CN109169288A - 一种由空心菜茎秆第一节间诱导再生植株的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种由空心菜茎秆节间诱导再生植株的方法，包括选取种子灭菌后接种于生苗培养基暗培养至种子露白后，进行正常光照培养，生苗培养基为MS添加0.05％含量PPM；切取无菌苗茎秆第一节间作为外植体，接种于诱芽培养基上诱导产生不定芽，诱芽培养基为MS+1.0mg/L 6‑BA+0.1mg/L IAA；将不定芽自基部切下作为外植体，接种到生根培养基中进行生根诱导，生根培养基为1/2MS+0.1mg/L NAA；待空心菜再生苗生长状况良好时，炼苗1d后，将植株移栽到含有品氏泥炭土的营养钵中培养，温度为24℃，光照强度为2500lux，光照时间为16h/d。采用茎秆第一节间作为外植体，配合特制诱芽培养基和生根培养基培养，显著提高诱芽率和生根质量，本发明构建的离体再生体系，为后续空心菜遗传转化的研究奠定了基础。

Description

一种由空心菜茎秆第一节间诱导再生植株的方法
技术领域
本发明涉及植物培育领域，尤其涉及一种由空心菜茎秆第一节间诱导再生植株的方法。
背景技术
空心菜(Ipomoea aquatica Forsk)又称蕹菜，属于旋花科甘薯属草本植物，既能水生也能陆生。空心菜营养价值高，是颇受人们喜爱的蔬菜，可炒食、凉拌和做汤等。另外，空心菜还具有清热、解毒、凉血、利尿和通便等功效以及净化水环境的作用。空心菜根系分布浅，须根发达，茎蔓生，圆形而中空，柔软，绿色或淡紫色，茎粗1-2厘米，茎有节，节间长为3.5-5厘米，最长的可达7厘米以上，每节除腋芽外，还可长出不定根，茎秆第一节间为紧子叶节和第一片真叶节之间的部分。空心菜具有耐高温高湿，不定根发达等特性，基因组相对小且为二倍体，可作为甘薯属研究的模式植物，通过遗传转化手段验证重要基因的功能。由于种脐结构特殊，造成空心菜种子消毒困难，污染率高，无菌苗获得率低。空心菜的离体再生频率低，基因型依赖性强，培养过程中容易发生褐化或玻璃化现象，这些限制了空心菜深入的基于遗传转化的功能基因组研究和空心菜分子育种的进行，因此建立高效的空心菜离体再生体系尤为重要。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种由空心菜茎秆第一节间诱导再生植株的方法，为空心菜植株再生提供了新的外植体类型，解决了空心菜再生植株时存在的诱芽率低、生根质量差的问题。
本发明采用的技术手段如下：一种由空心菜茎秆第一节间诱导再生植株的方法，包括以下步骤：
S101无菌苗的培育：选取饱满的空心菜种子，灭菌后接种于生苗培养基暗培养至种子露白后，进行正常光照培养，待子叶完全展开后备用，所述生苗培养基为MS基本培养基上添加0.05％含量PPM；
S102不定芽的诱导
待步骤S101得到的无菌苗长出茎段后，切取无菌苗茎秆第一节间作为外植体，接种于不定芽诱导的诱芽培养基上，20d后第一节间部位开始诱导产生不定芽，诱芽培养基为基本培养基MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L IAA；
S103不定芽的生根培养
将步骤S102诱导得到的不定芽自基部切下作为外植体，接种到生根培养基中进行生根诱导，2d后开始生根，10d后长出健壮的根系，生根培养基为1/2MS+0.1mg/L NAA；
S104炼苗和移栽
待空心菜再生苗生长状况良好时，在培养室内将其瓶口松开，炼苗1d后，将植株从培养基中小心取出，清水洗净根部残留的培养基，移栽到含有品氏泥炭土的营养钵中，放置于人工培养箱中，培养室温度为24℃，光照强度为2500lux，光照时间为16h/d，1周后转移到室外正常管理。
