CN109134184B

CN109134184B - 二萜类化合物、其制备方法及用途

Info

Publication number: CN109134184B
Application number: CN201710456115.5A
Authority: CN
Inventors: 郭跃伟; 李静; 龚景旭; 戚欣; 叶飞; 陈俊生
Original assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Priority date: 2017-06-16
Filing date: 2017-06-16
Publication date: 2021-03-19
Anticipated expiration: 2037-06-16
Also published as: CN109134184A

Abstract

本发明涉及一种二萜类化合物、其制备方法及用途。所述二萜类化合物选自下式(Ⅰ)、(II)和(III)。实验结果显示本发明的化合物具有良好的促进T淋巴细胞增殖的活性，可以用于制备提高免疫功能药物和/或促进T淋巴细胞增殖活性药物，或为研制新型的提高免疫功能药物提供苗头化合物或先导化合物。

Description

二萜类化合物、其制备方法及用途

技术领域

本发明属于医药技术领域。具体而言，涉及具有良好的促进T淋巴细胞增殖活性的新颖骨架二萜类化合物、其制备方法及其在制药中的用途，尤其涉及在研发和制备提高人体免疫功能药物中的用途。

背景技术

免疫系统是机体保护自身的防御和监视性结构。免疫细胞是免疫系统中的重要组成部分，包括参与特异性免疫的T、B淋巴细胞以及参与非特异免疫细胞的单核/巨噬细胞、NK细胞等。其中T、B淋巴细胞参与的特异性免疫是高等生物特有的免疫形式，对人类免疫系统起着精细的调节与机体保护作用。特别是T细胞作为特异性免疫系统的核心，其对抗原刺激后的B细胞的充分活化与抗体产生也起着重要的辅助作用。特异性免疫的激活，其产生的细胞因子等又会作用于非特异免疫细胞，增加非特异免疫应答，从而改善整个机体的免疫系统。

许多疾病与T淋巴细胞功能缺陷有关，如引起反复性的细菌、真菌与病毒感染，肿瘤等疾病，并且导致输血等后易发生移植物抗宿主、不可接种疫苗等问题。T细胞功能增强对肿瘤治疗更为重要，T细胞是机体识别和杀伤肿瘤的主要细胞。现有免疫增强小分子药物还非常少，大部分为生物大分子提取物、抗体药物或疫苗。鉴于小分子化合物成药、运用、价格及保存的优势，研究和开发结构新颖，功能明确新的小分子免疫增强剂仍非常必要。

发明内容

本发明一方面提供了一种二萜类化合物，其选自下列式(Ⅰ)(命名为XishacoreneA)、(II)(命名为Xishacorene B)和(III)(命名为Xishacorene C)所示的化合物：

本发明还提供了所述二萜类化合物的制备方法，，其包括以下步骤：

(1)提取：将短指软珊瑚Sinularia polydactyla在丙酮中浸泡提取，得到丙酮提取液；

(2)萃取：将上述丙酮提取液浓缩得丙酮粗提物；将丙酮粗提物用萃取溶剂萃取，收集上清液，浓缩得到浸膏；

(3)色谱柱层析分离：

将浸膏进行硅胶柱层析，用石油醚-乙醚组成的洗脱溶剂进行梯度洗脱，收集石油醚-乙醚体积比约95：5部分的洗脱组分2；

将收集的洗脱组分2经过凝胶柱层析得到亚组分2A、2B、2C，经过薄层层析确认亚组分2C在254nm处有紫外吸收,

2C经高效液相分离纯化，洗脱液为乙腈/水体积比95:5的混合试剂，得到两个洗脱峰，收集前一个洗脱峰的馏分得到二萜类化合物I，收集后一个洗脱峰的馏分得到洗脱组分2C2，

洗脱组分2C2经高效液相分离纯化，洗脱液为甲醇/水体积比80:20的混合试剂，得到两个洗脱峰，收集前一个洗脱峰的馏分得到化合物II，收集后一个洗脱峰的馏分得到III。

步骤(1)中，优选将短指软珊瑚Sinularia polydactyla粉碎(例如剪碎)后进行浸泡提取。所述浸泡提取可以进行多次，例如3～6次。此外，所述浸泡提取可以在超声条件下进行。

步骤(2)中，所述萃取溶剂为无水乙醚或正丁醇。所述浓缩优选在减压下进行。

步骤(3)中，所述硅胶柱层析优选为200-300目硅胶柱层析。

步骤(3)所述洗脱溶剂为石油醚-乙醚体积比约100:0、约95:5、约8:2、约7:3、约6:4、约3:7组成的洗脱溶剂。所述“约”指的是误差在±10％之内，优选±5％之内。

