CN112869049B - 一种磷酸化亚硝基血红蛋白色素的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种磷酸化亚硝基血红蛋白色素的制备方法及其应用,特点是其制备方法包括以下步骤:将亚硝基血红蛋白溶解至1/15 M的磷酸缓冲液中使其浓度为200mg/mL,然后在亚硝基血红蛋白溶液中加入亚硝基血红蛋白溶液质量10%的三聚磷酸钠,调节pH至8.5,水浴恒温50‑60℃,时间为30‑60min,反应结束后,将溶液pH调节至7,4℃条件下透析过夜,然后冷冻干燥,即得到磷酸化亚硝基血红蛋白,优点是经过磷酸化处理过后的亚硝基血红蛋白,在贮藏期色差值变化小,能够更好的保持色泽;并且色素在氧、光、温度、金属离子等条件下的稳定性提高。
Description
技术领域
本发明涉及一种红蛋白色素的制备方法,尤其是涉及一种磷酸化亚硝基血红蛋白色素的制备方法及其应用。
背景技术
近年来,畜产品生产加工过程中产生了大量的副产物。猪血中蛋白种类繁多,但绝大部分为血红蛋白(hemoglobin,Hb),血红蛋白存在于红血球中,占猪血总蛋白质的80%。动物血液是污染环境的一大副产物,但目前副产物血液没有得到充分利用,血红蛋白是蛋白质的优质来源,其优良的功能特性也可以赋予和提升食品在制备、加工、保藏和消费过程中的品质。目前食品当中一般都加入亚硝酸盐来发色,但亚硝酸盐会在特定条件下转变为N-亚硝胺,当人体摄入一定量时会有致癌致畸的危险,因此,食品中添加亚硝酸盐存在一定的安全隐患。目前关于血红蛋白作为天然色素的研究还不是很全面深入,亚硝基血红蛋白是一种新型且安全的肉品发色剂,但它在自然空气中,对光敏感,稳定性不高,易氧化变色,可以通过蛋白质改性技术来提高其稳定性,糖基化改性制备的糖基化亚硝基血红蛋白具有良好的稳定性和溶解性,蛋白质改性能够改善蛋白质的功能特性,然而目前尚无糖基化亚硝基血红蛋白的糖基化改性机理以及改性结合位点的相关研究,与此同时,目前国内外没有关于磷酸化改性改善亚硝基血红蛋白色素的功能特性,提高其稳定性方面的研究,因此,利用磷酸化改性开发一种天然的、健康、安全、高品质的新型色素,以期为亚硝酸盐替代物的开发提供可能。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种上色稳定性好的磷酸化亚硝基血红蛋白色素的制备方法及其应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种磷酸化亚硝基血红蛋白色素的制备方法包括以下步骤:将亚硝基血红蛋白溶解至1/15 M的磷酸缓冲液中使其浓度为200mg/mL,然后在亚硝基血红蛋白溶液中加入亚硝基血红蛋白溶液质量10%的三聚磷酸钠,调节pH至8.5,水浴恒温50-60℃,时间为30-60min,反应结束后,将溶液pH调节至7,4℃条件下透析过夜,然后冷冻干燥,即得到磷酸化亚硝基血红蛋白。
优选的,所述的硝基血红蛋白的制备方法如下:将血细胞中加入血细胞2倍体积的生理盐水,轻轻混匀后于4 ℃,10000 r/min条件下离心20 min,弃上层液,将沉淀反复洗涤3次,收集下层血细胞并记录体积;向血细胞中加入血细胞2倍的纯水,置于4℃冰箱中磁力搅拌,当溶液由暗红转为鲜红时,将溶液以3000 r/min离心15 min,弃去沉淀,得血红蛋白粗提液;在血红蛋白粗提液中加入异抗坏血酸钠和亚硝酸钠混合后,于65 ℃反应25 min,4℃避光静置12 h,得到亚硝基血红蛋白溶液。
优选的,所述的血红蛋白粗提液、所述的异抗坏血酸钠和所述的亚硝酸钠的混合比例为1 L:18 g:3 g。
优选的,水浴恒温55 ℃,时间为45min。
上述磷酸化亚硝基血红蛋白色素在制备肉制品中的应用。
与现有技术相比,本发明的优点在于:本发明一种磷酸化亚硝基血红蛋白色素的制备方法,取新鲜猪血,经过预处理、亚硝基化、磷酸化改性,从而提高色素稳定性,方法中所采用的食品色素都是天然提取物,因此,在此条件下制备的色素品质能够得以保证,且对人体的健康不存在威胁。对制备色素的稳定性效果进行理化指标测评,其结果显示:经过磷酸化处理过后的亚硝基血红蛋白,在贮藏期色差值变化小,能够更好的保持色泽;并且色素在氧、光、温度、金属离子等条件下的稳定性提高。
附图说明
图1为色素稳定性随贮藏时间的延长在不同光照条件下的稳定性变化。(A)阳光直射对色素吸光度值的影响,(B)室内自然光下对色素吸光度值的影响,(C)避光条件下对色素吸光度值得影响;
图2为色素在不同温度条件下的稳定性变化示意图;
图3为色素在不同氧化剂浓度条件下的稳定性变化示意图;
图4为冷藏过程中色素色差值变化示意图;
图5为贮藏过程中保存率变化示意图;
图6为磷酸化亚硝基血红蛋白结构表征示意图;
图7为不同处理组香肠切片图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
一、具体实施例
实施例1
一种磷酸化亚硝基血红蛋白色素的制备方法,包括下述步骤:
(1)亚硝基血红蛋白色素的制备
于宁波市屠宰中心收集5 L已加入0.5wt% 柠檬酸钠的猪血至桶里(以每0.59柠檬酸钠抗凝100 mL全血计),全程于4 ℃下运送回实验室,用100目筛子过滤除纤,再在4℃,4000 r/min条件下离心20 min,收集底部血细胞。向得到的血细胞中加入2倍体积的生理盐水(0.9% NaCl溶液),轻轻混匀后于4 ℃,10000 r/min条件下离心20 min,弃上层液,取沉淀反复洗涤3次,收集下层血细胞并记录体积。向血细胞中加入血细胞2体积的纯水,置于4℃冰箱中磁力搅拌,当溶液由暗红转为鲜红时,将溶液以3000 r/min离心15 min,弃去沉淀,得血红蛋白粗提液。准确量取1 L上述血红蛋白溶液至一具塞广口瓶(称广口瓶的总量,去皮),添加18 g的异抗坏血酸钠和3 g的亚硝酸钠混合后,于65 ℃反应25 min,4℃避光静置12 h,得到亚硝基血红蛋白(NO-Hb)溶液,加冷冻保护剂进行真空冷冻干燥(冷冻干燥条件为:冷阱温度56 ℃,真空度25.0 Pa,冷冻干燥时间14 h),得到粉状色素,避光-40 ℃保存;
(2)磷酸化亚硝基血红蛋白的制备
将亚硝基血红蛋白溶解至1/15 M的磷酸缓冲液中使其浓度为200mg/mL,然后在亚硝基血红蛋白溶液中加入亚硝基血红蛋白溶液质量10%的三聚磷酸钠,调节pH至8.5,水浴恒温55℃,时间为45min,反应结束后,将溶液pH调节至7,4℃条件下透析过夜,然后冷冻干燥,即得到磷酸化亚硝基血红蛋白,避光-40℃保存。
实施例2
同上述实施例1,其区别在于:水浴恒温50℃,时间为60min。
实施例3
同上述实施例1,其区别在于:水浴恒温60℃,时间为30min。
二、结果分析
1、磷酸化亚硝基血红蛋白与磷酸化血红蛋白、亚硝基血红蛋白在不同条件下的稳定性比较
(1)光照对蛋白稳定性的影响
将磷酸化亚硝基血红蛋白(P-NO-Hb)、磷酸化血红蛋白(P-Hb)和亚硝基血红蛋白(NO-Hb)溶解于80%的丙酮溶液中,立即测其吸光度,并分别倒入3支15 mL离心管中,其中一支放置在阳光能直射的地方,一支放置在室内自然光下,一支放置在暗处,每隔一定时间于540 nm处测定产物吸光度,确定光照对P-NO-Hb、P-Hb和NO-Hb稳定性的影响。
结果如图1所示,在室外光(图1A),室内光(图1B)和暗光(图1C)三种条件下测定了Hb,NO-Hb和P-NO-Hb的稳定性,结果表明,在上述三种条件下,P-NO-Hb都更稳定。三组实验组在黑暗,室外和室内光线下的初始吸光度值基本相同。Hb和NO-Hb组的吸光度下降速度明显快于P-NO-Hb组(P <0.05),P-NO-Hb组的吸光度值始终大于其他两组,这可能与Hb聚合引起的降解或破坏有关。在三种不同的光照条件下,各实验组在整个贮藏过程中的变化趋势基本相同。因此,P-NO-Hb在光照条件下更稳定,不易受光照影响而引起氧化和其他变质反应。此外,与Hb,NO-Hb实验组相比,P-NO-Hb组的稳定性大大提高,其可能更适合在黑暗条件下保存。
2、贮藏温度对稳定性的影响
将P-NO-Hb、P-Hb和NO-Hb溶解于80%的丙酮溶液中,立即测其吸光度,用四支离心管取上述溶液分别在室温25℃、-4℃下恒温放置,每间隔一定时间取样一次,于540 nm处测定产物吸光度,确定温度对P-NO-Hb、P-Hb和NO-Hb稳定性的影响。
结果如图2所示,不同温度能够影响的P-NO-Hb稳定性的变化。蛋白质的热稳定性是其结构完整性和功能特性的重要指标。血红素蛋白的热稳定性较低与血红素-珠蛋白键稳定性的降低有关。三组实验组的吸光度值差异很大(P <0.05)。其中,原始的Hb不耐高温,其吸光度值随温度升高而急剧下降(P <0.05)。 Hb在60℃时的吸光度值约为0.09(图2),表明它已经变性。随着温度的升高,P-NO-Hb的吸光度值也呈下降趋势(P <0.05),但下降速度没有Hb快,在80℃时吸光度仍达到0.13(图2)。表明磷酸化修饰后的P-NO-Hb稳定性增强,因此在60℃时P-NO-Hb仍未发生变性。从Hb到NO-Hb再到P-NO-Hb,当在相同温度下处理时,其热稳定性也呈上升趋势。结合图6可知,P-NO-Hb吸光度值很高,可能是由于“+ HPO3”通过C-O-P键与NO-Hb单链结合所致,影响蛋白质的空间结构,从而防止氧气和蛋白质的结合反应,使蛋白质处于脱氧状态。总之,P-NO-Hb具有很强的稳定性。
3、氧化剂对稳定性的影响
以过氧化氢为氧化剂,在含P-NO-Hb、P-Hb和NO-Hb的80%丙酮溶液中,分别加入浓度为0.3%、0.6%、0.9%和 1.2%的过氧化氢溶液,室温暗处放置1 h,于540 nm处测定产物吸光度,确定氧化剂P-NO-Hb、P-Hb和NO-Hb稳定性的影响。
结果如图3所示,三组实验组的吸光度值随着氧化剂浓度的增加而呈下降趋势,但Hb组和NO-Hb组的下降趋势更为显著,P-NO-Hb组的吸光度值始终大于其他两组。当氧化剂浓度为0〜0.6%时,样品的吸光度明显降低(P <0.05)。当氧化剂浓度大于0.9%时,Hb,NO-Hb和P-NO-Hb组的吸光度值基本保持不变(P> 0.05)。综上所述可知,Hb和NO-Hb的稳定性差,P-NO-Hb的抗氧化性显著提高(P<0.05)。这可能是由于P-NO-Hb中存在磷酸基团所致。STP通过与NO-Hb形成C-O-P共价键来降低蛋白质的α-螺旋含量(图6)。这种结构变化可以使P-NO-Hb在氧气环境中保持较高的稳定性。
4、色差的检测
色差的检测指标分为亮度 (L*),红度(a*)和黄度(b*)三种。将样品制成(4cm×4cm×2cm)厚度,用色差仪测量,每次平行分别测6次。仪器的测量光源和直径分别是D65和8mm。检测样品前先测定色差计的标准化白色板(L*= 94.93、a * =−0.24和b*= 2.99)。
结果如图4所示,与添加Hb、NO-Hb或NaNO2组相比,添加P-NO-Hb组的乳化肠具有更加理想的色泽,说明P-NO-Hb 比NaNO2具有更好的发色作用。随着贮藏时间的延长,各组的L*值基本没变化(P>0.05),但是P-NO-Hb组样品的L*值显著高于NaNO2组、Hb组和NO-Hb组样品,结合图4和图7可知,相比NO-Hb组,添加经过磷酸化改性后的P-NO-Hb组更鲜亮。肉类产品的粉红色是检验其质量的重要标准之一,由图4可知,各组的a*值随贮存时间的延长逐渐降低,但添加P-NO-Hb(添加量为1 g/kg)组的a*值显著高于NaNO2组(添加量为0.1 g/kg)、Hb组(添加量为1 g/kg)和NO-Hb组(添加量为1 g/kg)样品(P<0.05),且随时间延长,P-NO-Hb组的a*值降低均比其他组都少,这表明P-NO-Hb可以改善乳化肠的色泽,同时能够维持乳化肠色泽稳定,而且不需要与NaNO2复配使用便可以达到理想颜色。添加P-NO-Hb的乳化肠比其他组乳化肠的色泽理想,表明本研究所制得的新型色素P-NO-Hb可以代替NaNO2在肉类制品中发挥发色作用。
5、保存率检测
取2mL的P-NO-Hb、P-Hb和NO-Hb溶液,分别用0.4mol/L pH1.0的HCl-KCl缓冲液和pH5.0柠檬酸-NaHPO4缓冲液稀释,定容到10mL。混匀后,用蒸馏水作对照,在λ=540nm下测定光密度值(D)。
计算公式:保存率%=(Tt/T0)×100%=(△Dt/D0)×100%,其中T0:贮藏开始时的含量;Tt:经过t时间后的含量;T=△D=D(pH1.0)-(pH5.0)。
结果如图5所示,经过磷酸化改性后的亚硝基血红蛋白保存率下降的较慢,表明磷酸化改性增加了蛋白的稳定性。可能是由于磷酸化改性可以将磷酸基团结合到蛋白质的侧链上,通过增强蛋白分子之间的静电排斥力来增加蛋白的稳定性。因此,磷酸化改性延长了色素的保存时间,达到了实验预期效果。
综上,可以得出温度、氧化剂、光照对三者的稳定性影响都具有较强的影响。但是,相对于P-Hb和NO-Hb, P-NO-Hb在不同条件下都更加稳定,且稳定性效果更加显著,这表明本发明所得到的磷酸化亚硝基血红蛋白色素P-NO-Hb更具价值。
6、磷酸化亚硝基血红蛋白结构表征
(1)傅里叶红外(FTIR)光谱
FTIR测量是通过JASCO FT / IR-4700光谱仪(日本JASCO)。通过KBr压片法测定。在玛瑙研钵中将2 mg冻干粉末样品和200-300 mg溴化钾粉末混合在一起。然后将混合物在压机上压成透明片进行测量。波数范围为4000〜500 cm-1。
2、圆二色谱
在J-1500分光旋光计(日本JASCO)上测量二级结构含量的变化。扫描速度,带宽和灵敏度分别保持在20 nm / min,1.0 nm和100 mdeg。使用Jasco软件在允许范围内进行平滑。
结果如图6所示,天然Hb的FTIR光谱在1062、1317、1553、1679和3497 cm-1处具有明显的峰值。 酰胺I峰位于1620–1700 cm-1范围内,表示C = O拉伸振动与C-N 拉伸耦合,Hb是四聚体蛋白,其溶剂可及性应受到内部α-螺旋的阻碍。与天然Hb相比,P-NO-Hb和NO-Hb的FTIR光谱的峰形和峰位略有变化,只有一些特定的吸收峰发生了变化,表明磷酸化处理将磷酸基团与NO-Hb上的某些特定的氨基酸残基结合。由于O-P的拉伸振动,磷酸化处理后的P-NO-Hb在980 cm-1附近有吸收峰,而在1050 cm-1和1130 cm-1附近的吸收峰是由N-P的拉伸振动所致。STP与NO-Hb氨基酸侧链上的-OH和-NH2之间可以形成C-O-P或C-N-P键。此外,经磷酸化处理后,吸收峰位置略微蓝移,吸收强度增加。光谱的蓝移表明该基团变得稳定,说明磷酸化处理改变了蛋白质的二级结构,从而提高了P-NO-Hb稳定性。
由图6可知,在大约209和223 nm处的负带表明天然Hb中存在α-螺旋构象。当用STP处理后,特定的螺旋模式显著减少,这意味着α-螺旋减少,并且α-螺旋和β-转角变成β-折叠,此时,Hb,NO-Hb和P-NO-Hb的α螺旋含量分别为59.20%,52.60%和53.20%。 Hb,NO-Hb和P-NO-Hb基团之间存在显著差异(P <0.05)。α-螺旋可以稳定的主要原因是羰基氧(-CO)和氨基氢(NH-)之间存在氢键。通过引入磷酸基团增强了电荷排斥,并且由于更多的水分子结合位点,从而氢键增加。静电相互作用和氢键的稳定性可以决定α-螺旋的稳定性,从而增加蛋白质的稳定性。但是,与STP络合后,Hb的结构仍主要为螺旋形,其光谱形状保持不变。因此,STP可以通过保持α-螺旋的稳定性使P-NO-Hb具有很强的稳定性。
三、具体应用实施例
将本发明制备的新型色素磷酸化亚硝基血红蛋白(P-NO-Hb)应用于猪肉乳化肠当中,P-NO-Hb的添加量为1 g/kg。瘦肉剔除结缔组织并切丁成3 cm,肥肉切丁,将肥肉与瘦肉混匀后加入食盐、磷酸化亚硝基血红蛋白色素(P-NO-Hb)、β-环糊精和多聚磷酸盐混匀腌制,然后在6 mm孔板绞肉机中绞碎后,使用斩拌机斩拌腌制好的原料肉,并按顺序依次加入白酒、花椒粉、TG酶,斩拌期间不断加入冰水控制肉糜温度在10 ℃以下。斩拌完成后将肉糜灌入羊肠肠衣(直径3 cm)中,75 ℃条件下煮制40 min。煮制结束放置冷却后抽真空包装,于4 ℃条件下保存备用。上述白酒、花椒粉、TG酶、β-环糊精和多聚磷酸盐均为食品级。在上述猪肉乳化肠制备过程中,将磷酸化亚硝基血红蛋白色素(P-NO-Hb)删除作为空白组,将磷酸化亚硝基血红蛋白色素分别替换为亚硝酸钠(0.1 g/kg,结合国家标准 亚硝酸盐的添加量控制在国标范围内)、血红蛋白(Hb,1 g/kg)、磷酸化血红蛋白(P-Hb,1 g/kg)、亚硝基血红蛋白(NO-Hb,1 g/kg)作为对照组,结果图7所示。由图7可知,添加P-NO-Hb的乳化肠的色泽最理想。
上述说明并非对本发明的限制,本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内,做出的变化、改型、添加或替换,也应属于本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种磷酸化亚硝基血红蛋白色素的制备方法,其特征在于包括以下步骤:将亚硝基血红蛋白溶解至1/15 M的磷酸缓冲液中使其浓度为200mg/mL,然后在亚硝基血红蛋白溶液中加入亚硝基血红蛋白溶液质量10%的三聚磷酸钠,调节pH至8.5,水浴恒温50-60℃,时间为30-60min,反应结束后,将溶液pH调节至7,4℃条件下透析过夜,然后冷冻干燥,即得到磷酸化亚硝基血红蛋白,其中所述的亚硝基血红蛋白的制备方法如下:将血细胞中加入血细胞2倍体积的生理盐水,轻轻混匀后于4 ℃,10000 r/min条件下离心20 min,弃上层液,将沉淀反复洗涤3次,收集下层血细胞并记录体积;向血细胞中加入血细胞2倍的纯水,置于4℃冰箱中磁力搅拌,当溶液由暗红转为鲜红时,将溶液以3000 r/min离心15 min,弃去沉淀,得血红蛋白粗提液;在血红蛋白粗提液中加入异抗坏血酸钠和亚硝酸钠混合后,于65℃反应25 min,4℃避光静置12 h,得到亚硝基血红蛋白溶液,所述的血红蛋白粗提液、所述的异抗坏血酸钠和所述的亚硝酸钠的混合比例为1 L:18 g:3 g。
2. 根据权利要求1所述的一种磷酸化亚硝基血红蛋白色素的制备方法,其特征在于:水浴恒温55 ℃,时间为45min。
3.权利要求1制备的磷酸化亚硝基血红蛋白色素在制备肉制品中的应用。
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