优选地，步骤S101中，灭菌具体为用55℃蒸馏水浸种30min，后在超净工作台上用75％酒精浸泡30s，无菌水冲洗2次，每次2min，再用20％次氯酸钠溶液浸泡20min，无菌水冲洗6次，经过本方法可彻底消毒带有特殊种脐结构的空心菜种子，可减少杂菌污染，利于获得健康无菌苗。
优选地，诱芽培养基和生根培养基的pH均为5.8，在本pH的条件下，减少愈伤组织氧化褐变，利于诱芽生根。
优选地，品氏泥炭土的纤维长度0-10mm。
采用本发明所提供的一种由空心菜茎秆第一节间诱导再生植株的方法，采用茎秆第一节间作为外植体，在没有芽点的嫩茎上，选用特制诱芽培养基MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L IAA和生根培养基1/2MS+0.1mg/L NAA，在特定浓度的激素刺激下，减少培养过程中发生褐化或玻璃化现象，提高了诱芽率和生根质量，为后续遗传转化研究提供了有力支持。
附图说明
图1为本发明的一种由空心菜茎秆第一节间诱导再生植株的方法中各个阶段示意图；其中A：空心菜播种；B：空心菜无菌苗发芽；C：空心菜无菌苗；D：空心菜不定芽诱导初期；E-F：诱导的不定芽；G-H：不定芽诱导生根；I：再生苗；J：移栽的再生苗。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本专利采用的MS为基本培养基，PPM为植物组培抗菌剂，6-BA为6-苄基腺嘌呤，IAA为吲哚乙酸，NAA为萘乙酸，KT为氯吡脲，TDZ为噻苯隆。
实施例一：一种由空心菜茎秆第一节间诱导再生植株的方法，包括以下步骤：
1、无菌苗的培育
首先选取饱满的空心菜种子，用55℃蒸馏水温烫浸种30min，然后在超净工作台上用75％酒精浸泡30s，无菌水冲洗2次，每次2min。再用20％次氯酸钠溶液浸泡20min，无菌水冲洗6次，最后接种于培育空心菜无菌苗的生苗培养基，生苗培养基为MS基本培养基上添加0.05％含量的植物组培抗菌剂PPM，暗培养至种子露白后，进行正常光照培养，待子叶完全展开后备用(约7-10d)无菌苗生长状况良好，污染率低于3％。
2、不定芽的诱导
待步骤1得到的无菌苗长出茎段后，切取无菌苗茎秆第一节间作为外植体，第一节间上无芽点，接种于不定芽诱导的诱芽培养基上，诱芽培养基为基本培养基MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L IAA，诱芽培养基pH值为5.8，20d后节间切割部位开始诱导产生不定芽。
3、不定芽的生根培养
将步骤2诱导得到的不定芽自基部切下作为外植体，接种到生根培养基中进行生根诱导，生根培养基为1/2MS+0.1mg/L NAA，培养基pH值为5.8，2d后开始生根，10d后长出健壮的根系。
4、炼苗和移栽
待空心菜再生苗生长状况良好时，在培养室内将其瓶口松开，炼苗1d。炼苗完成后，将植株从培养基中小心取出，清水洗净根部残留的培养基，移栽到含有品氏泥炭土(纤维长度0-10mm)的营养钵中，放置于人工培养箱中，培养室温度为24℃，光照强度为2500lux，光照时间为16h/d，1周后转移到室外正常管理，本实施例的空心菜茎秆第一节间诱导再生植株的过程如示意图图1。
实施例二：不同诱芽培养基对空心菜茎秆第一节间不定芽诱导的影响
将空心菜茎秆第一节间置于不同浓度激素的诱芽培养基上，如表1，随着6-BA浓度的升高，诱导率呈现先上升后下降的趋势，6-BA浓度为2mg/L时，不定芽诱导率下降，可能高浓度的6-BA对不定芽有抑制作用。而随着IAA浓度的升高，不定芽诱导率下降，可见低浓度的IAA可以促进不定芽的生成，高浓度的IAA反而会产生抑制作用。在6-BA浓度为1.0mg/L，IAA浓度为0.1mg/L时诱导率最高，为20％。如表2，相对于其它常用的激素配方，本发明采用的激素配方对不定芽诱导率较高。
表1不同浓度激素配比对空心菜茎秆第一节间不定芽诱导的影响
表2不同激素配比对空心菜不定芽诱导的影响
实施例三：不同生根培养基对空心菜生根培养的影响
本试验研究不同浓度生长素NAA对空心菜不定芽生根的影响，将诱导的不定芽自基部切下，接种到含有不同浓度的NAA的1/2MS、MS基本培养基上，每个处理20个外植体，10d后观察生根情况。根据表3可知，在未添加任何植物激素时，不定芽也可长出不定根，从而形成完整植株，但是所需时间较长，且不定根数较少，在添加NAA后，生根时间缩短且生根数明显增多，随着NAA浓度的升高，生根数呈现先上升后降低的趋势。同时与MS基本培养基相比，1/2MS基本培养基上所得须根较长，生根数较多，可见1/2MS为诱导空心菜不定芽生根的最佳基本培养基，因此诱导空心菜不定根形成的最佳培养基配方为1/2MS+0.1mg/L NAA。
表3不同生根培养基对不定芽生根的影响
综上所述，采用本发明所提供的一种由空心菜茎秆第一节间诱导再生植株的方法，采用茎秆第一节间作为外植体，选用特制诱芽培养基和生根培养基，尤其是特定浓度的激素刺激，在没有芽点的嫩茎上，提高了诱芽率和生根质量，为后续遗传转化研究提供了有力支持。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。

Claims (4)

1.一种由空心菜茎秆第一节间诱导再生植株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S101无菌苗的培育：选取饱满的空心菜种子，灭菌后接种于生苗培养基暗培养至种子露白后，进行正常光照培养，待子叶完全展开后备用，所述生苗培养基为MS基本培养基上添加0.05％含量PPM；
S102不定芽的诱导
待步骤S101得到的无菌苗长出茎段后，切取无菌苗茎秆第一节间作为外植体，接种于不定芽诱导的诱芽培养基上，20d后第一节间部位开始诱导产生不定芽，诱芽培养基为基本培养基MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L IAA；
S103不定芽的生根培养
将步骤S102诱导得到的不定芽自基部切下作为外植体，接种到生根培养基中进行生根诱导，2d后开始生根，10d后长出健壮的根系，生根培养基为1/2MS+0.1mg/L NAA；
S104炼苗和移栽
待空心菜再生苗生长状况良好时，在培养室内将其瓶口松开，炼苗1d后，将植株从培养基中小心取出，清水洗净根部残留的培养基，移栽到含有品氏泥炭土的营养钵中，放置于人工培养箱中，培养室温度为24℃，光照强度为2500lux，光照时间为16h/d，1周后转移到室外正常管理。
2.根据权利要求1所述的一种由空心菜茎秆第一节间诱导再生植株的方法，其特征在于，所述步骤S101中，灭菌具体为用55℃蒸馏水浸种30min，后在超净工作台上用75％酒精浸泡30s，无菌水冲洗2次，每次2min，再用20％次氯酸钠溶液浸泡20min，无菌水冲洗6次。
3.根据权利要求1所述的一种由空心菜茎秆第一节间诱导再生植株的方法，其特征在于，所述诱芽培养基和生根培养基的pH均为5.8。
4.根据权利要求1所述的一种由空心菜茎秆第一节间诱导再生植株的方法，其特征在于，所述品氏泥炭土的纤维长度0-10mm。
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