CN109134683B - 一种火棘多糖铁复合物的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种火棘多糖铁复合物的制备方法及其应用，所述火棘多糖铁复合物的制备方法包括以下步骤：在搅拌作用下，先向火棘多糖的水溶液中加入柠檬酸三钠形成混合溶液，然后再向所述混合溶液中加入氯化铁溶液和氢氧化钠溶液，至所述混合溶液的pH值为7～9，形成反应溶液；将所述反应溶液加热至50～70℃反应1～2h后冷却，对所述反应溶液中生成的反应产物进行分离纯化，得到火棘多糖铁复合物。本发明采用火棘多糖作为配糖体，与三氯化铁反应制备火棘多糖铁复合物，通过工艺条件的优化，提高了所制备的火棘多糖铁复合物的铁含量，使得火棘多糖铁复合物具有更强的生物活性。

Description

一种火棘多糖铁复合物的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种火棘多糖铁复合物的制备方法及其应用。

背景技术

火棘(Pyracantha fortuneana(Maxim.)Li)果实，又叫赤阳子、救军粮，其果实性味干酸，药用具有健脾消积、生津止渴、清热解毒、活血止血的功效，治胸中痞块、食积、崩漏、产后淤血，还可消虫、明目。近年来的研究表明火棘果实具有很大的药用和食用开发价值。报道火棘果实总提取物具有消除自由基、降血脂、增强免疫力、增强体力和促进消化等作用。

火棘多糖是火棘果中的有效成分之一，天然产物一直是国内外研究的热点,而运用现代科学技术对天然产物的活性成分进行研究，包括分离、纯化、结构测定、结构与功能的研究是新世纪天然产物研究的趋势，具有生物活性多糖的研究是其重要组成部分。因此，研究开发火棘多糖意义重大。现代药理学研究证实火棘多糖具有多种生物学活性，其中以抗氧化、抗疲劳等研究较多也较为深入。

铁是人体中必需的微量元素，是人体血液中的血红蛋白，肌红蛋白及多种酶的重要组成部分。当体内缺铁或铁的利用发生障碍时，会使血红蛋白合成减少，新生的红细胞血红蛋白量不足；严重缺铁时不仅会发生贫血，也可引起体内含铁酶类的缺乏，导致细胞呼吸发生障碍，影响组织器官的功能，临床上可引发胃肠道、循环、神经等系统的功能障碍。铁缺乏和缺铁性贫血是当今世界上最常见的营养不良，也是我国亟待解决的微量营养素缺乏问题。传统补铁制剂的口服吸收利用率低，易引起胃肠道不良反应，且传统补铁制剂疗程长，患者难于坚持接受全程治疗，从而影响患者用药的依从性。目前较为理想的补铁剂是以三价铁为核心，多糖为配合物的复合补血制剂。多糖铁复合物(polysaccharide-ironcomplex，PIC)作为补铁剂不仅有合适的络合稳定性，对胃肠道无或甚少刺激性，而且当其释放铁之后，多糖本身具有多方面的生物活性，是对机体有益的成分，可被吸收利用。因此，是一类很有前途的口服补铁剂。

多糖铁复合物由糖基和配糖铁(Ⅲ)两部分组成，其制备方法主要包括化学合成法和模拟生物矿化法，其中，化学合成法是向多糖溶液中加入柠檬酸氢钠，缓慢滴加FeCl₃溶液，用NaOH溶液调节pH，得到红棕色胶体溶液后加热数小时，然后分别进行离心、浓缩、醇沉，加乙醇和乙醚洗涤纯化即得棕褐色多糖铁的复合物产品。然而，通过现有化学合成法制备的多糖铁复合物的铁含量较低，导致生物活性不强。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种火棘多糖铁复合物的制备方法及其应用，旨在提高所制备的火棘多糖铁复合物的含铁量。

为实现上述目的，本发明提出一种火棘多糖铁复合物的制备方法，包括以下步骤：

步骤S20、在搅拌作用下，先向火棘多糖的水溶液中加入柠檬酸三钠形成混合溶液，然后再向所述混合溶液中加入氯化铁溶液和氢氧化钠溶液，至所述混合溶液的pH值为7～9，形成反应溶液；

步骤S30、将所述反应溶液加热至50～70℃反应1～2h后冷却，对所述反应溶液中生成的反应产物进行分离纯化，得到火棘多糖铁复合物。

优选地，在步骤S20中：

所述混合溶液中的柠檬酸三钠与火棘多糖的质量比为(0.5～2)：1。

优选地，在步骤S20中：

所述氯化铁溶液的摩尔浓度为2mol/L；和/或，

所述氢氧化钠溶液的体积浓度为20％。

优选地，步骤S30中所述的对所述反应溶液中生成的反应产物进行分离纯化的步骤，具体包括：

步骤S32、将冷却后的所述反应溶液进行固液分离，收集红棕色液体；

步骤S33、对所述红棕色液体进行醇沉处理后再次使固液分离，收集沉淀物并干燥，得到火棘多糖铁复合物。

优选地，步骤S33具体包括：

步骤S33a、向所述红棕色液体中加入乙醇溶液，混合形成混合液；

步骤S33b、将所述混合液静置以使所述红棕色溶液中形成有沉淀物，然后分离出所述沉淀物，并用乙醇溶液进行洗涤后干燥，得到火棘多糖铁复合物。

优选地，在步骤S33a中：所述混合液中乙醇的体积浓度为70～75％。

本发明还提出如上所述的火棘多糖铁复合物的制备方法制得的火棘多糖铁复合物在制备抗卵巢癌的药物中的应用。

本发明提供的技术方案中，采用火棘多糖作为配糖体，与三氯化铁反应制备火棘多糖铁复合物，通过工艺条件的优化，提高了所制备的火棘多糖铁复合物的铁含量，使得火棘多糖铁复合物具有更强的生物活性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例中绘制的铁标准曲线；

图2为应用实施例中不同浓度的火棘多糖铁溶液处理卵巢癌细胞Skov3后的MTT检测结果图；

图3为应用实施例中不同浓度的火棘多糖铁溶液处理卵巢癌细胞A2780后的MTT检测结果图；

图4为应用实施例中不同浓度的火棘多糖铁溶液处理卵巢癌细胞Skov3和A2780后的细胞活力结果图；

图5为应用实施例中不同浓度的火棘多糖铁溶液处理卵巢癌细胞Skov3后的MTT检测结果图；

图6为图5中对应的平均荧光强度结果图；

图7为应用实施例中不同浓度的火棘多糖铁溶液处理卵巢癌细胞Skov3后的ROS检测结果图；

图8为图7中对应的平均荧光强度结果图；

图9为应用实施例中不同浓度的火棘多糖铁溶液处理卵巢癌细胞Skov3后的JC-1检测结果图；

图10为图9中对应的JC-1单体/JC-1聚集体的比值结果图；

图11为应用实施例中不同浓度的火棘多糖铁溶液处理卵巢癌细胞Skov3后的细胞免疫荧光法观测到的DNA修复蛋白γH₂AX的观测结果图；

图12为图11中对应的γH₂AX蛋白的平均荧光强度结果图；

图13为应用实施例中不同浓度的火棘多糖铁溶液处理卵巢癌细胞Skov3后的细胞免疫荧光法观测到的DNA修复蛋白Rad51的观测结果图；

图14为图13中对应的Rad51蛋白的平均荧光强度结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以化学合成法制成多糖铁复合物是向多糖溶液中加入柠檬酸氢钠，缓慢滴加FeCl₃溶液，用NaOH溶液调节pH，得到红棕色胶体溶液后加热数小时，然后分别进行离心、浓缩、醇沉，加乙醇和乙醚洗涤纯化即得棕褐色多糖铁的复合物产品，其中，反应过程中的pH值、反应温度、溶剂水加入量、催化剂柠檬酸氢钠加入量均会对所制备的多糖铁的质量有影响，而通过现有化学合成法制备的多糖铁复合物通常铁含量较低，导致其生物活性不强。

为解决现有技术中制备的多糖铁复合物的铁含量较低的问题，本发明提出一种火棘多糖铁复合物的制备方法，其是以火棘多糖作为配糖体与三氯化铁反应制备火棘多糖铁复合物，通过工艺条件的优化，提高了火棘多糖铁复合物的铁含量，同时，由于火棘多糖本身具有多种生物活性，与金属离子的结合不仅能够给机体提供安全无毒的微量元素，同时也发挥了火棘多糖自身的药用价值，具有更强的生物活性。在本发明提供的火棘多糖铁复合物的制备方法的一实施例中，所述火棘多糖铁复合物的制备方法包括以下步骤：

步骤S20、在搅拌作用下，先向火棘多糖的水溶液中加入柠檬酸三钠形成混合溶液，然后再向所述混合溶液中加入氯化铁溶液和氢氧化钠溶液，至所述混合溶液的pH值为7～9，形成反应溶液；

所述氯化铁溶液和氢氧化钠溶液在添加时，为避免添加量过多而使得所述混合溶液的pH值超过预设范围，优选为采用滴加的方式进行，通过控制所述氯化铁溶液和氢氧化钠溶液的滴加速度，以调节所述混合溶液的pH值为7～9，此时，所述混合溶液中产生的红棕色沉淀(氯化铁与氢氧化钠反应生成的氢氧化铁沉淀，所述氯化铁和氢氧化钠在就搅拌作用下添加可以避免生成的沉淀团聚)不再溶解，即停止滴加所述氯化铁溶液和氢氧化钠溶液，形成所述反应溶液。进一步地，在本实施例中，所述混合溶液中的柠檬酸三钠与火棘多糖的质量比为(0.5～2)：1，例如可以是0.5：1、1：1、1.25：1、1.5：1或者2：1等等，优选为2：1。

可选地，在本实施例具体实施时，可以选用摩尔浓度为2mol/L的氯化铁溶液的；和/或，选用体积浓度为20％的氢氧化钠溶液，如此，便于在所述氯化铁溶液和氢氧化钠溶液的添加时，更易于控制两者的添加量。

步骤S30、将所述反应溶液加热至50～70℃反应1～2h后冷却，对所述反应溶液中生成的反应产物进行分离纯化，得到火棘多糖铁复合物。

加热所述反应溶液的方式可以是直接加热，也可以是水浴加热，优选为水浴加热，具有升温速率平缓、温度稳定的优点。所述反应溶液在进行水浴加热反应的过程中，火棘多糖与铁结合形成火棘多糖铁，得到红棕色的反应液，而为了使更多的铁元素与火棘多糖反应，在反应过程中铁元素过量，剩余的铁元素生成氢氧化铁沉淀而析出，在反应完成后，对所述红棕色的反应液进行分离纯化，即可获得火棘多糖铁复合物。所述反应温度可以为50～70℃中的任一温度，例如50℃、55℃、60℃、65℃或70℃等等，优选为70℃；所述反应时间可以为1～2h中的任一时间，例如1h、1.5h或2h等等，优选为1.5h。

进一步地，在本实施例中，对所述红棕色的反应液进行分离纯化的方法包括以下步骤：

步骤S32、将冷却后的所述反应溶液进行固液分离，收集红棕色液体；

步骤S33、对所述红棕色液体进行醇沉处理后再次使固液分离，收集沉淀物并干燥，得到火棘多糖铁复合物。

在步骤S32和步骤S33中，所述使固液分离的方式可以是过滤或者离心等本领域常用的方式，优选为离心的方式，具有固液分离率高、操作简便的优点，例如，在步骤S32具体实施时，可以将冷却后的所述反应溶液在8000r/min的转速下离心10min，以使固液分离；在步骤S33具体实施时，可以将所述红棕色液体在8000r/min的转速下离心5min，以使故固液分离。

在步骤S33中，干燥所收集的沉淀物时，可以选用鼓风干燥、真空干燥或者微波干燥等常规干燥固体的方式，在本实施例中，优选为将鼓风干燥与真空干燥结合使用，具体实施时，可采用以下方式进行：将所收集的沉淀物放入温度设置为40℃的鼓风干燥箱中干燥4h，然后取出放入温度设置为35℃的真空干燥箱中干燥至恒重，即获得火棘多糖铁复合物，如此，干燥速度更快、效率更高。

通常而言，醇沉处理是指向中药的水体浓缩液中加入乙醇而使之达到不同的含醇量，利用某些药物成分在醇溶液中溶解度降低的特性而析出沉淀，然后固液分离以使水提液得以精制的方法，在本实施例中，按照上述醇沉处理的原理对所述所述红棕色液体进行醇沉处理，具体地，步骤S33具体包括：

步骤S33a、向所述红棕色液体中加入乙醇溶液，混合形成混合液；

在步骤S33a实施的过程中，对所述乙醇溶液的浓度和添加量不做具体限定，只需要使最终形成的所述混合液中乙醇的体积浓度为70～75％即可，优选为75％，在本实施例中，可采用以下方式进行：向所述红棕色液体中加入体积浓度为95％的乙醇溶液，其中，所述乙醇溶液与所述红棕色液体的体积比为3：1，如此，使所述混合液中乙醇的体积浓度达到75％左右。

步骤S33b、将所述混合液静置以使所述红棕色溶液中形成有沉淀物，然后分离出所述沉淀物，并用乙醇溶液进行洗涤后干燥，得到火棘多糖铁复合物。

所述混合液静置的时间以使所述红棕色溶液中不再生成沉淀物为准，通常情况下放置过夜即可，然后舍弃上清液并收集沉淀物，将所述沉淀物用适量的95％(体积浓度)乙醇溶液进行洗涤，然后离心以去除洗涤液，再将洗涤后的沉淀物干燥至恒重，即获得火棘多糖铁复合物。所制备的火棘多糖铁复合物的铁含量可达20～30％。

需要说明的是，本发明实施例的步骤S20中所采用的火棘多糖可以是从市场直接购买的原材料，也可以是从新鲜火棘果中提取出的火棘多糖提取物，在本发明实施例中，以从新鲜火棘果中提取出的火棘多糖为制备火棘多糖铁复合物的原料为例进行说明，在步骤S20之前，还包括从火棘果中提取火棘多糖的步骤，选用中药提取领域常用的水提醇沉法进行，具体操作包括以下步骤：

步骤S11、将新鲜火棘果干燥后粉碎，得火棘果粉料；

所述火棘果的干燥方式有多种，可以选用热干燥或微波干燥等方式，在本实施例中优选为真空干燥，具有干燥效率高、不影响被干燥物质自身性能的优点，干燥温度可设置为50℃左右，烘干至恒重后粉碎成为火棘果粉料。

步骤S12、先用乙醇溶液对所述火棘果粉料进行回流提取，获得火棘果提取液；

步骤S13、将所述火棘果提取液浓缩后静置至生成沉淀，弃去所述沉淀后，脱除所述火棘果提取液中的蛋白质和色素，得到处理后的提取液；

制得所述火棘果提取液后，先水浴蒸发浓缩，然后减压浓缩，得浓缩液，将浓缩液静置过夜以使其中产生沉淀，弃去产生的沉淀后，再脱除所述浓缩液中的蛋白质，常用的去除多糖中蛋白质的方法有Sevage法、三氟三氯乙烷法和三氯醋酸法等，这些方法的原理是使多糖不沉淀而使蛋白质沉淀，在本实施例中优选为采用Sevage方法脱除所述党参提取液中的蛋白质，对蛋白质的脱除效果较好，具体实施时，可采用以下方式：向所述浓缩液中加入等体积的Sevage溶液(氯仿和正丁醇以3：1的体积比混合形成的混合溶液)，充分混合使所述浓缩液中的蛋白质沉淀析出，然后弃去沉淀并保留上清液即可。另一方面，由于火棘多糖是有色的，所以在这里需要将其脱除色素以达到需要的色度要求，脱除色素可以采用活性炭等吸附剂进行吸附，也可以采用大孔树脂法进行，在本实施例中优选为采用大孔树脂吸附法进行，具体实施时可按照现有技术中大孔树脂吸附法的一般流程进行，例如通过大孔树脂预处理、样品装填以及洗脱等工序完成，在此不做赘述。

步骤S14、对所述处理后的提取液进行醇沉处理，收集醇沉处理时生成的沉淀物并干燥，得到火棘多糖。

去除蛋白质和色素后，再通过醇沉处理使所述火棘果提取液中的火棘多糖沉淀析出，即可分离并获得火棘多糖提取物，在本实施例中，步骤S14具体包括：向所述处理后的提取液中加入乙醇溶液，混合形成混合液后静置至生成火棘多糖沉淀，分离出所述火棘多糖沉淀并干燥，得到火棘多糖，其中，所述混合液中乙醇的体积浓度为80％。在具体实施时，优选为采用体积浓度为95％的乙醇溶液，便于快速调节至混合液中的乙醇浓度；形成所述混合液后静置过夜，即可使火棘多糖完全沉淀析出，然后通过离心或者过滤等常规固液分离方式(优选为离心)分离出所形成的火棘多糖沉淀物，然后干燥至恒重即可获得火棘多糖。需要说明的是，为进一步去除所提取的火棘多糖中的杂质，以提高火棘多糖的纯度，在本实施例中，优选为将收集的所述火棘多糖沉淀物再次溶解并按照上述提供的方法进行醇沉、分离和干燥，重复多次，最终获得火棘多糖的产率在68％以上。

本发明提供的技术方案中，采用火棘多糖作为配糖体，与三氯化铁反应制备火棘多糖铁复合物，通过工艺条件的优化，提高了所制备的火棘多糖铁复合物的铁含量，使得火棘多糖铁复合物具有更强的生物活性。

本发明还提出如上所述的火棘多糖铁复合物的制备方法制得的火棘多糖铁复合物在制备抗卵巢癌的药物中的应用，本发明制备的火棘多糖铁复合物的铁含量较高，可有效清除ABTS自由基、超氧根离子和金属离子，具有显著的抗氧化活性，还具有抑制癌细胞生长、诱导癌细胞凋亡的功效，可用于制备抗卵巢癌的药物，应用前景广阔。

以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例

(1)火棘多糖的提取

①取新鲜火棘果1kg，放入温度设置为50℃的真空干燥箱中烘干至恒重，粉碎后置于圆底烧瓶中，用体积浓度为90％的乙醇溶液回流提取2次，每次2小时，分别收集提取液和固体渣料；将固体渣料烘干，然后加水并在60℃下加热提取3h，收集提取液；将两次提取的提取液合并，得火棘果提取液；

②将火棘果提取液先水浴蒸发浓缩，然后减压浓缩后静置过夜，弃去产生的沉淀，再通过Sevage法脱除火棘果提取液中的蛋白质、通过大孔树脂吸附法脱除火棘果提取液中的色素，得到处理后的提取液；

③向处理后的提取液中加入提交浓度为95％的乙醇溶液，使乙醇的体积浓度达到80％，然后静置过夜，通过离心分离出溶液中析出的沉淀并干燥，得到火棘多糖。

(2)火棘多糖铁复合物的制备

①将上述步骤(1)制备的火棘多糖加入圆底烧瓶中，加入一定体积的水，搅拌使火棘多糖完全溶解，形成火棘多糖的水溶液；

②先向火棘多糖的水溶液中缓慢地加入柠檬酸三钠并不断地搅拌使其溶解，获得混合溶液；然后，在搅拌作用下向混合溶液中滴加摩尔浓度为2mol/L的氯化铁溶液和体积浓度为20％的氢氧化钠溶液，控制两者的滴加速度以调节混合溶液的pH值，当混合溶液中产生的红棕色沉淀不在溶解时，停止滴加氯化铁溶液和氢氧化钠溶液，得到反应液；

③将反应液在水浴中加热反应1.5h后冷却，通过离心弃去反应过程中生成的沉淀物，收集上清液，然后向上清液中加入3倍体积的体积浓度为95％的乙醇溶液后静置过夜，再次离心并收集沉淀，对沉淀进行向热风干燥再真空干燥至恒重，获得火棘多糖铁复合物。其中，以反应pH值(即混合溶液的pH值)X₁、反应温度X₂以及混合溶液中柠檬酸三钠与火棘多糖的质量比X₃为自变量，以吸光度A(510nm波长处的吸光度值OD₅₁₀)为响应值，利用Box-Benhnken中心组合设计3因素3水平试验，如下表1所示，对应进行多组试验，即为如表2所示的实施例1至实施例17。

表1 Box-Behnken设计因素及编码值

表2各实施例中干酵母溶液的体积以及恒温发酵培养的时间和温度条件

其中，各实施例制备的火棘多糖铁复合物产物中的铁含量采用邻菲罗啉比色法测定，具体测试方法和结果如下：

1、铁含量标准曲线测定：取8个25mL的容量瓶，分别加入铁的标准溶液各0mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL和7mL，再分别加入10％的抗坏血酸1.75mL和0.1％的邻菲啰啉2.5mL，用蒸馏水定容后摇匀，放置10min，测定510nm处的吸光度A，以铁的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制铁的标准曲线，如图1所示。

2、火棘多糖铁复合物中铁含量测定：取干燥的火棘多糖铁复合物粉末0.05g，溶于适量蒸馏水中，转移至50mL容量瓶中定容至刻度，制得火棘多糖铁溶液；取火棘多糖铁溶液1.0m L，置于50mL容量瓶内，加入10的％抗坏血酸溶液2.5mL和0.1％的邻菲啰啉溶液5.0mL，用蒸馏水定容后摇匀，然后在37℃下反应若干时间，测定510nm处的吸光度值A，按照下列公式计算铁含量Y：

实施例1至实施例17所制备的火棘多糖铁复合物的铁含量计算结果如表2所示。

采用响应曲面法对上述实验结果进行分析，以反应pH(X1)、反应温度(X2)和柠檬酸三钠与火棘多糖质量比(X3)为单因素，吸光度Y为响应值，按下列公式进行多因素回归分析：

式中，Y是与每个三级组合相关联的预测响应变量，A₀是常数，并且A_i，A_ii和A_ij是由模型估计的系数，X_i和X_j是自变量的水平，它们分别代表X₁、X₂和X₃因子对响应的线性、二次和交叉积效应；其响应的多项式回归方程如下：

Y＝-39.12478+10.7115X₁+0.36801X₂+9.33944X₃+0.128X₁X₂-0.16X₁X₃-0.17367X₂X₃-1.08775X₁ ²-0.0087025X₂ ²-0.106222X₃ ²，对上述回归方程进行方差分析，分析结果如下表3所示(表3中，P<0.05为显著作用；P<0.01为高度显著作用；P<0.001为极显著作用)。

表3回归方程方差分析

由上述表3中的分析结果可知，实验选用的模型(P<0.001)极显著，失拟项(P>0.05)不显著，表明该响应面模型用于优化合成火棘多糖铁复合物工艺是可行的。信噪比Adeq Precisior＝33.858比较高，说明该模型可以用于预测，而模型校正判定系数R² _Adj＝0.9802，说明该模型能解释98.02％的响应值变化。判定系数R²＝0.9918，说明模型拟合程度良好，可以使用该模型分析和预测合成的火棘多糖的铁含量，R² _Pred＝0.9218与R²＝0.9918的值相差不大说明该响应面方程无需做进一步优化。

根据其响应方程，确定火棘多糖铁复合物的铁含量最高时的最佳制备条件为：反应pH值为9.0，反应温度为70℃，柠檬酸三钠与火棘多糖的质量比为1：2。按照此最佳条件，根据上述实施例1提供的方法进行火棘多糖铁复合物的制备，记为实施例18，所制得的火棘多糖铁复合物的铁含量为30.76％。

应用实施例火棘多糖铁复合物的生物活性试验

以实施例18制备的火棘多糖铁复合物(铁含量为30.76％)进行生物活性试验，试验方法及结果如下：

一、抗氧化性

试验方法：配制梯度浓度的火棘多糖铁溶液，浓度分别为1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、8mg/mL和10mg/mL，每个浓度平行试验3份。按照下列方法检测火棘多糖铁清除ABTS自由基、超氧阴离子自由基和金属离子Fe²⁺自由基的活性。

(1)清除ABTS活性试验：取各种浓度样品溶液各50μL后，各加入200μL的ABTS+阳离子储液后摇匀，在室温下反应10min，在波长为734nm处测定其吸光度A₁。

(2)清除超氧阴离子自由基活性的方法:取各种浓度样品100μL后，加入6mmol/L邻苯三酚溶液0.2mL，快速混匀，于25℃准确保温4min后，用3mol/L HCL溶液0.2mL终止反应，在波长322nm处测定各管吸光度A₁值。

(3)清除金属金属离子活性的方法:取各种浓度样品各100μL，分别加入10μLFeCl₂溶液、20μL菲啰嗪试液和0.27mL的蒸馏水，在562nm处测定其吸光度为A₁。

火棘多糖铁自由基清除率的计算公式如下：

清除率(％)＝[1－(A₁－A₂)/A₀]×100

式中，A₀为对照组的吸光度(样品溶液改为蒸馏水代替)；A₁为样品吸光度；A₂为样品的本底吸光度值。

火棘多糖铁复合物对ABTS自由基、超氧阴离子自由基和金属离子Fe²⁺自由基的清除率计算结果如表4所示。

表4不同浓度的火棘多糖铁对自由基的清除率

由表4中的结果可知，各个试验组均表现出对自由基的清楚作用，且对自由基的清除率随着火棘多糖铁浓度的增加而逐渐增大，当火棘多糖铁的浓度最大时，对各种自由基清除效果依次为ABTS自由基＞金属离子Fe²⁺自由基＞超氧阴离子自由基，说明本发明实施例制备的火棘多糖铁复合物能有效清除ABTS自由基、超氧阴离子自由基和金属离子Fe²⁺自由基，具有显著的抗氧化活性。

二、抗癌活性

(1)抑癌作用

实验细胞：卵巢癌细胞(Skov3与A2780)。

试验方法：将贴壁生长的卵巢癌细胞用0.25％的胰蛋白酶消化后接种于孔板中，设4个组，3个试验组各加入浓度分别为100μg/mL、200μg/mL和400μg/mL的火棘多糖铁溶液(每个浓度设置3个平行试验)，1个空白对照组加入DEM/F12培养基，试验组和空白组均置于CO₂培养箱中培养24h，然后用MTT法(MTT比色法)检测，检测结果如表5(表5中，*表示与空白组比较P<0.05)和图2至图4所示，图2和图3分别为不同浓度的火棘多糖铁溶液处理卵巢癌细胞Skov3和A2780的MTT检测结果图(图中标尺为200μm)，图4为不同浓度的火棘多糖铁溶液处理卵巢癌细胞Skov3和A2780后对应的细胞活力结果图。

表5不同浓度的火棘多糖铁对卵巢癌细胞(Skov3与A2780)生长的抑制率

结合表5和图2至图4的结果可以看出，与空白对照组相比，各个浓度剂量的试验组的细胞(包括卵巢癌细胞Skov3与A2780)活力均表现出显著降低，且随着火棘多糖铁浓度的逐渐增大，对卵巢癌细胞Skov3与A2780的抑制率逐渐升高，说明本发明实施例制备的火棘多糖铁对卵巢癌细胞具有一定的杀伤作用，且相同浓度剂量的火棘多糖铁对Skov3的抑制作用明显强于A2780。

(2)诱导癌细胞凋亡作用

实验细胞：卵巢癌细胞(Skov3)

试验方法：将贴壁生长的卵巢癌细胞用0.25％的胰蛋白酶消化后接种于孔板中，设4个组，3个试验组各加入浓度分别为100μg/mL、200μg/mL和400μg/mL的火棘多糖铁溶液(每个浓度设置3个平行试验)，1个空白对照组加入DEM/F12培养基，试验组和空白组均置于CO₂培养箱中培养24h，然后分别用活化氧(ROS)检测、线粒体膜电位(JC-1)检测、脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)检测和细胞免疫荧光方法(均按照试剂盒的说明书进行操作)，检测不同浓度的火棘多糖铁诱导卵巢癌细胞Skov3凋亡的效果，检测结果如图5至图14所示(图5、7、9、11、13中的标尺均为100μm)。

其中，图5和图6分别为TUNEL检测的观测结果图和对应的平均荧光强度结果图，图5中，凋亡的细胞被标记成红色(图5中将观测到的红色荧光标记为的白色实心圆圈，需要说明的是，圆圈标记仅为便于将标记为红色的凋亡细胞与未标记的正常存活细胞区分开来，并不是实际观测结果)，与对照组相比，随着火棘多糖铁浓度的增加，细胞发生凋亡的数量逐渐增多，高浓度处理组的细胞凋亡则更为显著，对应地，图6中红色荧光的平均荧光强度随着火棘多糖铁浓度的增加而逐渐增大。

图7和图8分别为ROS检测的观测结果图和对应的平均荧光强度结果图，利用荧光探针DCFH-DA来检测细胞中活性氧(ROS)的水平，由图7和图8可以看出，火棘多糖铁处理组与对照组相比，DCF的平均荧光强度更高，ROS也有所提高，而且其提高幅度均随火棘多糖铁浓度的增加而逐渐增大。

图9和图10分别为JC-1检测的观测结果图和对应的JC-1单体/JC-1聚集体的比值结果图，Skov3细胞经过火棘多糖铁处理后加入JC-1来测定MMP，与对照组相比，处理组的红色荧光明显减弱，即图9中的JC-1聚集体(第一排图片)对应的红色荧光减弱；绿色荧光都有明显增强，即图9中的JC-1单体(第二排图片)对应的绿色荧光增强，而红/绿荧光强度比则都有所下降(图10所示)。

图11和12分别为细胞免疫荧光法观测到的DNA修复蛋白γH₂AX的观测结果图和对应的γ-H₂AX蛋白的平均荧光强度结果图，图13和14分别为细胞免疫荧光法观测到的DNA修复蛋白Rad51的观测结果图和对应的Rad51蛋白的平均荧光强度结果图。由图11至图14可以看出，不管是显示绿色荧光的γ-H₂AX蛋白位点(图11中第二排所示的γ-H₂AX蛋白荧光)，还是显示红色荧光的Rad51蛋白位点(图13中第二排所示的Rad51蛋白荧光)，与空白对照组相比，各个处理组的平均荧光强度均是增加的，表明火棘多糖铁会造成细胞DNA损伤，而且其平均荧光强度增加的幅度随火棘多糖铁浓度的增加而逐渐更大。

由上述分析可知，使用不同浓度的火棘多糖铁对卵巢癌细胞(Skov3)处理后，细胞发生凋亡、细胞内活性氧(ROS)升高、线粒体膜电位(MMP)遭到破坏、造成细胞DNA损伤，说明本发明实施例制备的火棘多糖铁具有诱导癌细胞凋亡的作用。

综上所述，本发明实施例制备的火棘多糖铁复合物可有效清除ABTS自由基、超氧阴离子自由基和金属离子Fe²⁺自由基，具有显著的抗氧化活性，对卵巢癌细胞(Skov3与A2780)具有一定的杀伤作用，进而抑制癌细胞的生长，还能诱导卵巢癌细胞Skov3发生细胞凋亡，可用于制备具有抗卵巢癌功效的药物，应用前景广阔。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (6)

1.一种火棘多糖铁复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤S20、在搅拌作用下，先向火棘多糖的水溶液中加入柠檬酸三钠形成混合溶液，然后再向所述混合溶液中加入氯化铁溶液和氢氧化钠溶液，至所述混合溶液的pH值为7～9，形成反应溶液；

步骤S30、将所述反应溶液加热至50～70℃反应1～2h后冷却，对所述反应溶液中生成的反应产物进行分离纯化，得到火棘多糖铁复合物；

其中，在步骤S20中：

所述混合溶液中的柠檬酸三钠与火棘多糖的质量比为(0.5～2)：1。

2.如权利要求1所述的火棘多糖铁复合物的制备方法，其特征在于，在步骤S20中：

所述氯化铁溶液的摩尔浓度为2mol/L；和/或，

所述氢氧化钠溶液的体积浓度为20％。

3.如权利要求1所述的火棘多糖铁复合物的制备方法，其特征在于，步骤S30中所述的对所述反应溶液中生成的反应产物进行分离纯化的步骤，具体包括：

步骤S32、将冷却后的所述反应溶液进行固液分离，收集红棕色液体；

步骤S33、对所述红棕色液体进行醇沉处理后再次使固液分离，收集沉淀物并干燥，得到火棘多糖铁复合物。

4.如权利要求3所述的火棘多糖铁复合物的制备方法，其特征在于，步骤S33具体包括：

步骤S33a、向所述红棕色液体中加入乙醇溶液，混合形成混合液；

步骤S33b、将所述混合液静置以使所述红棕色溶液中形成有沉淀物，然后分离出所述沉淀物，并用乙醇溶液进行洗涤后干燥，得到火棘多糖铁复合物。

5.如权利要求4所述的火棘多糖铁复合物的制备方法，其特征在于，在步骤S33a中：所述混合液中乙醇的体积浓度为70～75％。

6.如权利要求1至5任意一项所述的火棘多糖铁复合物的制备方法制得的火棘多糖铁复合物在制备抗卵巢癌的药物的应用。

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