzimidazole-based polyheterocycles from ninhydrin: Synthesis, X-ray crystal structure and photophysical property
CN109180652B (zh) 一种检测Cys的苯并吡喃腈类荧光探针分子的制备工艺
CN112485231B (zh) 一种二氧化硫和谷胱甘肽联合检测试剂盒
CN109369569B (zh) 一类检测丙酮醛的荧光探针及其制备方法和应用
CN111233851A (zh) 东莨菪素苯磺酰基呋咱氮氧化物类衍生物及其制备方法与用途
CN113666937B (zh) 一种用于检测锌离子的近红外荧光探针及其制备方法和应用
CN108947916B (zh) 一种Perimidine醌类衍生物及其制备方法和应用
CN112480909B (zh) 一种用于检测细胞内谷胱甘肽的荧光探针及其制备方法和应用
CN106554770A (zh) 一种三氮唑衍生物的制备及其应用
CN112851650B (zh) 一种超快速检测生物硫醇荧光探针的制备方法及其应用
CN111072694A (zh) 一种硫化氢识别检测荧光探针及其制备方法与应用
CN111004166A (zh) 一种spdib的制备方法
CN109503634B (zh) 一种异恶唑衍生物及其合成方法和检测硫化氢的应用
CN106220634A (zh) 培美曲塞二钠的相关物质f和g及其制备和检测方法
CN107141303B (zh) 一种反应型巯基化合物探针及其制备方法
CN108558746A (zh) 一种Nitro-PAPS的合成方法
CN108610349A (zh) 一种n-(2-羟基-5-氯苯)基罗丹明b酰肼的制备及其应用
CN110642871B (zh) 一种用于铜离子检测的大斯托克斯位移深红荧光探针rqna及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant