CN109153995A - miR-125a-3p靶向PTB蛋白及其在制备抗轮状病毒药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了miR‑125a‑3p抑制靶定蛋白PTB表达以及其在制备抗轮状病毒药物中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,尤其涉及miR-125a-3p靶定PTB调控轮状病毒复制,以及利用miR-125a-3p靶定PTB蛋白表达来制备抗轮状病毒药物过程中的用途。
背景技术
轮状病毒(Rotavirus,RV)属于呼肠孤病毒属,是一种无包膜的二十面体形状的双链RNA病毒。是引起五岁以下婴幼儿腹泻的主要病原体之一。目前对于轮状病毒感染机制的研究,仍然不是十分清楚。病毒感染宿主细胞包括病毒吸附和入侵细胞,病毒基因组的表达和复制,病毒颗粒的装配和释放三个过程。病毒在宿主细胞中的成功复制是病毒结构蛋白和非结构蛋白与宿主细胞相互作用的结果。在进化过程中,作为外源物质,病毒发掘了多种适应宿主细胞微环境的策略,包括调控宿主细胞的microRNA表达水平。
miR-125是一类从线虫到人广泛表达的高度保守的MicroRNAs(miRNAs)家族,包括三类miRNAs:miR-125a,miR-125b-1和miR-125b-2,在各种疾病特别是肿瘤方面和宿主免疫反应中起重要调控作用。miR-125a是miR-125家族中的一员,定位于第十九号染色的长臂1区3亚区(19q13),根据其转录方向不同可产生两种成熟miR-125a:miR-125a-3p和miR-125a-5p。研究表明miR-125a-5p能够干扰HBV表面抗原的表达进而抑制病毒的复制,而HBV的X蛋白能够上调肝脏的miR-125a的表达水平,作为负反馈环调控HBV的增殖。关于miR-125-3p调控病毒感染的研究还比较少,在轮状病毒感染中的调控机制还未见报道。在我们的研究中,发现轮状病毒感染宿主细胞后miR-125a-3p的表达水平出现了下调,空白对照宿主细胞microRNAs表达水平变化,并且在轮状病毒感染中的调控机制还不清楚,急需探讨。
多聚嘧啶序列结合蛋白(polypyrinidine tract binding protein,PTB),属于hnRNP家族,是外显子识别抑制因子中研究较多的一类RNA结合蛋白,结合于C或U富集的短的RNA序列,最初是以剪接因子的身份而被鉴定的,主要通过结合在pre-mRNA的不同位置而对可变外显子的剪接实行正负双向调控,近年来被发现在神经发育和肿瘤发生中有重要功能。PTB大小为57kDa,N端包含核定位和核输出信号,由4个RNA识别区域构成(RRM1-4)。四个结构域均能结合RNA,其中RRM3和4能够形成稳定的连续结构。PTB能够快速往返胞核和胞质的穿梭蛋白,主要定位表达于细胞核,调控组织特异性的识别和可变剪接。研究表明,PTB作为广泛表达的调控蛋白,与病毒的感染存在相互作用。甲肝病毒(hepatitis A virus,HAV)、脊髓灰质炎病毒(poliovirus)、丙肝病毒(hepatitis C virus)及柯萨奇病毒CVB3(Coxsackievirus B3)的翻译和复制与PTB密切相关,双链RNA病毒尤其是轮状病毒与PTB的调控关系还未见报道。
病毒与宿主细胞的相互作用研究是了解病毒感染增殖和预防病毒感染的关键。在本研究中,我们以轮状病毒野毒株ZTR-68为研究对象,发现轮状病毒感染宿主细胞后miR-125a-3p表达水平下调,人为上调miR-125a-3p能够抑制轮状病毒复制,PTB蛋白作为miR-125a-3p的新靶点,二者协同调控轮状病毒复制。该研究有助于深入了解轮状病毒与宿主细胞间相互作用原理,为轮状病毒改变宿主细胞microRNA表达水平,调控宿主RNA结合蛋白PTB,利用宿主细胞RNA翻译方式促进自身蛋白复制的调控机制提供实验依据。以PTB为靶点的药物研究正在进行中,若由miR-125a-3p介导的PTB促进轮状病毒增殖的调控环路存在,该研究也可以为进一步研究如何防治轮状病毒感染开发抗轮状病毒药物提供有益的借鉴。
发明内容
本发明的目的在于找到microRNAmiR-125a-3p靶定PTB蛋白表达以及其在制备抗轮状病毒药物中的用途。
miR-125a-3p的靶基因为PTB,结合位置在PTB基因的3’UTR区的412nt-437nt,通过双荧光素酶报告系统验证miRNA(mml-miR-125a-3p成熟序列)对目的基因PTB的调控作用,将PTB基因3’UTR区的412nt-437nt的序列GGCTCCTGCAGGATCATGTGCCTGG突变为CCGAGGTGCAGGATCATGTGCCTGG后,能够明显降低miR-125a-3p对目的基因PTB的luciferase表达,说明PTB是miR-125a-3p的靶基因,且结合位置在PTB基因3’UTR区的412nt-437nt。抑制PTB mRNA表达的方法,通过人为导入miR-125a-3p能够抑制PTB的表达,PTB mRNA的表达水平与miR-125a-3p的表达水平呈负相关,即随着miR-125a-3p表达水平的上调,PTB mRNA和蛋白的表达水平下调,PTB是miR-125a-3p的一个新靶点。
miR-125a-3p靶定PTB在制备抗轮状病毒药物中的用途。
本发明通过体外转染miR-125a-3p mimics和体内感染轮状病毒乳鼠模型实验发现宿主细胞miR-125a-3p会抑制轮状病毒的复制和增殖,但宿主细胞miR-125a-3p在感染轮状病毒后表达水平出现下调,且随病毒感染时间和单个细胞病毒感染个数(Multiplicityof infection,MOI)下调增强,说明轮状病毒感染宿主细胞后miR-125a-3p表达水平的下调,是病毒应对宿主对抗作用做出的主动调控策略,能够对抗宿主细胞的抗病毒效应,促进自身复制。
PTB是外显子识别抑制因子中研究比较多的一类蛋白,结合于内含子的嘧啶丰富成份,能够快速往返于胞核和胞质的穿梭蛋白。PTB能够与mRNA的5’和3’非翻译区(UTRs)的多聚嘧啶序列结合,参与mRNA 3’末端的剪切和多聚腺苷化,mRNA定位及稳定性维持。同时PTB也能够与RNP复合体之间相互作用,进行RNP的结构重塑。除了调控RNA的可变剪接和代谢过程,PTB还可以作为IRES-trans-acting-factor(ITAF)结合于病毒和细胞RNAs的IRES结构调控病毒蛋白和细胞RNAs的翻译。PTB作为RNA结合蛋白,在多种病毒翻译机制中起调控作用,但在轮状病毒中的研究还未见报道。轮状病毒作为RNA病毒,很有可能与PTB的表达改变密切相关。通过miRnada软件预测,双荧光素酶报告检测系统和体外转染实验验证了miR-125a-3p与PTB之间存在靶定关系,PTB是miR-125a-3p的一个新的靶基因,miR-125a-3p能够抑制靶基因PTB的mRNA和蛋白表达。
miR-125a-3p能够抑制轮状病毒的复制,PTB是miR-125a-3p的一个新靶点,为轮状病毒与宿主细胞microRNAs之间的相互作用研究提供实验基础,可用于利用microRNAsmiR-125a-3p靶向PTB这个原理的抗轮状病毒药物的制备。
附图说明
图1:miR-125a-3p在感染轮状病毒ZTR-68株的MA104细胞中的表达检测。(A)以MOI=0.5感染病毒后不同感染时间(0,6,12,24,36and 48h)miR-125a-3p表达水平的RT-PCR检测结果;(B)感染24h后不同MOI(0.1,0.5,1,1.5and 2)检测结果;(C)不同G型轮状病毒包括G1(ZTR-68),G1(WA),G3(SA11),G4(Gottfried),and G9(ZTR-18)感染MA104细胞后miR-125a-3p表达水平检测。
图2:miR-125a-3p在轮状病毒感染中的作用检测。(A)miR-125a-3p mimics和inhibitor转染MA104细胞后通过RT-PCR检测miR-125a-3p表达水平,*P<0.05,Error bars代表标准偏差;(B)上调和下调miR-125a-3p表达,病毒感染16h后,RT-PCR检测冻融后病毒上清病毒NSP3和VP7,与对照相比*P<0.01,Error bars代表标准偏差;(C)上调和下调miR-125a-3p表达,病毒感染16h后,蚀斑检测收获病毒的滴度。
图3:miR-125a-3p在轮状病毒与宿主细胞相互作用中的作用检测。(A)上调和下调miR-125a-3p表达,病毒感染16h后收获病毒液通过透射电镜H-7650观察病毒颗粒及病毒池形成情况;(B)上调和下调miR-125a-3p表达,RV阳性荧光细胞计数,*P≤0.01;(C)上调和下调miR-125a-3p表达(转染mimics或者inhibitor),病毒感染16h,通过免疫荧光检测RV感染情况。