本发明再一方面提供了所述二萜类化合物在制备提高免疫功能药物中的用途。

优选地，所述提高免疫功能是指促进T淋巴细胞增殖的活性。因此，本发明还提供了所述二萜类化合物在制备促进T淋巴细胞增殖活性的药物中的用途。

本发明提供了一种提高免疫功能的方法，其包括向有此需要的患者施用所述二萜类化合物。所述患者可以是人或动物。

本发明提供了一种促进T淋巴细胞增殖活性的方法，其包括向有此需要的对象施用所述二萜类化合物。所述对象可以为人或动物，细胞或酶。

附图说明

图1为三种二萜类化合物体外对脾细胞活性、T、B细胞增殖的影响(与DMSO对照组相比较：^#P<0.05；与刺激组(conA)相比较：*P<0.05，**P<0.01)。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明做进一步说明，但本发明并不仅限于此。

实施例1：Xishacorene A、Xishacorene B和XishacoreneC的制备方法

(1)短指软珊瑚(Sinularia polydactyla)样品于2013年采自中国南海西沙海域，采集后冷冻保存，直接剪碎，用丙酮浸泡提取4次，合并提取液，减压浓缩得到丙酮(国药集团化学试剂有限公司，中国)粗提物，用无水乙醚(国药集团化学试剂有限公司，中国)将粗提物萃取至上清液无色，减压浓缩得到无水乙醚浸膏。

(2)将无水乙醚浸膏进行硅胶柱层析(200-300目，青岛海洋化工有限公司，中国)处理，用有机溶剂石油醚-乙醚(体积比约100:0、约95:5、约8:2、约7:3、约6:4、约3:7)(国药集团化学试剂有限公司，中国)进行梯度洗脱，收集体积比约95：5部分洗脱组分2。

将收集的洗脱组分2再经过凝胶柱层析(Pharmacia,USA，Sephadex LH20)得到亚组分2A、2B、2C，经过薄层层析确认亚组分2C在254nm处有紫外吸收。

亚组分2C经过高效液相(RP-HPLC)(Agilent 1260，DAD G1315D检测器，半制备ODS-HG-5层析柱5μm，250×9.4mm)分离纯化，洗脱液为乙腈/水(体积比)95:5，洗脱速度为3.0mL/min，得到两个洗脱峰，收集前一个洗脱峰的馏分得到Xishacorene A和收集后一个洗脱峰的馏分得到洗脱组分2C2。

洗脱组分2C2经高效液相分离纯化，洗脱液为甲醇/水(体积比)80：20，洗脱速度为3.0mL/min，得到两个洗脱峰，收集前一个洗脱峰的馏分得到XishacoreneB，收集后一个洗脱峰的馏分得到Xishacorene C。

将Xishacorene A，Xishacorene B和Xishacorene C进行波谱解析，分别具有化学式(Ⅰ)、(II)和(III)所示的结构：

结构如式(I)所示的化合物Xishacorene A的理化性质：

¹H NMR(MeOD)：δ0.91(3H,s),1.07(3H,s),1.41-1.44(2H,m),1.51(1H,m),1.57-1.70(4H,m),1.70(3H,s),1.73(3H,s),1.85(3H,s),1.87(1H,t,J＝2.4Hz),5.05(2H,m),5.27(1H,m),5.39(1H,d,J＝15.3Hz),5.71(1H,d,J＝11.4Hz),5.92(1H,dd,J＝11.0,17.7Hz),6.01(1H,dd,J＝11.4,15.3Hz)ppm；质谱数据：HREIMS:m/z270.2361.

结构如式(II)所示的化合物Xishacorene B的理化性质：

¹H NMR(MeOD)：δ0.90(3H,s),1.01(3H,s),1.24(1H,m),1.44(1H,m),1.52-1.60(3H,m),1.67(1H,dt,J＝12.5,3.2Hz),1.73(3H,s),1.76(3H,s),1.81(1H,dtJ＝12.5,2.8),1.84(3H,d,J＝1.3Hz),1.85(1H,t,J＝2.9Hz),5.03(2H,m),5.43(1H,brs),5.52(1H,d,J＝15.4Hz),5.81(1H,d,J＝10.7Hz),5.91(1H,dd,J＝17.7,11.0Hz),6.26(1H,dd,J＝15.4,10.7Hz)ppm；质谱数据：HREIMS:m/z270.2341.

结构如式(III)所示的化合物Xishacorene C的理化性质：

¹H NMR(MeOD)：δ0.85(3H,s),1.04(3H,s),1.41(1H,brs),1.63(2H,m),1.74(1H,m),1.73(3H,s),1.75(3H,s),1.76(3H,s),1.78(1H,m),1.82(1H,m),2.08(1H,t,J＝2.8Hz),4.77(2H,s),5.03(2H,m),5.61(1H,d,J＝15.5Hz),5.82(2H,m),6.20(1H,dd,J＝15.5,10.6Hz)ppm；质谱数据：HREIMS:m/z270.2350.

¹H NMR测试以MeOD(δ_H3.31ppm；)做内标，仪器为Bruker DRX-500spectrometer(Bruker Biospin AG,

Germany)。

实施例2：Xishacorene A、B、C体外对脾细胞活性、T、B细胞增殖的影响。

准确称取上述实施例1中分离精制的化合物Xishacorene A、Xishacorene B和Xishacorene C纯品适量，用DMSO配制成30mM。

脱颈椎处死小鼠，无菌取其脾脏，脾脏剪碎，用一次性注射器活塞在筛网(200目)上轻轻研磨制备脾细胞悬液。用含10％胎牛血清(FBS)的RPMI1640完全培养基调整脾细胞数为5×10⁶/mL，加入96孔板。

设静息的脾细胞组、LPS(内毒素)刺激的B细胞增殖组、ConA(刀豆蛋白A)刺激的T细胞增殖组；其中，静息的脾细胞组中设置：DMSO对照组(Ctrl)、刺激组(2.5μg/mL ConA)、化合物组(2.5μg/mL ConA+10μM化合物、2.5μg/mL ConA+20μM化合物、2.5μg/mL ConA+40μM化合物)；LPS刺激的B细胞增殖组设置：DMSO对照组(Ctrl)、刺激组(1.0μg/mL LPS)、化合物组(1.0μg/mL LPS+10μM化合物、1.0μg/mL LPS+20μM化合物、1.0μg/mL LPS+40μM化合物)。

各组作用72h后加入20μL MTT溶液(5mg/mL)后，37℃孵育4h。加入三联液于37℃孵育过夜，酶标仪于570nm测定吸光值(OD值)。

按照下式计算每个浓度下的脾细胞活性和细胞增殖率。

脾细胞活性＝(OD_化合物组-OD_{DMSO对照组})/OD_{DMSO对照组}×100％

T或B细胞增殖率＝(OD_{刺激+化合物组}-OD_刺激组)/OD_刺激组×100％

实验结果如图1，表明Xishacorene A、B和C对静息的脾细胞活力无明显影响，对LPS刺激的B细胞增殖也无明显影响，但可以明显增加ConA刺激的T细胞增殖，说明Xishacorene A-C能够进一步活化抗原刺激后的T细胞，具有T细胞免疫调节活性。

Claims

1.选自式(Ⅰ)、(II)和(III)化合物的二萜类化合物：

2.一种权利要求1中所述的二萜类化合物的制备方法，其特征是，该方法包括以下步骤：

(1)提取：将短指软珊瑚在丙酮中浸泡提取，得到丙酮提取液；

(2)萃取：将上述丙酮提取液浓缩得丙酮粗提物；将丙酮粗提物用萃取溶剂萃取，收集上清液，浓缩得到浸膏；其中，所述萃取溶剂为无水乙醚；

(3)色谱柱层析分离：

将浸膏进行硅胶柱层析，用石油醚-乙醚组成的洗脱溶剂进行梯度洗脱，收集石油醚-乙醚体积比95：5部分的洗脱组分2；

将收集的洗脱组分2经过凝胶柱层析得到亚组分2A、2B、2C，经过薄层层析确认亚组分2C在254nm处有紫外吸收；

2C经高效液相分离纯化，洗脱液为乙腈/水体积比95:5的混合试剂,即得二萜类化合物I和洗脱组分2C2，

洗脱组分2C2经高效液相分离纯化，洗脱液为甲醇/水体积比80:20的混合试剂，得到二萜类化合物II和III。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述浸泡提取，在超声条件下进行。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述硅胶柱层析为200-300目硅胶柱层析。

5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述洗脱溶剂为石油醚-乙醚体积比100:0、95:5、8:2、7:3、6:4、3:7组成的洗脱溶剂。

6.权利要求1所述二萜类化合物在制备促进T淋巴细胞增殖活性药物中的用途。