CN106566278A - 血红蛋白着色剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种血红蛋白着色剂的制备方法，包括：步骤一、从畜禽新鲜血液中提取血红蛋白水溶液；步骤二、向所述血红蛋白水溶液中加入精氨酸或赖氨酸，得混合液，其中，精氨酸或赖氨酸在所述混合液中的比例为4～12mg/mL，调节pH值为9.5～12；步骤三、将所述混合液干燥。在制备过程中，添加了精氨酸或赖氨酸，精氨酸或赖氨酸作为抗氧化剂能够保护血红蛋白，使其能够维持鲜艳的红色。本发明确定了制备稳定性高的血红蛋白的最佳工艺条件，为大规模生产加工提供依据。本发明制备的新型血红蛋白着色剂产品在不同浓度的NaCl和不同梯度的pH中表现出良好的稳定性。

Description

血红蛋白着色剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种血红蛋白着色剂及其制备方法。
背景技术
2015年，我国猪牛羊出栏总数达10亿头，家禽出栏总数超过130亿羽，畜禽血总量达300万吨，是世界上畜禽血液资源最为丰富的国家。但多年以来，我国畜禽血液利用率低，仅部分用作血肠、血豆腐等传统血制品加工和以血粉形式作为动物饲料，其余约70％的畜禽血液均以污水形式排放，不仅造成资源的浪费，而且引起严重的环境污染。血红蛋白是天然红色素的一种，生产原料来源于畜禽血液血红蛋白，具有较高的营养价值和药理作用，在食品、医药、保健品领域有着广泛的应用。随着消费者对食品安全和营养健康的不断关注，崇尚自然日益增强，天然着色剂越来越受到人们的欢迎，市场前景广阔。由于血红蛋白富含亚铁离子，不仅具有着色功能，而且具有补铁保健功能，目前已被美国、荷兰、智利、西班牙等国广泛接受和使用。然而由于血红蛋白对光敏感，稳定性差，限制了其加工与应用的发展。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供了一种提高稳定性的血红蛋白着色剂的制备方法。
另外，本发明提供了一种稳定性更好的血红蛋白着色剂。
本发明提供的技术方案为：
一种血红蛋白着色剂的制备方法，包括：
步骤一、从畜禽新鲜血液中提取血红蛋白水溶液；
步骤二、向所述血红蛋白水溶液中加入精氨酸或赖氨酸，得混合液，其中，精氨酸或赖氨酸在所述混合液中的比例为4～12mg/mL，调节pH值为9.5～12；
步骤三、将所述混合液干燥。
优选的是，所述的血红蛋白着色剂的制备方法中，所述步骤二中，在向所述血红蛋白水溶液中加入精氨酸或赖氨酸时，还进行搅拌，搅拌时间为10～20min，搅拌温度为25℃～45℃。
优选的是，所述的血红蛋白着色剂的制备方法中，从畜禽新鲜血液中提取血红蛋白水溶液的具体过程包括：步骤(1)向禽畜新鲜血液中加入抗凝剂；步骤(2)对加入抗凝剂的畜禽血液进行低温离心处理，去除上层血浆，收集下层血细胞；步骤(3)对血细胞进行处理，提取血细胞破碎液；步骤(4)从血细胞破碎液中提取所述血红蛋白水溶液。
优选的是，所述的血红蛋白着色剂的制备方法中，所述步骤(1)的具体过程为：向畜禽新鲜血液以体积比为1:10加入抗凝剂，其中，抗凝剂为浓度为4％～16％的柠檬酸钠溶液。
优选的是，所述的血红蛋白着色剂的制备方法中，所述步骤(2)的具体过程为：对加入抗凝剂的畜禽血液进行低温离心处理，分离得到下层的血细胞，分离条件为3000～10000g，离心时间为20～30min，温度为2℃～10℃。
优选的是，所述的血红蛋白着色剂的制备方法中，所述步骤(3)的具体过程为：采用生理盐水对血细胞进行清洗，并加入等体积的生理盐水，超声破碎血细胞，得到所述血细胞破碎液，其中，超声功率为250w，频率为25kHz，超声处理20～40min。
优选的是，所述的血红蛋白着色剂的制备方法中，所述步骤(4)的具体过程为：将血细胞破碎液离心取一级上清液，离心条件为6000～10000g，温度为4℃～6℃，之后将一级上清液水浴加热至45℃～60℃，水浴加热时间为20～30min，再冷却，并离心收集二级上清液，离心条件为6000～10000g，温度为4℃～6℃，该二级上清液为所述血红蛋白水溶液。
优选的是，所述的血红蛋白着色剂的制备方法中，所述步骤三中，采用冷冻干燥方式，冷阱温度为-60℃，真空度为1.0Pa，干燥时间为36～48h。
优选的是，所述的血红蛋白着色剂的制备方法中，所述步骤三中，采用喷雾干燥方式，进口温度为180℃，出口温度为80℃。
一种血红蛋白着色剂，由所述的方法制备得到。