图4:miR-125a-3p与宿主细胞PTB的靶定关系检测。(A)通过miRanda v3.3aalgorithm分析miR-125a-3p结合PTB基因的位置;(B)荧光素酶活性分析:在HEK293细胞中转染miR-125a-3p mimics,miR control,pRL-TK,携带野生型PTB序列和突变型序列的荧光素酶质粒,检测荧光素酶活性,每个样品设置3个复孔,重复三次实验,*P≤0.05;(C)miR-125a-3p结合PTB位置区域及突变序列;(D)RT-PCR检测miR-125a-3p与PTB之间的相互作用:MA104细胞中转染miR-125a-3p的mimics和inhibitor,转染24h后检测PTB的mRNA表达水平,*P≤0.01;(E)Western blot检测miR-125a-3p与PTB之间的相互作用;(F)病毒感染MA104细胞不同时间(0,12,24和48h)同时检测miR-125a与PTB的表达水平。
具体实施方式:
实施例1、miR-125a-3p在轮状病毒感染中的表达检测
对感染轮状病毒的MA104细胞进行了小RNA深度测序检测基因差异表达谱,经过分析筛选出了36个表达有显著差异的microRNA。这36个microRNAs中有29个表达水平下调,有7个表达水平上调。其中miR-125a-3p在轮状病毒ZTR-68或Wa株感染MA104细胞或HT-29细胞后表达水平都明显下调。为了进一步明确miR-125a-3p在轮状病毒感染中表达变化,我们检测了不同基因型(G1、G3、G4、G9)轮状病毒,以及相同轮状病毒不同感染剂量和相同轮状病毒不同感染时间段的轮状病毒感染后PTB的表达水平。我们用轮状病毒野毒株ZTR-68以MOI=0.5感染MA104细胞后,取不同时间点(0h、6h,12h,24h、36h和48h)收集细胞总RNA,通过RT-PCR检测miR-125a-3p的表达情况,结果显示,随感染时间的延长,miR-125a-3p表达水平不断降低(图1-A);用野毒株ZTR-68以不同剂量(MOI=0.1、0.5、1、1.5、2)感染MA104细胞后,miR-125a-3p的表达水平随MOI的增加也不断下调(图1-B)。不同基因型(G1、G3、G4、G9)的轮状病毒后感染MA104细胞后,miR-125a-3p表达水平也出现了不同程度的下调(图1-C);综上,在感染轮状病毒后,miR-125a-3p的mRNA表达水平明显上调,随病毒感染时间和MOI的增加而下调,且在不同基因型的轮状病毒感染中表达均为下调。
实施例2、miR-125a-3p抑制病毒增殖
合成针对miR-125a-3p的抑制剂(inhibitor)和类似物(mimics),以及对照NC,对MA104细胞转染miR-125a-3p mimics/inhibitor/NC后,qRT-PCR鉴定转染效率,检测miR-125a-3p的表达水平。RT-qPCR结果表示转染inhibitor宿主细胞MA104中miR-125a-3p的表达水平有明显的下调,而转染mimics后miR-125a-3p的表达水平明显上调(图2-A)。qRT-PCR检测病毒基因组VP7以及NSP3的转录情况,与对照组NC感染轮状病毒相比,转染miR-125a-3p mimics的MA104细胞中VP7、NSP3的mRNA转录水平明显下调,而转染miR-125a-3pinhibitor的MA104细胞中VP7、NSP3的mRNA转录水平有一定程度的上调(图2-B),miR-125a-3p能抑制轮状病毒的复制。收集轮状病毒感染后72h的病毒上清,在miR-125a-3p上调的细胞中连续传4代,通过蚀斑法检测病毒滴度,同时以正常MA104为对照组。结果显示,对照连续传代,病毒滴度基本维持稳定,而上调了miR-125a-3p的MA104细胞,病毒在传代过程中病毒滴度有所下降(图2-C)。病毒滴度测定结果表示,上调miR-125a-3p会抑制轮状病毒子代病毒的复制。
通过转染试剂将miR-125a-3p mimics、inhibitor以及对照NC的siRNA转染至MA104细胞24h后,感染轮状病毒(MOI=1),20h后取样做超薄切片,设置阴性对照未感染病毒的MA104细胞组。利用透射电镜观察细胞内病毒池的病毒颗粒数量的情况。转染miR-125a-3p inhibitor后感染轮状病毒,细胞中病毒池病毒颗粒数比对照组MA104感染轮状病毒的病毒颗粒数有所增多。转染miR-125a-3p mimics后感染轮状病毒,与对照组相比病毒池的病毒颗粒数有所减少。透射电镜观查结果表示,miR-125a-3p能抑制轮状病毒的复制(图3-A)。
通过转染试剂将miR-125a-3p mimics、inhibitor以及对照NC的siRNA转染至MA104细胞24h后,感染轮状病毒(MOI=1),16h后通过免疫荧光检测轮状病毒复制情况。MA104细胞中的miR-125a-3p表达水平上调,能有效的抑制轮状病毒的复制;而将MA104细胞中的miR-125a-3p表达水平下调,能一定程度的促进轮状病毒的复制(图3-B,C)。
实施例3、miR-125a-3p靶定宿主细胞PTB基因
为了寻找miR-125a-3p与轮状病毒的潜在靶定位点,通过miRanda软件来预测miR-125a-3p分子的靶基因,包括病毒自身基因和宿主细胞基因。结果显示,miR-125a-3p分子不靶定轮状病毒基因,靶定多个宿主细胞基因。结合前期研究基础和靶基因筛选原则,我们确定了miR-125a-3p的靶基因为PTB,结合位置在2668nt-2691nt(图4-A)。构建PTB的突变和野生型质粒,通过双荧光素酶报告检测系统检测miR-125a-3p和靶蛋白PTB之间的调控关系。结果显示miR-125a-3p对带有野生型目的基因PTB的luciferase表达具有显著地调控作用,在结合位点突变后,这种调控关系消失,由此证实PTB是miR-125a-3p的靶基因(图4-B,C)。在上调和下调miR-125a-3p的表达后,PTB的mRNA水平和蛋白水平均发生变化。miR-125a-3pmimics/inhibitor/NC 24h后,提取细胞总蛋白,通过western blot检测PTB的蛋白表达情况。结果显示,与转染对照NC相比,上调miR-125a-3p的MA104细胞中,PTB蛋白的表达水平明显下调;将miR-125a-3p的MA104细胞中,PTB蛋白的表达水平上调(图4-D,E)。转染miR-125a-3p mimics后取不同的时间点(0h、12h、24h、48h)检测,随转染时间的延长,PTB mRNA的表达水平与miR-125a-3p的表达水平呈负相关,即随着miR-125a-3p的水平上调,PTBmRNA表达下调(图4-F)。综上结果表明,miR-125a-3p能够抑制PTB的表达,PTB是miR-125a-3p的一个新靶点。
PTB基因3’ UTR区的412nt-437nt的序列GGCTCCTGCAGGATCATGTGCCTGG
突变后序列CCGAGGTGCAGGATCATGTGCCTGG
Claims (3)
1.microRNAmiR-125a-3p靶定PTB蛋白表达,miR-125a-3p的靶基因为PTB,结合位置在PTB基因的3’UTR区的412nt-437nt,通过双荧光素酶报告系统验证miRNA(mml-miR-125a-3p成熟序列)对目的基因PTB的调控作用,将PTB基因3’UTR区的412nt-437nt的序列GGCTCCTGCAGGATCATGTGCCTGG突变为CCGAGGTGCAGGATCATGTGCCTGG后,能够明显降低miR-125a-3p对目的基因PTB的luciferase表达,说明PTB是miR-125a-3p的靶基因,且结合位置在PTB基因3’UTR区的412nt-437nt。
2.抑制PTB mRNA表达的方法,其特征在于通过人为导入miR-125a-3p能够抑制PTB的表达,PTB mRNA的表达水平与miR-125a-3p的表达水平呈负相关,即随着miR-125a-3p表达水平的上调,PTB mRNA和蛋白的表达水平下调,PTB是miR-125a-3p的一个新靶点。
3.miR-125a-3p靶定PTB在制备抗轮状病毒药物中的用途。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20190104 |
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