本发明所述的血红蛋白着色剂的制备方法具备以下有益效果：在制备过程中，添加了精氨酸或赖氨酸，精氨酸或赖氨酸作为抗氧化剂能够保护血红蛋白，使其能够维持鲜艳的红色。本发明确定了制备稳定性高的血红蛋白的最佳工艺条件，为大规模生产加工提供依据。
本发明制备的新型血红蛋白着色剂产品在不同浓度的NaCl和不同梯度的pH中表现出良好的稳定性。本发明制备的新型血红蛋白着色剂，大幅度提高了血红蛋白的稳定性，增加了其实用性和应用范围。
附图说明
图1为对比例中血红蛋白着色剂的全波长扫描图谱；
图2为实施例五中加入精氨酸后血红蛋白着色剂的全波长扫描图谱；
图3为实施例六中加入赖氨酸后血红蛋白着色剂的全波长扫描图谱；
图4为NaCl浓度对血红蛋白着色剂稳定性的影响结果(注：a-e表示同一处理的血红蛋白在不同的NaCl浓度下差异显著(P<0.05)，x-z表示不同处理的血红蛋白在相同的NaCl浓度下差异显著(P<0.05))；
图5为pH对血红蛋白着色剂稳定性的影响结果(注：a-g表示同一处理的血红蛋白在不同pH的缓冲液中差异显著(P<0.05)，x-z表示不同处理的血红蛋白在相同pH的缓冲液中差异显著(P<0.05))。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
本发明提供了一种血红蛋白着色剂的制备方法，包括：步骤一、从畜禽新鲜血液中提取血红蛋白水溶液；步骤二、向所述血红蛋白水溶液中加入精氨酸或赖氨酸，得混合液，其中，精氨酸或赖氨酸在所述混合液中的比例为4～12mg/mL，调节pH值为9.5～12；步骤三、将所述混合液干燥。精氨酸或赖氨酸作为抗氧化剂能够保护血红蛋白，避免血红蛋白在干燥过程中被氧化为高铁血红蛋白，维持了铁的二价状态，使其能够维持鲜艳的红色。本发明确定了制备稳定性高的血红蛋白的最佳工艺条件，为大规模生产加工提供依据。
在一个优选的实施例中，所述的血红蛋白着色剂的制备方法中，所述步骤二中，在向所述血红蛋白水溶液中加入精氨酸或赖氨酸时，还进行搅拌，搅拌时间为10～20min，搅拌温度为25℃～45℃。
在一个优选的实施例中，所述的血红蛋白着色剂的制备方法中，从畜禽新鲜血液中提取血红蛋白水溶液的具体过程包括：步骤(1)向禽畜新鲜血液中加入抗凝剂；步骤(2)对加入抗凝剂的畜禽血液进行低温离心处理，去除上层血浆，收集下层血细胞；步骤(3)对血细胞进行处理，提取血细胞破碎液；步骤(4)从血细胞破碎液中提取所述血红蛋白水溶液。
在一个优选的实施例中，所述的血红蛋白着色剂的制备方法中，所述步骤(1)的具体过程为：向畜禽新鲜血液以体积比为1:10加入抗凝剂，其中，抗凝剂为浓度为4％～16％的柠檬酸钠溶液。柠檬酸钠溶液的浓度优选为5％。
在一个优选的实施例中，所述的血红蛋白着色剂的制备方法中，所述步骤(2)的具体过程为：对加入抗凝剂的畜禽血液进行低温离心处理，分离得到下层的血细胞，分离条件为3000～10000g，优选为6000g，离心时间为20～30min，温度为2℃～10℃，优选为4℃～6℃。。
在一个优选的实施例中，所述的血红蛋白着色剂的制备方法中，所述步骤(3)的具体过程为：采用生理盐水对血细胞进行清洗，并加入等体积的生理盐水，超声破碎血细胞，得到所述血细胞破碎液，其中，超声功率为250w，频率为25kHz，超声处理20～40min。
在一个优选的实施例中，所述的血红蛋白着色剂的制备方法中，所述步骤(4)的具体过程为：将血细胞破碎液离心取一级上清液，离心条件为6000～10000g，温度为4℃～6℃，之后将一级上清液水浴加热至45℃～60℃，水浴加热时间为20～30min，再冷却，并离心收集二级上清液，离心条件为6000～10000g，温度为4℃～6℃，该二级上清液为所述血红蛋白水溶液。
在一个优选的实施例中，所述的血红蛋白着色剂的制备方法中，所述步骤三中，采用冷冻干燥方式，冷阱温度为-60℃，真空度为1.0Pa，干燥时间为36～48h。
在一个优选的实施例中，所述的血红蛋白着色剂的制备方法中，所述步骤三中，采用喷雾干燥方式，进口温度为180℃，出口温度为80℃。
本发明还提供了一种血红蛋白着色剂，由所述的方法制备得到。
对比例无精氨酸或赖氨酸的血红蛋白着色剂(即精氨酸或赖氨酸浓度为0mg/mL)
(1)采血：将经过检疫合格的羊屠宰后，将血液收集到事先装有5％抗凝剂的容器中，使血液与抗凝剂的体积比为1:10定量混合；
(2)离心：将抗凝血在4℃下以6000g离心30min，收集下层红细胞；
(3)粗提血红蛋白：将红细胞用生理盐水清洗3～5次，超声功率为250w，频率25kHz，超声处理30min，离心条件为离心力8000g，温度为4℃～6℃。
(4)精提血红蛋白：将血红蛋白粗提液60℃水浴加热30min，冷却后离心，离心力为8000g，温度为4℃～6℃。
(5)冷冻干燥。
实施例一低浓度精氨酸的血红蛋白着色剂(精氨酸浓度为4mg/mL)
(1)采血：将经过检疫合格的羊屠宰后，将血液收集到事先装有5％抗凝剂的容器中，使血液与抗凝剂的体积比为1:10定量混合；
(2)离心：将抗凝血在4℃下以6000g离心30min，收集下层红细胞；
(3)粗提血红蛋白：将红细胞用生理盐水清洗3～5次，超声功率为250w，频率25kHz，超声处理30min，离心条件为离心力8000g，温度为4℃～6℃。
(4)精提血红蛋白：将血红蛋白粗提液60℃水浴加热30min，冷却后离心，离心力为8000g，温度为4℃～6℃。
(5)血红蛋白的处理：将步骤4)所得的上清液与一定量的精氨酸混匀，调节溶液的pH，并搅拌一定时间，精氨酸在所述混合液中的比例为4mg/mL，调节pH值为9.5。
(6)冷冻干燥。
实施例二高浓度精氨酸的血红蛋白着色剂(精氨酸浓度为12mg/mL)
其中步骤与实施例一相同。步骤(5)中，添加的精氨酸浓度为12mg/mL。
实施例三低pH的精氨酸血红蛋白着色剂(pH＝9.5)
其中步骤与实施例一相同。步骤(5)中，加入10mg/mL的精氨酸后用0.1M的HCl调节pH至9.5，在室温下搅拌10min。
实施例四高pH的精氨酸血红蛋白着色剂(pH＝12)
其中步骤与实施例一相同。步骤(5)中，添加加入10mg/mL的精氨酸后用1M的NaOH调节pH至12，在室温下搅拌10min。
实施例五较高搅拌温度的精氨酸血红蛋白着色剂(45℃)
其中步骤与实施例一相同。步骤(5)中，添加加入10mg/mL的精氨酸后在45℃下搅拌10min。
实施例六赖氨酸处理的血红蛋白着色剂
其中步骤与实施例一相同。步骤(5)中，添加加入10mg/mL的赖氨酸后在室温(25℃)下搅拌10min。
测定对比例、实施例一至实施例六中所得的血红蛋白着色剂的各项指标，主要包括色泽、高铁血红蛋白含量(请看表1)。具体测定方法如下：(1)使用Digieye电子眼测量血红蛋白色素的色泽指标亮度值L*、红度值a*；(2)使用Benesch的方法测定三种状态血红蛋白含量。分别测定血红蛋白色素在560、576和630nm处的吸光度，每个样品重复3次。其三种不同状态下的血红蛋白计算公式如下：
[LHb]＝(1.013A576-0.3296A630-0.7353A560)×10-4
[Hb]＝(1.373A560-0.747A576-0.737A630)×10-4
[MetHb]＝(2.985A630+0.194A576-0.4023A560)×10-4
注：LHb-配体血红蛋白(氧合血红蛋白)
；Hb-血红蛋白；
MetHb-高铁血红蛋白
表1对比例、实施例一至实施例六的血红蛋白着色剂指标比较
项目 亮度值L* 红度值a* 高铁血红蛋白含量％
对比例 14.73±0.94g 7.51±0.76f 73.64±0.78a
实施例一 18.61±0.47f 12.48±0.54e 44.76±0.29c
实施例二 29.54±2.66b 21.14±2.55b 22.41±0.02g
实施例三 22.81±0.51d 17.31±0.47c 56.53±0.26b
实施例四 25.77±1.52c 23.47±1.28a 34.73±0.50d
实施例五 20.53±2.20e 17.12±1.01c 32.00±0.25e
实施例六 30.48±1.17a 15.95±1.89d 25.49±1.35f
注：同列不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。
虽然实施例一至实施例六都取得了相对现有技术而言不错的效果，但根据表1中的数据，可以看出，当制备的精氨酸血红蛋白着色剂的工艺参数在实施例二列出的工艺参数时，可以获得更好的效果。表1可以说明，赖氨基酸具有类似于精氨酸的作用效果。
血红蛋白着色剂的光谱扫描
对比例中的血红蛋白、实施例二中的精氨酸血红蛋白着色剂、实施例六中的赖氨酸血红蛋白着色剂分别用蒸馏水溶解配制成1mg/mL的溶液，进行全波长扫描。其吸收图谱分别如图1、图2和图3所示。血红蛋白在540nm处有一个特征吸收峰，测定不同处理的样品在540nm处的吸光度，即A540，作为血红蛋白稳定性的评价标准。全波长结果表明，在加入精氨酸或赖氨酸后，血红蛋白中的血红素铁仍能够维持二价的状态，说明精氨酸或赖氨酸抑制了血红蛋白的氧化，添加精氨酸或赖氨酸后血红蛋白能够维持良好的色泽。
测定NaCl对血红蛋白着色剂稳定性的影响
分别配制浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0M的NaCl溶液，取对比例(即对照组)、实施例二中精氨酸血红蛋白着色剂、实施例六中的赖氨酸血红蛋白着色剂溶解于不同浓度的NaCl溶液中，使终浓度为1mg/mL，以10000g离心10min去除沉淀，测定A540，结果如图4所示。说明在精氨酸和赖氨酸能够提高血红蛋白对不同NaCl浓度的稳定性。
测定pH对血红蛋白着色剂稳定性的影响
配制0.5M的磷酸二氢钠溶液，用2M的NaOH分别调节pH为5、6、7、8、9、10、11、12，用不同梯度的pH溶液将对比例、实施例二中的精氨酸血红蛋白着色剂、实施例六中的赖氨酸血红蛋白着色剂稀释至1mg/mL，充分溶解后，以10000g离心10min去除沉淀，测定上清液在540nm处的吸光度，即A540，结果如图5所示。说明在精氨酸和赖氨酸能够提高血红蛋白对不同pH梯度的稳定性。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (10)

1.一种血红蛋白着色剂的制备方法，其特征在于，包括：
步骤一、从畜禽新鲜血液中提取血红蛋白水溶液；
步骤二、向所述血红蛋白水溶液中加入精氨酸或赖氨酸，得混合液，其中，精氨酸或赖氨酸在所述混合液中的比例为4～12mg/mL，调节pH值为9.5～12；
步骤三、将所述混合液干燥。
2.如权利要求1所述的血红蛋白着色剂的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，在向所述血红蛋白水溶液中加入精氨酸或赖氨酸时，还进行搅拌，搅拌时间为10～20min，搅拌温度为25℃～45℃。
3.如权利要求1所述的血红蛋白着色剂的制备方法，其特征在于，从畜禽新鲜血液中提取血红蛋白水溶液的具体过程包括：步骤(1)向禽畜新鲜血液中加入抗凝剂；步骤(2)对加入抗凝剂的畜禽血液进行低温离心处理，去除上层血浆，收集下层血细胞；步骤(3)对血细胞进行处理，提取血细胞破碎液；步骤(4)从血细胞破碎液中提取所述血红蛋白水溶液。
4.如权利要求3所述的血红蛋白着色剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的具体过程为：向畜禽新鲜血液以体积比为1:10加入抗凝剂，其中，抗凝剂为浓度为4％～16％的柠檬酸钠溶液。
5.如权利要求3所述的血红蛋白着色剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的具体过程为：对加入抗凝剂的畜禽血液进行低温离心处理，分离得到下层的血细胞，分离条件为3000～10000g，离心时间为20～30min，温度为2℃～10℃。
6.如权利要求3所述的血红蛋白着色剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)的具体过程为：采用生理盐水对血细胞进行清洗，并加入等体积的生理盐水，超声破碎血细胞，得到所述血细胞破碎液，其中，超声功率为250w，频率为25kHz，超声处理20～40min。
7.如权利要求3所述的血红蛋白着色剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)的具体过程为：将血细胞破碎液离心取一级上清液，离心条件为6000～10000g，温度为4℃～6℃，之后将一级上清液水浴加热至45℃～60℃，水浴加热时间为20～30min，再冷却，并离心收集二级上清液，离心条件为6000～10000g，温度为4℃～6℃，该二级上清液为所述血红蛋白水溶液。
8.如权利要求1所述的血红蛋白着色剂的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，采用冷冻干燥方式，冷阱温度为-60℃，真空度为1.0Pa，干燥时间为36～48h。
9.如权利要求1所述的血红蛋白着色剂的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，采用喷雾干燥方式，进口温度为180℃，出口温度为80℃。
10.一种血红蛋白着色剂，其特征在于，由如权利要求1至9中任一项所述的方法制备得到。
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